DE102016212754B4

DE102016212754B4 - Biomimetic cartilage matrix

Info

Publication number: DE102016212754B4
Application number: DE102016212754.3A
Authority: DE
Inventors: Kirsten Borchers; Eva Hoch; Achim Weber
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Universitaet Stuttgart
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Universitaet Stuttgart
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2016-07-13
Publication date: 2019-05-09
Anticipated expiration: 2036-07-14
Also published as: DE102016212754A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen von mindestens einem Substrat und mindestens drei Komponenten mit artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen, wobei die Komponenten mindestens ein vernetzbares Kollagenderivat aus der Gruppe A, mindestens ein vernetzbares Glykosaminoglykanderivat aus der Gruppe B umfassen und mindestens eine der Komponenten ausgewählt aus den Gruppen A und B, in mindestens zwei Spezies mit unterschiedlichem Modifizierungsgrad vorliegt,
b) Aufbringen einer ersten Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B auf das mindestens eine Substrat, gefolgt von einem Vernetzen der aufgebrachten Zusammensetzung, anschließend
c) mindestens einmaliges Aufbringen mindestens einer weiteren Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B auf die jeweils vorherige Zusammensetzung und Vernetzen der im Verfahrensschritt b) und c) oder der in Verfahrensschritt c) aufgebrachten Zusammensetzungen, und
d) Erhalten einer biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung, wobei mindestens eine der weiteren Zusammensetzungen in Schritt c) dadurch gekennzeichnet ist, dass in Bezug auf die jeweils vorherige Zusammensetzung der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit durch Änderung der Menge und Identität mindestens einer Spezies ausgewählt aus den Gruppen A und B gegensätzlich zueinander verändert sind, und wobei die zonale Strukturierung durch gleichgerichtete Festigkeits- und Quellbarkeitsgradienten innerhalb der zonalen Strukturierung ausgezeichnet ist.

A method of making a biomimetic cartilage matrix having zonal structuring comprising the steps of:
a) providing at least one substrate and at least three components with artificially introduced crosslinkable groups, said components comprising at least one crosslinkable collagen derivative from group A, at least one crosslinkable glycosaminoglycan derivative from group B and at least one of the components selected from groups A and B. , is present in at least two species with different degrees of modification,
b) applying a first composition comprising at least one respective species from Groups A and B to the at least one substrate, followed by crosslinking of the applied composition, then
c) at least one application of at least one further composition comprising at least one respective species from groups A and B to the respective previous composition and crosslinking of the compositions applied in process steps b) and c) or in process step c), and
d) obtaining a biomimetic cartilage matrix with zonal structuring, wherein at least one of the further compositions in step c) is characterized in that with respect to the respective previous composition the total polymer content and the crosslinkability by changing the amount and identity of at least one species selected from the groups A and B are changed in opposition to each other and the zonal patterning is characterized by rectified strength and swellability gradients within the zonal patterning.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung sowie eine nach dem Verfahren hergestellte biomimetische Knorpelmatrix.The present invention relates to a method for the preparation of a biomimetic cartilage matrix with zonal structuring and to a biomimetic cartilage matrix produced according to the method.

Eine der größten Herausforderungen bei der dreidimensionalen Rekonstruktion von biologischen Geweben ist die möglichst mimetische Nachbildung der extrazellulären Matrix (EZM). Die EZM liegt im Interzellularraum tierischen Gewebes und weist in unterschiedlichen Gewebetypen eine unterschiedliche Beschaffenheit auf. Sie enthält unter anderem (u.a.) Proteine, Proteoglykane, Glykosaminoglykane und Glykoproteine in unterschiedlichen Zusammensetzungen. Es wird heute davon ausgegangen, dass die spezifische stoffliche Zusammensetzung der Matrix an der Stabilisierung der Funktion der gewebebildenden Zellen beteiligt ist. So konnte für isolierte Knorpelzellen, die zunächst in einer zweidimensionalen Kultur ihren spezifischen Differenzierungszustand verloren haben, beobachtet werden, dass es in einer dreidimensionalen Gelatinematrix durch Zugabe von Chondroitinsulfat (CS) und Hyaluronsäure (HA) zur Redifferenzierung der Zellen kam ( Levett et al., A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia, 2014, 10(1), 214-223 ).One of the biggest challenges in the three-dimensional reconstruction of biological tissues is the mimetic simulation of the extracellular matrix (ECM). The ECM is located in the intercellular space of animal tissue and has a different nature in different tissue types. It contains, inter alia, proteins, proteoglycans, glycosaminoglycans and glycoproteins in various compositions. It is now believed that the specific material composition of the matrix is involved in stabilizing the function of tissue-forming cells. Thus, for isolated cartilage cells, which initially lost their specific differentiation state in a two-dimensional culture, it was observed that the redifferentiation of the cells occurred in a three-dimensional gelatin matrix by adding chondroitin sulfate (CS) and hyaluronic acid (HA) ( Levett et al., A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia, 2014, 10 (1), 214-223 ).

Insbesondere Stützgewebe, wie Bindegewebe, Knorpel oder Knochen, besitzen einen hohen Anteil an EZM, die dabei selbst wesentliche Funktionen des Gewebes übernimmt. Es ist bekannt, dass sich beispielsweise innerhalb des Knorpelgewebes in Gelenken die Zusammensetzung der EZM und damit auch die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Gewebes vom Gelenkspalt bis zum Knochen zonenweise verändert. Während der Kollagengehalt weitestgehend konstant bleibt, steigt der Glykosaminoglykangehalt von der Gelenkoberfläche zur tiefen, knochennahen Zone deutlich an. Gleichzeitig ändern sich auch die mechanischen Eigenschaften des Knorpels. Die knochennahe Region besitzt eine besonders hohe Druckfestigkeit, während die Gelenkoberfläche besonders zugfest ist ( Klein et al., Tissue engineering of articular cartilage with biomimetic zones. Tissue Engineering Part B: Reviews, 2009, 15(2), 143-157 ). Insbesondere steigen sowohl die Festigkeit als auch die Quellbarkeit (Wassergehalt) der EZM von der Gelenkoberfläche gleichgerichtet zur tiefen, knochennahen Zone an. Diese Eigenschaften sind durch die chemische Natur der Makromoleküle der EZM, ihre Fähigkeit Wasser zu binden, und die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Makromolekülen bestimmt.In particular, supporting tissue, such as connective tissue, cartilage or bone, have a high proportion of ECM, which itself assumes essential functions of the tissue. It is known that, for example, within the cartilaginous tissue in joints, the composition of the ECM and thus also the physicochemical properties of the tissue changes zone-wise from the joint space to the bone. While the collagen content remains largely constant, the Glykosaminoglykangehalt increases significantly from the articular surface to the deep, bone-near zone. At the same time, the mechanical properties of the cartilage also change. The bone-near region has a particularly high compressive strength, while the joint surface is particularly tensile ( Klein et al., Tissue engineering of articular cartilage with biomimetic zones. Tissue Engineering Part B: Reviews, 2009, 15 (2), 143-157 ). In particular, both the strength and the swellability (water content) of the ECM from the articular surface increase rectified to the deep, bone-near zone. These properties are determined by the chemical nature of the ECM macromolecules, their ability to bind water, and the intermolecular interactions between the macromolecules.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der EZM biologischer Gewebe konnten bislang nicht systematisch nachgebildet werden. In bisher beschriebenen Hydrogel-Systemen, insbesondere auf der Basis von vernetzbarer Gelatine, ist eine Erhöhung der Zugfestigkeit der Gele durch Erhöhung des Polymergehalts oder der Vernetzungsdichte immer mit einer Verringerung der Quellbarkeit des Gels verbunden. Insbesondere im Gelenkknorpel hingegen, steigen sowohl Festigkeit als auch Quellbarkeit von der Gelenkoberfläche zur tiefen, knochennahen Zone an, worin u. a. die besonderen Eigenschaften des Gewebes begründet sind.The physico-chemical properties of the ECM of biological tissues have not yet been systematically replicated. In previously described hydrogel systems, especially based on crosslinkable gelatin, an increase in the tensile strength of the gels by increasing the polymer content or the crosslinking density is always associated with a reduction in the swellability of the gel. In particular, in the articular cartilage, however, increase both strength and swellability of the articular surface to the deep, bone near zone, wherein u. a. the special properties of the tissue are justified.

Bislang werden für die dreidimensionale Rekonstruktion von biologischem Gewebe unterschiedliche Methoden eingesetzt. Bei der Verwendung von Zell-Sphäroiden liegen die Zellen ohne Matrix vor, es handelt sich daher um eine Vorstufe zu einem Gewebekonstrukt, in dem die Matrix erst noch von den Zellen gebildet werden muss. Insbesondere im Fall von Knorpelzellen wird beobachtet, dass sich innerhalb von Sphäroiden eine knorpelähnliche, in radialer Richtung zonale Struktur ausbildet, die sich auch in der Expression zonentypischer extrazellulärer Matrix zeigt. Die Sphäroide sind aufgrund ihrer geringen Größe und sphärischen Geometrie in der Praxis zur Geweberekonstruktion jedoch kaum einsetzbar.So far, different methods have been used for the three-dimensional reconstruction of biological tissue. When using cell spheroids, the cells are present without a matrix, so it is a precursor to a tissue construct in which the matrix has yet to be formed by the cells. Particularly in the case of cartilage cells, it is observed that within spheroids a cartilage-like, radially-zonal structure is formed, which is also evident in the expression of zone-specific extracellular matrix. However, due to their small size and spherical geometry, the spheroids are hardly usable in practice for tissue reconstruction.

In einem alternativen Ansatz werden Knorpelzellen aus den verschiedenen Knorpelzonen des Gelenkknorpels isoliert, wobei durch die Wahl geeigneter Kulturbedingungen die Fähigkeit der Zellen zur Bildung zonentypischer Proteine und Matrixkomponenten erhalten bleibt. Jedoch ist diese Methode zum Aufbau einer Gewebematrix sehr langwierig und erfordert die Bereitstellung von ausreichend Knorpelzellen aus den einzelnen Zonen.In an alternative approach, cartilage cells are isolated from the various articular cartilage cartilage cells, and the choice of suitable culture conditions maintains the cell's ability to form zone-specific proteins and matrix components. However, this method of constructing a tissue matrix is very tedious and requires the provision of sufficient cartilage cells from the individual zones.

In einem weiteren Verfahren werden dreidimensionale Trägermaterialien, beispielsweise dezellularisierte Knorpelmatrix, zur Besiedlung mit Knorpelzellen eingesetzt. Die Besiedlung poröser dreidimensionaler Substrate birgt jedoch prinzipiell das Problem, dass die Zellen nicht in genügendem Maße in die Gerüststruktur einwandern. Auch erweist es sich als schwierig, unterschiedliche Zelltypen in eine räumliche Anordnung gemäß der zonalen Organisation von natürlichem Gelenkknorpel zu bringen. Zudem erfordert die Verwendung dezellularisierter Gewebematrices die Bereitstellung von Spendergewebe.In another method, three-dimensional support materials, for example decellularized cartilage matrix, are used to colonize cartilage cells. The colonization of porous three-dimensional substrates, however, in principle involves the problem that the cells do not migrate sufficiently into the framework structure. Also, it proves difficult to place different cell types in a spatial arrangement according to the zonal organization of natural articular cartilage. In addition, the use of decellularized tissue matrix requires the provision of donor tissue.

Für die Herstellung von zellhaltigen, EZM-ähnlichen Matrices werden beispielsweise verschiedene Vertreter der Molekülklassen Proteine und Glykosaminoglykane zur Einkapselung von Zellen eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Zusammensetzung der verwendeten Matrix Einfluss auf die EZM-Produktion der eingekapselten Chondrozyten hatte. Um die mechanischen Eigenschaften der Hydrogel-Matrix für die Knorpelrekonstruktion zu beeinflussen, werden ebenfalls zwei Ansätze verfolgt. Zum einen wird die Matrixproduktion der eingekapselten Zellen angeregt, um so die Festigkeit der Matrix zu erhöhen, zum anderen werden die mechanischen Eigenschaften der Hydrogele durch Wahl der Matrixzusammensetzung bereits gezielt eingestellt. Dabei wird die Festigkeit von nativem Gelenkknorpel noch nicht erreicht. For example, various members of the molecule classes proteins and glycosaminoglycans are used for the encapsulation of cells for the production of cell-containing ECM-like matrices. It could be shown that the composition of the matrix used had an influence on the ECM production of the encapsulated chondrocytes. To influence the mechanical properties of the hydrogel matrix for cartilage repair, two approaches are also pursued. On the one hand, the matrix production of the encapsulated cells is stimulated so as to increase the strength of the matrix, on the other hand, the mechanical properties of the hydrogels are already deliberately set by choice of the matrix composition. The strength of native articular cartilage is not yet reached.

Um die mechanischen Eigenschaften der Hydrogele zu variieren, wurden verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix kombiniert. Bei gegebener Vernetzungschemie, zum Beispiel radikalisch initiierte Vernetzung von acrylierten oder methacrylierten Polymeren, stehen für die Einstellung der Hydrogeleigenschaften drei Stellschrauben zur Verfügung: der Gesamtpolymergehalt, die Anzahl vernetzbarer Gruppen und die stoffliche Zusammensetzung der Gele. Die Eigenschaften der resultierenden Hybridhydrogele können durch die geschickte Wahl der Komponenten gezielt beeinflusst werden. Im Allgemeinen wird jedoch beobachtet, dass ein steigender Gesamtpolymergehalt mit einer Zunahme der mechanischen Festigkeit bei gleichzeitiger Abnahme der Quellbarkeit verbunden ist.In order to vary the mechanical properties of the hydrogels, various components of the extracellular matrix were combined. For given crosslinking chemistry, for example radically initiated crosslinking of acrylated or methacrylated polymers, there are three set screws available for adjusting the hydrogel properties: the total polymer content, the number of crosslinkable groups and the material composition of the gels. The properties of the resulting hybrid hydrogels can be specifically influenced by the skillful choice of components. In general, however, it is observed that increasing total polymer content is associated with an increase in mechanical strength coupled with a decrease in swellability.

Zellfreie, zonal organisierte Gele aus methacrylierter Gelatine (GM) mit drei unterschiedlichen Modifizierungsgraden und methacryliertem Chitosan, variierendem Gesamtpolymer- und Vernetzergehalt, sowie dispergierten Siliziumoxidnanopartikeln in der unteren Zone zeigten in Bezug auf Deformation unter Kompression ähnliche Eigenschaften wie porziner Gelenkknorpel. Die knorpelspezifische gemeinsame Zunahme von Festigkeit und Quellbarkeit konnte hierbei jedoch nicht erreicht werden ( Han et al., Photocrosslinked layered gelatin-chitosan hydrogel with graded compositions for osteochondral defect repair. Journal of Material Science: Materials in Medicine, 2015. 26(4), 1-13 ).Cell-free, zonally-organized gels of methacrylated gelatin (GM) with three different degrees of modification and methacrylated chitosan, varying total polymer and crosslinker content, as well as dispersed silica nanoparticles in the lower zone, showed compression-related properties similar to porcine articular cartilage. The cartilage-specific joint increase of firmness and swellability could not be achieved ( Han et al., Photocrosslinked layered gelatin-chitosan hydrogel with graded compositions for osteochondral defect repair. Journal of Material Science: Materials in Medicine, 2015. 26 (4), 1-13 ).

Diese Eigenschaften wurden bislang nur für Kombinationen aus synthetischen und biobasierten Hydrogelen beschrieben. Für Hybrid-Hydrogele aus methacryliertem Polyvinylalkohol (PVAM) und methacryliertem Chondroitinsulfat (CSM) konnten durch die Erhöhung des CSM-Anteils am Gesamtpolymergehalt gleichzeitig sowohl die Festigkeit als auch die Quellbarkeit gesteigert werden (Bryant et al., Synthesis and Characterization of Photopolymerized Multifunctional Hydrogels: Water-Soluble Poly(Vinyl Alcohol) and Chondroitin Sulfate Macromers for Chondrocyte Encapsulation. Macromolecules, 2004, 37(18), 6726-6733) .These properties have so far been described only for combinations of synthetic and bio-based hydrogels. For hybrid hydrogels of methacrylated polyvinyl alcohol (PVAM) and methacrylated chondroitin sulfate (CSM), both the strength and the swellability could be simultaneously increased by increasing the CSM content of the total polymer content (Bryant et al., Synthesis and Characterization of Photopolymerized Multifunctional Hydrogels: Water-Soluble Poly (Vinyl Alcohol) and Chondroitin Sulfate Macromers for Chondrocyte Encapsulation. Macromolecules, 2004, 37 (18), 6726-6733) ,

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die vorgenannten Nachteile im Stand der Technik zu überwinden, insbesondere durch die Bereitstellung eines, vorzugsweise einfach und effizient durchzuführenden, Verfahrens zur Herstellung einer der natürlich vorkommenden Knorpelmatrix so weit wie möglich gleichenden biomimetischen Knorpelmatrix, insbesondere mit zonaler Strukturierung, sowie die Bereitstellung einer nach diesem Verfahren hergestellten biomimetischen Knorpelmatrix.It is therefore the object of the present invention to overcome the aforementioned drawbacks in the prior art, in particular by providing a method, preferably simple and efficient, of producing a biomimetic cartilage matrix which is as similar as possible to the naturally occurring cartilage matrix, in particular zonal Structuring, as well as the provision of a prepared according to this method biomimetic cartilage matrix.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende Problem insbesondere durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche.The present invention solves the underlying problem in particular by the subject matters of the independent claims.

Dabei betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen von mindestens einem Substrat und mindestens drei Komponenten mit artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen, wobei die Komponenten mindestens ein vernetzbares Kollagenderivat aus der Gruppe A, mindestens ein vernetzbares Glykosaminoglykanderivat aus der Gruppe B umfassen und mindestens eine der Komponenten ausgewählt aus den Gruppen A und B, in mindestens zwei Spezies mit unterschiedlichem Modifizierungsgrad vorliegt,
b) Aufbringen einer ersten Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B auf das mindestens eine Substrat, gefolgt von einem Vernetzen der aufgebrachten Zusammensetzung, anschließend
c) mindestens einmaliges Aufbringen mindestens einer weiteren Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B auf die jeweils vorherige Zusammensetzung und Vernetzen der im Verfahrensschritt b) und c) oder der in Verfahrensschritt c) aufgebrachten Zusammensetzungen, und
d) Erhalten einer biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung,

wobei mindestens eine der weiteren Zusammensetzungen in Schritt c) dadurch gekennzeichnet ist, dass in Bezug auf die jeweils vorherige Zusammensetzung der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit durch Änderung der Menge und Identität mindestens einer Spezies ausgewählt aus den Gruppen A und B gegensätzlich zueinander verändert sind, und wobei die zonale Strukturierung durch gleichgerichtete Festigkeits- und Quellbarkeitsgradienten innerhalb der zonalen Strukturierung ausgezeichnet ist.The present invention relates to a method for producing a biomimetic cartilage matrix with zonal structuring, comprising the steps:

a) providing at least one substrate and at least three components with artificially introduced crosslinkable groups, said components comprising at least one crosslinkable collagen derivative from group A, at least one crosslinkable glycosaminoglycan derivative from group B and at least one of the components selected from groups A and B. , is present in at least two species with different degrees of modification,
b) applying a first composition comprising at least one respective species from Groups A and B to the at least one substrate, followed by crosslinking of the applied composition, then
c) at least one application of at least one further composition comprising at least one respective species from groups A and B to the respective previous composition and crosslinking of the compositions applied in process steps b) and c) or in process step c), and
d) obtaining a biomimetic cartilage matrix with zonal structuring,

wherein at least one of the further compositions in step c) is characterized in that, with respect to the respective previous composition, the total polymer content and the crosslinkability are changed by changing the amount and identity of at least one species selected from groups A and B in opposite directions, and wherein the zonal patterning is characterized by rectified strength and swelling gradients within the zonal patterning.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch mittels der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte biomimetische Knorpelmatrices mit zonaler Strukturierung.The present invention also relates to biomimetic cartilage matrices with zonal structuring produced by the methods of the invention.

In besonders vorteilhafter Weise ermöglicht es die vorliegende Erfindung, biomimetische Matrices, welche aus biobasierten Substanzen hergestellt und aufgebaut sind, bereitzustellen, die der natürlichen Zusammensetzung und Strukturierung der natürlicherweise vorkommenden extrazellulären Matrix von Knorpel nahezu oder vollständig gleichen und bei denen eine gleichgerichtete graduelle Steigerung oder Erniedrigung von Festigkeit und Quellbarkeit wie im natürlicherweise vorkommenden Gelenkknorpel vorliegt. Die vorliegende Erfindung stellt daher Verfahren und damit hergestellte Produkte, insbesondere biomimetische Knorpelmatrices, bereit, die aus Biopolymeren hergestellt und aufgebaut sind, wobei sich die hergestellte biomimetische Knorpelmatrix durch zumindest zwei Zonen unterschiedlicher Festigkeit und Quellbarkeit auszeichnet. Die Bereitstellung dieser mindestens zwei Zonen wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass zumindest zwei unterschiedliche Zusammensetzungen, insbesondere eine erste Zusammensetzung und mindestens eine weitere abweichende Zusammensetzung, in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden und durch die erfindungsgemäß abweichende Zusammensetzung der mindestens einen weiteren Zusammensetzung zwei unterschiedliche Zonen unterschiedlicher Festigkeit und Quellbarkeit bereitgestellt werden, wobei sich die beiden Parameter entweder erhöhen oder erniedrigen. Erfindungsgemäß wird die Lehre bereitgestellt, die mindestens eine weitere Zusammensetzung in ihrer Zusammensetzung so von der vorherig aufgebrachten, insbesondere ersten, Zusammensetzung abweichend auszuführen, dass in Bezug auf die jeweilig vorherig aufgebrachte, insbesondere erste, Zusammensetzung der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit durch Änderung der Menge und Identität mindestens einer Spezies ausgewählt aus den Gruppen A und B gegensätzlich zueinander verändert sind. Die Erfindung stellt daher die Lehre bereit, eine zonal strukturierte biomimetische Knorpelmatrix bereitzustellen, wobei mindestens zwei unterschiedliche Zusammensetzungen zur Generierung dieser zonalen Strukturierung eingesetzt werden und wobei die Zusammensetzungen so abweichend voneinander gestaltet werden, dass in Bezug auf die jeweilig vorherige Zusammensetzung der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit durch Änderung der Menge und Identität mindestens einer Spezies ausgewählt aus den Gruppen A und B gegensätzlich zueinander verändert sind. Demgemäß werden die unterschiedlichen Zusammensetzungen erfindungsgemäß so ausgeführt, dass sich der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit einer Zusammensetzung von dem Gesamtpolymergehalt einer im erfindungsgemäßen Verfahren bereits vorher aufgebrachten Zusammensetzung unterscheiden und zwar dergestalt, dass der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit gegensätzlich zueinander verändert sind, das heißt beispielsweise der Gesamtpolymergehalt erhöht und die Vernetzbarkeit verringert oder der Gesamtpolymergehalt verringert und die Vernetzbarkeit erhöht ist. Erfindungsgemäß ist es daher vorgesehen, dass sich zumindest eine der in c) aufgebrachten Zusammensetzungen von mindestens einer vorherig in Schritt b) oder c) aufgebrachten Zusammensetzung dergestalt unterscheidet, dass in Bezug auf diese vorherige Zusammensetzung der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit durch Änderung der Menge und Identität mindestens einer Spezies ausgewählt aus den Gruppen A und B verändert sind. So kann es beispielsweise vorgesehen sein, dass eine erste Schicht gemäß Schritt b) und mehrere weitere Schichten gemäß Schritt c) aufgebracht werden, die sich hinsichtlich ihrer Zusammensetzung gleichen und wobei dann im Rahmen einer weiteren, gemäß Schritt c) aufgebrachten, Zusammensetzung die vorstehend beschriebene gegensätzliche Veränderung des Gesamtpolymergehalt und der Vernetzbarkeit realisiert ist.In a particularly advantageous manner, the present invention makes it possible to provide biomimetic matrices made and constructed from bio-based substances which are almost or completely similar to the natural composition and structuring of the naturally occurring extracellular matrix of cartilage and which have a rectified gradual increase or decrease firmness and swellability as in naturally occurring articular cartilage. The present invention therefore provides methods and products made thereby, in particular biomimetic cartilage matrices, made and constructed from biopolymers, the biomimetic cartilage matrix produced being characterized by at least two zones of differing strength and swellability. The provision of these at least two zones is achieved according to the invention in that at least two different compositions, in particular a first composition and at least one further differing composition, are used in the method according to the invention and two different zones of different strength by the inventively deviating composition of at least one further composition and swellability, with either parameter either increasing or decreasing. According to the invention, the teaching is provided that deviating at least one further composition in its composition from the previously applied, in particular first, composition that with respect to the respective previously applied, in particular first, composition of the total polymer content and the crosslinkability by changing the amount and Identity of at least one species selected from the groups A and B are changed in opposite to each other. The invention therefore provides the teaching of providing a zonally structured biomimetic cartilage matrix employing at least two different compositions for generating this zonal patterning and wherein the compositions are designed so as to differ from one another in respect of the respective previous composition of total polymer content and crosslinkability by changing the amount and identity of at least one species selected from the groups A and B are changed in opposite to each other. Accordingly, the different compositions are carried out according to the invention such that the total polymer content and the crosslinkability of a composition differ from the total polymer content of a previously applied composition in the process of the invention such that the total polymer content and the crosslinkability are altered in opposite directions, that is, for example, the total polymer content increases and reduces the crosslinkability or reduces the total polymer content and the crosslinkability is increased. According to the invention, it is therefore provided that at least one of the compositions applied in c) differs from at least one composition previously applied in step b) or c) in such a way that with respect to this previous composition the total polymer content and the crosslinkability are changed by changing the amount and identity at least one species selected from the groups A and B are changed. Thus, it can be provided, for example, that a first layer according to step b) and several further layers according to step c) are applied, which are identical in composition and then in the context of a further, applied according to step c), the composition described above Contrary change in the total polymer content and the crosslinkability is realized.

Erfindungsgemäß ist es möglich, durch Erhöhung des Gesamtpolymergehaltes bei gleichzeitiger Verringerung der Vernetzbarkeit eine Steigerung von Festigkeit und Quellbarkeit zu erreichen. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, durch Verringerung des Gesamtpolymergehaltes in Bezug auf die jeweils vorherige Zusammensetzung bei gleichzeitiger Erhöhung der Vernetzbarkeit eine Verringerung von Festigkeit und Quellbarkeit bereitzustellen. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise erlaubt daher vorteilhafterweise die Bereitstellung von biomimetischen Knorpelmatrices, die eine zonale Strukturierung aufweisen, welche in einer Ausführungsform mit von Zone zu Zone steigendem Gesamtpolymergehalt und verringerter Vernetzbarkeit gleichzeitig eine Steigung von Festigkeit und Quellbarkeit aufweisen und die in einer anderen Ausführungsform mit sinkendem Gesamtpolymergehalt und steigender Vernetzbarkeit von Zone zu Zone gleichzeitig eine Reduktion von Festigkeit und Quellbarkeit aufweisen. Erfindungsgemäß wird dies ermöglicht durch die bereitgestellte Lehre, insbesondere die Lehre den Gesamtpolymergehalt in zumindest zwei der aufgebrachten Zusammensetzungen und damit in den derart erzeugten verschiedenen Zonen gegensätzlich zur Vernetzbarkeit zu verändern, das heißt, entweder den Gesamtpolymergehalt der auf die bereits aufgebrachte Zusammensetzung folgenden weiteren Zusammensetzung zu erhöhen und gleichzeitig die Vernetzbarkeit dieser weiteren Zusammensetzung zu reduzieren oder entsprechend den Gesamtpolymergehalt zu reduzieren und die Vernetzbarkeit zu erhöhen oder aber beispielsweise nacheinander die beiden vorgenannten Verfahrensweisen miteinander zu kombinieren.According to the invention, it is possible to achieve an increase in strength and swellability by increasing the total polymer content while at the same time reducing the crosslinkability. According to the invention, it is also possible to provide a reduction of strength and swellability by reducing the total polymer content in relation to the respective previous composition while at the same time increasing the crosslinkability. The method of the invention therefore advantageously permits the provision of biomimetic cartilage matrices which have a zonal structure which, in one embodiment, having an increase in total polymer content and reduced crosslinkability from zone to zone simultaneously exhibits an increase in strength and swellability and in another embodiment with decreasing total polymer content Increasing crosslinkability from zone to zone at the same time have a reduction of strength and swellability. According to the invention, this is made possible by the teaching provided, in particular the teaching of the total polymer content in at least two of the applied compositions and thus in the different zones thus produced in contrast to the crosslinkability that is, to either increase the total polymer content of the further composition following the already applied composition and at the same time to reduce the crosslinkability of this further composition or to correspondingly reduce the total polymer content and to increase the crosslinkability or, for example, successively combine the two abovementioned procedures ,

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Kollagenderivat ein Gelatinederivat.In a preferred embodiment, the collagen derivative is a gelatin derivative.

In bevorzugter Ausführungsform können erfindungsgemäß mindestens zwei, vorteilhafterweise aber mehr als zwei, beispielsweise 2 bis 100, 3 bis 90, 3 bis 60, 5 bis 55 Zusammensetzungen aufgebracht werden, von denen zumindest zwei, vorzugsweise drei Zusammensetzungen hinsichtlich des Gesamtpolymergehalts und der Vernetzbarkeit gegensätzlich unterschiedlich zueinander ausgeführt sind. Erfindungsgemäß ist es daher von Bedeutung, dass sich durch die unterschiedliche Ausgestaltung von zumindest zwei, vorzugsweise drei aufgebrachten Zusammensetzungen eine zonale Strukturierung ergibt. Erfindungsgemäß bevorzugt wird die gegensätzliche Änderung der zumindest zwei voneinander abweichenden aufgebrachten Zusammensetzungen durch Änderung der Identität und Menge mindestens einer Spezies ausgewählt aus den Gruppen A und B erreicht.In a preferred embodiment, at least two, but advantageously more than two, for example 2 to 100, 3 to 90, 3 to 60, 5 to 55 compositions can be applied according to the invention, of which at least two, preferably three, compositions differ in terms of total polymer content and crosslinkability executed to each other. It is therefore important in accordance with the invention that zonal structuring results from the different design of at least two, preferably three, applied compositions. Preferably, according to the invention, the opposite change of the at least two divergent applied compositions is achieved by changing the identity and amount of at least one species selected from Groups A and B.

Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei mindestens eine der Komponenten aus den Gruppen A und B in mindestens zwei unterschiedlichen Modifikationsgraden, das heißt in zwei unterschiedlichen Spezies, vorliegt. Insbesondere weist dabei eine Spezies einen höheren und eine Spezies einen niedrigeren Modifizierungsgrad auf. Bevorzugt liegt mindestens eine Komponente aus der Gruppe A in mindestens einem höheren und einem niedrigeren Modifizierungsgrad vor. Bevorzugt liegt mindestens eine Komponente aus Gruppe B in mindestens einem höheren und einem niedrigeren Modifizierungsgrad vor. Bevorzugt liegen mindestens eine Komponente aus der Gruppe A und mindestens eine Komponente aus der Gruppe B in jeweils mindestens einem höheren und einem niedrigeren Modifizierungsgrad vor. Erfindungsgemäß werden die Komponenten aus den Gruppen A und B mit A und B bezeichnet, wobei die hinter der Komponentenbezeichnung geführten numerischen Indizes anzeigen, in welcher Spezies die jeweilige Komponente der Gruppen A und B vorliegt. Werden für eine Spezies aus den Gruppen A und B zwei unterschiedliche numerische Indizes geführt, so liegt diese Komponente in zwei unterschiedlichen Spezies mit voneinander abweichenden Modifizierungsgraden vor. Erfindungsgemäß liegt mindestens eine der Komponenten aus den Gruppen A und B in zwei unterschiedlichen Spezies, das heißt in zwei voneinander abweichenden, also unterschiedlichen, Modifizierungsgraden vor.The present invention accordingly relates to a process according to the invention, wherein at least one of the components from groups A and B is present in at least two different degrees of modification, that is to say in two different species. In particular, one species has a higher and one species a lower degree of modification. Preferably, at least one component from group A is present in at least one higher and one lower degree of modification. Preferably, at least one component of group B is present in at least one higher and one lower degree of modification. At least one component from group A and at least one component from group B are preferably present in each case in at least one higher and one lower degree of modification. According to the invention, the components from the groups A and B are denoted by A and B, wherein the numerical indices run behind the component designation indicate in which species the particular component of the groups A and B is present. If two different numerical indices are carried out for a species from groups A and B, this component is present in two different species with different degrees of modification. According to the invention, at least one of the components from groups A and B is present in two different species, that is to say in two different, ie different, degrees of modification.

Erfindungsgemäß wird vorgesehen, dass aus den in Verfahrensschritt a) bereitgestellten Komponenten eine erste Zusammensetzung hergestellt wird, die in Schritt b) auf das mindestens eine Substrat aufgebracht und vernetzt wird. Gleichzeitig oder anschließend wird aus den in Verfahrensschritt a) bereitgestellten mindestens drei Komponenten mindestens eine weitere Zusammensetzung hergestellt und auf die in Verfahrensschritt b) auf das Substrat aufgebrachte und vernetzte erste Zusammensetzung aufgebracht und optional vernetzt, und wobei in optionalen weiteren Verfahrensschritten aus den in Verfahrensschritt a) bereitgestellten mindestens drei Komponenten weitere Zusammensetzungen hergestellt und auf die auf dem Substrat bereits aufgebrachten und optional vernetzten Zusammensetzungen aufgebracht und vernetzt werden. Dabei ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass mindestens eine der weiteren Zusammensetzungen in Schritt c) dadurch gekennzeichnet ist, dass in Bezug auf die jeweils vorherige Zusammensetzung der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit der mindestens einen weiteren Zusammensetzung durch Änderung der Menge und Identität mindestens einer Spezies ausgewählt aus den Gruppen A und B gegensätzlich zueinander verändert sind. Dies kann erfindungsgemäß dadurch erreicht werden, dass aus den in Verfahrensschritt a) bereitgestellten Komponenten für die mindestens eine weitere Zusammensetzung Spezies aus den Gruppen A und B ausgewählt und in einer Menge eingesetzt werden, so dass sich die mindestens eine weitere Zusammensetzung von der bereits zuvor aufgebrachten Zusammensetzung dadurch auszeichnet, dass deren Gesamtpolymergehalt und deren Vernetzbarkeit gegensätzlich zueinander verändert sind. So ist es erfindungsgemäß möglich, in der mindestens einen weiteren Zusammensetzung eine Spezies mit einem bestimmten Modifizierungsgrad entweder teilweise oder vollständig durch eine Spezies mit abweichenden Modifizierungsgrad zu ersetzen. Wird dadurch die Vernetzbarkeit der mindestens einen weiteren Zusammensetzung in Bezug auf die vorherig aufgebrachte Zusammensetzung erniedrigt, so muss in der Zusammensetzung erfindungsgemäß gleichzeitig eine Erhöhung des Gesamtpolymergehalts erfolgen. Wird durch das teilweise oder vollständige Ersetzen einer Spezies mit einem bestimmten Modifizierungsgrad durch eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad die Vernetzbarkeit der mindestens einen weiteren Zusammensetzung in Bezug auf die vorherig aufgebrachte Zusammensetzung erhöht, so muss entsprechend in der Zusammensetzung erfindungsgemäß gleichzeitig eine Erniedrigung des Gesamtpolymergehalts erfolgen.According to the invention, it is provided that from the components provided in process step a), a first composition is produced, which is applied to the at least one substrate in step b) and crosslinked. Simultaneously or subsequently, at least one further composition is prepared from the at least three components provided in process step a) and applied and crosslinked to the first composition applied to the substrate in step b) and optionally crosslinked, and wherein in optional further process steps from the process step a ) prepared at least three components further compositions and applied to the already applied to the substrate and optionally crosslinked compositions and crosslinked. It is provided according to the invention that at least one of the further compositions in step c) is characterized in that with respect to the respective previous composition, the total polymer content and the crosslinkability of the at least one further composition by changing the amount and identity of at least one species selected from the groups A and B are changed in opposition to each other. This can be achieved according to the invention by selecting species from groups A and B from the components provided in process step a) for the at least one further composition and using them in an amount such that the at least one further composition is of the type previously applied Composition characterized in that the total polymer content and their crosslinkability are changed in opposite to each other. Thus, it is possible according to the invention to replace in the at least one further composition a species with a certain degree of modification either partially or completely by a species with a different degree of modification. If this lowers the crosslinkability of the at least one further composition with respect to the previously applied composition, then, according to the invention, an increase in the total polymer content must occur simultaneously in the composition. If the crosslinkability of the at least one further composition in relation to the previously applied composition is increased by the partial or complete replacement of a species with a certain degree of modification by a species with a different degree of modification, it is accordingly necessary to simultaneously reduce the total polymer content in the composition.

Durch die abweichende Zusammensetzung der mindestens einen aufgebrachten weiteren Zusammensetzung in Verfahrensschritt c) kann gezielt eine zonale Strukturierung bereitgestellt werden, die sich dadurch auszeichnet, dass der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit von der mindestens einen aufgebrachten Zusammensetzung zu der mindestens einen weiteren abweichenden Zusammensetzung durch teilweises oder vollständiges Ersetzen mindestens einer Spezies durch eine Spezies mit verändertem Modifizierungsgrad gegensätzlich zueinander verändert sind, wodurch die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene zonal strukturierte biomimetische Knorpelmatrix von Zone zu Zone eine gleichgerichtete Änderung von Festigkeit und Quellbarkeit aufweist, wie es von natürlich vorkommendem Gelenkknorpel bekannt ist. Due to the deviating composition of the at least one applied further composition in process step c), a zonal structuring can be provided which is characterized in that the total polymer content and the crosslinkability of the at least one applied composition to the at least one further deviating composition by partial or complete Replacement of at least one species by a modified-modification species is altered in opposite directions, whereby the zonally-structured biomimetic cartilage matrix obtained by the method of the invention exhibits a rectified change in strength and swellability as known from naturally occurring articular cartilage.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in Schritt c) die Vernetzbarkeit der Zusammensetzung durch vollständiges Ersetzen mindestens einer Spezies mit einem bestimmten Modifizierungsgrad durch mindestens eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad verändert.In a further embodiment of the present invention, in step c) the crosslinkability of the composition is changed by completely replacing at least one species with a certain degree of modification by at least one species with a different degree of modification.

Bevorzugt ist die mindestens eine Spezies, die durch mindestens eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad vollständig ersetzt wird, mindestens ein Kollagenderivat, bevorzugt mindestens ein Gelatinederivat.Preferably, the at least one species, which is completely replaced by at least one species with a different degree of modification, at least one collagen derivative, preferably at least one gelatin derivative.

Bevorzugt ist die mindestens eine Spezies, die durch mindestens eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad vollständig ersetzt wird, mindestens ein Glykosaminoglykanderivat, bevorzugt mindestens ein Chondroitinsulfatderivat, bevorzugt mindestens ein Hyaluronsäurederivat.Preferably, the at least one species, which is completely replaced by at least one species with a different degree of modification, at least one Glykosaminoglykanderivat, preferably at least one Chondroitinsulfatderivat, preferably at least one Hyaluronsäurederivat.

Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei in Schritt c) die Vernetzbarkeit der Zusammensetzung durch teilweises Ersetzen mindestens einer Spezies mit einem bestimmten Modifizierungsgrad durch mindestens eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad verändert ist.In a preferred embodiment, the present invention relates to a process according to the invention, wherein in step c) the crosslinkability of the composition is modified by partial replacement of at least one species with a certain degree of modification by at least one species with a different degree of modification.

Bevorzugt ist die mindestens eine Spezies, die durch mindestens eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad teilweise ersetzt wird, mindestens ein Kollagenderivat, bevorzugt mindestens ein Gelatinederivat.Preferably, the at least one species partially replaced by at least one species of differing degree of modification is at least one collagen derivative, preferably at least one gelatin derivative.

Bevorzugt ist die mindestens eine Spezies, die durch mindestens eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad teilweise ersetzt wird, mindestens ein Glykosaminoglykanderivat, bevorzugt mindestens ein Chondroitinsulfatderivat, bevorzugt mindestens ein Hyaluronsäurederivat.Preferably, the at least one species partially replaced by at least one species of differing degree of modification is at least one glycosaminoglycan derivative, preferably at least one chondroitin sulfate derivative, preferably at least one hyaluronic acid derivative.

Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte biomimetische Knorpelmatrix zeichnet sich insbesondere vorteilhafterweise dadurch aus, dass sie insbesondere unter physiologischen Temperaturen, insbesondere bei ungefähr 37°C, thermo-irreversibel ist und eine biomimetische zonale Strukturierung mit gleichgerichteten Gradienten der Festigkeit und der Quellbarkeit aufweist. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten mindestens zwei Zusammensetzungen können bevorzugt für die Verarbeitung bei Temperaturen unter und bei 37°C in additiven Auftragungsverfahren, insbesondere Druck- oder Pipettierverfahren, insbesondere Druckverfahren, insbesondere in einem Tintenstrahldruckverfahren, insbesondere in einem „Tropfen auf Verlangen“-Tintenstrahldruckverfahren („drop on demand ink jet“), insbesondere in einem pneumatischen oder extrusion-basierten Dispensierverfahren, verwendet werden. Insbesondere härten die Zusammensetzungen erst nach dem Aufbringen auf mindestens ein Substrat zu einer stabilen, irreversiblen, bevorzugt thermo-irreversiblen biomimetischen Knorpelmatrix aus.The biomimetic cartilage matrix produced according to the method of the invention is particularly advantageously characterized in that it is thermo-irreversible, in particular at physiological temperatures, in particular at approximately 37 ° C., and has biomimetic zonal structuring with rectified gradients of strength and swellability. The at least two compositions used in the process according to the invention may preferably be used for processing at temperatures below and at 37 ° C. in additive application processes, in particular printing or pipetting processes, in particular printing processes, in particular in an ink-jet printing process, in particular in a drop-on-demand inkjet printing process (US Pat. Drop on demand ink jet), in particular in a pneumatic or extrusion-based dispensing method. In particular, the compositions cure only after application to at least one substrate to a stable, irreversible, preferably thermo-irreversible biomimetic cartilage matrix.

Die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen wurden in die verwendeten Komponenten, insbesondere Kollagen, bevorzugt Gelatine, und die Glykosaminoglykane, insbesondere nicht strukturell modifiziertes Kollagen, bevorzugt nicht strukturell modifizierte Gelatine, und nicht strukturell modifizierte Glykosaminoglykane, durch geeignete chemische Reaktion mit den funktionellen Gruppen der Komponenten, insbesondere des Kollagens, bevorzugt Gelatine, und Glykosaminoglykane, insbesondere nicht strukturell modifiziertes Kollagen, bevorzugt nicht strukturell modifizierte Gelatine, und nicht strukturell modifizierte Glykosaminoglykane, insbesondere durch Addition oder Substitution, eingeführt.The artificially introduced crosslinkable groups were incorporated into the components used, in particular collagen, preferably gelatin, and the glycosaminoglycans, in particular non-structurally modified collagen, preferably non-structurally modified gelatin, and non-structurally modified glycosaminoglycans, by suitable chemical reaction with the functional groups of the components, in particular collagen, preferably gelatin, and glycosaminoglycans, in particular non-structurally modified collagen, preferably non-structurally modified gelatin, and non-structurally modified glycosaminoglycans, in particular by addition or substitution.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mindestens eine vernetzbare Glykosaminoglykanderivat aus der Gruppe B ausgewählt aus Hyaluronsäurederivate, Heparinderivate, Heparinsulfatderivate, Chondroitinsulfatderivate, Dermatansulfatderivate und Keratansulfatderivate. Bevorzugt ist das mindestens eine vernetzbare Glykosaminoglykanderivat aus der Gruppen B ausgewählt aus Chondroitinsulfatderivate und Hyaluronsäurederivate.In a preferred embodiment of the present invention, the group B at least one crosslinkable glycosaminoglycan derivative is selected from hyaluronic acid derivatives, heparin derivatives, heparin sulfate derivatives, chondroitin sulfate derivatives, dermatan sulfate derivatives and keratan sulfate derivatives. The at least one crosslinkable glycosaminoglycan derivative from groups B is preferably selected from chondroitin sulfate derivatives and hyaluronic acid derivatives.

Die artifiziell einzuführenden vernetzbaren Gruppen oder artifiziell einzuführenden nicht-vernetzbaren Gruppen können erfindungsgemäß entweder direkt oder über eine molekulare Spacergruppe (Abstandshalter) an das Kollagen, bevorzugt die Gelatine, oder das Glykosaminoglykan gebunden werden. Die Ankopplung erfolgt über Standardchemie an die funktionellen Gruppen der Aminosäurereste des Kollagens, bevorzugt der Gelatine, oder die funktionellen Gruppen der Glykosaminoglykane. Die Spacergruppe kann bevorzugt an ihrem Ende, das nicht für die Kopplung an die funktionellen Gruppen vorgesehen ist, die artifiziell einzuführende vernetzbare Gruppe oder die artifiziell einzuführende nicht-vernetzbare Gruppe tragen oder diese wird in einem zweiten Schritt ebenfalls mittels Standardchemie an die Spacergruppe gekoppelt. Bevorzugt werden einseitig geschützte Spacergruppen verwendet. According to the invention, the crosslinkable groups or artificially introduced non-crosslinkable groups to be introduced in an artificially bound form can be bound either directly or via a molecular spacer group (spacers) to the collagen, preferably the gelatin, or the glycosaminoglycan. The coupling takes place via standard chemistry to the functional groups of the amino acid residues of the collagen, preferably the gelatin, or the functional groups of the glycosaminoglycans. The spacer group may preferably carry at its end, which is not intended for coupling to the functional groups, the artificially introduced crosslinkable group or the noncrosslinking group to be introduced in an optional manner, or it is also coupled to the spacer group in a second step by standard chemistry. Preference is given to using unilaterally protected spacer groups.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung tragen die in Schritt a) bereitgestellten mindestens drei Komponenten mit artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen Spacergruppen zwischen den funktionellen Gruppen des Kollagens, bevorzugt der Gelatine, insbesondere nicht strukturell modifiziertes Kollagen, bevorzugt nicht strukturell modifizierte Gelatine, und/oder den funktionellen Gruppen der Glykosaminoglykane, insbesondere nicht strukturell modifizierte Glykosaminoglykane, und den artifiziell eingeführten vernetzbaren funktionellen Gruppen und/oder den artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren Gruppen.In a preferred embodiment of the present invention, the at least three components with artificially introduced crosslinkable groups provided in step a) carry spacer groups between the functional groups of the collagen, preferably gelatin, in particular non-structurally modified collagen, preferably non-structurally modified gelatin, and / or the functional groups of the glycosaminoglycans, in particular non-structurally modified glycosaminoglycans, and the artificially introduced crosslinkable functional groups and / or the artificially introduced non-crosslinkable groups.

Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Spacergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituierten und nicht-substituierten kurz- oder langkettigen Alkylgruppen, Aromaten, substituierten und nicht-substituierten Oligoethylenglycolgruppen und substituierten und nicht-substituierten Polyethylenglycolgruppen.The present invention relates, in a preferred embodiment, to a process according to the invention wherein the spacer group is selected from the group consisting of substituted and unsubstituted short or long chain alkyl groups, aromatics, substituted and unsubstituted oligoethylene glycol groups and substituted and unsubstituted polyethylene glycol groups.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Spacergruppen ausgewählt aus kurz- oder langkettigen Alkylgruppen, insbesondere mit Kohlenwasserstoffketten von C₁-C₃₀, bevorzugt C₁-C₂₀, bevorzugt C₁-C₁₅, bevorzugt C₅-C₃₀ und modifizierten oder unmodifizierten Oligo- und Polyethylenglycolgruppen R-[O-CH₂-CH₂]_n-R, wobei n = 1 < n < 40, bevorzugt 1 < n < 20, bevorzugt 3 < n < 40, bevorzugt 3 < n < 20 ist.In a preferred embodiment of the present invention, the spacer groups are selected from short- or long-chain alkyl groups, in particular with hydrocarbon chains of C ₁ -C ₃₀ , preferably C ₁ -C ₂₀ , preferably C ₁ -C ₁₅ , preferably C ₅ -C ₃₀ and modified or unmodified oligo- and polyethylene glycol groups R- [O-CH ₂ -CH ₂ ] _n -R, where n = 1 <n <40, preferably 1 <n <20, preferably 3 <n <40, preferably 3 <n <20 is.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe des mindestens einen Kollagenderivats, bevorzugt Gelatinederivats aus der Gruppe A und des mindestens einen Glykosaminoglykanderivats aus der Gruppe B ausgewählt aus Gruppe 1, bestehend aus Maleinimidgruppe und C-C-Doppelbindung, insbesondere Methacrylgruppe, Acrylgruppe, Maleinimidgruppe, Allylgruppe und Vinylgruppe, bevorzugt Methacrylgruppe und Acrylgruppe, bevorzugt Methacrylgruppe oder aus Gruppe 2, bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the at least one artificially introduced crosslinkable group of the at least one collagen derivative, preferably gelatin derivative from group A and the at least one glycosaminoglycan derivative from group B is selected from group 1 consisting of maleimide group and CC double bond, in particular Methacryl group, acrylic group, maleimide group, allyl group and vinyl group, preferably methacrylic group and acrylic group, preferably methacrylic group or from group 2, consisting of azide group, CC double bond, CC triple bond, aldehyde group, ketone group, imine group, thioketone group, thiol group, CN triple bond and diene group.

In besonders bevorzugter Ausführungsform ist die mindestens eine artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe des mindestens einen Kollagenderivats, bevorzugt Gelatinederivats, aus Gruppe A und des mindestens einen Glykosaminoglykanderivats aus der Gruppe B eine C-C-Doppelbindung ausgewählt aus Methacrylgruppe und Acrylgruppe.In a particularly preferred embodiment, the at least one artificially introduced crosslinkable group of the at least one collagen derivative, preferably gelatin derivative, from group A and the at least one glycosaminoglycan derivative from group B is a C-C double bond selected from methacrylic group and acrylic group.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist mindestens eine, vorzugsweise zwei, vorzugsweise drei, vorzugsweise vier, vorzugsweise alle der in Schritt a) bereitgestellten Komponenten zusätzlich zu der mindestens einen artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppe mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare Gruppe auf. Bevorzugt ist die mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare Gruppe ausgewählt aus Halogen, Aldehyd, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl, wobei wenn die artifiziell eingeführte vernetzbaren Gruppe eine Diengruppe ist, die nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt wird aus Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxyaryl. Durch die Einführung von nicht-vernetzbaren Gruppen ist es zum Beispiel vorteilhafterweise möglich, die Viskosität der Zusammensetzung zu regulieren.In a further preferred embodiment of the present invention, at least one, preferably two, preferably three, preferably four, preferably all of the components provided in step a) have at least one artificially introduced non-crosslinkable group in addition to the at least one artificially introduced crosslinkable group. Preferably, the at least one artificially introduced non-crosslinkable group is selected from halogen, aldehyde, alkyl, haloalkyl, heteroalkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, heteroarylalkyl, arylheteroalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkoxyaryl, and acyl, where those introduced artificially crosslinkable group is a diene group, the non-crosslinkable functional group is selected from halogen, alkyl, haloalkyl, heteroalkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, heteroarylalkyl, arylheteroalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl and alkoxyaryl. For example, by introducing non-crosslinkable groups, it is advantageously possible to control the viscosity of the composition.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Alkyl ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, bevorzugt Methyl, bevorzugt Ethyl, bevorzugt Propyl, bevorzugt Butyl.In a preferred embodiment of the present invention, the alkyl is a methyl, ethyl, propyl, butyl, preferably methyl, preferably ethyl, preferably propyl, preferably butyl.

In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Heteroalkyl ein O-substituiertes Heteroalkyl, bevorzugt ein Si-substituiertes Heteroalkyl, bevorzugt ein P-substituiertes Heteroalkyl.In a particular embodiment of the present invention, the heteroalkyl is an O-substituted heteroalkyl, preferably an Si-substituted heteroalkyl, preferably a P-substituted heteroalkyl.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Heterocycloalkyl ein O-substituiertes Heterocycloalkyl, bevorzugt ein Si-substituiertes Heterocycloalkyl, bevorzugt ein P-substituiertes Heterocycloalkyl. In a preferred embodiment of the present invention, the heterocycloalkyl is an O-substituted heterocycloalkyl, preferably an Si-substituted heterocycloalkyl, preferably a P-substituted heterocycloalkyl.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Heteroaryl ein O-substituiertes Heteroaryl, bevorzugt ein Si-substituiertes Heteroaryl, bevorzugt ein P-substituiertes Heteroaryl.In a preferred embodiment of the present invention, the heteroaryl is an O-substituted heteroaryl, preferably an Si-substituted heteroaryl, preferably a P-substituted heteroaryl.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Heteroarylalkyl ein O-substituiertes Heteroarylalkyl, bevorzugt ein Si-substituiertes Heteroarylalkyl, bevorzugt ein P-substituiertes Heteroarylalkyl.In a preferred embodiment of the present invention, the heteroarylalkyl is an O-substituted heteroarylalkyl, preferably an Si-substituted heteroarylalkyl, preferably a P-substituted heteroarylalkyl.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Arylheteroalkyl ein O-substituiertes Arylheteroalkyl, bevorzugt ein Si-substituiertes Arylheteroalkyl, bevorzugt ein P-substituiertes Arylheteroalkyl.In a preferred embodiment of the present invention, the aryl heteroalkyl is an O-substituted aryl heteroalkyl, preferably an Si-substituted aryl heteroalkyl, preferably a P-substituted aryl heteroalkyl.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die artifiziell eingeführten funktionellen Gruppen substituiert.In a preferred embodiment, the artificially introduced functional groups are substituted.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen substituiert.In a preferred embodiment, the artificially introduced crosslinkable groups are substituted.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Acyl ein Acetyl.In a preferred embodiment of the present invention, the acyl is an acetyl.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren Gruppen Methylgruppen und/oder Acetylgruppen, bevorzugt Acetylgruppen.In a preferred embodiment of the present invention, the artificially introduced non-crosslinkable groups are methyl groups and / or acetyl groups, preferably acetyl groups.

Erfindungsgemäß werden die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten mit artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen und mit artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren Gruppen eingesetzt, um zu erlauben, unabhängig voneinander das Gelierverhalten der Zusammensetzung durch „Maskieren“ der funktionellen Gruppen der Komponenten zu vermindern und den Vernetzungsgrad einzustellen. Dazu wird die benötigte Menge an artifiziellen vernetzbaren Gruppen an die funktionellen Gruppen der Komponenten eingeführt, um den Vernetzungsgrad, das heißt die gewünschte Festigkeit der kovalent vernetzten Hydrogele einzustellen. Zusätzlich werden weitere funktionelle Gruppen der Komponenten, bevorzugt des mindestens einen Kollagenderivats, bevorzugt Gelatinederivats, mit artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen maskiert, um die Viskosität der Zusammensetzung zu erniedrigen und das Gelieren bei niedrigen Temperaturen, z.B. bei Raumtemperatur und hohen Feststoffgehalten (10 Gew.-% bis 30 Gew.-%) zu verhindern.According to the invention, the components with artificially introduced crosslinkable groups and with artificially introduced non-crosslinkable groups provided in step a) are used in order to independently reduce the gelling behavior of the composition by "masking" the functional groups of the components and to adjust the degree of crosslinking. For this purpose, the required amount of artificial crosslinkable groups is introduced to the functional groups of the components in order to adjust the degree of crosslinking, ie the desired strength of the covalently crosslinked hydrogels. In addition, further functional groups of the components, preferably of the at least one collagen derivative, preferably gelatin derivative, are masked with artificially introduced non-crosslinkable functional groups to lower the viscosity of the composition and gelling at low temperatures, e.g. at room temperature and high solids contents (10 wt .-% to 30 wt .-%) to prevent.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die artifiziell einzuführenden vernetzbaren Gruppen und/oder Spacergruppen durch chemische Reaktion an die funktionellen Gruppen der verwendeten Komponenten eingeführt. Bevorzugt findet dabei eine Addition an die oder Substitution der funktionellen Gruppen der verwendeten Komponenten statt.In a preferred embodiment, the artificially introduced crosslinkable groups and / or spacer groups are introduced by chemical reaction to the functional groups of the components used. In this case, preference is given to an addition to or substitution of the functional groups of the components used.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die artifiziell einzuführenden vernetzbaren Gruppen an die funktionellen Gruppen der zuvor eingebrachten Spacergruppen chemisch gekoppelt, bevorzugt addiert.In a preferred embodiment of the present invention, the artificially introduced crosslinkable groups are chemically coupled to the functional groups of the previously introduced spacer groups, preferably added.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die artifiziell einzuführenden nicht-vernetzbaren Gruppen und/oder Spacergruppen durch chemische Reaktion an die funktionellen Gruppen der verwendeten Komponenten eingeführt. Bevorzugt findet dabei eine Addition an die oder Substitution der funktionellen Gruppen der verwendeten Komponenten statt.In a preferred embodiment, the artificially introduced non-crosslinkable groups and / or spacer groups are introduced by chemical reaction to the functional groups of the components used. In this case, preference is given to an addition to or substitution of the functional groups of the components used.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die artifiziell einzuführenden nicht-vernetzbaren Gruppen an die funktionellen Gruppen der zuvor eingebrachten Spacergruppen chemisch gekoppelt, bevorzugt addiert.In a preferred embodiment of the present invention, the artificially introduced non-crosslinkable groups are chemically coupled to the functional groups of the previously introduced spacer groups, preferably added.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten genau eine Art von artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen auf. Bevorzugt weisen die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe, bevorzugt allein, Methacrylatgruppen auf. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppen, bevorzugt allein, Acrylatgruppen auf.In a preferred embodiment of the present invention, the components provided in step a) have exactly one kind of artificially introduced crosslinkable groups. Preferably, the in step a) provided components as artificially introduced crosslinkable group, preferably alone, methacrylate groups. In a preferred embodiment of the present invention, the components provided in step a) have acrylate groups as artificially introduced crosslinkable groups, preferably alone.

In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten mindestens zwei, insbesondere drei, insbesondere vier unterschiedliche artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppen auf. Bevorzugt weisen die unterschiedlichen in Schritt a) bereitgestellten Komponenten unterschiedliche artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppen auf, welche miteinander kompatibel sind, das heißt, welche untereinander zur Ausbildung mindestens einer kovalenten Bindung mit den artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen der anderen Komponenten fähig sind.In a preferred embodiment, the components provided in step a) have at least two, in particular three, in particular four different, artificially introduced crosslinkable groups. Preferably, the different components provided in step a) have different artificially introduced crosslinkable groups which are compatible with each other, that is, which are capable of forming at least one covalent bond with the artificially introduced crosslinkable groups of the other components.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Anzahl der vernetzbaren Gruppen, insbesondere Methacrylgruppen pro Gramm Gelatine von 0,1 mmol/g bis 4,0 mmol/g, bevorzugt 0,2 mmol/g bis 2,0 mmol/g, bevorzugt 0,3 mmol/g bis 1,8 mmol/g.In a preferred embodiment, the number of crosslinkable groups, especially methacrylic groups, per gram of gelatin is from 0.1 mmol / g to 4.0 mmol / g, preferably 0.2 mmol / g to 2.0 mmol / g, preferably 0.3 mmol / g to 1.8 mmol / g.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Modifizierung mit vernetzbaren Gruppen der mindestens zwei vernetzbaren Glykosaminoglykane in Bezug auf die vorhandenen Disaccharideinheiten 5% bis 200%, bevorzugt 10% bis 180%, bevorzugt 10% bis 150%.In a preferred embodiment, the modification with crosslinkable groups of the at least two crosslinkable glycosaminoglycans with respect to the disaccharide units present is 5% to 200%, preferably 10% to 180%, preferably 10% to 150%.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die mindestens drei Komponenten mit artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen, wobei die Komponenten mindestens ein vernetzbares Kollagenderivat, bevorzugt Gelatinederivat aus der Gruppe A und mindestens ein vernetzbares Glykosaminoglykanderivat aus der Gruppe B umfassen, bevorzugt zusammen mit einer Fotoinitiator-Komponente, in einem wässrigen oder organischen Medium bereitgestellt. Die so erhaltene Zusammensetzung ist bevorzugt ein flüssiges Medium, insbesondere eine Suspension oder Lösung, die in Schritt b) auf das mindestens eine Substrat oder in Schritt c) auf die jeweils vorherige Zusammensetzung aufgebracht wird.In a preferred embodiment of the present invention, the at least three components with artificially introduced crosslinkable groups, the components comprising at least one crosslinkable collagen derivative, preferably Group A gelatin derivative and at least one Group B crosslinkable glycosaminoglycan derivative, preferably together with a photoinitiator component , provided in an aqueous or organic medium. The composition thus obtained is preferably a liquid medium, in particular a suspension or solution, which in step b) is applied to the at least one substrate or in step c) to the respective previous composition.

Die so erhaltene Zusammensetzung ist bevorzugt ein viskoses Medium, insbesondere eine Suspension oder Lösung, das in Schritt b) auf das mindestens eine Substrat oder in Schritt c) auf die jeweils vorherige Zusammensetzung aufgebracht wird.The composition thus obtained is preferably a viscous medium, in particular a suspension or solution, which in step b) is applied to the at least one substrate or in step c) to the respectively previous composition.

Die so erhaltene Zusammensetzung ist bevorzugt ein physikalisch gelierendes Medium, insbesondere eine Suspension oder Lösung, die in Schritt b) auf das mindestens eine Substrat oder in Schritt c) auf die jeweils vorherige Zusammensetzung aufgebracht wird.The composition thus obtained is preferably a physically gelling medium, in particular a suspension or solution which is applied in step b) to the at least one substrate or in step c) to the respectively previous composition.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Gesamtmenge des mindestens einen vernetzbaren Kollagenderivats, bevorzugt Gelatinederivats, aus der Gruppe A in den Zusammensetzungen konstant.In a preferred embodiment of the present invention, the total amount of the at least one crosslinkable collagen derivative, preferably gelatin derivative, from group A in the compositions is constant.

Die Erfindung sieht in einer Ausführungsform vor, dass in Verfahrensschritt b) die aufgebrachte Zusammensetzung unmittelbar nach dem Aufbringen vernetzt wird. Die Erfindung sieht in einer weiteren Ausführungsform vor, dass die in Verfahrensschritt b) aufgebrachte erste Zusammensetzung zusammen mit mindestens einer weiteren in Verfahrensschritt c) aufgebrachten Zusammensetzung gemeinsam vernetzt wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch vorgesehen, dass in Verfahrensschritt c) eine, zwei, drei oder viele weitere Zusammensetzungen aufgebracht werden, wobei vorgesehen sein kann, dass nach dem Aufbringen jeder einzelnen dieser weiteren Zusammensetzungen einen Vernetzung der Zusammensetzungen stattfindet oder aber ein einmaliger Vernetzungsschritt nach Aufbringen von mindestens zwei, bevorzugt drei, bevorzugt vier, bevorzugt fünf, bevorzugt sechs, bevorzugt sieben, bevorzugt acht, bevorzugt aller weiteren Zusammensetzungen erfolgt.The invention provides in one embodiment that in process step b) the applied composition is crosslinked immediately after application. In a further embodiment, the invention provides that the first composition applied in method step b) is crosslinked together with at least one further composition applied in method step c). According to the present invention, it is also provided that in process step c) one, two, three or many further compositions are applied, it being possible for crosslinking of the compositions to take place after the application of each of these further compositions or else a one-time crosslinking step Application of at least two, preferably three, preferably four, preferably five, preferably six, preferably seven, preferably eight, preferably all other compositions takes place.

Bevorzugt findet in Schritt b) oder in Schritt c) das Vernetzen einer ersten Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B auf das mindestens eine Substrat durch radikalische oder additive Initiierung, bevorzugt durch radikalische Initiierung, statt.Preferably, in step b) or in step c), the crosslinking of a first composition comprising at least one respective species from groups A and B to the at least one substrate takes place by free-radical or additive initiation, preferably by free-radical initiation.

Bevorzugt findet in Schritt c) das mindestens einmalige Vernetzen mindestens einer weiteren Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B auf die jeweils vorherige Zusammensetzung durch radikalische oder additive Initiierung, bevorzugt durch radikalische Initiierung, statt.In step c), preference is given to crosslinking at least one further composition comprising at least one species each of groups A and B to the respective previous composition by free-radical or additive initiation, preferably by free-radical initiation.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten in Schritt b) in Form einer ersten Zusammensetzung auf das mindestens eine Substrat aufgebracht und unter Verwendung eines Initiators, bevorzugt eines Fotoinitiators, bevorzugt eines UV-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines UVA-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines IR-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines thermischen Initiators, bevorzugt eines Redox-Initiators, in Schritt b) oder c), vernetzt, wenn die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen aus der Gruppe 1 ausgewählt sind.In a preferred embodiment of the present invention, the components provided in step a) are applied in step b) in the form of a first composition to the at least one substrate and using an initiator, preferably a photoinitiator, preferably a UV sensitive photoinitiator, preferably a UVA-sensitive photoinitiator, preferably an IR-sensitive photoinitiator, preferably a thermal initiator, preferably a redox initiator, in step b) or c), crosslinked, if the artificially introduced crosslinkable groups from group 1 are selected ,

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Vernetzen der Zusammensetzung in Schritt b) oder Schritt c) mittels elektromagnetischer Strahlung, Erwärmung oder mittels Redoxreaktion, falls die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe 1.In a preferred embodiment of the present invention, the crosslinking of the composition in step b) or step c) takes place by means of electromagnetic radiation, heating or by redox reaction, if the artificially introduced crosslinkable groups are selected from group 1.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten in Schritt c) in Form mindestens einer weiteren Zusammensetzung auf die jeweils vorherige Zusammensetzung aufgebracht und unter Verwendung eines Initiators, bevorzugt eines Fotoinitiators, bevorzugt eines UV-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines UVA-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines IR-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines thermischen Initiators, bevorzugt eines Redox-Initiators, in Schritt c) vernetzt, wenn die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen aus der Gruppe 1 ausgewählt sind.In a preferred embodiment of the present invention, the components provided in step a) are applied in the form of at least one further composition to the respective previous composition and using an initiator, preferably a photoinitiator, preferably a UV-sensitive photoinitiator, preferably one UVA-sensitive photoinitiator, preferably an IR-sensitive photoinitiator, preferably a thermal initiator, preferably a redox initiator, crosslinked in step c), when the artificially introduced crosslinkable groups from group 1 are selected.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Vernetzen in Schritt c) mittels elektromagnetischer Strahlung, Erwärmung oder mittels Redoxreaktion, falls die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe 1.In a preferred embodiment of the present invention, the crosslinking in step c) takes place by means of electromagnetic radiation, heating or by redox reaction, if the artificially introduced crosslinkable groups are selected from group 1.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten, wobei die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen mindestens einer Komponente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe und Thiolgruppe und die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen mindestens einer weiteren Komponente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, C-N-Dreifachbindung, Diengruppe, Thiolgruppe und Aminogruppe in Schritt b) in Form einer ersten Zusammensetzung auf das mindestens eine Substrat aufgebracht. Bevorzugt sind die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen mindestens einer Komponente fähig mit den artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen mindestens einer weiteren Komponente mittels einer Ringschlussreaktion oder ringfreien Reaktion mindestens eine kovalente Bindung auszubilden, insbesondere ohne die Zugabe eines Katalysators. Diese Art der Vernetzung wird auch „Klickchemie“ genannt.In a preferred embodiment of the present invention, the components provided in step a), wherein the artificially introduced crosslinkable groups of at least one component are selected from the group consisting of azide group, CC double bond, CC triple bond, aldehyde group, ketone group, imine group, thioketone group and Thiol group and the artificially introduced crosslinkable groups of at least one further component selected from the group consisting of CC double bond, CC triple bond, CN triple bond, diene group, thiol group and amino group in step b) applied in the form of a first composition on the at least one substrate , The artificially introduced crosslinkable groups of at least one component are preferably capable of forming at least one further covalent bond with the artificially introduced crosslinkable groups of at least one further component by means of a ring-closing reaction or ring-free reaction, in particular without the addition of a catalyst. This type of networking is also called "click chemistry."

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Vernetzen in Schritt b) oder c), falls mindestens eine artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe mindestens einer Komponente ausgewählt ist aus Gruppe 2 durch Aufbringen mindestens einer weiteren Komponente die mindestens eine artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe aus Gruppe 2 aufweist, die zu der mindestens einen artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppe der mindestens einen anderen Komponente komplementär ist.In a preferred embodiment of the present invention, the crosslinking in step b) or c) takes place if at least one artificially introduced crosslinkable group of at least one component is selected from group 2 by applying at least one further component having at least one artificially introduced crosslinkable group from group 2 which is complementary to the at least one artificially introduced crosslinkable group of the at least one other component.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Schritt a) bereitgestellten Komponenten, wobei die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen mindestens einer Komponente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe und Thiolgruppe und die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen mindestens einer weiteren Komponente ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, C-N-Dreifachbindung, Diengruppe, Thiolgruppe und Aminogruppe in Schritt c) in Form mindestens einer weiteren Zusammensetzung auf die jeweils vorherige Zusammensetzung aufgebracht. Bevorzugt sind die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen mindestens einer Komponente fähig mit den artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen mindestens einer weiteren Komponente der vorherig aufgebrachten Zusammensetzung mittels einer Ringschlussreaktion oder ringfreien Reaktion mindestens eine kovalente Bindung auszubilden, insbesondere ohne die Zugabe eines Katalysators. Diese Art der Vernetzung wird auch „Klickchemie“ genannt.In a preferred embodiment of the present invention, the components provided in step a), wherein the artificially introduced crosslinkable groups of at least one component are selected from the group consisting of azide group, CC double bond, CC triple bond, aldehyde group, ketone group, imine group, thioketone group and Thiol group and the artificially introduced crosslinkable groups of at least one further component are selected from the group consisting of CC double bond, CC triple bond, CN triple bond, diene group, thiol group and amino group in step c) in the form of at least one further composition to the respective previous composition applied. Preferably, the artificially introduced crosslinkable groups of at least one component are capable of forming at least one covalent bond with the artificially introduced crosslinkable groups of at least one further component of the previously applied composition by means of a ring closure reaction or non-ring reaction, especially without the addition of a catalyst. This type of networking is also called "click chemistry."

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Vernetzen in Schritt c), falls mindestens eine artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe mindestens einer Komponente ausgewählt ist aus Gruppe 2 durch Aufbringen mindestens einer weiteren Komponente die mindestens eine artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe aufweist, die zu der mindestens einen artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppe aus der Gruppe 2 der mindestens einen anderen Komponente komplementär ist.In a preferred embodiment of the present invention, the crosslinking in step c) takes place if at least one artificially introduced crosslinkable group of at least one component is selected from group 2 by applying at least one further component which has at least one artificially introduced crosslinkable group to at least one artificially introduced crosslinkable group from group 2 of the at least one other component is complementary.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zusammensetzungen eine Viskosität von maximal 20 mPas, insbesondere maximal 15 mPas, insbesondere maximal 10 mPas, insbesondere weniger als 20 mPas, bevorzugt weniger als 15 mPas, bevorzugt weniger als 10 mPas auf. Die genannten Viskositäten beziehen sich auf einen Temperaturbereich von 20°C bis 40°C. Bevorzugt liegt die Viskosität, bestimmt unter den vorgenannten Bedingungen, bei mindestens 1 mPas, vorzugsweise mindestens 2 mPas, insbesondere 3 mPas, vorzugsweise 4 mPas. Besonders bevorzugt liegt die Viskosität in einem Bereich von 1 bis 20 mPas, vorzugsweise 2 bis 20 mPas, insbesondere 4 bis 20 mPas.In a preferred embodiment of the present invention, the compositions used in the process according to the invention have a viscosity of not more than 20 mPas, in particular not more than 15 mPas, in particular not more than 10 mPas, in particular less than 20 mPas, preferably less than 15 mPas, preferably less than 10 mPas. The stated viscosities relate to a temperature range from 20 ° C to 40 ° C. The viscosity, determined under the abovementioned conditions, is preferably at least 1 mPas, preferably at least 2 mPas, in particular 3 mPas, preferably 4 mPas. The viscosity is particularly preferably in the range from 1 to 20 mPas, preferably from 2 to 20 mPas, in particular from 4 to 20 mPas.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zusammensetzungen eine Viskosität von mindestens 20 mPas auf. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Zusammensetzungen scherverdünnendes Verhalten und in Ruhe eine Viskosität zwischen 1 Pas und 100.000 Pas auf, bevorzugt 1-10.000 Pas, bevorzugt 1-1.000 Pas.In a preferred embodiment of the present invention, the compositions used in the process according to the invention have a viscosity of at least 20 mPas. In a preferred embodiment, the compositions shear-thinning behavior and at rest have a viscosity between 1 Pas and 100,000 Pas, preferably 1-10,000 Pas, preferably 1-1,000 Pas.

Bevorzugt wird die gewünschte Viskosität der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen durch die Bereitstellung von Komponenten mit artifiziell eingeführten vernetzbaren und artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren Gruppen in Schritt a) eingestellt.The desired viscosity of the compositions according to the invention is preferably set by the provision of components with artificially introduced crosslinkable and artificially introduced non-crosslinkable groups in step a).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen pH-Wert von 6 bis 8, bevorzugt 6,5 bis 7,5, bevorzugt 7 bis 7,4, bevorzugt 7,4.In a preferred embodiment of the present invention, the compositions according to the invention have a pH of 6 to 8, preferably 6.5 to 7.5, preferably 7 to 7.4, preferably 7.4.

Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Aufbringen und Vernetzen von Zusammensetzungen schichtweise erfolgt. Bevorzugt können eine oder mehrere Schichten einer Zusammensetzung auf das mindestens eine Substrat oder die jeweils vorherige Zusammensetzung aufgebracht werden.The present invention relates, in a preferred embodiment, to a method according to the invention, wherein the application and crosslinking of compositions takes place in layers. Preferably, one or more layers of a composition can be applied to the at least one substrate or the respective previous composition.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Vernetzung einer Schicht unmittelbar nach dem Aufbringen einer Zusammensetzung auf das mindestens eine Substrat in Schritt b) oder auf die jeweils vorherige Zusammensetzung in Schritt c) und somit vor dem Aufbringen der nächsten Zusammensetzung. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt zunächst das schichtweise Aufbringen der Zusammensetzungen auf das mindestens eine Substrat in Schritt b) oder die jeweils vorherige Zusammensetzung in Schritt c) und abschließend die Vernetzung der mindestens zwei aufgebrachten Schichten. Erfolgt die Vernetzung aller aufgetragenen Zusammensetzungen gemeinsam, so reagieren bevorzugt alle vernetzbaren Gruppen der Komponenten miteinander. Erfolgt das Vernetzen der aufgebrachten Zusammensetzungen schichtweise, so ist es erforderlich, dass ein Teil der vernetzbaren Gruppen nach dem Vernetzungsschritt für die Vernetzung mit der nächsten Zusammensetzung zur Verfügung steht. In diesen Fall reagiert zumindest ein Teil, insbesondere reagieren im Wesentlichen alle der vernetzbaren Gruppen der Komponenten miteinander.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the crosslinking of a layer takes place immediately after the application of a composition to the at least one substrate in step b) or to the respective previous composition in step c) and thus before the application of the next composition. In a further embodiment, the layers are first applied layer by layer to the at least one substrate in step b) or the respective previous composition in step c) and finally the crosslinking of the at least two applied layers. If the crosslinking of all applied compositions occurs together, then preferably all crosslinkable groups of the components react with one another. If the crosslinking of the applied compositions is carried out in layers, it is necessary that some of the crosslinkable groups after the crosslinking step be available for crosslinking with the next composition. In this case, at least one part reacts, in particular substantially all of the crosslinkable groups of the components react with one another.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt b) eine erste Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B, welche bevorzugt artifiziell eingeführte fotovernetzbare Gruppen aufweisen, zusammen mit einer Fotoinitiator-Komponente auf das mindestens eine Substrat aufgebracht, das während der Herstellung der biomimetischen Knorpelmatrix insbesondere stützend und/oder modellierend wirkt, und wobei die erste Zusammensetzung in Schritt b) oder c) durch elektromagnetische Strahlung vernetzt wird. In Schritt b) oder c) reagiert zumindest ein Teil, insbesondere im Wesentlichen alle, bevorzugt alle, der fotovernetzbaren Gruppen der Komponenten miteinander, wodurch ein chemisch vernetztes Material erhalten wird. Die Vernetzung in Schritt b) oder c) findet bevorzugt dergestalt statt, dass durch die elektromagnetische Strahlung die Fotoinitiator-Komponente, insbesondere durch Spaltung, angeregt wird, um die fotoinitiierte Reaktion, bevorzugt Polymerisationsreaktion, der insbesondere fotovernetzbaren Gruppen der Komponenten zu starten. Durch diese kontrollierte Kettenreaktion wird zumindest ein Teil, bevorzugt im Wesentlichen alle, vorzugsweise alle der in dem elektromagnetisch bestrahlten Bereich liegenden fotovernetzbaren Gruppen umgesetzt.In a preferred embodiment of the present invention, in step b) a first composition comprising at least one species from groups A and B, which preferably have artificially introduced photocrosslinkable groups, is applied to the at least one substrate together with a photoinitiator component in particular supporting and / or modeling the production of the biomimetic cartilage matrix, and wherein the first composition in step b) or c) is crosslinked by electromagnetic radiation. In step b) or c), at least a part, in particular substantially all, preferably all, of the photocrosslinkable groups of the components react with one another, whereby a chemically crosslinked material is obtained. The crosslinking in step b) or c) preferably takes place in such a way that the photoinitiator component, in particular by cleavage, is excited by the electromagnetic radiation in order to initiate the photoinitiated reaction, preferably polymerization reaction, of the particular photocrosslinkable groups of the components. By this controlled chain reaction, at least a part, preferably substantially all, preferably all of the photocrosslinkable groups lying in the electromagnetically irradiated area are reacted.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt c) mindestens eine weitere Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B, welche bevorzugt artifiziell eingeführte fotovernetzbare Gruppen aufweisen, zusammen mit einer Fotoinitiator-Komponente auf die jeweils vorherige Zusammensetzung aufgebracht, wobei die mindestens eine weitere Zusammensetzung in Schritt c) durch elektromagnetische Strahlung vernetzt wird. In Schritt c) reagiert zumindest ein Teil, insbesondere im Wesentlichen alle, bevorzugt alle, der fotovernetzbaren Gruppen der Komponenten miteinander, wodurch ein chemisch vernetztes Material erhalten wird. Die Vernetzung in Schritt c) findet bevorzugt dergestalt statt, dass durch die elektromagnetische Strahlung die Fotoinitiator-Komponente, insbesondere durch Spaltung, angeregt wird, um die fotoinitiierte Reaktion, bevorzugt Polymerisationsreaktion, der insbesondere fotovernetzbaren Gruppen der Komponenten zu starten. Durch diese kontrollierte Kettenreaktion wird zumindest ein Teil, bevorzugt im Wesentlichen alle, vorzugsweise alle der in dem elektromagnetisch bestrahlten Bereich liegenden fotovernetzbaren Gruppen umgesetzt.In a preferred embodiment of the present invention, in step c) at least one further composition comprising at least one species from groups A and B, which preferably have artificially introduced photocrosslinkable groups, together with a photoinitiator component applied to the respective previous composition, wherein the at least one further composition in step c) is crosslinked by electromagnetic radiation. In step c) at least a part, in particular substantially all, preferably all, of the photocrosslinkable groups of the components react with one another, whereby a chemically crosslinked material is obtained. The crosslinking in step c) preferably takes place in such a way that the photoinitiator component, in particular by cleavage, is excited by the electromagnetic radiation in order to initiate the photoinitiated reaction, preferably polymerization reaction, of the particular photocrosslinkable groups of the components. By this controlled chain reaction, at least a part, preferably substantially all, preferably all of the photocrosslinkable groups lying in the electromagnetically irradiated area are reacted.

In bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Aufbringen und Vernetzen der Zusammensetzungen kontinuierlich, das heißt nicht schichtweise, erfolgt. In a preferred embodiment, the present invention relates to a method according to the invention, wherein the application and crosslinking of the compositions is carried out continuously, that is not in layers.

Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei in den Schritten b) und/oder c) Zellen, insbesondere Knorpelzellen oder deren Vorläufer, in oder auf die sich bildende Knorpelmatrix eingebracht oder aufgebracht werden. Bevorzugt werden die Zellen, insbesondere Knorpelzellen oder deren Vorläufer, in den Schritten b) und/oder c) in die sich bildende Knorpelmatrix eingebracht. Bevorzugt werden die Zellen, insbesondere Knorpelzellen oder deren Vorläufer, in den Schritten b) und/oder c) auf die sich bildende Knorpelmatrix aufgebracht.In a preferred embodiment, the present invention relates to a method according to the invention, wherein in steps b) and / or c) cells, in particular cartilage cells or their precursors, are introduced or applied into or onto the forming cartilage matrix. The cells, in particular cartilage cells or their precursors, are preferably introduced into the forming cartilage matrix in steps b) and / or c). The cells, in particular cartilage cells or their precursors, are preferably applied to the forming cartilage matrix in steps b) and / or c).

Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Aufbringen der Zusammensetzungen in den Schritten b) und c) mittels additiver Auftragungsverfahren erfolgt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das additive Auftragungsverfahren ein Pipettierverfahren, bevorzugt ein Dispensierverfahren, bevorzugt ein Druckverfahren, insbesondere ein „Tropfen auf Verlangen“- („Drop-on-Demand“)-Tintenstrahl-Druckverfahren.The present invention relates in a preferred embodiment to a method according to the invention, wherein the application of the compositions in steps b) and c) takes place by means of additive application methods. In a particularly preferred embodiment, the additive application method is a pipetting method, preferably a dispensing method, preferably a printing method, in particular a "drop-on-demand" ink-jet printing method.

Bei Dispensierverfahren, vorliegend ein kontinuierliches Dispensierverfahren, wird bevorzugt Tinte durch eine Düse oder Kanüle befördert, indem ein Kolben mittels Drehen eines Gewindes oder durch Beaufschlagung von Druckluft kontrolliert in eine Tintenkartusche eingeführt wird und der Flüssigkeitsstrahl mit oder ohne das Öffnen oder Verschließen eines Ventils gestartet und gestoppt wird. Das Dispensierverfahren wird bevorzugt mit viskosen Flüssigkeiten, insbesondere > 20 mPas betrieben. Dagegen arbeiten Tintenstrahl-Druckverfahren, vorliegend Verfahren, bei denen durch Spannungsimpuls piezoelektrisch oder thermisch in einer Tintenkammer Einzeltropfen im Picoliter bis Nanoliterbereich erzeugt werden („Drop on Demand“) im Allgemeinen in einem Viskositätsbereich von < 20mPas.In dispensing methods, in the present case a continuous dispensing method, ink is preferably conveyed through a nozzle or cannula by controlled introduction of a piston into an ink cartridge by turning a thread or by pressurized air, and the liquid jet is started with or without the opening or closing of a valve is stopped. The dispensing method is preferably operated with viscous liquids, in particular> 20 mPas. On the other hand, ink-jet printing methods, in the present method, in which piezoelectrically or thermally in an ink chamber individual drops are produced in the picoliter to nanoliter range ("drop on demand") generally in a viscosity range of <20 mPas.

„Drop on Demand“-Tintenstrahl-Verfahren erreichen Auflösungen von weniger als 200 µm, bevorzugt weniger als 100 µm, während Dispersiertechniken im mm-Bereich operieren. Da Struktureinheiten in natürlichen Geweben - beispielsweise der Abstand zwischen zwei Blutkapillaren - im Submillimeterbereich liegen, ist es erforderlich, bevorzugt für den künstlichen Aufbau von Geweben und Organen, diese Fertigungsverfahren einzusetzen."Drop on demand" ink-jet processes achieve resolutions of less than 200 μm, preferably less than 100 μm, while dispersing techniques operate in the mm range. Since structural units in natural tissues - for example, the distance between two blood capillaries - lie in the submillimeter range, it is necessary, preferably for the artificial structure of tissues and organs, to use these manufacturing methods.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als Substrat, auf welches in Schritt b) die erste Zusammensetzung, umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B, aufgebracht und vernetzt wird, eine steife oder flexible Stützstruktur verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Stützstruktur eine Plastikfolie, Plastikfilm, Membran, Glas, Metall, Halbmetall, Verbundmaterial, Keramik, Flies oder Papier sein, vorzugsweise aus biokompatiblen und insbesondere bioabbaubaren Materialien.In a particularly preferred embodiment, the substrate to which in step b) the first composition comprising at least one species from groups A and B is applied and crosslinked is a rigid or flexible support structure. In a preferred embodiment, the support structure may be a plastic film, plastic film, membrane, glass, metal, semi-metal, composite, ceramic, tile or paper, preferably of biocompatible and especially biodegradable materials.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäß hergestellte biomimetische Knorpelmatrix von der Stützstruktur abgetrennt, insbesondere durch chemischen, physikalischen oder biologischen Abbau, und so eine biomimetische Knorpelmatrix ohne Stützstruktur erhalten.In a preferred embodiment, the biomimetic cartilage matrix produced according to the invention is separated from the support structure, in particular by chemical, physical or biological degradation, and thus obtained a biomimetic cartilage matrix without support structure.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine erfindungsgemäße biomimetische Knorpelmatrix hergestellt nach einem Verfahren zur Herstellung einer biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung gemäß der vorliegenden Erfindung.The present invention also relates to a biomimetic cartilage matrix according to the invention made by a method for producing a biomimetic cartilage matrix with zonal structuring according to the present invention.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Summe der Konzentrationen aller Kollagenderivate, bevorzugt Gelatinederivate, in jeder Zonen der biomimetischen Knorpelmatrix in einem Bereich von 2,5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, bevorzugt 3 Gew.-% bis 40 Gew.-%, bevorzugt 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bevorzugt 7,5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bevorzugt 10 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bevorzugt 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%.In a preferred embodiment of the present invention, the sum of the concentrations of all collagen derivatives, preferably gelatin derivatives, in each zone of the biomimetic cartilage matrix ranges from 2.5% to 50%, preferably from 3% to 40% Wt .-%, preferably 5 wt .-% to 30 wt .-%, preferably 7.5 wt .-% to 30 wt .-%, preferably 10 wt .-% to 30 wt .-%, preferably 10 wt. -% to 20 wt .-%.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Summe der Konzentrationen aller Glykosaminoglykanderivate in jeder Zone der biomimetischen Knorpelmatrix in einem Bereich von 0,1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, bevorzugt 0,1 Gew.-% bis 4,5 Gew.-%, bevorzugt 0,1 Gew.-% bis 4 Gew.-%, bevorzugt 0,5 Gew.-% bis 4 Gew.-%, 0,5 Gew.% bis 3 Gew.-%, bevorzugt 0,5 Gew.-% bis 2,5 Gew.-%.In a preferred embodiment of the present invention, the sum of the concentrations of all glycosaminoglycan derivatives in each zone of the biomimetic cartilage matrix ranges from 0.1% to 5%, preferably 0.1% to 4.5% Wt .-%, preferably 0.1 wt .-% to 4 wt .-%, preferably 0.5 wt .-% to 4 wt .-%, 0.5 wt .-% to 3 wt .-%, preferably 0 , 5 wt .-% to 2.5 wt .-%.

Die erfindungsgemäße biomimetische Knorpelmatrix, insbesondere hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, weist eine gleichgerichtete Veränderung von Festigkeit und Quellbarkeit innerhalb einer zonalen Strukturierung auf. In einer bevorzugten Ausführungsform nehmen Festigkeit und Quellbarkeit innerhalb der zonalen Strukturierung vom Substrat aus gesehen ab. In einer weiteren Ausführungsform nehmen Festigkeit und Quellbarkeit innerhalb der zonalen Strukturierung vom Substrat aus gesehen zu. In einer weiteren Ausführungsform nehmen Festigkeit und Quellbarkeit innerhalb der biomimetischen Knorpelmatrix zunächst zu und anschließend wieder ab. In einer weiteren Ausführungsform nehmen Festigkeit und Quellbarkeit innerhalb der biomimetischen Knorpelmatrix zunächst ab und anschließend wieder zu.The biomimetic cartilage matrix according to the invention, in particular produced by the method according to the invention, exhibits a rectified change of strength and swellability within a zonal structuring. In a preferred embodiment, strength and swellability increase within the zonal patterning seen from the substrate. In another embodiment, strength and swellability within the zonal patterning increases from the substrate. In another embodiment, strength and swellability within the biomimetic cartilage matrix initially increase and subsequently decrease. In another embodiment, strength and swellability within the biomimetic cartilage matrix first decrease and then re-increase.

In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung daher in einer Ausführungsform vor, dass vom Substrat aus gesehen die Festigkeit und Quellbarkeit zunimmt, indem in jeder weiteren Zusammensetzung, die gemäß Verfahrensschritt c) auf eine bereits aufgebrachte Zusammensetzung aufgebracht wird, in Bezug auf die vorherige Zusammensetzung der Gesamtpolymergehalt der aufgebrachten weiteren Zusammensetzung zu- und die Vernetzbarkeit abnimmt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, gemäß dem vom Substrat aus gesehen die Festigkeit und Quellbarkeit abnimmt, indem jede weitere Zusammensetzung, die gemäß Verfahrensschritt c) auf eine bereits aufgebrachte Zusammensetzung aufgebracht wird, einen im Vergleich zur vorher aufgebrachten Zusammensetzung geringeren Gesamtpolymergehalt und höhere Vernetzbarkeit aufweist. _Es ist auch offenbart, dass die beiden vorgenannten Verfahrensweisen miteinander kombiniert werden können.In a preferred embodiment, the invention therefore provides, in one embodiment, for the strength and swellability to be increased from the substrate, by virtue of the fact that in any further composition applied to an already applied composition according to method step c) with respect to the previous composition Total polymer content of the applied further composition and increases the crosslinkability decreases. In a further preferred embodiment, a method is provided according to which the strength and swellability decreases from the substrate, in that any further composition applied to an already applied composition according to method step c) has a lower total polymer content compared to the previously applied composition has higher crosslinkability. It is also disclosed that the two aforementioned methods can be combined with each other.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten biomimetischen Knorpelmatrices zur Herstellung, insbesondere zum Aufbau, künstlicher Gewebe oder Organe, z.B. Knorpel, insbesondere Gelenkknorpel, Implantate oder Transplantate oder zur Oberflächenfunktionalisierung verwendet werden.In a preferred embodiment of the present invention, the biomimetic cartilage matrices produced by the method according to the invention can be used for the manufacture, in particular for the construction, of artificial tissue or organs, e.g. Cartilage, in particular articular cartilage, implants or grafts or be used for surface functionalization.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die biomimetische Knorpelmatrix selbst ein künstliches Gewebe, ein künstliches Organ, ein Implantat, ein Transplantat oder ein Bestandteil einer dieser Komponenten sein.In a preferred embodiment of the present invention, the biomimetic cartilage matrix itself may be an artificial tissue, an artificial organ, an implant, a graft or a component of one of these components.

In einer bevorzugten Ausführungsform gelten die Aussagen bezüglich der biomimetischen Knorpelmatrix, welche in Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren getroffen wurden mutatis mutandis auch für die erfindungsgemäß hergestellte biomimetische Knorpelmatrix als solche.In a preferred embodiment, the statements regarding the biomimetic cartilage matrix, which were taken in connection with the method according to the invention mutatis mutandis also apply to the biomimetic cartilage matrix prepared according to the invention as such.

Unter dem Begriff „Vernetzung/vernetzen“ wird erfindungsgemäß ein chemischer Vorgang verstanden, bei dem mindestens eine kovalente chemische Bindung zwischen den vernetzbare Gruppen aufweisenden Komponenten der Zusammensetzungen ausgebildet wird. Mit der erfindungsgemäßen Vernetzung wird nicht die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen oder anderer rein physikalischer Wechselwirkungen verstanden. Erfindungsgemäß kann es bevorzugt zusätzlich zur irreversiblen Vernetzung durch die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen auch zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen in der nach den Schritten b) und c) fixiert vorliegenden biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung kommen, beispielsweise durch Hydroxylgruppen und/oder weiterer funktioneller Gruppen, die zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen geeignet sind.The term "crosslinking / crosslinking" is understood according to the invention to mean a chemical process in which at least one covalent chemical bond is formed between the components of the compositions comprising crosslinkable groups. The crosslinking according to the invention does not mean the formation of hydrogen bonds or other purely physical interactions. According to the invention, in addition to the irreversible crosslinking by the artificially introduced crosslinkable groups, it is also preferable for hydrogen bonds to be formed in the biomimetic cartilage matrix with zonal structuring fixed in steps b) and c), for example by hydroxyl groups and / or further functional groups Training of hydrogen bonds are suitable.

Unter dem Begriff „Vernetzbarkeit“ wird erfindungsgemäß das Potential der Gesamtheit der eingesetzten Komponenten einer Zusammensetzung zur intermolekularen Ausbildung von kovalenten Bindungen verstanden.According to the invention, the term "crosslinkability" is understood to mean the potential of the entirety of the components of a composition used for the intermolecular formation of covalent bonds.

Unter dem Begriff „Modifizierungsgrad“ wird erfindungsgemäß der Grad der chemischen Modifizierung der funktionellen Gruppen von Komponenten durch die Einführung von vernetzbaren Gruppen verstanden. Entsprechend wird unter einem höheren beziehungsweise niedrigeren Modifizierungsgrad einer Komponente verstanden, dass in dieser Komponente mehr beziehungsweise weniger vernetzbare Gruppen vorliegen als in einer zweiten Komponente. Zur Bewertung des Modifizierungsgrades einer Komponente werden erfindungsgemäß die nicht-vernetzbaren Gruppen nicht hinzugezählt. So kann es vorkommen, dass in einer Komponente zwar eine größere Anzahl an funktionellen Gruppen chemisch verändert wurde als in einer anderen Komponente, diese aber dennoch erfindungsgemäß einen niedrigeren Modifizierungsgrad als die andere Komponente aufweist, in welcher eine geringere Anzahl an funktionellen Gruppen chemisch verändert wurde. Somit bestimmt der Modifizierungsgrad die Vernetzbarkeit einer einzelnen Komponente, das heißt deren Fähigkeit intermolekulare kovalente Bindungen auszubilden. Erfindungsgemäß werden Komponenten mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden mit numerischen Indizes 1, 2, 3, ... hinter der Komponentenbezeichnung A, B, ... angezeigt. Dabei bedeuten unterschiedliche numerische Indizes hinter derselben Komponentenbezeichnung, dass es sich zwar um Komponenten aus derselben Gruppe handelt, diese jedoch in verschiedenen Spezies mit voneinander abweichenden Modifizierungsgraden vorliegen.The term "degree of modification" is understood according to the invention as the degree of chemical modification of the functional groups of components by the introduction of crosslinkable groups. Accordingly, a higher or lower degree of modification of a component is understood to mean that there are more or less crosslinkable groups in this component than in a second component. To evaluate the degree of modification of a component, the non-crosslinkable groups are not added according to the invention. Thus, it may happen that in one component, although a larger number of functional groups was chemically altered than in another component, but this according to the invention has a lower degree of modification than the other component in which a smaller number of functional groups has been chemically altered. Thus, the degree of modification determines the crosslinkability of a single component, that is, its ability to form intermolecular covalent bonds. According to the invention components with different degrees of modification with numerical indices 1, 2, 3, ... behind the component designation A, B, ... are displayed. Different numerical indices behind the same component designation mean that they are components from the same group, but they are present in different species with different degrees of modification.

Unter dem Begriff „vernetzbare Gruppe“ wird erfindungsgemäß eine funktionelle Gruppe verstanden, die entweder mit einer identischen oder chemisch sehr ähnlich aufgebauten Gruppe oder mit einer kompatiblen funktionellen Gruppe eine chemische Reaktion eingehen kann, wobei mindestens eine, insbesondere thermoirreversible, kovalente Bindung ausgebildet werden kann. Dabei kann bevorzugt zur Initiierung der Reaktion ein Initiator notwendig sein. Die Bildung der mindestens einen kovalenten Bindung ist unter physiologischen Bedingungen, insbesondere bei einem pH-Wert von 6 bis 8 und einer Temperatur von 30°C bis 45°C, irreversibel. Eine erfindungsgemäße artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe kann in einer bevorzugten Ausführungsform auch eine nicht-vernetzende Gruppe sein, falls keine geeignete kompatible vernetzbare Gruppe vorliegt, mit der sie mindestens eine kovalente Bindung ausbilden kann. The term "crosslinkable group" is understood according to the invention as meaning a functional group which can undergo a chemical reaction either with an identical or chemically very similar group or with a compatible functional group, it being possible to form at least one, in particular thermo-reversible, covalent bond. It may be necessary to initiate the reaction preferably an initiator. The formation of the at least one covalent bond is irreversible under physiological conditions, in particular at a pH of 6 to 8 and a temperature of 30 ° C to 45 ° C. In one preferred embodiment, an artificially introduced crosslinkable group may also be a non-crosslinking group if there is no suitable compatible crosslinkable group with which it can form at least one covalent bond.

Unter dem Begriff „funktionelle Gruppen“ werden Atomgruppen in organischen Verbindungen verstanden, welche die Stoffeigenschaften und das Reaktionsverhalten der sie tragenden Verbindungen maßgeblich bestimmen. Erfindungsgemäß sind die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren Gruppen und die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen bevorzugt ein Teil einer funktionellen Gruppe. Erfindungsgemäß wird bevorzugt allein der Teil der funktionellen Gruppe wiedergegeben, der entscheidend ist, um den erfindungsgemäß beabsichtigten technischen Effekt der Vernetzbarkeit oder der Nichtvernetzbarkeit zu gewährleisten. Die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen und/oder die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen sind in den erfindungsgemäßen Komponenten deshalb entweder mit einem Kohlenstoff- oder einem Heteroatom, bevorzugt mit einem Heteroatom, verbunden. Bevorzugt kann die Vernetzergruppe Acrylgruppe als Acrylatgruppe oder Acrylamidgruppe, bevorzugt Acrylamidgruppe, vorliegen. Bevorzugt liegt die Methacrylatgruppe als Methacrylat- oder Methacrylatamidgruppe vor.The term "functional groups" is understood to mean atomic groups in organic compounds which decisively determine the material properties and the reaction behavior of the compounds carrying them. In accordance with the invention, the artificially introduced non-crosslinkable groups and the artificially introduced crosslinkable groups are preferably part of a functional group. According to the invention, it is preferable to reproduce only that part of the functional group which is decisive in order to ensure the technical effect of crosslinkability or non-crosslinkability which is intended according to the invention. The artificially introduced crosslinkable groups and / or the artificially introduced non-crosslinkable functional groups are therefore connected in the components according to the invention either with a carbon atom or a heteroatom, preferably with a heteroatom. The crosslinker group may preferably be acrylic group as acrylate group or acrylamide group, preferably acrylamide group. The methacrylate group is preferably in the form of a methacrylate or methacrylamide group.

Unter dem Begriff „artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe“ werden funktionelle Gruppen verstanden, die durch chemische Kopplung an eine funktionelle Gruppe einer nichtderivatisierten Komponente eingebracht werden und mit gleichen und/oder kompatiblen funktionellen Gruppen derselben oder anderer Komponenten unter Ausbildung einer kovalenten Bindung chemisch reagieren können.The term "artificially introduced crosslinkable group" is understood to mean functional groups which are introduced by chemical coupling to a functional group of a non-derivatized component and can chemically react with identical and / or compatible functional groups of the same or other components to form a covalent bond.

Unter dem Begriff „artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare Gruppe“ werden funktionelle Gruppen verstanden, die durch chemische Kopplung an eine funktionelle Gruppe einer Komponente in das Molekül eingebracht werden und mit den in der gleichen oder einer anderen Komponente vorhandenen gleichen und/oder kompatiblen funktionellen Gruppen nicht chemisch reagieren und keine zur reversiblen Gelierung führende physikalische Wechselwirkung ausbilden.The term "artificially introduced non-crosslinkable group" is understood as meaning functional groups which are introduced into the molecule by chemical coupling to a functional group of one component and do not react with the same and / or compatible functional groups present in the same or another component chemically react and form no leading to reversible gelation physical interaction.

Unter dem Begriff „Spezies“ werden erfindungsgemäß Derivate aus einer Gruppe der bereitgestellten Kollagene, bevorzugt Gelatine, oder Glykosaminoglykane verstanden, die sich durch einen bestimmten Modifizierungsgrad auszeichnen. Erfindungsgemäß werden unterschiedliche Spezies aus einer Gruppe mit der Komponentenbezeichnung A, B, ... und einem zugeordneten numerischen Index 1, 2, 3, ... angezeigt. So zählt beispielsweise jede der Spezies A(1), A(2), A(3), ... zu den Kollagenderivaten, bevorzugt Gelatinederivaten, aus Gruppe A, und entsprechend jede der Spezies B(1), B(2), B(3), ... zu den Glykosaminoglykanderivaten der Gruppe B. Werden verschiedene Kollagene, bevorzugt Gelatinen, oder verschiedene Glykosaminoglykane eingesetzt, so erhalten diese unterschiedliche Suffixe A₁, A₂, ... und B₁, B₂, .... Werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren unterschiedliche Spezies aus einer Gruppe eingesetzt, so unterscheiden sich diese untereinander durch voneinander abweichende Modifizierungsgrade. Jede dieser Spezies gilt dann erfindungsgemäß als eine Komponente der Zusammensetzung. Dementsprechend wird unter dem Bereitstellen von mindestens drei Komponenten gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens verstanden, dass mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B bereitgestellt wird und zusätzlich mindestens eine weitere Spezies aus den Gruppen A und B vorliegt, die sich von der/den anderen Spezies aus derselben Gruppe durch einen abweichenden Modifizierungsgrad unterscheidet.According to the invention, the term "species" means derivatives from a group of the collagens provided, preferably gelatin, or glycosaminoglycans, which are distinguished by a certain degree of modification. According to the invention different species from a group with the component name A, B, ... and an associated numerical index 1, 2, 3, ... are displayed. Thus, for example, each of the species A (1), A (2), A (3), ... belongs to the collagen derivatives, preferably gelatin derivatives, from group A, and correspondingly each of the species B (1), B (2), B (3),... To the glycosaminoglycan derivatives of group B. If different collagens, preferably gelatins, or different glycosaminoglycans are used, they are given different suffixes A ₁ , A ₂ ,... And B ₁ , B ₂ ,. If different species from a group are used in the process according to the invention, these differ from each other by differing degrees of modification. Each of these species then applies according to the invention as a component of the composition. Accordingly, the provision of at least three components according to step a) of the process according to the invention means that at least one species from each of groups A and B is provided and additionally at least one further species from groups A and B is present, which differs from the / distinguishes the other species from the same group by a different degree of modification.

Unter dem Begriff „Gesamtpolymergehalt“ wird erfindungsgemäß die Summe der prozentualen Anteile aller eingesetzten vernetzbaren Polymere am Gesamtgewicht einer Zusammensetzung der biomimetischen Knorpelmatrix verstanden.The term "total polymer content" is understood according to the invention as the sum of the percentage of all crosslinkable polymers used in the total weight of a composition of the biomimetic cartilage matrix.

Unter dem Begriff „zonale Strukturierung“ wird erfindungsgemäß das Vorliegen von untereinander in Bezug auf die physikochemischen und biologischen Eigenschaften, insbesondere Festigkeit und/oder Quellbarkeit, unterscheidbaren Bereichen (Zonen) innerhalb einer Gesamtstruktur verstanden. Dabei können die einzelnen Zonen erfindungsgemäß zum Beispiel scharf voneinander abgrenzbar sein oder graduell ineinander übergehen. Eine Zone kann dabei erfindungsgemäß aus einer oder mehreren Schichten bestehen. In bevorzugter Ausführungsform entspricht jede Zone einer aufgebrachten und vernetzten Zusammensetzung gemäß Verfahrensschritt b) oder c). In einer Zone können erfindungsgemäß allerdings auch mehrere separat aufgebrachte Schichten der gleichen Zusammensetzung vorhanden sein.According to the invention, the term "zonal structuring" is understood to mean the existence of regions (zones) which can be distinguished from each other with regard to the physicochemical and biological properties, in particular strength and / or swellability, within a complete structure. In this case, according to the invention, the individual zones may, for example, be sharply delimited or gradually merge into one another. A zone can according to the invention consist of one or more layers. In a preferred embodiment, each zone corresponds to an applied and crosslinked composition according to Process step b) or c). However, according to the invention, it is also possible for a plurality of separately applied layers of the same composition to be present in one zone.

Unter dem Begriff „Gradient“ wird erfindungsgemäß das Gefälle oder der Anstieg mindestens einer Größe, insbesondere der Festigkeit und der Quellbarkeit innerhalb der biomimetischen Knorpelmatrix, verstanden. Dabei kann es sich erfindungsgemäß um einen Stufengradienten handeln, bei dem das Gefälle oder der Anstieg einer Größe, insbesondere der Festigkeit und der Quellbarkeit, innerhalb der biomimetischen Knorpelmatrix, in scharf voneinander abgrenzbaren Stufen, das heißt nicht-kontinuierlich, erfolgt. Erfindungsgemäß kann es sich auch um einen kontinuierlichen Gradient handeln bei dem das Gefälle oder der Anstieg einer Größe, insbesondere der Festigkeit und der Quellbarkeit innerhalb der biomimetischen Knorpelmatrix, stufenlos und in gleich bleibender Weise erfolgt.The term "gradient" is understood according to the invention to mean the slope or the increase in at least one size, in particular the strength and the swellability within the biomimetic cartilage matrix. According to the invention, this may be a step gradient in which the gradient or increase in size, in particular the strength and the swellability, takes place within the biomimetic cartilage matrix in sharply delimitable stages, that is to say non-continuously. According to the invention, it can also be a continuous gradient in which the gradient or increase in size, in particular the strength and the swellability within the biomimetic cartilage matrix, takes place continuously and in a consistent manner.

Unter dem Begriff „biomimetische Knorpelmatrix“ wird erfindungsgemäß ein Hybrid-Hydrogelnetzwerk mit mehreren Zonen unterschiedlicher Festigkeit und Quellbarkeit verstanden, das sich in Anlehnung an natürliches Knorpelgewebe dadurch auszeichnet, dass innerhalb der Gesamtstruktur sowohl die Festigkeit als auch die Quellbarkeit gleichgerichtet verändert sind und zur Herstellung des Hybrid-Hydrogelnetzwerks biobasierte Polymere aus der extrazellulären Matrix biologischer Gewebe eingesetzt werden. Die biomimetische Knorpelmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung zeichnet sich zudem dadurch aus, dass die Verhältnisse der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix aus Proteinbestandteilen und Polysaccharidbestandteilen, insbesondere in Zusammenhang mit hyalinem Knorpelgewebe, berücksichtigt sind.The term "biomimetic cartilage matrix" is understood according to the invention as a hybrid hydrogel network with several zones of different strength and swellability, which is characterized by natural cartilage tissue characterized in that both the strength and the swellability are rectified rectified within the forest and for the production of the Hybrid hydrogel network uses bio-based polymers from the extracellular matrix of biological tissues. The biomimetic cartilage matrix according to the present invention is further characterized in that the ratios of the composition of the extracellular matrix of protein constituents and polysaccharide constituents, in particular in connection with hyaline cartilage tissue, are taken into account.

Unter dem Begriff „biobasierte Polymere“ werden erfindungsgemäß Polymere verstanden, deren chemische Grundstruktur und deren Eigenschaften Polymeren biologischen Ursprungs gleichen, ähneln, davon abgeleitet sind oder die in dieser Form natürlich vorkommen, also biologischen Ursprungs sind. Der Begriff umfasst neben unmodifizierten Polymeren biologischen Ursprungs auch nachträglich modifizierte Polymere biologischen Ursprungs, sowie biotechnologisch hergestellte Moleküle, beispielsweise Hyaluronsäure. So kann ein biobasiertes Polymer beispielsweise durch teilweise Hydrolyse von natürlich vorkommenden Kollagenen oder natürlich vorkommenden Glykosaminoglykanen erhalten werden. Auf diese Weise ist es möglich, Polymere mit definiertem Molekulargewicht zu erhalten. Auch durch die Einführung zusätzlicher vernetzbarer und nicht-vernetzbarer Gruppen können biobasierte Polymere erhalten werden.According to the invention, the term "bio-based polymers" refers to polymers whose basic chemical structure and properties resemble, resemble or are derived from polymers of biological origin or which naturally occur in this form, ie are of biological origin. The term encompasses not only modified polymers of biological origin but also subsequently modified polymers of biological origin, as well as biotechnologically produced molecules, such as hyaluronic acid. For example, a bio-based polymer can be obtained by partial hydrolysis of naturally occurring collagens or naturally occurring glycosaminoglycans. In this way it is possible to obtain polymers of defined molecular weight. Also, by introducing additional crosslinkable and non-crosslinkable groups, bio-based polymers can be obtained.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Begriffen „umfassend“ und „aufweisend“ verstanden, dass zusätzlich zu den von diesen Begriffen explizit erfassten Elementen noch weitere, nicht explizit genannte Elemente hinzutreten können. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter diesen Begriffen auch verstanden, dass allein die explizit genannten Elemente erfasst werden und keine weiteren Elemente vorliegen. In dieser besonderen Ausführungsform ist die Bedeutung der Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „bestehend aus“. Darüber hinaus erfassen die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ auch Zusammensetzungen, die neben den explizit genannten Elementen auch weitere nicht genannte Elemente enthalten, die sich jedoch von funktionell und qualitativ untergeordneter Natur sind. In dieser Ausführungsform sind die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“.In the context of the present invention, the terms "comprising" and "having" mean that, in addition to the elements explicitly covered by these terms, further elements not explicitly mentioned may also be added. In the context of the present invention, these terms also mean that only the explicitly mentioned elements are detected and no further elements are present. In this particular embodiment, the meaning of the terms "comprising" and "comprising" is synonymous with the term "consisting of". In addition, the terms "comprising" and "comprising" also encompass compositions which, in addition to the explicitly mentioned elements, also contain other elements which are not mentioned, but which are of a functional and qualitatively subordinate nature. In this embodiment, the terms "comprising" and "comprising" are synonymous with the term "consisting essentially of".

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen. Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Figuren, Tabellen und den dazugehörigen Ausführungsbeispielen beschrieben.Further advantageous embodiments will be apparent from the dependent claims. The invention will be described below without limiting the general inventive idea with reference to figures, tables and the associated embodiments.

Dabei zeigt

1 die Veränderung der mechanischen Festigkeit (G') (1A) und Quellbarkeit ( 1B) von Hybrid-Hydrogelen aus methacrylierter und acetylierter Gelatine (GMA), methacryliertem Chondroitinsulfat (CSM) und methacrylierter Hyaluronsäure (HAM) bei steigendem Gesamtpolymergehalt und konstantem Gelatinegehalt, ohne Variation des Modifizierungsgrades der Komponenten in Bezug auf artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppen.
2 die Veränderung der mechanischen Festigkeit (G') (2A) und Quellbarkeit ( 2B) von Hybrid-Hydrogelen aus methacrylierter und acetylierter Gelatine (GMA), methacryliertem Chondroitinsulfat (CSM) und methacrylierter Hyaluronsäure (HAM) bei steigendem Gesamtpolymergehalt und steigendem Glykosaminoglykangehalt unter Variation des Modifizierungsgrades der eingesetzten Biomolekülderivate in Bezug auf artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppen.
3 die Viabilität porziner Chondrozyten in zonal strukturierten Hydrogelen. Erfindungsgemäße Gele aus drei Zonen wurden mittels kolbengeführtem Dispergierens horizontal schichtweise aufgebaut.
4 ein gedrucktes, mehrschichtiges Gel mit drei Zonen erfindungsgemäßer Zusammensetzung (drei Schichten gleicher Zusammensetzung pro Zone), Maßstab: 1 mm.

It shows

1 the change in mechanical strength (G ') ( 1A) and swellability ( 1B) of hybrid hydrogels of methacrylated and acetylated gelatin (GMA), methacrylated chondroitin sulfate (CSM) and methacrylated hyaluronic acid (HAM) with increasing total polymer content and constant gelatin content, without varying the degree of modification of the components with respect to artificially introduced crosslinkable groups.
2 the change in mechanical strength (G ') ( 2A) and swellability ( 2 B) of hybrid hydrogels of methacrylated and acetylated gelatin (GMA), methacrylated chondroitin sulfate (CSM) and methacrylated hyaluronic acid (HAM) with increasing total polymer content and increasing glycosaminoglycan content, varying the degree of modification of the biomolecule derivatives used with respect to artificially introduced crosslinkable groups.
3 the viability of porcine chondrocytes in zonally structured hydrogels. Gels of three zones according to the invention were built up horizontally in layers by means of piston-guided dispersing.
4 a printed multilayer gel with three zones of inventive composition (three layers of the same composition per zone), scale: 1 mm.

BeispieleExamples

Beispiel 1example 1

Zusammensetzung der zonal strukturierten Matrix beim Aufbau von drei Zonen Z1, Z2, Z3 mit von Z1 nach Z3 steigendem GesamtpolymergehaltComposition of the zonally structured matrix in the construction of three zones Z1, Z2, Z3 with increasing total polymer content from Z1 to Z3

Konzentrationen der BiopolymereConcentrations of biopolymers

$c {(Gesamt)}_{Z1} < c {(Gesamt)}_{Z2} < c {(Gesamt)}_{Z3}$

c {(total)}_{Z1} < c {(total)}_{Z2} < c {(total)}_{Z3}

c {(A_{i})}_{Z1} = c {(A_{i})}_{Z2} = c {(A_{i})}_{Z3}

c {(A_{i})}_{Z1} = c {(A_{i})}_{Z2} = c {(A_{i})}_{Z3}

c {(B_{1} + B_{2} + \dots)}_{Z1} < c {(B_{1} + B_{2} + \dots)}_{Z2} < c {(B_{1} + B_{2} + \dots)}_{Z3}

c {(B_{1} + B_{2} + ...)}_{Z1} < c {(B_{1} + B_{2} + ...)}_{Z2} < c {(B_{1} + B_{2} + ...)}_{Z3}

Einsatz von Biomolekülderivaten mit unterschiedlichen ModifizierungsgradenUse of biomolecule derivatives with different degrees of modification

Die einzusetzenden Biomoleküle, als Komponenten aus den Gruppen Kollagene, bevorzugt Gelatine, und Glykosaminoglykane werden als Spezies mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden bezüglich der artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen eingesetzt. Zur Unterscheidung der eingesetzten Modifizierungsgrade innerhalb der verschiedenen Zonen werden allgemeine numerische Indizes 1, 2, 3, ... eingeführt. Dabei bezeichnen die Indizes 1, 2, 3, ... hinter der jeweiligen Komponentenbezeichnung A, B, ... in vorliegendem Beispiel jeweils Spezies aus den Gruppen A, B, ... mit relativ zueinander abnehmenden Modifizierungsgraden. Die numerischen Indizes legen jedoch quantitativ keinen konkreten Modifizierungsgrad fest. Das heißt, Spezies A(l) ist ein Kollagenderivat, bevorzugt Gelatinederivat, aus der Gruppe A und kann quantitativ einen anderen Modifizierungsgrad aufweisen, als Spezies B₁(1) des Glykosaminoglykanderivats aus der Gruppe B, beziehungsweise als Spezies B₂(1) des anderen Glykosaminoglykanderivats aus Gruppe B. In jedem Fall ist in diesem Beispiel jedoch der Modifizierungsgrad einer Spezies mit dem numerischen Index 2 für jede der Komponenten ein relativ geringerer Modifizierungsgrad als der Modifizierungsgrad einer Spezies mit dem numerischen Index 1 aus derselben Gruppe. Das heißt: Werden in einer Zone zwei Spezies aus Gruppe A (Kollagenderivate) mit den Indices A(l) und A(2) mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden 1 und 2 eingesetzt, so besitzt die Spezies A(2) einen geringeren Modifizierungsgrad als die Spezies A(l) der entsprechenden Komponente. Um bei steigendem Gesamtpolymergehalt eine Verringerung des Vernetzungspotenzials zu erreichen, werden erfindungsgemäß in zonal strukturierten Matrices sukzessive Spezies der Derivate mit in Bezug auf die artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen vermindertem Modifizierungsgrad eingesetzt. Dies lässt sich folgendermaßen beschreiben: In Zone 1 betragen die Modifizierungsgrade der einzelnen eingesetzten Biomolekülderivate, als Komponenten, per definitionem 1 (zum Beispiel die Spezies A₁(1), B₁(1), B₂(1)). Alternativ werden in Zone 1 Mischungen mehrerer Derivate 1, 2, 3, ... einer Komponente eingesetzt (zum Beispiel die Spezies A₁(1), A₁(2), B₁(1), B₂(1)). Unabhängig von den in Zone Z1 eingesetzten Konzentrationen der verschiedenen Komponenten wird in der darauffolgenden Zone Z2 mindestens eine Spezies entweder vollständig durch eine Spezies derselben Gruppe mit geringerem Modifizierungsgrad ersetzt oder sie wird teilweise durch eine Spezies mit geringerem Modifizierungsgrad ersetzt, sodass sich das Mischungsverhältnis zugunsten der Spezies mit geringerem Modifizierungsgrad verschiebt. So sind beispielsweise folgende erfindungsgemäße Hybrid-Hydrogel-Zusammensetzungen denkbar:

Hybrid-Hydrogel 1:
- Z1: A₁(1), B₁(1), B₂(1)
- Z2: A₁(2), B₁(1), B₂(1)
- Z3: A₁(3), B₁(1), B₂(1)
Hybrid-Hydrogel 2:
- Z1: A₁(1)/A₁(2) (4:1), B₁(1), B₂(1)
- Z2: A₁(1)/A₁(2) (1:1), B₁(1), B₂(1)
- Z3: A₁(1)/A₁(2) (1:4), B₁(1), B₂(1)
Hybrid-Hydrogel 3:
- Z1: A₁(1), B₁(1), B₂(1)
- Z2: A₁(1), B₁(2), B₂(2)
- Z3: A₁(2), B₁(3), B₂(3)

The biomolecules to be used, as components of the groups collagens, preferably gelatin, and glycosaminoglycans are used as species with different degrees of modification with respect to the artificially introduced crosslinkable groups. To differentiate the degrees of modification used within the different zones, general numerical indices 1, 2, 3, ... are introduced. In this case, the indices 1, 2, 3,... Behind the respective component designation A, B,... In the present example respectively denote species from the groups A, B,... With degrees of modification decreasing relative to one another. However, the numerical indices do not quantify any specific degree of modification. That is, species A (1) is a collagen derivative, preferably gelatin derivative, from group A and may have a different degree of modification than species B ₁ (1) of the glycosaminoglycan derivative from group B, or species B ₂ (1) of However, in this instance, the degree of modification of a species having the numerical index 2 for each of the components is a relatively lower degree of modification than the degree of modification of a species having the numerical index 1 from the same group. This means that if two species from group A (collagen derivatives) with the indices A (l) and A (2) with different degrees of modification 1 and 2 are used in one zone, the species A (2) has a lower degree of modification than the species A. (l) the corresponding component. In order to achieve a reduction in the crosslinking potential with increasing total polymer content, according to the invention successive species of the derivatives are used in zonally structured matrices with a reduced degree of modification with respect to the artificially introduced crosslinkable groups. This can be described as follows: In zone 1, the degrees of modification of the individual biomolecule derivatives employed, as components, are by definition 1 (for example the species A ₁ (1), B ₁ (1), B ₂ (1)). Alternatively, in zone 1 mixtures of several derivatives 1, 2, 3, ... of a component are used (for example the species A ₁ (1), A ₁ (2), B ₁ (1), B ₂ (1)). Regardless of the concentrations of the various components used in zone Z1, in the subsequent zone Z2 at least one species is either completely replaced by a species of the same lower modifying group or it is partially replaced by a lower modifying species, thus increasing the mixing ratio in favor of the species shifts with a lesser degree of modification. For example, the following hybrid hydrogel compositions according to the invention are conceivable:

Hybrid Hydrogel 1:
- Z1: A ₁ (1), B ₁ (1), B ₂ (1)
- Z2: A ₁ (2), B ₁ (1), B ₂ (1)
- Z3: A ₁ (3), B ₁ (1), B ₂ (1)
Hybrid hydrogel 2:
- Z1: A ₁ (1) / A ₁ (2) (4: 1), B ₁ (1), B ₂ (1)
- Z2: A ₁ (1) / A ₁ (2) (1: 1), B ₁ (1), B ₂ (1)
- Z3: A ₁ (1) / A ₁ (2) (1: 4), B ₁ (1), B ₂ (1)
Hybrid hydrogel 3:
- Z1: A ₁ (1), B ₁ (1), B ₂ (1)
- Z2: A ₁ (1), B ₁ (2), B ₂ (2)
- Z3: A ₁ (2), B ₁ (3), B ₂ (3)

Der Gesamtpolymergehalt der Hydrogele steigt von Z1 nach Z2 nach Z3 an, wobei der Gehalt der Summe aller Spezies aus der Gruppe A vorzugsweise konstant bleibt.The total polymer content of the hydrogels increases from Z1 to Z2 to Z3, the content of the sum of all species from group A preferably remaining constant.

Herstellung einer erfindungsgemäß aufgebauten StrukturProduction of a structure constructed according to the invention

In der Zone Z1 werden eingesetzt:

- 10 Gew.-% der Gesamtmatrix Gelatinederivatspezies GM₅A₅ (A₁(1)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die mittlere Anzahl freier Aminogruppen in Gelatine eingeführt wurden. Zusätzlich besitzt GM₅A₅ nicht-vernetzbare Acetylgruppen, die ebenfalls unter Einsatz von fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die mittlere Anzahl freier Aminogruppen in die Gelatine eingeführt wurden, deren eventueller Einfluss auf die Vernetzbarkeit jedoch vernachlässigt wird. Der Modifizierungsgrad der Gelatinederivatspezies in Z1 ist per definitionem 1.
- 0,5 Gew.-% der methacrylmodifizierten Glykosaminoglykanderivatspezies Chondroitinsulfat CSM₅ (B₁(1)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylatgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die Anzahl Dissacharideinheiten in Chondroitinsulfat eingeführt wurden. Der Modifizierungsgrad der Chondroitinsulfatspezies in Z1 ist per definitionem 1.
- 0,1 Gew.-% der methacrylmodifizierten Glykosaminoglykanderivatspezies Hyaluronsäure HAM₅ (B₂(1)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylatgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die Anzahl Dissacharideinheiten in Hyaluronsäure eingeführt wurden. Der Modifizierungsgrad der Hyaluronsäurespezies in Z1 ist per definitionem 1.

In zone Z1 are used:

- 10 wt .-% of the total matrix gelatin derivative species GM ₅ A ₅ (A ₁ (1)), which has as an artificially introduced crosslinkable group methacrylic groups by chemical reaction with the addition of methacrylic anhydride in a fivefold molar excess with respect to the average number of free amino groups were introduced into gelatin. In addition, GM ₅ A ₅ possesses non-crosslinkable acetyl groups, which were also introduced into the gelatin using five times the molar excess relative to the mean number of free amino groups, but neglecting their possible influence on the crosslinkability. The degree of modification of the gelatin derivative species in Z1 is by definition 1.
Chitroitin sulfate CSM ₅ (B ₁ (1)), which has methacrylate groups introduced as an artificially introduced crosslinkable group, obtained by chemical reaction with the addition of methacrylic anhydride in a fivefold molar excess in relation to the number of dissacharide units in Chondroitin sulfate were introduced. The degree of modification of the chondroitin sulfate species in Z1 is 1 by definition.
Hyaluronic acid HAM ₅ (B ₂ (1)), which contains methacrylate groups as an artificially introduced crosslinkable group, obtained by chemical reaction with the addition of methacrylic anhydride in a fivefold molar excess in relation to the number of dissacharide units in Hyaluronic acid were introduced. The degree of modification of the hyaluronic acid species in Z1 is by definition 1.

Dargestellt in Kurzform: A₁(1), B₁(1), B₂(1).Shown in short form: A ₁ (1), B ₁ (1), B ₂ (1).

In der Zone Z2 werden eingesetzt:

- 5 Gew.-% der, das heißt die Hälfte des Gelatinemethacrylamidanteils, Gelatinederivatspezies GM₅A₅ (A₁(1)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die mittlere Anzahl freier Aminogruppen in Gelatine eingeführt wurden. Der Modifizierungsgrad der ersten Gelatinederivatspezies beträgt per definitionem 1.
- 5 Gew.-% der, das heißt die Hälfte des Gelatinemethacrylamidanteils, Gelatinederivatspezies GM₂A₈ (A₁(2)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in zweifachem molaren Überschuss in Bezug auf die mittlere Anzahl freier Aminogruppen in Gelatine eingeführt wurden, sodass der Modifizierungsgrad in Bezug auf artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppen geringer ist als der des Derivats GM₅A₅. Zusätzlich besitzt GM₂A₈ nicht-vernetzbare Acetylgruppen, die in achtfachem molaren Überschuss in Bezug auf die mittlere Anzahl freier Aminogruppen in die Gelatine eingeführt wurden, deren eventueller Einfluss auf die Vernetzbarkeit jedoch vernachlässigt wird. Damit beträgt der Modifizierungsgrad der zweiten Gelatinederivatspezies per definitionem 2. Beide Gelatinespezies werden zu gleichen Teilen eingesetzt, wobei der Gehalt der vernetzbaren Gelatinespezies in Summe zu dem in Zone Z1 eingesetzten Gehalt konstant bleibt.
- 1,25 Gew.-% der methycrylmodifizierten Glykosaminoglykanderivatspezies Chondroitinsulfat CSM₅ (B₁(1)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylatgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die Anzahl Dissacharideinheiten in Chondroitinsulphat eingeführt wurden. Der Modifizierungsgrad der Chondroitinsulfatspezies in Z2 ist per definitionem 1.
- 0,25 Gew.-% der methacrylmodifizierten Glykosaminoglykanderivatspezies Hyaluronsäure HAM₅ (B₂(1)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylatgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die Anzahl Dissacharideinheiten in Hyaluronsäure eingeführt wurden. Der Modifizierungsgrad der Hyaluronsäurespezies in Z2 ist per definitionem 1.

Zone Z2 uses:

- 5 wt .-%, that is, half of the Gelatinemethacrylamidanteils, gelatin derivative species GM ₅ A ₅ (A ₁ (1)), which has as an artificially introduced crosslinkable group methacrylic groups by chemical reaction with addition of methacrylic anhydride in a fivefold molar excess in With respect to the mean number of free amino groups in gelatin were introduced. The degree of modification of the first gelatin derivative species is by definition 1.
- 5 wt .-%, that is, half of Gelatinemethacrylamidanteils, gelatin derivative species GM ₂ A ₈ (A ₁ (2)), which has as an artificially introduced crosslinkable group methacrylic groups by chemical reaction with the addition of methacrylic anhydride in a two-fold molar excess With respect to the mean number of free amino groups in gelatin, so that the degree of modification with respect to artificially introduced crosslinkable groups is lower than that of the derivative GM ₅ A ₅ . In addition, GM ₂ A ₈ possesses non-crosslinkable acetyl groups introduced into the gelatin in an eightfold molar excess relative to the mean number of free amino groups, but neglecting any influence on its crosslinkability. Thus, the degree of modification of the second gelatin derivative species is by definition 2. Both gelatin species are used in equal proportions, with the content of the crosslinkable gelatin species remaining constant in proportion to the content used in zone Z1.
1.25% by weight of the methacrylate-modified glycosaminoglycan derivative species chondroitin sulfate CSM ₅ (B ₁ (1)), which as an artificially introduced crosslinkable group has methacrylate groups which are related by chemical reaction with addition of methacrylic anhydride in a five-fold molar excess were introduced on the number Dissacharideinheiten in Chondroitinsulphat. The degree of modification of the chondroitin sulfate species in Z2 is by definition 1.
Hyaluronic acid HAM ₅ (B ₂ (1)), which as an artificially introduced crosslinkable group possesses methacrylate groups obtained by chemical reaction with the addition of methacrylic anhydride in a fivefold molar excess in relation to the number of dissacharide units in Hyaluronic acid were introduced. The degree of modification of the hyaluronic acid species in Z2 is by definition 1.

Dargestellt in Kurzform:Shown in short form:

$A_{1} (1) / A_{1} (2) (1 : 1), B_{1} (1), B_{2} (1)$

A_{1} (1) / A_{1} (2) (1 : 1) . B_{1} (1) . B_{2} (1)

c {(A_{1} (1))}_{Z1} = c {(A_{1} (1))}_{Z2} + c {(A_{1} (2))}_{Z2}

c {(A_{1} (1))}_{Z1} = c {(A_{1} (1))}_{Z2} + c {(A_{1} (2))}_{Z2}

c {(B_{1} (1) + B_{2} (2))}_{Z1} < c {(B_{1} (1) + B_{2} (1))}_{Z2}

c {(B_{1} (1) + B_{2} (2))}_{Z1} < c {(B_{1} (1) + B_{2} (1))}_{Z2}

In der Zone Z3 werden eingesetzt:

- 10 Gew.-% der Gelatinederivatspezies GM₂A₈ (A₁(2)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in zweifachem molaren Überschuss in Bezug auf die mittlere Anzahl freier Aminogruppen in Gelatine eingeführt wurden. Zusätzlich besitzt GM₅A₈ nicht-vernetzbare Acetylgruppen, die ebenfalls in achtfachem molaren Überschuss in Bezug auf die mittlere Anzahl freier Aminogruppen in die Gelatine eingeführt wurden, deren eventueller Einfluss auf die Vernetzbarkeit jedoch vernachlässigt wird. Der Modifizierungsgrad der Gelatinederivatspezies in Z3 ist per definitionem 2.
- 2,5 Gew.-% der methacrylmodifizierten Glykosaminoglykanderivatspezies Chondroitinsulfat CSM₅ (B₁(1)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylatgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die Anzahl Dissacharideinheiten in Chondroitinsulfat eingeführt wurden. Der Modifizierungsgrad der Chondroitinsulfatspezies in Z3 ist per definitionem weiterhin 1.
- 0,5 Gew.-% der methacrylmodifizierten Glykosaminoglykanderivatspezies HyaluronsäureHAM₅ (B₂(1)), welche als artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe Methacrylatgruppen besitzt, die durch chemische Reaktion unter Zugabe von Methacrylsäureanhydrid in fünffachem molaren Überschuss in Bezug auf die Anzahl Dissacharideinheiten in Hyaluronsäure eingeführt wurden. Der Modifizierungsgrad der Hyaluronsäurespezies in Z3 ist per definitionem 1.

Zone Z3 uses:

- 10 wt .-% of the gelatin derivative species GM ₂ A ₈ (A ₁ (2)), which has as an artificially introduced crosslinkable group methacrylic groups by chemical reaction with addition of methacrylic anhydride in a two-fold molar excess with respect to the average number of free amino groups in Gelatin were introduced. In addition, GM ₅ A ₈ possesses non-crosslinkable acetyl groups, which were also introduced into the gelatin in an eightfold molar excess relative to the mean number of free amino groups, but whose possible influence on the crosslinkability is neglected. The degree of modification of the gelatin derivative species in Z3 is by definition 2.
- 2.5 wt .-% of the methacrylmodifizierten Glykosaminoglykanderivatspezies chondroitin sulfate CSM ₅ (B ₁ (1)), which has as an artificially introduced crosslinkable group methacrylate groups by chemical reaction with the addition of methacrylic anhydride in a fivefold molar excess in relation to the number Dissacharideinheiten in Chondroitin sulfate were introduced. The degree of modification of the chondroitin sulfate species in Z3 is still 1 by definition.
Hyaluronic acid HAM ₅ (B ₂ (1)), which has methacrylate groups introduced as an artificially introduced crosslinkable group, by methacrylic acid reaction with addition of methacrylic anhydride in a fivefold molar excess relative to the number of dissacharide units in hyaluronic acid were introduced. The degree of modification of the hyaluronic acid species in Z3 is by definition 1.

Dargestellt in Kurzform:Shown in short form:

$A_{1} (2) {, B}_{1} (1), B_{2} (1)$

A_{1} (2) {, B}_{1} (1) . B_{2} (1)

c {(A_{1} (1))}_{Z1} = c {(A_{1} (1))}_{Z2} + c {(A_{1} (2))}_{Z2} = c {(A_{1} (2))}_{Z3}

c {(A_{1} (1))}_{Z1} = c {(A_{1} (1))}_{Z2} + c {(A_{1} (2))}_{Z2} = c {(A_{1} (2))}_{Z3}

c {(B_{1} (1) + B_{2} (2))}_{Z1} < c {(B_{1} (1) + B_{2} (1))}_{Z2} < c {(B_{1} (1) + B_{2} (1))}_{Z3}

c {(B_{1} (1) + B_{2} (2))}_{Z1} < c {(B_{1} (1) + B_{2} (1))}_{Z2} < c {(B_{1} (1) + B_{2} (1))}_{Z3}

Beispiel 2 Example 2

Gegenüberstellung der physikochemischen Eigenschaften von zonal strukturierten Matrices bei nicht-erfindungsgemäßer und erfindungsgemäßer ZusammensetzungComparison of the physicochemical properties of zonally structured matrices in non-inventive and inventive composition

Nicht-erfindungsgemäßes zonal strukturiertes Hydrogel mit zonenweise zunehmendem Speichermodul und gleichzeitig zonenweise abnehmender QuellbarkeitNon-inventive zonal structured hydrogel with zone-wise increasing storage modulus and at the same time zone-wise decreasing swellability

Durch die alleinige Erhöhung der Konzentration der vernetzbaren Glykosaminoglykanderivate CSM₅ und HAM₅ bei gleichbleibender Konzentration der mit vernetzbaren Methacrylgruppen und nicht-vernetzbaren Acetylgruppen modifizierten Gelatine GM₅A₅ konnte die gewünschte Änderung der physikalischen Eigenschaften der Hydrogelzonen nicht realisiert werden, wenn der Modifizierungsgrad der eingesetzten Spezies nicht variiert wurde. In dem so erzeugten zonal strukturierten Hydrogel nahm der Gesamtpolymergehalt von Z1 nach Z3 zu, gleichzeitig nahm auch die Vernetzbarkeit von Z1 nach Z3 zu. So kam es zwar, wie gewünscht, zu einer Zunahme des Speichermoduls G' (Festigkeit) von Z1 nach Z3 (1A), jedoch nahm gleichzeitig die Quellbarkeit von Z1 zu Z3 ab (1B). Tabelle 1: Anteile der unterschiedlichen Komponenten in den Zonen Z1 bis Z3 in einem nicht erfindungsgemäßen zonal strukturierten Hydrogel Gew.-% (GM₅A₅)* Gew.-% (GM₂A₈)* Gew.-% (CSM₅)* Gew.-% (HAM₅)* Z1 (Superf). 10 0 0,5 0,1 Z2 (Middle) 10 0 1,25 0,25 Z3 (Deep) 10 0 2,5 0,5 * G = Gelatine, CS = Chrondroitinsulfat, HA = Hyaluronsäure, M_x = Methacrylierungsgrad, A_y = Acetylierungsgrad The sole increase in the concentration of the crosslinkable glycosaminoglycan derivatives CSM ₅ and HAM ₅ at a constant concentration of the crosslinkable methacrylic groups and non-crosslinkable acetyl groups modified gelatin GM ₅ A ₅ , the desired change in the physical properties of the hydrogel zones could not be realized if the degree of modification of the used Species was not varied. In the zonally structured hydrogel thus produced, the total polymer content of Z1 increased to Z3, and at the same time, the crosslinkability of Z1 to Z3 increased. Thus, as desired, there was an increase in the storage modulus G '(strength) from Z1 to Z3 ( 1A) , but at the same time decreased the swellability of Z1 to Z3 ( 1B) , Table 1: Shares of the different components in zones Z1 to Z3 in a non-inventive zonal structured hydrogel Wt% (GM ₅ A ₅ ) * Wt% (GM ₂ A ₈ ) * Wt% (CSM ₅ ) * Wt% (HAM ₅ ) * Z1 (Superf). 10 0 0.5 0.1 Z2 (Middle) 10 0 1.25 0.25 Z3 (Deep) 10 0 2.5 0.5 * G = gelatin, CS = chondroitin sulfate, HA = hyaluronic acid, M _x = degree of methacrylate, A _y = degree of acetylation

Erfindungsgemäßes zonal strukturiertes Hydrogel mit zonenweise zunehmendem Speichermodul und gleichzeitig zonenweise zunehmender QuellbarkeitInventive zonal structured hydrogel with zone-increasing storage modulus and at the same time increasing zonewise swellability

Durch die erfindungsgemäße Erhöhung des Gesamtpolymergehalt und des CSM₅- und HAM₅-Anteils zwischen den Hydrogelzonen und gleichzeitiger Reduktion des Gesamtvernetzungspotentials durch Variation des Modifizierungsgrades der eingesetzten Gelatinederivatspezies konnte die gewünschte Änderung der physikalischen Eigenschaften der Hydrogele realisiert werden. Mit von Z1 nach Z3 zunehmendem Speichermodul G' (2A) kommt es innerhalb des Hydrogels auch zu einer signifikanten Steigerung der Quellbarkeit (2B). Tabelle 2: Anteile der unterschiedlichen Komponenten in den Zonen Z1 bis Z3 in einem erfindungsgemäßen zonal strukturierten Hydrogel Gew.-% (GM₅A₅)* Gew.-% (GM₂A₈)* Gew.-% (CSM₅)* Gew.-% (HAM₅)* Z1 (Superf). 10 0 0,5 0,1 Z2 (Middle) 5 5 1,25 0,25 Z3 (Deep) 0 10 2,5 0,5 * G = Gelatine, CS = Chrondroitinsulfat, HA = Hyaluronsäure, M_x = Methacrylierungsgrad, A_y = Acetylierungsgrad By increasing the total polymer content and the CSM ₅ and HAM ₅ content between the hydrogel zones and simultaneously reducing the overall crosslinking potential by varying the degree of modification of the gelatin derivative species used, the desired change in the physical properties of the hydrogels could be realized. With memory module G 'increasing from Z1 to Z3 ( 2A) there is also a significant increase in swellability within the hydrogel ( 2 B) , Table 2: Shares of the different components in zones Z1 to Z3 in a zonal structured hydrogel according to the invention Wt% (GM ₅ A ₅ ) * Wt% (GM ₂ A ₈ ) * Wt% (CSM ₅ ) * Wt% (HAM ₅ ) * Z1 (Superf). 10 0 0.5 0.1 Z2 (Middle) 5 5 1.25 0.25 Z3 (Deep) 0 10 2.5 0.5 * G = gelatin, CS = chondroitin sulfate, HA = hyaluronic acid, M _x = degree of methacrylate, A _y = degree of acetylation

Beispiel 3Example 3

Zytokompatibilität von erfindungsgemäß zusammengesetzten HydrogelenCytocompatibility of hydrogels composed according to the invention

Kryokonservierte porzine Chondrozyten aus dem Knieknorpel von fünf bis acht Monate alten Schweinen wurden in einer Menge von 3×10⁵ Zellen pro Milliliter in sterilfiltrierte Gelvorläuferlösungen mit erfindungsgemäßen Zusammensetzungen (siehe Beispiel 2, Abschnitt 2.) eingebracht. Die Lösungen wurden in sterile Pipetten aufgenommen und mit Hilfe eines automatischen Dispersiersystems schichtweise auf ein Glassubstrat aufgebracht. Je Zone wurden drei Schichten gleicher Zusammensetzung zu je 16 µl aufgebracht und nach jeder Schicht unter Einsatz des Fotoinitiators Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) durch UV-Bestrahlung radikalisch vernetzt (15 s, 385 nm, 8,6 mW/cm²). Der Anteil lebender Zellen (Viabilität) in den Gelen wurde in drei unabhängigen Experimenten zu vier Zeitpunkten (Tag 1, Tag 7, Tag 14 und Tag 28) überprüft. Hierfür wurden lebende Zellen mit Fluorescein und tote Zellen mit Propidiumiodid gefärbt. Die Zellzählung erfolgte automatisiert.Cryopreserved porcine knee cartilage chondrocytes from five to eight month old pigs were introduced at a rate of 3 x 10 ⁵ cells per milliliter into sterile-filtered gel precursor solutions having compositions of the invention (see Example 2, Section 2.). The solutions were taken in sterile pipettes and layered onto a glass substrate using an automatic dispersing system. Three layers of the same composition of 16 .mu.l were applied per zone and, after each layer, free-radically cross-linked by means of the photoinitiator lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) by UV irradiation (15 s, 385 nm, 8.6 mW / cm ² ). The proportion of live cells (viability) in the gels was checked in three independent experiments at four time points (day 1, day 7, day 14 and day 28). For this purpose, living cells were stained with fluorescein and dead cells stained with propidium iodide. The cell count was automated.

Chondrozyten waren in erfindungsgemäßen biomimetischen Matrices aus drei Zonen unterschiedlich zusammengesetzter Hydrogele über mindestens 28 Tage lebensfähig, länger wurde die Lebensfähigkeit nicht untersucht. Der Anteil toter Zellen verringerte sich (diese werden aus den Gelen ausgewaschen) stärker als der Anteil der lebenden Zellen, woraus eine steigende Viabilität resultierte (3).Chondrocytes were viable in biomimetic matrices of three zones of differentially composed hydrogels for at least 28 days according to the invention; viability was not studied for longer. The proportion of dead cells (which are washed out of the gels) decreased more than the proportion of living cells, resulting in an increased viability ( 3 ).

Beispiel 4Example 4

Gedrucktes mehrschichtiges Gel mit drei Zonen erfindungsgemäßer Zusammensetzung (4, drei Schichten gleicher Zusammensetzung pro Zone). Die unterschiedliche molekulare Zusammensetzung der Zonen ist auf dem optischen Mikrograph nicht zu unterscheiden. Maßstab 1mm.Printed multilayer gel with three zones of inventive composition ( 4 , three layers of the same composition per zone). The different molecular composition of the zones is indistinguishable on the optical micrograph. Scale 1mm.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von mindestens einem Substrat und mindestens drei Komponenten mit artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppen, wobei die Komponenten mindestens ein vernetzbares Kollagenderivat aus der Gruppe A, mindestens ein vernetzbares Glykosaminoglykanderivat aus der Gruppe B umfassen und mindestens eine der Komponenten ausgewählt aus den Gruppen A und B, in mindestens zwei Spezies mit unterschiedlichem Modifizierungsgrad vorliegt, b) Aufbringen einer ersten Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B auf das mindestens eine Substrat, gefolgt von einem Vernetzen der aufgebrachten Zusammensetzung, anschließend c) mindestens einmaliges Aufbringen mindestens einer weiteren Zusammensetzung umfassend mindestens jeweils eine Spezies aus den Gruppen A und B auf die jeweils vorherige Zusammensetzung und Vernetzen der im Verfahrensschritt b) und c) oder der in Verfahrensschritt c) aufgebrachten Zusammensetzungen, und d) Erhalten einer biomimetischen Knorpelmatrix mit zonaler Strukturierung, wobei mindestens eine der weiteren Zusammensetzungen in Schritt c) dadurch gekennzeichnet ist, dass in Bezug auf die jeweils vorherige Zusammensetzung der Gesamtpolymergehalt und die Vernetzbarkeit durch Änderung der Menge und Identität mindestens einer Spezies ausgewählt aus den Gruppen A und B gegensätzlich zueinander verändert sind, und wobei die zonale Strukturierung durch gleichgerichtete Festigkeits- und Quellbarkeitsgradienten innerhalb der zonalen Strukturierung ausgezeichnet ist.A process for the preparation of a biomimetic cartilage matrix with zonal structuring, comprising the steps of: a) providing at least one substrate and at least three components with artificially introduced crosslinkable groups, said components at least one group A cross-linkable collagen derivative, at least one crosslinkable glycosaminoglycan derivative from the group B and at least one of the components selected from groups A and B is present in at least two species with different degrees of modification, b) applying a first composition comprising at least one species from groups A and B to the at least one substrate, followed by a Crosslinking of the applied composition, then c) at least one application of at least one further composition comprising at least one respective species from the groups A and B to the respective previous composition and crosslinking the in the Verfahrensschri d) b) and c) or the compositions applied in process step c), and d) obtaining a biomimetic cartilage matrix with zonal structuring, wherein at least one of the further compositions in step c) is characterized in that with respect to the respective previous composition of the total polymer content and the crosslinkability is altered by altering the amount and identity of at least one species selected from Groups A and B to be opposite to each other, and wherein the zonal patterning is characterized by rectified strength and swellability gradients within the zonal patterning.

Verfahren nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine vernetzbare Glykosaminoglykanderivat aus der Gruppe B ausgewählt ist aus Chrondroitinsulfatderivate und Hyaluronsäurederivate.Method according to Claim 1 in which the at least one group B crosslinkable glycosaminoglycan derivative is selected from chondroitin sulfate derivatives and hyaluronic acid derivatives.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Gesamtmenge des mindestens einen vernetzbaren Kollagenderivats aus der Gruppe A in den Zusammensetzungen konstant ist.Method according to Claim 1 or 2 wherein the total amount of the at least one group A crosslinkable collagen derivative in the compositions is constant.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei mindestens eine der Komponenten aus den Gruppen A und B in mindestens einem höheren und einem niedrigeren Modifizierungsgrad vorliegt.Method according to one of the preceding claims, wherein at least one of the components of the groups A and B is present in at least a higher and a lower degree of modification.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei in Schritt c) die Vernetzbarkeit jeder weiteren Zusammensetzung durch vollständiges Ersetzen mindestens einer Spezies durch mindestens eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad verändert ist.Method according to one of the preceding claims, wherein in step c) the crosslinkability of each further composition is changed by complete replacement of at least one species by at least one species with a different degree of modification.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei in Schritt c) die Vernetzbarkeit jeder weiteren Zusammensetzung durch teilweises Ersetzen mindestens einer Spezies durch mindestens eine Spezies mit abweichendem Modifizierungsgrad verändert ist.Method according to one of the preceding claims, wherein in step c) the crosslinkability of each further composition is changed by partial replacement of at least one species by at least one species with a different degree of modification.

Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei die mindestens eine Spezies mindestens ein Kollagenderivat ist.Method according to one of Claims 5 or 6 wherein the at least one species is at least one collagen derivative.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 7, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe des mindestens einen Kollagenderivats aus der Gruppe A und des mindestens einen Glykosaminoglykanderivats aus der Grupper B ausgewählt ist aus Gruppe 1, bestehend aus Maleinimidgruppe, und C-C-Doppelbindung oder aus Gruppe 2, bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe. Method according to one of Claims 1 and 3 to 7 wherein the at least one artificially introduced crosslinkable group of the at least one group A and at least one glycosaminoglycan derivative from group B is selected from group 1 consisting of maleimide group and CC double bond or group 2 consisting of azide group, CC Double bond, CC triple bond, aldehyde group, ketone group, imine group, thioketone group, thiol group, CN triple bond and diene group.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 8, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe des mindestens einen Kollagenderivats aus Gruppe A und des mindestens einen Glykosaminoglykanderivats aus der Gruppe B ausgewählt ist aus Methacrylgruppe und Acrylgruppe.Method according to one of Claims 1 and 3 to 8th in which the at least one artificially introduced crosslinkable group of the at least one collagen derivative from group A and the at least one glycosaminoglycan derivative from group B is selected from methacrylic group and acrylic group.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Aufbringen und Vernetzen schichtweise erfolgt.Method according to one of the preceding claims, wherein the application and crosslinking takes place in layers.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei in den Schritten b) und c) Knorpelzellen oder deren Vorläufer in oder auf die sich bildende Knorpelmatrix eingebracht oder aufgebracht werden.Method according to one of the preceding claims, wherein in steps b) and c) cartilage cells or their precursors are introduced or applied in or on the forming cartilage matrix.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei mindestens eine der in Schritt a) bereitgestellten Komponenten zusätzlich zu der mindestens einen artifiziell eingeführten vernetzbaren Gruppe mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare Gruppe aufweist.Method according to one of the preceding claims, wherein at least one of the provided in step a) components in addition to the at least one artificially introduced crosslinkable group at least one artificially introduced non-crosslinkable group.

Verfahren nach Anspruch 12, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare Gruppe ausgewählt ist aus Halogen, Aldehyd, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl, wobei wenn die artifiziell eingeführte vernetzbare Gruppe eine Diengruppe ist, die nicht-vernetzbare Gruppe ausgewählt wird aus Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxyaryl.Method according to Claim 12 wherein the at least one artificially introduced non-crosslinkable group is selected from halo, aldehyde, alkyl, haloalkyl, heteroalkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, heteroarylalkyl, arylheteroalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, alkoxyaryl and acyl, where if artificially introduced crosslinkable group is a diene group, the non-crosslinkable group is selected from halogen, alkyl, haloalkyl, heteroalkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, heteroarylalkyl, arylheteroalkyl, alkoxy, alkoxyalkyl and alkoxyaryl.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Aufbringen der Zusammensetzungen in den Schritten b) und c) mittels additiver Auftragungsverfahren erfolgt.Method according to one of the preceding claims, wherein the application of the compositions in steps b) and c) takes place by means of additive application methods.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Kollagenderivat ein Gelatinederivat ist.A method according to any one of the preceding claims, wherein the collagen derivative is a gelatin derivative.

Biomimetische Knorpelmatrix, hergestellt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 15.Biomimetic cartilage matrix prepared by a method of Claims 1 to 15 ,