DE102015207516A1 - Coupling of Proteins of Interest (POI) to Viral Vectors by Intein-mediated Protein Splicing - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung stellt Viren und virale Vektoren sowie Verfahren zur Kopplung von Proteinen von Interesse an die Viren oder virale Vektoren mittels Intein-vermittelten Proteinspleißens bereit. Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit die kovalente Kopplung eines beliebigen separat produzierten Proteins von Interesse unter physiologischen Bedingungen an die Oberfläche eines Virus oder viralen Vektors nachdem das Virus oder der virale Vektor produziert und aufgereiningt wurde. Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit beispielsweise das Targeting von Viren oder viralen Vektoren für den selektiven Gentransfer bzw. die selektive Infektion/Transduktion von Zielzellpopulationen mit einem beliebigen Transgen. Außerdem können die hier beschriebenen Viren oder viralen Vektoren für den Proteintransfer genutzt werden. Neben Targeting von Viren oder viralen Vektoren liefert die vorliegende Erfindung außerdem Möglichkeiten zur Kopplung beliebiger Antigene an die Oberfläche von viralen Vektoren für die Herstellung von potenziellen Impfvektoren.The invention provides viruses and viral vectors as well as methods for coupling proteins of interest to the viruses or viral vectors via intein-mediated protein splicing. The present invention thus enables the covalent coupling of any separately produced protein of interest under physiological conditions to the surface of a virus or viral vector after the virus or viral vector has been produced and annealed. The present invention thus enables, for example, the targeting of viruses or viral vectors for the selective gene transfer or the selective infection / transduction of target cell populations with any transgene. In addition, the viruses or viral vectors described herein can be used for protein transfer. In addition to targeting viruses or viral vectors, the present invention also provides possibilities for coupling any antigens to the surface of viral vectors for the production of potential vaccine vectors.
Description
Bereich der Erfindung/Gebiet der ErfindungField of the Invention / Field of the Invention
Die Erfindung bezieht sich auf Viren und virale Vektoren sowie Verfahren zur Kopplung von Proteinen von Interesse an die Viren oder virale Vektoren mittels Intein-vermittelten Proteinspleißens.The invention relates to viruses and viral vectors as well as methods for coupling proteins of interest to the viruses or viral vectors using intein-mediated protein splicing.
Hintergrund/Stand der TechnikBackground / state of the art
Die Gentherapie, also das Einfügen von Nukleinsäuren wie DNA oder RNA in die Körperzellen eines Individuums, ist eine große Chance aber auch große Herausforderung um beispielsweise eine Krankheit nachhaltig zu behandeln. Klassischerweise soll bei der Gentherapie ein defektes Gen innerhalb des Genoms eines Individuums, welches ursächlich für die Entstehung der Krankheit ist, durch Einfügen eines intakten Gens ersetzt oder komplementiert werden. Da ein Gendefekt nicht immer in jeder Zelle eines Organismus vorliegt bzw. nicht jede Zelle oder Organ betrifft ist eine gezielte Behandlung, d.h. das gezielte Ersetzen oder Komplementieren des defekten Gens in der betroffen Zielzelle oder Zielgewebe erforderlich. Zur genetischen Modifikation der meisten Zellen ist dabei ein Gentransfer mittels viralen Vektoren die Methode der Wahl. Der Transfer von genetischem Material in eine Zielezelle oder Zielgewebe mit Hilfe eines viralen Vektors wird als Transduktion bezeichnet. Dabei wird ein Virus genetisch so modifiziert, dass er sowohl das intakte, zu transferierende Gen in seinem Genom enthält und nicht mehr replikationskompetent ist, um eine selbständige Vermehrung des Virus in der Zielzelle zu vermeiden. Letzteres wird durch Ersetzen bestimmter DNA-Bereiche des viralen Genoms, beispielsweise regulatorische Sequenzen oder Gene für Enzyme, Kapsid- oder Membranproteine, erreicht. Zudem werden die viralen Vektoren oft pseudotypisiert, d.h. Hüll- oder Kapsidproteine des viralen Vektors werden durch Hüll- oder Kapsidproteine anderer Viren ausgetauscht, um den Tropismus (Zielzellaffinität) und/oder die Gentransfereffizienz zu optimieren. Virale Vektoren werden dabei oft zunächst so pseudotypisiert, um möglichst einen effektiven, aber nicht-selektiven Zelleintritt in möglichst alle Zelltypen zu ermöglichen. Anschließen werden die viralen Vektoren durch Einfügen sog. Targeting-Domänen auf einen selektiven Gentransfer eines bestimmten Zielzelltyps ausgerichtet. Targeting-Domänen werden oft durch Kopplung mit einem viralen Hüll- oder Kapsidproteine an die Oberfläche des Virus bzw. viralen Vektors aufgebracht. Eine kovalente Kopplung der Targeting-Domäne an die Oberfläche eines Virus erfolgt zur Zeit entweder durch i) direkte genetische Modifikation der viralen Hüll- oder Kapsidproteine als Fusionsprotein, oder durch ii) chemische Modifikation (Klick-Chemie)(
Nach dem bisherigen Stand der Technik gibt es demnach noch kein Verfahren mit dem eine effiziente kovalente Kopplung eines Proteins von Interesse an die Oberfläche eines Virus oder viralen Vektors nach dessen Produktion unter physiologischen Bedingungen möglich ist.Accordingly, according to the prior art, there is still no method which allows efficient covalent coupling of a protein of interest to the surface of a virus or viral vector after its production under physiological conditions.
Aufgabe der Erfindung Object of the invention
Es war deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Kopplung von Proteinen von Interesse an Viren oder virale Vektoren bereitzustellen.It was therefore an object of the present invention to provide an improved method for coupling proteins of interest to viruses or viral vectors.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die kovalente Kopplung eines beliebigen separat produzierten Proteins von Interesse unter physiologischen Bedingungen an die Oberfläche eines Virus oder viralen Vektors nachdem das Virus oder der virale Vektor produziert und aufgereiningt wurde. Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit beispielsweise das Targeting von Viren oder viralen Vektoren für den selektiven Gentransfer bzw. die selektive Infektion/Transduktion von Zielzellpopulationen mit einem beliebigen Transgen. Insbesondere ermöglicht die vorliegende Erfindung das Targeting von Viren oder viralen Vektoren, die nach den bisherigen im Stand der Technik bekannten Verfahren schwer zugänglich oder nicht möglich waren (z.B. Kopplung von Immoglobulin-abgeleiteten Domänen mit Disulfidbrücken auf die Oberfläche von AAV-Vektoren).The present invention allows the covalent coupling of any separately produced protein of interest under physiological conditions to the surface of a virus or viral vector after the virus or viral vector has been produced and annealed. The present invention thus enables, for example, the targeting of viruses or viral vectors for the selective gene transfer or the selective infection / transduction of target cell populations with any transgene. In particular, the present invention enables the targeting of viruses or viral vectors that were difficult to access or not possible by the prior art methods (e.g., coupling of immunoglobulin-derived domains with disulfide bridges to the surface of AAV vectors).
Die hier beschriebenen Viren oder viralen Vektoren sind jedoch nicht auf gentherapeutische Zwecke beschränkt und können beispielsweise auch für den Proteintransfer genutzt werden. Dabei müssen solche Viren oder viralen Vektoren nicht zwingend ein Genom tragen, wie beispielsweise „Virus-like Particles (VLPs)“ oder Virosomen. VLPs und Virosomen sind Viruspartikel, die keine Nukleinsäuren oder keine funktionellen Nukleinsäuren enthalten und oft zu Impfzwecken eingesetzt werden. Während VLPs aus viralen Kapsiden bestehen, sind Virosomen dagegen Liposomen mit viralen Membranproteinen, in die gezielt Proteine verpackt werden können.However, the viruses or viral vectors described herein are not limited to gene therapy purposes and may, for example, also be used for protein transfer. In this case, such viruses or viral vectors do not necessarily carry a genome, such as "virus-like particles (VLPs)" or virosomes. VLPs and virosomes are virus particles that contain no nucleic acids or functional nucleic acids and are often used for vaccination purposes. Whereas VLPs consist of viral capsids, virosomes are liposomes with viral membrane proteins, in which proteins can be specifically packaged.
Neben Targeting von Viren oder viralen Vektoren liefert die vorliegende Erfindung außerdem Möglichkeiten zur Kopplung beliebiger Antigene an die Oberfläche von viralen Vektoren. Zusammen mit der Expression eines passenden zweiten Antigens durch den viralen Vektor ist so die Herstellung von potenziellen Impfvektoren möglich, die in der Lage sind humorale und zelluläre Immunantworten zu induzieren.In addition to targeting viruses or viral vectors, the present invention also provides possibilities for coupling any antigens to the surface of viral vectors. Together with the expression of a suitable second antigen by the viral vector, it is thus possible to produce potential vaccine vectors capable of inducing humoral and cellular immune responses.
Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entwicklung von Viren oder viralen Vektoren, die sich nach ihrer Produktion und Aufreinigung in einem in vitro Verfahren unter physiologischen Bedingungen an ein beliebiges Protein von Interesse auf ihrer Oberfläche kovalent binden lassen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine einfache, schnelle Durchführung der Kopplung und verzichtet auf den Einsatz von beispielsweise Enzymen, Katalysatoren, chemischen Additiven und/oder anderen Behandlungen. Dies wird dadurch erreicht, dass das erfindungsgemäße Virus oder der virale Vektor mindestens ein Oberflächenprotein mit einer ersten Protein-Domäne eines nicht-viralen Proteins auf der Oberfläche des Virus oder viralen Vektors exprimiert, das in der Lage ist durch Reaktion mit einer zweiten Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins eine kovalente Bindung (Kopplung) zwischen dem Oberflächenprotein und einem Protein von Interesse zu ermöglichen. Zur kovalenten Bindung an das mindestens eine Oberflächenprotein kann jegliches Protein von Interesse verwendet werden, das jene zweite Protein Domäne beinhaltet. Die kovalente Bindung ist dabei vorzugsweise eine Peptidbindung. Die zur kovalenten Bindung führende Reaktion verläuft vorzugsweise unter physiologischen Bedingungen, d.h. in einem Temperaturbereich zwischen 15–45°C und einem pH-Bereich zwischen 6–8. Die kovalente Bindung des mindestens einen Oberflächenproteins mit dem Protein von Interesse beruht auf einer Wechselwirkung der ersten Protein-Domäne mit der zweiten Proteine Domäne. Die Wechselwirkung umfasst dabei zunächst die Assoziation der beiden Protein-Domänen, die gefolgt ist von der Reaktion der beiden Protein-Domänen unter Bildung einer kovalenten Bindung, die vorzugsweise eine Peptidbindung ist. Die Reaktion beruht dabei auf dem Mechanismus des Proteinspleißens in dem das mindestens eine Oberflächenprotein und das Protein von Interesse unter Freisetzung jener ersten und zweiten Protein-Domäne kovalent verknüpft werden (siehe
Die Produktion und Aufreinigung des Virus oder viralen Vektors wird vorzugsweise separat von der Produktion und Aufreinigung des Proteins von Interesse durchgeführt. Erfindungsgemäß muss so ein Virus oder viraler Vektor hinsichtlich einer bestimmten Eigenschaft oder Funktion, beispielsweise hinsichtlich seines Transgens, nur einmal hergestellt werden und kann anschließend in vitro einer spezifischen Modifikation der Oberfläche des Virus oder viralen Vektors durch flexible Wahl eines Proteins von Interesse unterzogen werden, die für die experimentellen Anforderungen oder Anwendungen gewünscht sind bzw. benötigt werden. Somit liegt ein Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, dass ein Virus oder viraler Vektor universell auf seiner Oberfläche mit verschiedenen Proteinen von Interesse in einem einfachen Verfahren modifiziert werden kann. Weiter kann aber auch ein bereits hergestelltes Protein von Interesse (oder ein Plasmid oder eine Zelle, die das Protein von Interesse kodiert oder exprimiert) universell an die Oberfläche verschiedener erfindungsgemäßer Viren oder viralen Vektoren kovalent gebunden werden. Die vorliegende Erfindung eröffnet weiter die einfache Kopplung solcher Proteinen von Interesse an die Oberflache des Virus oder viralen Vektors, die mit den bisherigen dem Stand der Technik zugänglichen Verfahren nur mit enormem experimentellem und zeitlichem Aufwand, mit geringer Ausbeute oder gar nicht möglich waren. Im Fall der AAV Vektoren erschließt sich somit z.B. die Gesamtheit aller verfügbaren Einzelketten-Antikörperfragmente und sonstiger Disulfidbrücken-haltiger Targeting-Domänen zusätzlich zu den bisher innerhalb der genetischen Fusion verwendeten „Designed Ankyrin Repeat Proteins“ (DARPins). Auch die Prozessoptimierung für die Virus bzw. Vektorproduktion muss hier im Vergleich nur ein einziges Mal durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung liefert somit auch attraktive Vorteile für die Kommerzialisierung: ein universelles Virus oder ein universeller viraler Vektor und das für die jeweilige Anwendung relevante und spezifische Protein von Interesse können separat voneinander erzeugt und verkauft werden.The production and purification of the virus or viral vector is preferably carried out separately from the production and purification of the protein of interest. Thus, according to the invention, such a virus or viral vector must be prepared only once for a particular property or function, for example, for its transgene, and subsequently be subjected in vitro to a specific modification of the surface of the virus or viral vector by flexible choice of a protein of interest are desired or needed for the experimental requirements or applications. Thus, an advantage of the present invention is that a virus or viral vector can be universally modified on its surface with various proteins of interest in a simple process. Further, however, an already-produced protein of interest (or a plasmid or a cell encoding or expressing the protein of interest) may be universally attached to the surface of various of the invention Covalently bound to viruses or viral vectors. The present invention further provides for the simple coupling of such proteins of interest to the surface of the virus or viral vector, which were possible with the prior art methods accessible only with enormous experimental and temporal effort, with low yield or not at all. Thus, in the case of AAV vectors, for example, the totality of all available single-chain antibody fragments and other disulfide-bridge-containing targeting domains is revealed in addition to the "designed ankyrin repeat protein" (DARPins) previously used within the genetic fusion. The process optimization for the virus or vector production must be performed only once in comparison here. The present invention thus also provides attractive commercialization benefits: a universal virus or a universal viral vector and the protein of interest of interest and specific to the particular application can be generated and sold separately.
Demnach liefert die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Virus oder einen viralen Vektor umfassend mindestens ein Oberflächenprotein mit mindestens einer ersten Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins, die in der Lage ist durch Reaktion mit einer zweiten Protein Domäne eine kovalente Bindung, vorzugsweise eine Peptidbindung, zwischen dem Oberflächenprotein und einem Protein von Interesse zu ermöglichen.Thus, in one embodiment, the present invention provides a virus or viral vector comprising at least one surface protein having at least a first protein domain of a non-viral protein capable of reacting with a second protein domain, a covalent bond, preferably a peptide bond, between the surface protein and a protein of interest.
In einer Ausführungsform ist die erste Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins in der Lage mit der zweiten Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins ein Proteinspleißen durchzuführen, wobei eine kovalente Bindung, vorzugsweise eine Peptidbindung, zwischen dem Oberflächenprotein und einem Protein von Interesse entsteht. Bevorzugt wird während des Proteinspleißens die erste und zweite Domäne abgespleißt, d.h. freigesetzt. Ferner kann in einer Ausführungsform die Reaktion der ersten Protein-Domäne mit der zweiten Protein-Domäne auf einem Protein-trans-Spleißen beruhen.In one embodiment, the first protein domain of a non-viral protein is capable of protein splicing with the second protein domain of a non-viral protein to form a covalent bond, preferably a peptide bond, between the surface protein and a protein of interest. Preferably, during protein splicing, the first and second domains are spliced, i. released. Furthermore, in one embodiment, the reaction of the first protein domain with the second protein domain may be based on protein-trans splicing.
In einer Ausführungsform bilden die erste und zweite Protein-Domäne einen Protein-Komplex mit Proteinspleißaktivität.In one embodiment, the first and second protein domains form a protein complex having protein splicing activity.
In einer Ausführungsform ist die erste und zweite nicht virale Protein-Domäne ein Intein oder eine Intein-Domäne, oder Derivat davon.In one embodiment, the first and second non-viral protein domains are an intein or an intein domain, or derivative thereof.
In einer Ausführungsform bilden die erste und zweite Protein-Domäne ein funktionelles Intein oder eine funktionelle Intein-Domäne, oder Derivat davon. So kann in einer Ausführungsform die erste Intein-Domäne eine C-terminale-Domäne sein und die zweite Intein-Domäne eine N-terminale Intein-Domäne sein. Ebenfalls möglich ist in einer Ausführungsform, dass die erste Intein-Domäne eine N-terminale Intein-Domäne ist und die zweite Intein-Domäne eine C-terminale Intein-Domäne ist. Dabei bilden die C-terminale Intein-Domäne und die N-terminale Intein-Domäne zusammen eine funktionelles Intein oder eine funktionelle Intein-Domäne mit Proteinspleißaktivität. In einer Ausführungsformen können das funktionelle Intein die funktionelle Intein-Domäne, die C-terminale Intein-Domäne und/oder die N-terminale Intein-Domäne die im Stand der Technik bekannten Inteine oder Split-Inteine, beispielsweise die auf der
In einer Ausführungsform ist das Virus oder der virale Vektor abgeleitet von einem Virus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus (RV), Lentivirus (LV), Masernvirus (MV), Vesicular stomatitis virus (VSV) oder adeno-assoziierter Virus (AAV). In einer weiteren Ausführungsform können das Virus oder der virale Vektor ein pseudotypisiertes Virus oder viraler Vektor sein. In noch einer weitere Ausführungsform ist das Virus oder der virale Vektor abgeleitet von einem pseudotypisierten Virus oder viralen Vektor, der von einem Virus abgeleitet ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus (RV), Lentivirus (LV), Masernvirus (MV), Vesicular stomatitis virus (VSV) oder adeno-assoziierter Virus (AAV). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der virale Vektor ein AAV abgeleiteter viraler Vektor. Der Erfindung zugängliche Vektoren Viren oder Virale Vektoren sind beispielsweise in
In einer Ausführungsform umfasst das Virus oder der virale Vektor ein Transgen. Ferner umfasst das Virus oder der virale Vektor in einer Ausführungsform ein oder mehr Transgene. In noch einer Ausführungsform umfasst das Virus oder der virale Vektor mindestens ein, mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier oder mindestens fünf TransgeneIn one embodiment, the virus or viral vector comprises a transgene. Further, in one embodiment, the virus or viral vector comprises one or more transgenes. In yet another embodiment, the virus or viral vector comprises at least one, at least two, at least three, at least four, or at least five transgenes
In einer Ausführungsform ist die erste Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins an den N-Terminus des mindestens einen Oberflächenproteins fusioniert. Dabei kann die erste Protein-Domäne ein Intein, eine Intein-Domäne oder ein Derivat davon sein. Ferner kann die erste Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins eine C-terminale Intein-Domäne sein (InteinC)(siehe
In einer Ausführungsform ist das mindestens eine Oberflächenprotein ein virales Hüllprotein und/oder ein virales Kapsidprotein. In einer weiteren Ausführungsform ist das mindestens eine Oberflächenprotein ein modifiziertes virales Hüllprotein und/oder ein virales Kapsidprotein. Das modifizierte virale Hüllprotein und/oder virale Kapsidprotein kann modifiziert sein durch eine Aminosäuresubstitution, -deletion oder -addition, oder Kombinationen davon. Eine mögliche beispielhafte Modifikation des viralen Hüllproteins und/oder des viralen Kapsidproteins ist die „Verblindung“ des viralen Hüllproteins und/oder des viralen Kapsidproteins. Dabei werden die für die natürliche Rezeptorbindung verantwortlichen Aminosäuren mutiert, so dass der natürliche Tropismus des Virus/viralen Vektors weitestgehend verloren geht (
In einer Ausführungsform ist die zweite Protein-Domäne mit einem Protein von Interesse (POI) fusioniert. Dabei kann die zweite Protein-Domäne ein Intein, eine Intein-Domäne oder ein Derivat davon sein. Die zweite Protein-Domäne kann am N-Terminus oder am C-Terminus des Proteins von Interesse fusioniert sein. Liegt die zweite Protein-Domäne am N-Terminus des Proteins von Interesse kann die Intein-Domäne eine C-terminale Intein-Domäne (InteinC) oder ein Derivat davon sein (siehe
In einer Ausführungsform ist das Protein von Interesse ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Targeting-Domäne, Antigen, Markerprotein, Ligand, Rezeptor oder funktionelle Fragmente davon. Ferner kann die Targeting Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Antikörper, Antikörperfragmente und DARPins. Beispielhafte Antikörperketten oder davon abgeleitete Antikörperfragmente umfassen Einzelketten-Antikörper, Einzeldomänen-Antikörper, Kamel-Schwere-Kette Antikörper (VHH oder Nanobodies), oder einen rekombinanten Antikörper, der durch Kombination von Antikörperdomänen entwickelt wurde, wie monovalente (Variables Fragment (Fv), Disulfidbrücken-stabilisierte Fv-Antikörperfragment (dsFv), scFv, Einzelketten-Antikörperfragmente (scAb und Fab), divalente (Minibody, Diabody, F(ab‘)2 und (scFv)2) und multivalente (Tetrabody, Triabody und F(ab‘)3) Formate. Targeting-Domänen können beispielsweise auch DARPins („Designed Ankyrin Repeat Proteins“) sein. Der Ligand kann dabei ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Hormon, Wachstumsfaktor, Zytokin, Interferon, Chemokin. Das Antigen kann dabei ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus viralen oder bakteriellen Oberflächenproteinen, viralen oder bakteriellen Strukturproteinen und tumor-assoziierten Proteinen. Tumor-assozierte Proteine können dabei Proteine sein, die im Rahmen der Tumorigenese nicht-physiologisch exprimiert, beispielsweise überexprimiert werden, und/oder Proteine, die im Rahmen der Tumorigenese durch Genmutation eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen, welche beispielsweise in einer veränderten, nicht physiologischen Proteinaktivität resultiert. Das Markerprotein kann dabei ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus wie GFP, eGFP, RFP, CFP, YFP, dsRED oder dsRED2, Firefly Luciferase. Dabei kann das Protein von Interesse modifiziert sein durch eine Modifikation ausgewählt aus der Fusion mit einer weiteren Polypeptidsequenz, mit einem fluoreszierendem Farbstoff, mit einer pharmazeutisch wirksamen Verbindung oder mit einem Toxin.In one embodiment, the protein of interest is selected from the group consisting of targeting domain, antigen, marker protein, ligand, receptor or functional fragments thereof. Furthermore, the targeting domain may be selected from the group consisting of antibodies, antibody fragments and DARPins. Exemplary antibody chains or antibody fragments derived therefrom include single chain antibodies, single domain antibodies, camel heavy chain antibodies (VHH or nanobodies), or a recombinant antibody developed by combination of antibody domains, such as monovalent (variable fragment (Fv), disulfide bridges -stabilized Fv antibody fragment (dsFv), scFv, single chain antibody fragments (scAb and Fab), divalent (minibody, diabody, F (ab ') 2 and (scFv) 2 ) and multivalent (tetrabody, triabody and F (ab')) 3) Formats Targeting domains may, for example, also be DARPins ("Designed Ankyrin Repeat Proteins") The ligand may be selected from the group consisting of hormone, growth factor, cytokine, interferon, chemokine The antigen may be selected from the Group consisting of viral or bacterial surface proteins, viral or bacterial structural proteins and tumor-associated proteins In this context, proteins that have been synthesized can be proteins that are non-physiologically expressed in the course of tumorigenesis, for example overexpressed, and / or proteins which have a modified amino acid sequence as part of tumorigenesis by gene mutation, which results, for example, in an altered, non-physiological protein activity. The marker protein can be selected from the group consisting of GFP, eGFP, RFP, CFP, YFP, dsRED or dsRED2, firefly luciferase. In this case, the protein of interest may be modified by a modification selected from the fusion with a further polypeptide sequence, with a fluorescent dye, with a pharmaceutically active compound or with a toxin.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur kovalenten Kopplung eines Proteins von Interesse an mindestens ein Oberflächenprotein eines Virus oder viralen Vektors. Das Verfahren ist dabei gekennzeichnet durch die Schritte:
- a) Bereitstellen eines Virus oder viralen Vektors, umfassend mindestens ein Oberflächenprotein mit mindestens einer ersten Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins, die in der Lage ist durch Reaktion mit einer zweiten Protein Domäne eines nicht viralen Proteins eine kovalente Bindung, vorzugsweise eine Peptidbindung, zwischen dem Oberflächenprotein und einem Protein von Interesse zu ermöglichen;
- b) Bereitstellen mindestens eines Proteins von Interesse, das mit der zweiten Protein-Domäne fusioniert ist;
- c) Kontaktieren des Virus oder viralen Vektors mit dem Protein von Interesse, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem mindestens einen Oberflächenprotein und dem mindestens einen Protein von Interesse entsteht.
- a) providing a virus or viral vector comprising at least one surface protein having at least a first protein domain of a non-viral protein which is capable of a covalent bond, preferably a peptide bond, by reaction with a second protein domain of a non-viral protein to allow the surface protein and a protein of interest;
- b) providing at least one protein of interest fused to the second protein domain;
- c) contacting the virus or viral vector with the protein of interest, whereby a covalent bond is formed between the at least one surface protein and the at least one protein of interest.
In einer Ausführungsform wird das in b) bereitgestellte Protein von Interesse in Schritt c) mit einer Kopplungseffizienz von mindestens 1%, mindestens 2%, mindestens 3%, mindestens 4%, oder mindestens 5% an das mindestens eine Oberflächenprotein des in a) bereitgestellten Virus oder viralen Vektors kovalent gekoppelt. In one embodiment, the protein of interest provided in b) is provided with a coupling efficiency of at least 1%, at least 2%, at least 3%, at least 4%, or at least 5% to the at least one surface protein of the one provided in a) Covalently linked virus or viral vector.
In manchen Ausführungsformen führt die Kopplung zu mindestens 5%, mindestens 10%, mindestens 15%, mindestens 20%, mindestens 25%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% Kopplungseffizienz.In some embodiments, the coupling results in at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%. , at least 85%, at least 90%, at least 95% coupling efficiency.
In noch einer Ausführungsform entsteht die kovalent Bindung in c) durch Reaktion der ersten Protein-Domäne und der zweiten Protein-Domäne. Dabei kann die Reaktion auf einem Proteintrans-Spleißen beruhen.In yet another embodiment, the covalent bond in c) is formed by reaction of the first protein domain and the second protein domain. The reaction may be based on protein trans splicing.
In einer Ausführungsform kann das Kontaktieren in Schritt c) des Verfahrens durch Mischen des Virus oder viralen Vektors und dem mindestens einem Protein von Interesse bewerkstelligt werden. Dabei werden das in a) bereitgestellte Virus oder virale Vektor und das in b) bereitgestellte Protein von Interesse in Schritt c) für eine Zeit miteinander gemischt, die hinreichend ist damit die Reaktion mindestens 1% Proteins von Interesse mit dem bereitgestellten Virus oder viralen Vektor gekoppelt ist. In einer Ausführungsform erfolgt das Mischen für zwischen 1 Minute und 24 Stunden. Dabei kann das Mischen für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 30, 45 oder 60 Minuten durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Mischen für mindestens 5 Minuten, mindestens 10 Minuten, mindestens 15 Minuten, mindestens 20 Minuten, mindestens 25 Minuten, mindestens 30 Minuten, mindestens 35 Minuten, mindestens 40 Minuten, mindestens 45 Minuten, mindestens 50 Minuten, mindestens 55 Minuten oder mindestens 60 Minuten. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Mischen für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 15, 18 oder 24 Stunden.In one embodiment, contacting in step c) of the method may be accomplished by mixing the virus or viral vector and the at least one protein of interest. In this case, the virus or viral vector provided in a) and the protein of interest provided in b) are mixed together in step c) for a time sufficient for the reaction of at least 1% protein of interest to be coupled to the virus or viral vector provided has. In one embodiment, mixing occurs for between 1 minute and 24 hours. The mixing may be carried out for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 30, 45 or 60 minutes. In a preferred embodiment, mixing is for at least 5 minutes, at least 10 minutes, at least 15 minutes, at least 20 minutes, at least 25 minutes, at least 30 minutes, at least 35 minutes, at least 40 minutes, at least 45 minutes, at least 50 minutes, at least 55 Minutes or at least 60 minutes. In another embodiment, mixing is for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 15, 18 or 24 hours.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Kontaktieren oder Mischen in Schritt c) unter physiologischen Bedingungen. Dabei kann die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 25°C und 42°C und einem pH-Wert zwischen pH 6 und pH 8 erfolgen. Weiter kann die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 32°C und 40°C und einem pH-Wert zwischen pH 6 und pH 8 erfolgen. In einer Ausführungsform erfolgt das Kontaktieren oder Mischen bei einer Temperatur zwischen 36°C und 38°C und einem pH-Wert zwischen pH 6,5 und pH 7,5. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Kontaktieren oder Mischen bei einer Temperatur von 37°C und einem pH-Wert von 7,2.In a further embodiment, the contacting or mixing in step c) takes place under physiological conditions. The reaction can be carried out at a temperature between 25 ° C and 42 ° C and a pH between
In einer anderen Ausführungsform kann die kovalente Kopplung auch unter Bedingungen ablaufen, bei denen einer der Parameter Temperatur und pH in einem Bereich am Rande der physiologischen Bedingungen oder außerhalb der physiologischen Bedingungen liegt. Somit kann die kovalente Kopplung in einer Ausführungsform auch bei einer Temperatur zwischen 4°C und < 15°C oder zwischen > 45°C und 50°C erfolgen. In einer Ausführungsform erfolgt die kovalente Kopplung deshalb bei einer Temperatur von 4°C, 6°C, 8°C, 10°C, 12°C, 13°C, 14,5°C, 45,5°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C oder 50°C. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die kovalente Kopplung bei pH-Werten zwischen pH 4 und pH < 6 oder zwischen pH > 8 und pH 10. In manchen Ausführungsformen erfolgt die kovalente Kopplung bei pH 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 8,5, 9,0, 9,5 oder 10,0.In another embodiment, the covalent coupling can also take place under conditions in which one of the parameters temperature and pH lies in a region on the edge of the physiological conditions or outside the physiological conditions. Thus, in one embodiment, the covalent coupling may also be carried out at a temperature between 4 ° C and <15 ° C or between> 45 ° C and 50 ° C. Therefore, in one embodiment, the covalent coupling is carried out at a temperature of 4 ° C, 6 ° C, 8 ° C, 10 ° C, 12 ° C, 13 ° C, 14.5 ° C, 45.5 ° C, 46 ° C, 47 ° C, 48 ° C, 49 ° C or 50 ° C. In a further embodiment, the covalent coupling takes place at pH values between
In einer weiteren Ausführungsform kann das Verfahren zusätzlich in einem Spleißpuffer erfolgen. Dabei kann der Spleißpuffer mindestens ein Reduktionsmittel umfassen. Das Reaktionsmittel kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus DTT, TCEP und β-Mercaptoethanol.In a further embodiment, the method can additionally take place in a splice buffer. In this case, the splice buffer can comprise at least one reducing agent. The reactant may be selected from the group consisting of DTT, TCEP and β-mercaptoethanol.
Darüber hinaus kann in weiteren Ausführungsformen die Reaktion in Anwesenheit eines Denaturierungsmittels erfolgen, z.B. um die Proteinlöslichkeit zu steigern. Die Reaktion kann beispielsweise in Anwesenheit von Harnstoff erfolgen. In manchen Ausführungsformen erfolgt die Reaktion in Anwesenheit von nicht mehr als 6,5 M, 6 M, 5,5 M, 4,5 M, 4 M, 3,5 M, 3 M, 2,5 M, 2 M, 1,5 M, 1 M oder 0,5 M Harnstoff. In manchen Ausführungsformen erfolgt die Reaktion in Anwesenheit von 0,5 M bis 6 M, 0,5 M bis 4 M, 1 M bis 4,0 M, 2 M bis 4 M oder 3 M bis 4 M Harnstoff. In manchen Ausführungsformen erfolgt die Reaktion in Anwesenheit von 0,5 M bis 2 M oder 0,5 M bis 1 M Harnstoff.Moreover, in other embodiments, the reaction may be in the presence of a denaturant, e.g. to increase protein solubility. The reaction can be carried out, for example, in the presence of urea. In some embodiments, the reaction occurs in the presence of not more than 6.5M, 6M, 5.5M, 4.5M, 4M, 3.5M, 3M, 2.5M, 2M, 1 , 5 M, 1 M or 0.5 M urea. In some embodiments, the reaction occurs in the presence of 0.5M to 6M, 0.5M to 4M, 1M to 4.0M, 2M to 4M, or 3M to 4M urea. In some embodiments, the reaction occurs in the presence of 0.5M to 2M or 0.5M to 1M urea.
Die erfindungsgemäßen Viren oder viralen Vektoren, wie auch das vorliegende Verfahren dienen auch zur Verwendung in der Herstellung von Viren oder viralen Vektoren für die Gentherapie, d.h. zur Verwendung in der Herstellung von Viren oder viralen Vektoren für den spezifischen Austausch oder der Komplementierung von mindestens einem Gen (bzw. defektem Gen) in einer Zielzelle oder einem Zielgewebe. The viruses or viral vectors of the present invention, as well as the subject method, also serve for use in the production of viral or viral vectors for gene therapy, ie, for use in the production of viruses or viral vectors for the specific replacement or complementation of at least one gene (or defective gene) in a target cell or tissue.
Die erfindungsgemäßen Viren oder viralen Vektoren, wie auch das vorliegende Verfahren dienen auch zur Verwendung in der Herstellung von Impfvektoren. Ein mit den erfindungsgemäßen Viren oder viralen Vektoren und/oder dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellter Impfvektor kann ein an ein Oberflächenprotein fusioniertes Antigen tragen. Ein mit den erfindungsgemäßen Viren oder viralen Vektoren und/oder dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellter Impfvektor kann zudem noch ein zweites Antigen haben, das im Genom des Virus oder viralen Vektors kodiert ist und nach der Transduktion der Zielzelle durch diese exprimiert wird. Ein mit Hilfe der Erfindung hergestelltes Virus oder viraler Vektor ist so in der Lage eine humorale und zelluläre Immunantwort zu induzieren.The viruses or viral vectors of the invention, as well as the present method also serve for use in the production of vaccine vectors. A vaccine vector produced with the viruses or viral vectors according to the invention and / or the method according to the invention may carry an antigen fused to a surface protein. A vaccine vector prepared with the viruses or viral vectors according to the invention and / or the method according to the invention may additionally have a second antigen which is encoded in the genome of the virus or viral vector and which is expressed by the transduction of the target cell. A virus or viral vector produced by the invention is thus capable of inducing a humoral and cellular immune response.
Durch die vorliegende Erfindung können somit gezielt ein oder mehr Proteine von Interesse mit mindestens einem Oberflächenprotein eines Virus oder viralen Vektor verknüpft werden. Die eingebrachten ersten und zweiten nicht viralen Proteindomänen katalysieren dabei die Kopplungs- bzw. Verknüpfungsreaktion, die in Abwesenheit von jeglichen anderen Enzymen, chemischen Additiven, wie Katalysatoren, oder Behandlungen erfolgt.Thus, by the present invention, one or more proteins of interest may be specifically linked to at least one surface protein of a virus or viral vector. The introduced first and second non-viral protein domains thereby catalyze the coupling reaction that occurs in the absence of any other enzymes, chemical additives such as catalysts, or treatments.
Abbildungen pictures
Ausführliche Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention
Die hier verwendeten Begriffe sind entsprechend ihrer gewöhnlichen Bedeutung im Fachgebiet zu verstehen, wenn nicht eine andere Definition in dieser Anmeldung angegeben ist.The terms used herein are to be understood as meaningful in the art unless otherwise specified in this application.
Die vorliegende Erfindung kann durch die angehängten Ansprüche definiert werden.The present invention may be defined by the appended claims.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Virus oder viralen Vektor bereit, umfassend mindestens ein Oberflächenprotein mit mindestens einer ersten Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins, die in der Lage ist durch Reaktion mit einer zweiten Protein Domäne eines nicht viralen Proteins eine kovalente Bindung, vorzugsweise eine Peptidbindung, zwischen dem Oberflächenprotein und einem Protein von Interesse zu ermöglichen.The present invention provides a virus or viral vector comprising at least one surface protein having at least a first protein domain of a non-viral protein capable of Reaction with a second protein domain of a non-viral protein to allow a covalent bond, preferably a peptide bond, between the surface protein and a protein of interest.
Weiter stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur kovalenten Kopplung eines Proteins von Interesse an mindestens ein Oberflächenprotein eines Virus oder viralen Vektors, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch die Schritte:
- a) Bereitstellen eines Virus oder viralen Vektors, umfassend mindestens ein Oberflächenprotein mit mindestens einer ersten Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins, die in der Lage ist durch Reaktion mit einer zweiten Protein Domäne eines nicht viralen Proteins eine kovalente Bindung, vorzugsweise eine Peptidbindung, zwischen dem Oberflächenprotein und einem Protein von Interesse zu ermöglichen;
- b) Bereitstellen mindestens eines Proteins von Interesse, das mit der zweiten Protein-Domäne eines nicht viralen Proteins fusioniert ist;
- c) Kontaktieren des Virus oder viralen Vektors mit dem Protein von Interesse, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem mindestens einen Oberflächenprotein und dem mindestens einen Protein von Interesse entsteht.
- a) providing a virus or viral vector comprising at least one surface protein having at least a first protein domain of a non-viral protein which is capable of a covalent bond, preferably a peptide bond, by reaction with a second protein domain of a non-viral protein to allow the surface protein and a protein of interest;
- b) providing at least one protein of interest fused to the second protein domain of a non-viral protein;
- c) contacting the virus or viral vector with the protein of interest, whereby a covalent bond is formed between the at least one surface protein and the at least one protein of interest.
Der Vorteil der beschriebenen Erfindung gegenüber dem Stand der Technik liegt in der Kopplung des Proteins von Interesse an die Oberfläche eines Virus oder viralen Vektors nach erfolgreicher Produktion und Aufreinigung unter physiologischen Bedingungen. Letztlich erfordert dieses System die Erzeugung von nur einem Virus oder viralen Vektor. Die an das Oberflächenprotein des Virus oder viralen Vektors fusionierte erste Protein-Domäne erlaubt es jedes beliebige Protein von Interesse durch eine daran fusionierte zweite Protein-Domäne im Anschluss an die Produktion des Virus oder viralen Vektors unter physiologischen Bedingungen kovalent zu koppeln. Das Oberflächenrezeptor-Targeting von Viren oder viralen Vektoren, das bisher auf Modifikationen beruhte, die auf genetischer Ebene eingebracht wurden, gewinnt dadurch beispielsweise eine weitere Dimension an Flexibilität. Das bisherige Konzept bedeutete die Erzeugung eines neuen Vektorpartikels für jedes neue Target, d.h. das/die zu übertragende/n Transgen/e und/oder die Zielzelle/Zielgewebe. Für AAV-Vektoren beruhte das Targeting auf der genetischen Fusion der Targeting-Domäne an den N-Terminus des AAV-VP2 Kapsid-Proteins. Während der Vektorproduktion mit Produzentenzellen wird so das Oberflächenprotein-Targeting-Domäne-Fusionsprotein in das Viruspartikel eingebaut. Je nach verwendetem Fusionsprotein kommt es dabei zu unterschiedlichen Verpackungseffizienzen, die sich zum Teil erheblich von dem parentalen Vektor unterscheiden. Geringe Ausbeuten der jeweiligen Vektoren fordern entsprechend eine Produktion im größeren Maßstab. Bessere Virustiter können nur durch Optimierung des Verpackungsprotokolls erreicht werden, die zeitintensiv und nicht in jedem Fall nutzbringend sind. Mit der hier beschriebenen Erfindung ist jedes Virus oder jeder virale Vektor bzgl. des Transgens nur einmal herzustellen. Die Targeting-Domänen ebenfalls. Je nach Experiment ist eine flexible Wahl des Transgens, der Targeting-Domäne möglich und das entsprechende Virus oder virale Vektor nach erfolgreicher Kopplung einsetzbar. Ein solches System ist somit insbesondere für das Targeting von Viren oder viralen Vektoren für den selektiven Gentransfer bzw. die selektive Infektion bzw. Transduktion von Zielzellpopulationen oder Zielgewebe mit einem beliebigen Transgen attraktiv. Im Fall von AAV Vektoren erfolgte das AAV Targeting bisher nur durch die Insertion von kurzen Peptidsequenzen in das Kapsid und anschließende Bioselektion von potentiell bindenden Vektoren (AAV Peptid Display Methode (
Definitionen definitions
Der hier verwendete Begriff „viraler Vektor“ bedeutet replikationsdefizientes von einem Virus abgeleitetes Viruspartikel, das in seinem Genom beispielsweise ein therapeutisches Gen (Transgen), ein Gen für ein Markerprotein oder funktionelles Fragment davon enthält, das durch Infektion einer Zielzelle an diese übertragen werden kann (Transduktion). Ein viraler Vektor ist beispielsweise abgeleitet von einem Virus ausgewählt aus Lentivirus (LV), Masernvirus (MV), Vesicular stomatitis Virus (VSV) und adeno-assoziiertes Virus (AAV). Ein viraler Vektor kann zudem pseudotypisiert sein, d.h. dass ein oder mehr Oberflächenproteine des viralen Vektors, die von dem ursprünglich abgeleiteten Virus stammen, durch virale Oberflächenproteine eines anderen Virus ausgetauscht wurden. Für den Austausch können die viralen Oberflächenproteine des anderen Virus in ihrer natürlichen Wildtyp-Form verwendet werden, können aber auch in einer modifizierten Form verwendet werden. Eine modifizierte Form kann gegenüber ihrer Wildtyp-Form modifiziert sein durch ein oder mehr Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen, oder Kombinationen davon. Ebenfalls möglich ist eine Modifikation durch Fusion mit einer anderen Polypeptidsequenz oder Trunkierung. Die modifizierte Form kann aber auch modifiziert sein durch ein oder mehr Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen, oder Kombinationen davon, und zusätzlich modifiziert sein durch Fusion mit einer anderen Polypeptidsequenz oder Trunkierung. Auf diese Weise können verschiedene Veränderungen des viralen Vektors erzeugt werden, die unter anderem eine Veränderung des Tropismus gegenüber den Wirtszellen oder eine erhöhte Stabilität des Viruspartikels bewirken. Der Begriff Virus oder viraler Vektor umfasst hier auch „Virus-like Particles“ und Virosomen, also Viruspartikel, die keine Nukleinsäuren oder keine funktionellen Nukleinsäuren enthalten. Während VLPs aus viralen Kapsiden bestehen, sind Virosomen dagegen Liposomen mit viralen Membranproteinen. Diese Partikel sind oftmals nicht leer, da manche Viren für den Zusammenbau oder den Zusammenhalt sonst instabil werden können, sondern es werden entweder unspezifisch Nukleinsäuren verpackt oder nicht funktionelle DNA bzw. RNA mit den jeweiligen Erkennungssequenzen. Außerdem können in VLPs und Virosomen gezielt Proteine verpackt werden.The term "viral vector" as used herein means replication-deficient virus-derived virus particle containing in its genome, for example, a therapeutic gene (transgene), a gene for a marker protein or functional fragment thereof which can be transferred to it by infection of a target cell ( transduction). For example, a viral vector is derived from a virus selected from lentivirus (LV), measles virus (MV), vesicular stomatitis virus (VSV) and adeno-associated virus (AAV). A viral vector may also be pseudotyped, i. one or more surface proteins of the viral vector derived from the originally derived virus have been exchanged for viral surface proteins of another virus. For replacement, the viral surface proteins of the other virus may be used in their natural wild-type form, but may also be used in a modified form. A modified form may be modified from its wild-type form by one or more amino acid substitutions, deletions or additions, or combinations thereof. Also possible is a modification by fusion with another polypeptide sequence or truncation. However, the modified form may also be modified by one or more amino acid substitutions, deletions or additions, or combinations thereof, and additionally modified by fusion with another polypeptide sequence or truncation. In this way, various changes in the viral vector can be produced, which inter alia cause a change in the tropism to the host cells or increased stability of the virus particle. The term virus or viral vector here also includes "virus-like particles" and virosomes, ie virus particles which contain no nucleic acids or no functional nucleic acids. Whereas VLPs consist of viral capsids, virosomes are liposomes with viral membrane proteins. These particles are often not empty, as some viruses may become unstable for assembly or cohesion, but either nonspecific nucleic acids are packaged or non-functional DNA or RNA with the respective recognition sequences. In addition, proteins can be specifically packaged in VLPs and virosomes.
Der hier verwendete Begriff „Oberflächenprotein“ bezieht sich auf jegliches virale Protein, das an der Oberfläche eines Virus oder Viruspartikels exprimiert ist. Die Virusoberfläche kann der Virushülle, im Fall von behüllten Viren, wie auch dem Viruskapsid, im Falle von unbehüllten Viren entsprechen. Ein Oberflächenprotein kann in die Oberfläche eines Virus eingelagert oder aufgelagert sein. Der Begriff umfasst jedoch auch jegliches nicht-virale Oberflächenprotein, d.h. ein Protein das nicht von einem Virus stammt, aber auf der Oberfläche des Virus exprimiert wird.The term "surface protein" as used herein refers to any viral protein expressed on the surface of a virus or virus particle. The virus surface may correspond to the virus envelope, in the case of enveloped viruses, as well as the virus capsid, in the case of unencumbered viruses. A surface protein may be incorporated or deposited in the surface of a virus. However, the term also includes any non-viral surface protein, i. a protein that is not derived from a virus but that is expressed on the surface of the virus.
Der hier verwendete Begriff „Viruspartikel“ bezieht sich auf ein einzelnes Virus, das sich außerhalb einer Zelle befindet. Das Viruspartikel besteht im Allgemeinen aus ein oder mehr Nukleinsäuremolekülen, die oft von einer Proteinkapsel, dem Kapsid, umgeben sind. Eventuell befinden sich weitere Proteine beispielsweise mit enzymatischen Aktivitäten im Virus. Einige Viren, die sog. behüllten Viren, bestehen zusätzlich aus einer äußeren Lipidmembran, der Virushülle.As used herein, the term "virus particle" refers to a single virus that is external to a cell. The virus particle generally consists of one or more nucleic acid molecules, which are often surrounded by a protein capsule, the capsid. There may be additional proteins in the virus, for example with enzymatic activities. Some viruses, the so-called enveloped viruses, additionally consist of an outer lipid membrane, the virus envelope.
Ein „virales Protein“ wie hierin verwendet bezieht sich vorwiegend auf die endogenen Proteine der hier genannten Viren und andere dem Fachmann wohlbekannten Viren mit eukaryotischer Wirtsspezifität, d.h. Proteine die im Virus enthalten sind und/oder im Genom eines in der Natur vorkommenden Virus kodiert sind. Der Begriff umfasst jedoch nicht Proteine aus Bakteriophagen. Ein „nicht virales Protein“ wie hierin verwendet schließt deshalb alle „viralen Proteine“ aus und bezieht sich vielmehr auf jegliche anderen Proteine nicht viralen Ursprungs, wie prokaryotischen, archaelen oder eukaryotischen Ursprungs. Ein „nicht virales Protein“ wie hier verwendet umfasst jedoch auch jegliche Proteine aus Bakteriophagen. Ein nicht virales Protein kann auch ein synthetisches, nicht-natürliches Protein sein. A "viral protein" as used herein refers primarily to the endogenous proteins of the viruses referred to herein and other viruses of eukaryotic host specificity well known to those skilled in the art, i. Proteins contained in the virus and / or encoded in the genome of a naturally occurring virus. However, the term does not include proteins from bacteriophages. A "non-viral protein" as used herein therefore excludes all "viral proteins" and, rather, refers to any other proteins of non-viral origin, such as prokaryotic, archaelen or eukaryotic origin. However, a "non-viral protein" as used herein also includes any proteins from bacteriophages. A non-viral protein may also be a synthetic, non-natural protein.
Die Begriffe „Protein“, „Polypeptid“ und „Peptid“ werden hier als gleichwertig behandelt und beziehen sich auf ein Polymer aus Aminosäuren jeglicher Länge. Das Polymer kann linear oder verzweigt sein, kann modifizierte Aminosäuren enthalten und kann durch nicht-Aminosäuren unterbrochen sein. Der Begriff umfasst auch ein Aminosäurepolymer das natürlich oder durch einen Eingriff modifiziert wurde, beispielsweise durch Disulfidbrückenbildung, Glykosylierung, Lipidierung, Acetylierung, Phosphorylierung oder irgendeiner anderen Manipulation oder Modifikation wie Konjugation mit einer Markierungskomponente. Ebenfalls in der Definition mit eingeschlossen sind beispielsweise Aminosäurepolymere mit ein oder mehr Aminosäureanaloga, einschließlich beispielsweise nicht-natürliche Aminosäuren, sowie andere Modifikationen, die dem Fachmann bekannt sind.The terms "protein", "polypeptide" and "peptide" are treated as equivalent herein and refer to a polymer of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, may contain modified amino acids, and may be interrupted by non-amino acids. The term also includes an amino acid polymer which has been modified naturally or by interference, for example by disulfide bridge formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification such as conjugation with a label component. Also included in the definition are, for example, amino acid polymers having one or more amino acid analogs, including, for example, non-natural amino acids, as well as other modifications known to those skilled in the art.
Ein Protein kann aus einer einzelnen Domäne oder aus mehreren bestehen. Eine Protein-Domäne wie hier verwendet ist ein Bereich eines Proteins mit stabiler, meist kompakter Faltungsstruktur, der funktionell und strukturell unabhängig von benachbarten Bereichen des Proteins ist. Eine Domäne entspricht dabei meist einem zusammenhängenden Abschnitt der Aminosäuresequenz. Ausnahmen sind die zwei- und mehrteiligen Proteindomänen (englisch: bi- and multipartite domains). Nicht die gesamte Proteinkette besteht aus Domänen. Eine Domäne ist oftmals aus Bündeln von Sekundärstrukturen wie α-Helices und β-Faltblattstrukturen aufgebaut, mit verbindenden Kurven (engl. turn) zwischen den Sekundärstrukturen. Kleine Domänen sind oft durch eine Komplexbindung von Metallionen oder durch Disulfidbrücken stabilisiert.A protein can consist of a single domain or several. A protein domain as used herein is a region of a protein having a stable, mostly compact folding structure that is functional and structurally independent of adjacent regions of the protein. A domain usually corresponds to a contiguous portion of the amino acid sequence. Exceptions are the two- and multi-part protein domains (English: bi- and multipartite domains). Not the entire protein chain is made up of domains. A domain is often composed of bundles of secondary structures such as α-helices and β-sheet structures, with connecting curves between the secondary structures. Small domains are often stabilized by complex binding of metal ions or by disulfide bridges.
Ein „Protein von Interesse“ ist eine vom Benutzer oder Experimentator gezielt ausgewähltes bzw. gewünschtes Protein. Ein Protein von Interesse kann ein natürlich vorkommendes oder ein artifizielles Protein, beispielsweise ein Fusionsprotein, sein. Hinsichtlich der Erfindung können nicht-limitierende Beispiele solcher Proteine von Interesse sein: Targeting-Domänen, Antigene oder Markerproteine. Ein Protein von Interesse kann auch ein von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse sein. Proteine von therapeutischem Interesse können insbesondere Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine (Interleukine, Interferone, TNF, usw.), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder deren Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 usw), Apolipoproteine (ApoAI, ApoAIV, ApoE usw.), Dystrophin oder ein Minidystrophin, Tumorsuppressorgene (p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, usw.), Koagulationsfaktoren VII, VIII, IX, usw., oder auch noch die Gesamtheit oder ein Teil eines natürlichen oder künstlichen Immunglobulins (Fab, ScFv, usw.) sein. Das Protein von Interesse kann auch ein Antigen oder Immunogen, das fähig ist, beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort hervorzurufen, zur Herstellung von Impfstoffen sein. Es kann sich insbesondere um Antigenpeptide handeln, die spezifisch für Bakterien, Viren oder Tumoren sind. Das Protein von Interesse kann auch ein für Zellen toxisches Protein sein.A "protein of interest" is a protein selected or desired by the user or experimenter. A protein of interest may be a naturally occurring or an artificial protein, for example a fusion protein. Non-limiting examples of such proteins may be of interest in the invention: targeting domains, antigens or marker proteins. A protein of interest may also be of therapeutic, vaccinal, agricultural or veterinary interest. Proteins of therapeutic interest may in particular be enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines (interleukins, interferons, TNF, etc.), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc.), apolipoproteins (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc.), dystrophin or a minidystrophin, tumor suppressor genes (p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc.), coagulation factors VII, VIII, IX, etc., or even the whole or part of a natural or artificial immunoglobulin (Fab, ScFv, etc.). The protein of interest may also be an antigen or immunogen capable of eliciting an immune response in humans or animals for the preparation of vaccines. In particular, they may be antigenic peptides specific for bacteria, viruses or tumors. The protein of interest may also be a cell toxic protein.
Der Begriff „Protein-trans-Spleißen“ wie hier verwendet beruht auf dem Mechanismus des „Proteinspleißens“ der dem Fachmann bekannt ist. Das „Proteinspleißen“ ist eine posttranslationale intramolekulare Reaktion bestimmter Proteine, bei der ein Proteinsegment, Intein genannt, aus dem Protein herausgeschnitten wird. Die entstehenden N- und C-terminalen Enden des Proteins (Exteine) werden verknüpft, so dass wieder eine durchgehende Peptidkette entsteht. Die Spleißstelle des Ausgangsproteins ist meistens eine Aminosäure mit nukleophiler Seitenkette wie ein Cystein, Serin oder auch Threonin. Beim „Protein-trans-Spleißen“ (oder auch Proteinspleißen in trans) liegt das Intein in gespaltener Form auf zwei Polypeptiden vor. Solche gespaltenen Inteine (auch Split-Inteine genannt) findet man vereinzelt in der Natur können aber auch durch artifizielle Spaltung eines Inteins erhalten werden. Solche gespaltenen Inteine werden bezüglich des Terminus an dem das zu verknüpfende Extein fusioniert ist als C-terminale Intein-Domäne bzw. N-terminale Intein-Domäne bezeichnet. Eine C-terminale Intein-Domäne und N-terminale Intein-Domäne können zusammen in der Lage sein durch Reaktion die daran fusionierten Exteine kovalent zu verknüpfen; ein gespaltenes Intein mit einem C-terminal fusionierten Extein wird auch als InteinC-Domäne bezeichnet, ein gespaltenes Intein mit einem N-terminal fusionierten Extein wird auch als InteinN-Domäne bezeichnet. Die geteilten Intein-Domänen assoziieren zunächst (nicht kovalente Wechselwirkung) und rekonstituieren ein aktives Intein. Durch Reaktion der beiden geteilten Intein-Domänen werden so die an die Intein-Domänen fusionierten Exteinsequenzen von zwei separat produzierbaren Polypeptiden über den Mechanismus des Protein-trans-Spleißen kovalent verknüpft. Es liegt also eine intermolekulare Reaktion vor. Zwei Intein-Domänen die auf getrennten Polypeptiden vorliegen und zusammen eine Protein-trans-Spleißreaktion durchführen können werden als zueinander komplementär bezeichnet. The term "protein-trans-splicing" as used herein is based on the mechanism of "protein splicing" known to those skilled in the art. "Protein splicing" is a posttranslational intramolecular reaction of certain proteins, in which a protein segment, called intein, is excised from the protein. The resulting N- and C-terminal ends of the protein (Exteine) are linked to form a continuous peptide chain. The splice site of the parent protein is usually an amino acid with nucleophilic side chain such as a cysteine, serine or threonine. In "protein-trans splicing" (or else protein splicing in trans), the intein is present in cleaved form on two polypeptides. Such split inteins (also called split inteins) can be found isolated in nature but can also be obtained by artificial cleavage of an intein. Such cleaved inteins are termed the C-terminal intein domain and N-terminal intein domain, respectively, with respect to the terminus where the exte to be linked is fused. Together, a C-terminal intein domain and N-terminal intein domain may be capable of covalently linking by reaction the exteins fused thereto; a cleaved intein with a C-terminal fused extein is also called an intein C domain, a cleaved intein with an N-terminal fused extein is also called an intein N domain. The shared intein domains first associate (non-covalent interaction) and reconstitute an active intein. By reacting the two shared intein domains, the extein sequences of two separately producible polypeptides fused to the intein domains are covalently linked via the mechanism of protein trans splicing. So there is an intermolecular reaction. Two intein domains which are present on separate polypeptides and together can perform a protein-trans splicing reaction are said to be complementary to one another.
Das Intein ist ein Teil eines Proteins, das in der Lage ist sich selbst aus einem Protein auszuschneiden (Selbstspleißen in cis) und die Ligation der flankierenden Sequenzen durch Bildung einer Peptidbindung zu katalysieren. Ein Split-Intein ist jegliches Intein in dem die N-terminale Domäne des Inteins und die C-terminale Domäne des Inteins nicht direkt über eine Peptidbindung miteinander verknüpft sind. Split-Inteine können natürlichen Ursprungs sein, beispielsweise wurden Split-Inteine in Cyanobakterien und Archaeen gefunden, können aber auch künstlich durch Aufspalten einer Inteinsequenz in zwei Teile erzeugt werden. Nichtlimitierende Bespiele für Inteine können in der
Eine „N-Terminale Intein-Domäne“ oder eine „InteinN-Domäne“ bezieht sich auf eine Inteinsequenz die eine N-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die funktionell ist für die Spleißreaktion in trans und/oder für die Reaktion zum N-terminalen Selbstausschneiden (Selbstspleißen). Eine N-terminale Intein-Domäne kann durch Spleißen in trans herausgespleißt werden (Split-InteinN).An "N-terminal intein domain" or an "Intein N domain" refers to an intein sequence comprising an N-terminal amino acid sequence that is functional for the splice reaction in trans and / or for the N-terminal self-cleavage reaction ( self-splicing). An N-terminal intein domain can be spliced out by splicing into trans (split-intein N ).
Eine „C-Terminale Intein-Domäne“ oder eine „InteinC-Domäne“ bezieht sich auf eine Inteinsequenz die eine C-terminale Aminosäuresequenz umfasst, die funktionell ist für die Spleißreaktion in trans und/oder für die Reaktion zum C-terminalen Selbstausschneiden (Selbstspleißen). Eine C-terminale Intein-Domäne kann durch Spleißen in trans herausgespleißt werden (Split-InteinC).A "C-terminal intein domain" or an "Intein C domain" refers to an intein sequence comprising a C-terminal amino acid sequence that is functional for the splice reaction in trans and / or for the C-terminal self-cleavage reaction ( self-splicing). A C-terminal intein domain can be spliced out by splicing into trans (split intein C ).
„Exteine“ wie hier verwendet sind die flankierenden Sequenzen des/der Inteins/Inteine die durch Selbstspleißen des/der Inteins/Inteine durch Ligation unter Bildung einer Peptidbindung miteinander verknüpft werden. Gemäß der Erfindung umfasst der Begriff Extein ein Protein von Interesse und/oder ein virales Oberflächenprotein."Exteins" as used herein are the flanking sequences of the intein (s) linked by self-splicing of the intein (s) by ligation to form a peptide bond. According to the invention, the term extein comprises a protein of interest and / or a viral surface protein.
Ein „funktionelles Derivat“ in Bezug auf Intein oder Intein-Domäne bezieht sich auf eine Intein-abgeleitete Aminosäuresequenz, die funktionell ist für das intramolekulare Proteinspleißen (Spleißreaktion in cis) und/oder für die Spleißreaktion in trans. Funktionell für das Proteinspleißen bedeutet hier, dass eine mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% Spleißaktivität gegenüber einer Wildtyp-Inteinaktivität erreicht wird. Funktionell für das Proteinspleißen bedeutet hier aber auch, dass eine optimierte oder gesteigerte Spleißaktivität gegenüber einer Wildtyp-Inteinaktivität erreicht wird. Solche dem Fachmann bekannten Änderungen einer Aminosäuresequenz umfassen jegliche Aminosäureadditionen, -substitutionen (konservative und nicht konservativ) oder -deletion. Substituierte oder addierte Aminosäuren können dabei jegliche natürlichen und nicht-natürlichen Aminosäuren wie auch Aminosäureanaloga sein.A "functional derivative" with respect to intein or intein domain refers to an intein-derived amino acid sequence that is functional for intramolecular protein splicing (splicing reaction in cis) and / or for the splicing reaction in trans. Functional for protein splicing here means that at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90% or at least 95% splicing activity over a wild type Inteinaktivität is achieved. Functional for protein splicing, however, also means here that an optimized or increased splicing activity is achieved in comparison to a wild-type intein activity. Such changes in an amino acid sequence known to those skilled in the art include any amino acid additions, substitutions (conservative and non-conservative) or deletion. Substituted or added amino acids may be any natural and non-natural amino acids as well as amino acid analogs.
Ein „funktionelles Derivat“ in Bezug auf eine InteinC-Domäne bezieht sich auf eine InteinC-abgeleitete Aminosäuresequenz, die zusammen mit einer InteinN-Domäne oder einer InteinN-abgeleiteten Aminosäuresequenz funktionell ist für das Protein-trans-Spleißen (Spleißreaktion in trans). Ein „funktionelles Derivat“ in Bezug auf eine InteinN-Domäne bezieht sich auf eine InteinN-abgeleitete Aminosäuresequenz, die zusammen mit einer InteinC-Domäne oder einer InteinC-abgeleiteten Aminosäuresequenz funktionell ist für das Protein-trans-Spleißen (Spleißreaktion in trans). Funktionell für das Proteinspleißen bedeutet hier, dass eine mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% Spleißaktivität gegenüber einer Wildtyp-Inteinaktivität erreicht wird. Funktionell für das Protein-trans-Spleißen bedeutet hier aber auch, dass eine optimierte oder gesteigerte Spleißaktivität gegenüber einer Wildtyp-Inteinaktivität erreicht wird. Solche dem Fachmann bekannten Änderungen einer Aminosäuresequenz umfassen jegliche Aminosäureadditionen, -substitutionen (konservative und nicht konservativ) oder -deletion. Substituierte oder addierte Aminosäuren können dabei jegliche natürlichen und nicht-natürlichen Aminosäuren wie auch Aminosäureanaloga sein.A "functional derivative" with respect to an intein C domain refers to an intein C- derived amino acid sequence that is functional for protein trans-splicing (splice reaction in U.S. Patent Nos. 4,648,846) together with an intein N or intein N- derived amino acid sequence trans). A "functional derivative" with respect to an intein N domain refers to an intein N- derived amino acid sequence that is functional for protein trans-splicing together with an intein C or intein C- derived amino acid sequence (splice reaction in U.S. Pat trans). Functional for protein splicing here means that one has at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90% or at least 95% splicing activity over wild-type intein activity is reached. Functional for protein-trans splicing, however, also means here that an optimized or increased splicing activity is achieved compared to a wild-type intein activity. Such changes in an amino acid sequence known to those skilled in the art include any amino acid additions, substitutions (conservative and non-conservative) or deletion. Substituted or added amino acids may be any natural and non-natural amino acids as well as amino acid analogs.
„Wechselwirkung“ bedeutet in Bezug auf Moleküle die Assoziation oder Zusammenlagerung von zwei oder mehr Molekülen zu größeren Verbänden. Diese physikalische Wechselwirkung kann sich wahlweise auf eine (bio-)chemische Reaktion der Moleküle miteinander erstrecken."Interaction" in reference to molecules means the association or assembly of two or more molecules into larger bandages. This physical interaction can optionally extend to a (bio) chemical reaction of the molecules with each other.
Die hierin verwendeten Begriffe „kovalente Bindung“, „kovalente Kopplung“ oder „kovalente Verknüpfung“ werden äquivalent betrachtet und sind dem Fachmann wohlbekannt. Dabei handelt es sich um eine Form der chemischen Bindungen und ist als solche für den festen Zusammenhalt von Atomen in molekular aufgebauten chemischen Verbindungen verantwortlich. Eine kovalente Bindung beruht auf der gemeinsamen Nutzung von (Valenz-)Elektronen(paaren) zweier Atome und wird deshalb auch Elektronenpaarbindung genannt.As used herein, the terms "covalent bond", "covalent coupling" or "covalent linkage" are considered equivalent and are well known to those skilled in the art. This is a form of chemical bonding and as such is responsible for the solid cohesion of atoms in molecularly constructed chemical compounds. A covalent bond is based on the sharing of (valence) electrons (pairs) of two atoms and is therefore also called electron pair bonding.
Der hier verwendete Begriff „fusionieren“ bezieht sich auf die Verknüpfung von zwei oder mehr Molekülen. Die Verknüpfung kann wahlweise eine verknüpfende Sequenz (Linker) enthalten, um die zwei oder mehr Moleküle funktionell zu einem kontinuierlichen Molekül zu verbinden. Solche Moleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, biologische Moleküle, wie beispielsweise Proteine, Kohlenhydrate, Fette oder Fragmente davon, oder andere Moleküle, wie beispielsweise fluoreszierende Farbstoffe, Toxine, chemische Schutzgruppen oder molekulare Schalter Funktionalitäten (z.B. reversible und irreversible (de-)aktivierbar) oder pharmazeutisch wirksame Moleküle. Beispielsweise sind zwei in einem Fusionsprotein verknüpfte Proteine üblicherweise von zwei unabhängigen (biologischen) Quellen und das Fusionsprotein umfasst deshalb zwei verknüpfte Proteine die normalerweise in der Natur nicht miteinander verknüpft sind. Im Falle eines Fusionsproteins können diese direkt durch eine Peptidbindung funktionsfähig miteinander verknüpft sein oder indirekt durch einen Linker, wie hier beschrieben oder der dem Fachmann wohlbekannt ist, miteinander verknüpft sein.As used herein, the term "fusing" refers to the linking of two or more molecules. The linkage may optionally contain a linking sequence (linker) to functionally connect the two or more molecules into a continuous molecule. Such molecules include, but are not limited to, biological molecules such as proteins, carbohydrates, fats or fragments thereof, or other molecules such as fluorescent dyes, toxins, chemical protecting groups, or molecular switch functionalities (eg, reversible and irreversible (de-) activatable) or pharmaceutically active molecules. For example, two proteins linked in a fusion protein are usually from two independent (biological) sources and therefore the fusion protein comprises two linked proteins that are normally not linked together in nature. In the case of a fusion protein, these may be operably linked together directly by a peptide bond or indirectly linked together by a linker as described herein or well known to those skilled in the art.
Eine „Nukleinsäure“, „Polynukleotid“ oder „Nukleinsäuremolekül“ ist eine polymere Verbindung bestehend aus kovalent verknüpften Nukleotid-Untereinheiten. Nukleinsäuren umfassend Polyribonukleinsäuren (RNA) und Polydesoxyribonukleinsäuren (DNA), die sowohl einzelsträngig wie auch doppelsträngig vorliegen können. DNA umfasst, cDNA, genomische DNA, synthetische DNA und semi-synthetische DNA.A "nucleic acid," "polynucleotide," or "nucleic acid molecule" is a polymeric compound consisting of covalently linked nucleotide subunits. Nucleic acids comprising polyribonucleic acids (RNA) and polydeoxyribonucleic acids (DNA), which may be both single-stranded and double-stranded. DNA, cDNA, genomic DNA, synthetic DNA and semi-synthetic DNA.
„Physiologische Bedingungen“ wie hier verwendet beschreibt jede dem Fachmann wohlbekannte Bedingung die hinsichtlich des pH-Werts und der Temperatur die in der Natur vorkommenden Bedingungen innerhalb einer Zelle oder eines Organismus nachahmen oder diesen gleich- oder Nahe kommen. Solche Bedingungen können durch biologische Puffersysteme hergestellt werden. Wie hier verwendet ist eine physiologische Bedingung jede Bedingung in einem Temperaturbereich zwischen 15°C und 45°C, bevorzugt zwischen 20°C und 42°C, und einem pH-Wertbereich zwischen pH 6 und pH 8. Physiologische Bedingungen umfassen somit Temperaturebereiche zwischen 25°C und 42°C und einem pH-Wert zwischen pH 6 und pH 8, zwischen 32°C und 40°C und einem pH-Wert zwischen pH 6 und pH 8, zwischen 36°C und 38°C und einem pH-Wert zwischen pH 6,5 und pH 7,5. Eine physiologische Bedingung ist auch eine Temperatur von 37°C und ein pH-Wert von 7,2. Physiologische Bedingungen umfassen Temperaturen von 16°C, 20°C, 25°C, 30°C, 32°C, 34°C, 36°C, 37°C, 38°C, 40°C, 42°C oder 45 °C, vorzugsweise bei 37°C und pH-Bereiche von 6,0, 6,5, 6, 8, 7,0, 7,2 7,5, 8,0."Physiological conditions" as used herein describes any condition well known to those skilled in the art which mimics or approximates or approximates, in terms of pH and temperature, the naturally occurring conditions within a cell or organism. Such conditions can be produced by biological buffer systems. As used herein, a physiological condition is any condition in a temperature range between 15 ° C and 45 ° C, preferably between 20 ° C and 42 ° C, and a pH range between
Spleißpuffer wie hier verwendet umfasst jedes Puffersystem, das der Herstellung und Stabilisation der physiologischen Bedingungen dient und in dem die Kopplungsreaktion ablaufen kann. Beipielsweise kann ein Spleißbuffer auf einem Tris/HCl Puffer oder PBS basieren. Das Puffersystem kann ferner ein Reduktionsmittel enthalten. Ein geeignetes Reaktionsmittel ist dabei jedes Reaktionsmittel, das unter den Bedingungen des Spleißpuffers in der Lage ist ein reaktives Cystein eines im Reaktionspuffer vorliegenden Polypeptids zu reduzieren (
Gentransfer wie hier verwendet bezieht sich auf die Übertragung (Transduktion) bzw. Weitergabe von ein oder mehr Genen bzw. von Erbmaterial innerhalb des Genoms eines Virus oder viralen Vektors an eine eukaryotische Zelle. Beim selektiven Gentransfer werden die ein oder mehr Gene nur an eine bestimmte Zellpopulation (Zielzellpopulation) oder an ein Gewebe weitergegeben. Der selektive Gentransfer kann durch die Einführung einer Targeting-Domäne auf der Virusoberfläche begünstigt werden.Gene transfer as used herein refers to the transmission (transduction) or propagation of one or more genes within the genome of a virus or viral vector to a eukaryotic cell. In selective gene transfer, the one or more genes become specific only Cell population (target cell population) or passed on to a tissue. Selective gene transfer can be facilitated by the introduction of a targeting domain on the virus surface.
„Targeting“ von Viren oder viralen Vektoren wie hier verwendet bedeutet ein Virus oder viralen Vektor so zu modifizieren, dass das Virus oder virale Vektor selektive an eine bestimmte Zelle und/oder bestimmtes Gewebe bindet. Das Targeting von Viren oder viralen Vektoren wird mittels Modifikation der Virusoberfläche bewerkstelligt. Dabei wird meist eine Targeting-Domäne an die Oberfläche des Virus- oder viralen Vektors (d.h. Hülle oder Kpasid) angebracht oder in diese integriert."Targeting" viruses or viral vectors as used herein means to modify a virus or viral vector such that the virus or viral vector selectively binds to a particular cell and / or tissue. The targeting of viruses or viral vectors is accomplished by modification of the virus surface. In most cases, a targeting domain is attached to or integrated into the surface of the virus or viral vector (i.e., sheath or kpasid).
Eine „Targeting-Domäne“ wie hier verwendet beschreibt ein Peptid, das selektiv einen bestimmten Zelltyp und/oder ein bestimmtes Gewebe bindet. Eine Targeting-Domäne kann die Bindung an beispielweise eine bestimmte Subpopulation von Blutzellen, Immunzellen, Muskelzellen, Zellen des Nervensystems, Hautzellen, Lungenzellen, Leberzellen, Pankreaszellen, Magenzellen, Nierenzellen, Zellen des Auges, Zellen des Drüsengewebes, Knochen- und Knorpel-bildende Zellen, Fettzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, mukosale Zellen, Stromazellen oder Krebszellen begünstigen. Solche Targeting-Domänen sind beispielsweise Antikörperketten oder davon abgeleitete Antikörperfragmente wie beispielsweise Einzeldomänen-Antikörper, Einzelketten-Antikörper Kamel-Schwere-Kette Antikörper (VHH oder Nanobodies), oder ein rekombinanter Antikörper der durch Kombination von Antikörperdomänen entwickelt wurde, wie monovalente (Variables Fragment (Fv), Disulfidbrücken-stabilisierte Fv-Antikörperfragment (dsFv), scFv, Einzelketten-Antikörperfragmente (scAb) und Fab), divalente (Minibody, Diabody, F(ab‘)2 und (scFv)2) und multivalente (Tetrabody, Triabody und F(ab‘)3) Formate (
„Selektiv Binden“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das Peptid und letztlich das Virus/viraler Vektor mit einer bestimmten Zelle und/oder Gewebe bevorzugt, d.h. häufiger, schneller, länger und/oder mit höherer Affinität assoziiert als mit anderen Zellen und/oder Geweben.By "selectively binding" is meant in this context that the peptide and ultimately the virus / viral vector are preferred to a particular cell and / or tissue, i. more frequent, faster, longer, and / or associated with higher affinity than with other cells and / or tissues.
„Antigen“ ist jegliches Molekül (Protein, Zucker, Lipid oder dergleichen), das von einem Antikörper oder T-Zell-Rezeptor gebunden werden kann."Antigen" is any molecule (protein, sugar, lipid or the like) that can be bound by an antibody or T cell receptor.
„Ligand“ wie hier verwendet bezeichnet ein Molekül, das spezifisch an ein Zielprotein, beispielsweise einen Rezeptor, binden kann. Die Bindung des Liganden ist üblicherweise reversibel und wird insbesondere durch Ionenbindungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals-Kräfte und hydrophobe Effekte ermöglicht. Die Affinität eines Liganden zum Zielprotein kann mit Hilfe von Ligandenbindungstests bestimmt werden. Beispielhafte, nicht limitierende Liganden sind Enzyme oder deren Substrate, Wachstumsfaktoren, Hormone, Interferone oder Zytokine. Bespielhafte, nicht limitierende Rezeptoren sind Substrate oder deren Enzyme, Wachstumsfaktorrezeptoren, Hormonrezeptoren, Interferonrezeptoren oder Zytokinrezeptoren."Ligand" as used herein refers to a molecule that can specifically bind to a target protein, such as a receptor. The binding of the ligand is usually reversible and is made possible in particular by ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces and hydrophobic effects. The affinity of a ligand for the target protein can be determined by ligand binding assays. Exemplary non-limiting ligands are enzymes or their substrates, growth factors, hormones, interferons or cytokines. Representative non-limiting receptors are substrates or their enzymes, growth factor receptors, hormone receptors, interferon receptors or cytokine receptors.
„Markerprotein“ wie hier verwendet bezieht sich auf jegliches Protein, das einer Zelle in der das Markerprotein eingebracht oder an der Zelloberfläche angebracht wurde eine bestimmte Eigenschaft verleiht und beispielsweise der experimentellen Validierung der Transduktion und/oder Visualisierung dient. Ein Markerprotein kann als fertiges Protein in die Zelle eingebracht oder an die Zelloberfläche angebracht werden, oder als für das Markerprotein kodierende Sequenz (DNA, RNA) in die Zelle eingebracht werden (beispielsweise in das Genom) und durch die Zelle exprimiert werden. Solche Markerproteine können z.B. sein: sämtliche im Stand der Technik bekannten fluoreszierende Proteine wie beispielsweise GFP, eGFP, RFP, CFP, YFP, dsRED oder dsRED2. Ein Markerprotein kann aber auch ein pharmazeutisch wirksames Protein, ein Toxin oder ein enzymatischer Reporter (d.h. ein Enzym, dessen enzymatische Aktivität einem biochemischen oder genetischen Nachweis dient, z.B. Luciferase) sein."Marker protein" as used herein refers to any protein that confers a particular property on a cell in which the marker protein has been introduced or attached to the cell surface, for example, for experimental validation of transduction and / or visualization. A marker protein can be introduced into the cell as a final protein or attached to the cell surface, or introduced into the cell (e.g., into the genome) as the marker protein-encoding sequence (DNA, RNA) and expressed by the cell. Such marker proteins may be e.g. be: all known in the art fluorescent proteins such as GFP, eGFP, RFP, CFP, YFP, dsRED or dsRED2. However, a marker protein may also be a pharmaceutically active protein, toxin or enzymatic reporter (i.e., an enzyme whose enzymatic activity is for biochemical or genetic detection, e.g., luciferase).
Eine „hinreichende Zeit“ wie hier verwendet bezieht sich auf eine Zeit oder einen Zeitraum in dem eine bestimmte Kopplungseffizienz erreicht wird.A "sufficient time" as used herein refers to a time or period in which a certain coupling efficiency is achieved.
Unter einer „Kopplungseffizienz“ wie hier verwendet versteht man die Effizienz mit der das Protein von Interesse an das mindestens eine Oberflächenprotein des Virus oder viralen Vektors kovalent gekoppelt wird. Letztendlich entspricht die Kopplungseffizienz somit der Menge des kovalent gekoppelten Proteins von Interesse (bzw. des Kopplungsprodukts) im Verhältnis zur Menge des gesamt verfügbaren Proteins von Interesse oder Oberflächenproteins innerhalb einer Kopplungsreaktion, je nachdem welche der beiden Komponenten in seiner Menge limitierend ist.By "coupling efficiency" as used herein is meant the efficiency with which the protein of interest is covalently coupled to the at least one surface protein of the virus or viral vector. Finally, the coupling efficiency thus corresponds to the amount of covalently coupled protein of interest (or the coupling product) relative to the amount of total available protein of interest or surface protein within a coupling reaction, depending on which of the two components is limiting in its amount.
Der Begriff „Mischen“ wie hier verwendet, bezieht sich auf das Zusammenbringen von zwei oder mehr Komponenten um einen Kontakt oder eine Reaktion der Komponenten untereinander zu ermöglichen. Mischen kann dabei einen initialen aktiven Mischschritt für einen bestimmten Zeitraum und einem darauffolgenden Zeitraum in Ruhe (Inkubationszeit), also ohne aktives Mischen, umfassen. Mischen kann aber auch mehrere aktive Mischschritte für bestimmte Zeiträume umfassen, die unterbrochen sind von mehreren Zeiträumen in Ruhe. Mischen kann aber auch ein kontinuierlicher aktiver Misch-Prozess für einen bestimmten Zeitraum, z.B. durch kontinuierliches Rühren, umfassen. Aktives Mischen umfasst dabei mehrmaliges Auf- und Ab-Pipettieren, kontinuierliches Rühren, Schütteln oder Invertieren. Das Mischen erfolgt dabei beispielsweise für zwischen 1 Minute und 24 Stunden. Dabei kann das Mischen für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 30, 45 oder 60 Minuten durchgeführt werden. Das Mischen kann aber auch für mindestens 5 Minuten, mindestens 10 Minuten, mindestens 15 Minuten, mindestens 20 Minuten, mindestens 25 Minuten, mindestens 30 Minuten, mindestens 35 Minuten, mindestens 40 Minuten, mindestens 45 Minuten, mindestens 50 Minuten, mindestens 55 Minuten oder mindestens 60 Minuten erfolgen. Das Mischen kann aber auch für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 15, 18 oder 24 Stunden erfolgen.The term "mixing" as used herein refers to bringing together two or more components to allow contact or reaction of the components with each other. Mixing can include an initial active mixing step for a certain period of time and a subsequent period at rest (incubation time), ie without active mixing. However, mixing may also involve several active mixing steps for specific periods of time, interrupted by several periods of silence. However, mixing may also involve a continuous active mixing process for a period of time, e.g. by continuous stirring. Active mixing includes repeated up and down pipetting, continuous stirring, shaking or inverting. The mixing takes place, for example, for between 1 minute and 24 hours. The mixing may be carried out for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 30, 45 or 60 minutes. However, mixing may also be for at least 5 minutes, at least 10 minutes, at least 15 minutes, at least 20 minutes, at least 25 minutes, at least 30 minutes, at least 35 minutes, at least 40 minutes, at least 45 minutes, at least 50 minutes, at least 55 minutes or at least 60 minutes. However, the mixing can also be carried out for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 15, 18 or 24 hours.
„Impfvektor“ wie hier verwendet bezeichnet jegliches Virus oder jeden viralen Vektor, das/der eine humorale und/oder zelluläre Immunantwort gegen ein oder mehr (gewünschte) Antigene erzeugen kann."Vaccine vector" as used herein refers to any virus or viral vector capable of producing a humoral and / or cellular immune response to one or more (desired) antigens.
„Verblindet“ in Bezug auf eine Proteinmodifikation bedeutet hier, dass die Aminosäuren innerhalb der Proteinsequenz eines nativen Proteins, die für die Rezeptorerkennung notwendig sind, so mutiert sind, dass das Protein nicht mehr mit seinem natürlichen Liganden oder Rezeptor wechselwirkt. Beispielsweise können die Aminosäuren des Hämagglutinins von Morbilliviren, beispielsweise das Hämagglutinin des Masernvirus, so mutiert sein, dass das mutierte Hämagglutinin nicht mehr an seine natürliche Rezeptoren CD46, SLAM und/oder Nectin-4 bindet und somit „blind“ für diese Rezeptoren ist. Ein VP2-Kapsidprotein des AAV Serotyps 2 kann beispielsweise so mutiert sein, dass es nicht mehr an seinen natürlichen Liganden, dem Heperansulfat-Proteoglykan bindet."Blinded" in terms of protein modification herein means that the amino acids within the protein sequence of a native protein necessary for receptor recognition are mutated so that the protein no longer interacts with its natural ligand or receptor. For example, the amino acids of the hemagglutinin of Morbilliviruses, for example the hemagglutinin of the measles virus, may be mutated such that the mutant hemagglutinin no longer binds to its natural receptors CD46, SLAM and / or nectin-4 and thus is "blind" to these receptors. For example, a VP2 capsid protein of
(Split-)Intein-Systeme und Protein-trans-Spleißen(Split) intein systems and protein trans splicing
InteinC-Domänen und InteinN-Domänen die zusammen ein funktionelles Intein rekonstituieren und zusammen eine Proteinspleißreaktion unterlaufen werden hier als Split-Intein-System bezeichnet. Beispielhafte Split-Intein Systeme umfassen das Npu DnaE (SEQ ID NOs: 18, 19), gp41-1 (SEQ ID NOs: 20, 21), gp41-8 (SEQ ID NOs: 22, 23), NrdJ-1 (SEQ ID NOs: 24, 25), IMPDH-1 (SEQ ID NOs: 26, 27), Ssp DnaE (SEQ ID NOs: 28, 29). Weitere Beispielhafte Split-Intein-Systeme wie auch Inteine, die durch Spaltung als Split-Intein-Systeme verwendet werden können, sind: APMV Pol, Abr PRP8, Aca-G186AR PRP8, Aca-H143 PRP8, Aca-JER2004 PRP8, Aca-NAm1 PRP8, Ade-ER3 PRP8, Ade-SLH14081 PRP8, Afu-Af293 PRP8, Afu-FRR0163 PRP8, Afu-NRRL5109 PRP8, Agi-NRRL6136 PRP8, Ani-FGSCA4 PRP8, Avi PRP8, Bci PRP8, Bde-JEL197 RPB2, Bde-JEL423 PRP8-1, Bde-JEL423 PRP8-2, Bde-JEL423 RPC2, Bde-JEL423 eIF-5B, Bfu-B05 PRP8, CIV RIR1, CV-NY2A ORF212392, CV-NY2A RIR1, CZIV RIR1, Cba-WM02.98 PRP8, Cba-WM728 PRP8, Ceu ClpP, Cga PRP8, Cgl VMA, Cla PRP8, Cmo ClpP, Cmo RPB2 (RpoBb), Cne-A PRP8 (Fne-A PRP8), Cne-AD PRP8 (Fne-AD PRP8), Cne-JEC21 PRP8, Cpa ThrRS, Cre RPB2, CroV Pol, CroV RIR1, CroV RPB2, CroV Top2, Cst RPB2, Ctr ThrRS, Ctr VMA, Ctr-MYA3404 VMA, Ddi RPC2, Dhan GLT1, Dhan VMA, Eni PRP8, Eni-FGSCA4 PRP8, Fte RPB2 (RpoB), Gth DnaB, HaV01 Pol, Hca PRP8, IIV6 RIR1, Kex-CBS379 VMA, Kla-CBS683 VMA, Kla-IFO1267 VMA, Kla-NRRLY1140 VMA, Lel VMA, Mca-CBS113480 PRP8, Nau PRP8, Nfe-NRRL5534 PRP8, Nfi PRP8, Ngl-FR2163 PRP8, Ngl-FRR1833 PRP8, Nqu PRP8, Nspi PRP8, Pabr-Pb01 PRP8, Pabr-Pb03 PRP8, Pan CHS2, Pan GLT1, Pbl PRP8-a, Pbl PRP8-b, Pbr-Pb18 PRP8, Pch PRP8, Pex PRP8, Pgu GLT1, Pgu-alt GLT1, Pno GLT1, Pno RPA2, Ppu DnaB, Pst VMA, Ptr PRP8, Pvu PRP8, Pye DnaB, Sas RPB2, Sca-CBS4309 VMA, Sca-IFO1992 VMA, Scar VMA, Sce VMA, Sce-DH1-1A VMA, Sce-JAY291 VMA, Sce-OUT7091 VMA, Sce-OUT7112 VMA, Sce-YJM789 VMA, Sda VMA, Sex-IFO1128 VMA, She RPB2 (RpoB), Sja VMA, Spa VMA, Spu PRP8, Sun VMA, Tgl VMA, Tpr VMA, Ure-1704 PRP8, Vpo VMA, WIV RIR1, Zba VMA, Zbi VMA, Zro VMA, AP-APSE1 dpol, AP-APSE2 dpol, AP-APSE4 dpol, AP-APSE5 dpol, AP-Aaphi23 MupF, Aae RIR2, Aave-AAC001 Aave1721, Aave-AAC001 RIR1, Aave-ATCC19860 RIR1, Aba Hyp-02185, Ace RIR1, Aeh DnaB-1, Aeh DnaB-2, Aeh RIR1, AgP-S1249 MupF, Aha DnaE-c, Aha DnaE-n, Alvi-DSM180 GyrA, Ama MADE823, Amax-CS328 DnaX, Aov DnaE-c, Aov DnaE-n, Apl-C1 DnaX, Arsp-FB24 DnaB, Asp DnaE-c, Asp DnaE-n, Ava DnaE-c, Ava DnaE-n, Avin RIR1 BIL, Bce-MCO3 DnaB, Bce-PC184 DnaB, Bse-MLS10 TerA, BsuP-M1918 RIR1, BsuP-SPBc2 RIR1, Bvi IcmO, CP-P1201 Thy1, Cag RIR1, Cau SpoVR, CbP-C-St RNR, CbP-D1873 RNR, Cbu-Dugway DnaB, Cbu-Goat DnaB, Cbu-RSA334 DnaB, Cbu-RSA493 DnaB, Cce Hyp1-Csp-2, Cch RIR1, Ccy Hyp1-Csp-1, Ccy Hyp1-Csp-2, Cfl-DSM20109 DnaB, Chy RIR1, Ckl PTerm, Cra-CS505 DnaE-c, Cra-CS505 DnaE-n, Cra-CS505 GyrB, Csp-CCY0110 DnaE-c, Csp-CCY0110 DnaE-n, Csp-PCC7424 DnaE-c, Csp-PCC7424 DnaE-n, Csp-PCC7425 DnaB, Csp-PCC7822 DnaE-n, Csp-PCC8801 DnaE-c, Csp-PCC8801 DnaE-n, Cth ATPase BIL, Cth-ATCC27405 TerA, Cth-DSM2360 TerA, Cwa DnaB, Cwa DnaE-c, Cwa DnaE-n, Cwa PEP, Cwa RIR1, Daud RIR1, Dge DnaB, Dha-DCB2 RIR1, Dha-Y51 RIR1, Dpr-MLMS1 RIR1, Dra RIR1, Dra Snf2-c, Dra Snf2-n, Dra-ATCC13939 Snf2, Dth UDP GD, Dvul ParB, EP-Min27 Primase, Fal DnaB, Fsp-CcI3 RIR1, Gob DnaE, Gob Hyp, Gvi DnaB, Gvi RIR1-1, Gvi RIR1-2, Hhal DnaB, Kfl-DSM17836 DnaB, Kra DnaB, LLP-KSY1 PolA, LP-phiHSIC Helicase, Lsp-PCC8106 GyrB, MP-Be DnaB, MP-Be gp51, MP-Catera gp206, MP-KBG gp53, MP-Mcjw1 DnaB, MP-Omega DnaB, MP-U2 gp50, Maer-NIES843 DnaB, Maer-NIES843 DnaE-c, Maer-NIES843 DnaE-n, Mau-ATCC27029 GyrA, Mav-104 DnaB, Mav-ATCC25291 DnaB, Mav-ATCC35712 DnaB, Mav-PT DnaB, Mbo Pps1, Mbo RecA, Mbo SufB (Mbo Pps1), Mbo-1173P DnaB, Mbo-AF2122 DnaB, Mca MupF, Mca RIR1, Mch RecA, Mcht-PCC7420 DnaE-1, Mcht-PCC7420 DnaE-2c, Mcht-PCC7420 DnaE-2n, Mcht-PCC7420 GyrB, Mcht-PCC7420 RIR1-1, Mcht-PCC7420 RIR1-2, Mex Helicase, Mex TrbC, Mfa RecA, Mfl GyrA, Mfl RecA, Mfl-ATCC14474 RecA, Mfl-PYR-GCK DnaB, Mga GyrA, Mga RecA, Mga SufB (Mga Pps1), Mgi-PYR-GCK DnaB, Mgi-PYR-GCK GyrA, Mgo GyrA, Min-1442 DnaB, Min-ATCC13950 GyrA, Mkas GyrA, Mkas-ATCC12478 GyrA, Mle-Br4923 GyrA, Mle-TN DnaB, Mle-TN GyrA, Mle-TN RecA, Mle-TN SufB (Mle Pps1), Mma GyrA, Mmag Magn8951 BIL, Msh RecA, Msm DnaB-1, Msm DnaB-2, Msp-KMS DnaB, Msp-KMS GyrA, Msp-MCS DnaB, Msp-MCS GyrA, Mthe RecA, Mtu SufB (Mtu Pps1), Mtu-C RecA, Mtu-CDC1551 DnaB, Mtu-CPHL RecA, Mtu-Canetti RecA, Mtu-EAS054 RecA, Mtu-F11 DnaB, Mtu-H37Ra DnaB, Mtu-H37Rv DnaB, Mtu-H37Rv RecA, Mtu-Haarlem DnaB, Mtu-K85 RecA, Mtu-R604 RecA-n, Mtu-So93 RecA, Mtu-T17 RecA-c, Mtu-T17 RecA-n, Mtu-T46 RecA, Mtu-T85 RecA, Mtu-T92 RecA, Mvan DnaB, Mvan GyrA, Mxa RAD25, Mxe GyrA, Naz-0708 RIR1-1, Naz-0708 RIR1-2, Nfa DnaB, Nfa Nfa15250, Nfa RIR1, Nosp-CCY9414 DnaE-n, Npu DnaB, Npu GyrB, Npu-PCC73102 DnaE-c, Npu-PCC73102 DnaE-n, Nsp-JS614 DnaB, Nsp-JS614 TOPRIM, Nsp-PCC7120 DnaB, Nsp-PCC7120 DnaE-c, Nsp-PCC7120 DnaE-n, Nsp-PCC7120 RIR1, Oli DnaE-c, Oli DnaE-n, PP-PhiEL Helicase, PP-PhiEL ORF11, PP-PhiEL ORF39, PP-PhiEL ORF40, Pfl Fha BIL, Plut RIR1, Pma-EXH1 GyrA, Pma-ExH1 DnaE, Pna RIR1, Pnuc DnaB, Posp-JS666 DnaB, Posp-JS666 RIR1, Pssp-A1-1 Fha, Psy Fha, Rbr-D9 GyrB, Rce RIR1, Rer-SK121 DnaB, Rma DnaB, Rma-DSM4252 DnaB, Rma-DSM4252 DnaE, Rsp RIR1, SaP-SETP12 dpol, SaP-SETP3 Helicase, SaP-SETP3 dpol, SaP-SETP5 dpol, Sare DnaB, Sav RecG Helicase, Sel-PC6301 RIR1, Sel-PC7942 DnaE-c, Sel-PC7942 DnaE-n, Sel-PC7942 RIR1, Sel-PCC6301 DnaE-c, Sel-PCC6301 DnaE-n, Sep RIR1, ShP-Sfv-2a-2457T-n Primase, ShP-Sfv-2a-301-n Primase, ShP-Sfv-5 Primase, SoP-SO1 dpol, Spl DnaX, Sru DnaB, Sru PolBc, Sru RIR1, Ssp DnaB, Ssp DnaE-c, Ssp DnaE-n, Ssp DnaX, Ssp GyrB, Ssp-JA2 DnaB, Ssp-JA2 RIR1, Ssp-JA3 DnaB, Ssp-JA3 RIR1, Ssp-PCC7002 DnaE-c, Ssp-PCC7002 DnaE-n, Ssp-PCC7335 RIR1, StP-Twort ORF6, Susp-NBC371 DnaB intein, Taq-Y51MC23 DnaE, Taq-Y51MC23 RIR1, Tcu-DSM43183 RecA, Tel DnaE-c, Tel DnaE-n, Ter DnaB-1, Ter DnaB-2, Ter DnaE-1, Ter DnaE-2, Ter DnaE-3c, Ter DnaE-3n, Ter GyrB, Ter Ndse-1, Ter Ndse-2, Ter RIR1-1, Ter RIR1-2, Ter RIR1-3, Ter RIR1-4, Ter Snf2, Ter ThyX, Tfus RecA-1, Tfus RecA-2, Tfus Tfu2914, Thsp-K90 RIR1, Tth-DSM571 RIR1, Tth-HB27 DnaE-1, Tth-HB27 DnaE-2, Tth-HB27 RIR1-1, Tth-HB27 RIR1-2, Tth-HB8 DnaE-1, Tth-HB8 DnaE-2, Tth-HB8 RIR1-1, Tth-HB8 RIR1-2, Tvu DnaE-c, Tvu DnaE-n, Tye RNR-1, Tye RNR-2, Ape APE0745, Cme-boo Pol-II, Fac-Fer1 RIR1, Fac-Fer1 SufB (Fac Pps1), Fac-TypeI RIR1, Fac-typeI SufB (Fac Pps1), Hma CDC21, Hma Pol-II, Hma PolB, Hma TopA, Hmu-DSM12286 MCM, Hmu-DSM12286 PolB, Hsa-R1 MCM, Hsp-NRC1 CDC21, Hsp-NRC1 Pol-II, Hut MCM-2, Hut-DSM12940 MCM-1, Hvo PolB, Hwa GyrB, Hwa MCM-1, Hwa MCM-2, Hwa MCM-3, Hwa MCM-4, Hwa Pol-II-1, Hwa Pol-II-2, Hwa PolB-1, Hwa PolB-2, Hwa PolB-3, Hwa RCF, Hwa RIR1-1, Hwa RIR1-2, Hwa Top6B, Hwa rPol A'', Maeo Pol-II, Maeo RFC, Maeo RNR, Maeo-N3 Helicase, Maeo-N3 RtcB, Maeo-N3 UDP GD, Mein-ME PEP, Mein-ME RFC, Memar MCM2, Memar Pol-II, Mesp-FS406 PolB-1, Mesp-FS406 PolB-2, Mesp-FS406 PolB-3, Mesp-FS406-22 LHR, Mfe-AG86 Pol-1, Mfe-AG86 Pol-2, Mhu Pol-II, Mja GF-6P, Mja Helicase, Mja Hyp-1, Mja IF2, Mja KlbA, Mja PEP, Mja Pol-1, Mja Pol-2, Mja RFC-1, Mja RFC-2, Mja RFC-3, Mja RNR-1, Mja RNR-2, Mja RtcB (Mja Hyp-2), Mja TFIIB, Mja UDP GD, Mja r-Gyr, Mja rPol A', Mja rPol A'', Mka CDC48, Mka EF2, Mka RFC, Mka RtcB, Mka VatB, Mth RIR1, Mvu-M7 Helicase, Mvu-M7 Pol-1, Mvu-M7 Pol-2, Mvu-M7 Pol-3, Mvu-M7 UDP GD, Neq Pol-c, Neq Pol-n, Nma-ATCC43099 MCM, Nma-ATCC43099 PolB-1, Nma-ATCC43099 PolB-2, Nph CDC21, Nph PolB-1, Nph PolB-2, Nph rPol A'', Pab CDC21-1, Pab CDC21-2, Pab IF2, Pab KlbA, Pab Lon, Pab Moaa, Pab Pol-II, Pab RFC-1, Pab RFC-2, Pab RIR1-1, Pab RIR1-2, Pab RIR1-3, Pab RtcB (Pab Hyp-2), Pab VMA, Par RIR1, Pfu CDC21, Pfu IF2, Pfu KlbA, Pfu Lon, Pfu RFC, Pfu RIR1-1, Pfu RIR1-2, Pfu RtcB (Pfu Hyp-2), Pfu TopA, Pfu VMA, Pho CDC21-1, Pho CDC21-2, Pho IF2, Pho KlbA, Pho LHR, Pho Lon, Pho Pol I, Pho Pol-II, Pho RFC, Pho RIR1, Pho RadA, Pho RtcB (Pho Hyp-2), Pho VMA, Pho r-Gyr, Psp-GBD Pol, Pto VMA, Smar 1471, Smar MCM2, Tac-ATCC25905 VMA, Tac-DSM1728 VMA, Tag Pol-1 (Tsp-TY Pol-1), Tag Pol-2 (Tsp-TY Pol-2), Tag Pol-3 (Tsp-TY Pol-3), Tba Pol-II, Tfu Pol-1, Tfu Pol-2, Thy Pol-1, Thy Pol-2, Tko CDC21-1, Tko CDC21-2, Tko Helicase, Tko IF2, Tko KlbA, Tko LHR, Tko Pol-1 (Pko Pol-1), Tko Pol-2 (Pko Pol-2), Tko Pol-II, Tko RFC, Tko RIR1-1, Tko RIR1-2, Tko RadA, Tko TopA, Tko r-Gyr, Tli Pol-1, Tli Pol-2, Tma Pol, Ton-NA1 LHR, Ton-NA1 Pol, Tpe Pol, Tsi-MM739 Lon, Tsi-MM739 Pol-1, Tsi-MM739 Pol-2, Tsi-MM739 RFC, Tsp AM4 RtcB, Tsp-AM4 LHR, Tsp-AM4 Lon, Tsp-AM4 RIR1, Tsp-GE8 Pol-1, Tsp-GE8 Pol-2, Tsp-GT Pol-1, Tsp-GT Pol-2, Tsp-OGL-20P Pol, Tthi Pol, Tvo VMA, Tzi Pol, Unc-ERS PFL, Unc-ERS RIR1, Unc-ERS RNR, Unc-MetRFS MCM2. Die Squenzen können beispielsweise auf der
Inteine und Split-Inteine können ein oder mehr der sechs konservierten Proteinspleißmotive (Block A, N2, B, N4, F und G) der HINT(Hog/Intein)-Familie enthalten. N-Terminale Inteinmotive gehören zu den Blöcken A, N2, B und N4, während C-Terminale Inteinmotive zu den Blöcken F und G gehören. Die Sequenzen dieser Proteinspleißmotive können auch dazu dienen, (Split)Intein-Derivate davon abzuleiten. Manche Aminosäuren der Proteinspleißmotiv-Sequenzen sind streng konserviert während andere weniger streng konserviert sind. Mutationen (Aminosäuresubstitution, -addition oder -deletion) von streng konservierten Aminosäuren können dabei die Proteinspleiß-Effizienz reduzieren. Sequenzinformationen der konservierten Proteinspleißmotive der oben gelisteten Inteine/Split-Inteine bzw. deren konservierte Aminosäurereste können beispielsweise von der Intein-Datenbank abgerufen werden:
Eine Aminosäure- oder Aminosäuregruppenbezeichnung in der Konsensussequenz weist darauf hin, dass die Aminosäure (Großbuchstabe) oder Aminosäuregruppe (Kleinbuchstabe) in der Mehrheit der ersten 38 sequenzierten Inteine vorliegen, ausschließlich der sehr ähnlichen allelischen Inteine in
Auf Basis der Konsensussequenz und dem zugehörigen Konsensusschlüssel können beliebige Spleißmotiv-Derivate erzeugt werden. Ein (Split)Intein-Derivat kann dabei ein oder mehr der Blöcke A, N2, B, N4, F und G oder davon abgeleitete Proteinspleißmotive enthalten. Eine N-terminale Intein-Domäne kann dabei ein oder mehr Spleißmotive der Blöcke A, N2, B und N4 oder davon abgeleitete Proteinspleißmotive enthalten. Eine C-terminale Intein-Domäne kann dabei ein oder mehr Spleißmotive der Blöcke F und G oder davon abgeleitete Proteinspleißmotive enthalten.On the basis of the consensus sequence and the associated consensus key, any splice motif derivatives can be generated. A (split) intein derivative may contain one or more of the blocks A, N2, B, N4, F and G or protein splice motifs derived therefrom. An N-terminal intein domain may contain one or more splice motifs of blocks A, N2, B and N4 or protein splice motifs derived therefrom. A C-terminal intein domain may contain one or more splice motifs of blocks F and G or protein splice motifs derived therefrom.
Die erste Aminosäure in einer N-terminalen Intein-Domäne ist hochkonserviert und entscheidend für die Proteinspleißreaktion und ist meist eine nukleophile Aminosäure ausgewählt aus Cystein, Threonin oder Serin. In N-terminalen Intein-Domänen in denen die Spleißaktiviät zwischen einem Extein und einem Intein verringert oder verhindert werden soll kann die nukleophile Aminosäure ausgewählt aus Cystein, Threonin oder Serin am N-Terminus der Intein-Domäne ausgetauscht werden durch eine andere Aminosäure die nicht Cystein, Threonin oder Serin ist. In C-terminalen Intein-Domänen sind die letzte und vorletzte Aminosäure hochkonserviert und entscheidend für die Spleißreaktion. Die letzte Aminosäure der C-terminalen Domäne ist meist eine Aminosäure ausgewählt aus Asparagin oder Glutamin. Die vorletzte Aminosäure ist meist ein Histidin. Die erste Aminosäure des Exteins das auf die C-terminale Intein-Domäne folgt ist zudem meist ausgewählt aus einer nukleophilen Aminosäure ausgewählt aus Cystein, Threonin oder Serin. In C-terminalen Intein-Domänen in denen die Spleißaktiviät zwischen einem Extein und einem Intein verringert oder verhindert werden soll kann die letzte und/oder vorletzte Aminosäure am C-Terminus der Intein-Domäne ausgetauscht werden durch eine andere Aminosäure als die gerade beschriebenen.The first amino acid in an N-terminal intein domain is highly conserved and crucial for the protein splicing reaction and is usually a nucleophilic amino acid selected from cysteine, threonine or serine. In N-terminal intein domains in which the splice activity between an extein and an intein may be reduced or prevented, the nucleophilic amino acid selected from cysteine, threonine or serine at the N-terminus of the intein domain may be replaced by another amino acid other than cysteine, threonine or serine. In C-terminal intein domains, the last and penultimate amino acids are highly conserved and critical for the splicing reaction. The last amino acid of the C-terminal domain is usually an amino acid selected from asparagine or glutamine. The penultimate amino acid is usually a histidine. The first amino acid of the exte following the C-terminal intein domain is moreover usually selected from a nucleophilic amino acid selected from cysteine, threonine or serine. In C-terminal intein domains in which the splicing activity between an extein and an intein is to be reduced or prevented, the last and / or penultimate amino acid at the C-terminus of the intein domain may be replaced by an amino acid other than those just described.
Die erfindungsgemäßen (Split-)Intein-Systeme können auch einige Aminosäuren ihrer natürlichen Exteine umfassen, um beispielsweise die Spleißeffizienz zu erhöhen. So kann eine N-Terminale Intein-Domäne (InteinN) sowohl die eigentliche Inteinsequenz als auch einige Aminosäuren ihres am N-Terminus anghängten natürlichen Exteins umfassen. Gleichermaßen kann eine C-Terminale Intein-Domäne (InteinC) sowohl die eigentliche Inteinsequenz und einige Aminosäuren ihres am C-Terminus anghängten natürlichen Exteins umfassen. Beispielsweise kann eine N-terminale Intein-Domäne 1, 2, 3, 4, 5 oder auch mehr Extein-Aminosäuren (auch bezeichnet als –1, –2, –3, –4, –5 Aminosäure, etc.) umfassen. Eine C-terminale Intein-Domäne kann beispielsweise 1, 2, 3, 4, 5 oder auch mehr Extein-Aminosäuren (auch bezeichnet als +1, +2, +3, +4, +5 Aminosäure, etc.) umfassen. Diese Extein-Aminoäuren werden im Rahmen der Intein-vermittelten Spleißreaktionen nicht-herausgeschnitten und verbleiben nach einer Kopplungsreaktion gemäß der Erfindung zwischen dem Protein von Interesse und dem Oberflächenprotein des Virus oder viralen Vektors. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein N-terminales Intein ausgwählt von einem ein InteinN-Fragement aus gp41-1 (SEQ ID NO: 20), gp41-8 (SEQ ID NO: 22), NrdJ-1 (SEQ ID NO: 24) oder IMPH1 (SEQ ID NO: 26) zusammen mit ihren 5 nativen Extein-Aminosäureresten (–1 bis –5 Aminosäuren). In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein N-terminales Intein deshalb ausgewählt aus TRSGY-gp41-1, SQLNR-gp41-8, GTNPC-NrdJ-1 oder GIGGG-IMPH1. Zudem ist in einer bevorzugten Ausführungsform ein C-terminales Intein ausgwählt von einem ein InteinC-Fragement von gp41-1 (SEQ ID NO: 21), gp41-8 (SEQ ID NO: 23), NrdJ-1 (SEQ ID NO: 25) oder IMPH1 (SEQ ID NO: 27) zusammen mit ihren 5 nativen Extein-Aminosäureresten (+1 bis +5 Aminosäuren). In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein C-terminales Intein deshalb ausgewählt aus gp41-1-SSSDV, gp41-8-SAVEE, NrdJ-1-SEIVL oder IMPH1-SICST (siehe
Gerade bei Split-Intein bzw. dem Proteinspleißen in trans ist für die Spleißaktivität entscheidend, dass die inaktiven, gespaltenen Intein-Domänen – die N-terminale (Split)Intein-Domäne und die C-terminale (Split)Intein-Domäne – zunächst assoziieren. Um die Assoziation zu fördern können die beiden Domänen beispielsweise so modifiziert werden, dass sie gegensätzliche Ladungen haben. So kann beispielsweise die N-terminale (Split)Intein-Domäne negativ geladen sein und die C-terminale (Split)Intein-Domäne positiv geladen, oder umgekehrt. Eine Assoziation lässt sich aber auch durch zusätzliche Fusion von Dimerisierungsdomänen an die N-terminale (Split)Intein-Domäne und die C-terminale (Split)Intein-Domäne fördern bzw. auch kontrollieren. Eine Dimerisierungsdomäne von zwei miteinander wechselwirkenden Dimerisierungsdomänen kann dabei an die N-terminale (Split)Intein-Domäne fusioniert sein und die andere Dimerisierungsdomäne der zwei miteinander wechselwirkenden Dimerisierungsdomänen kann dabei an die C-terminale (Split)Intein-Domäne fusioniert sein. So könnten beispielsweise auch N-terminale (Split)Intein-Domänen und C-terminale (Split)Intein-Domänen verwendet und zur Assoziation gebracht werden, die ohne die Dimerisierungsdomänen nur schlecht oder gar nicht assoziieren würden. Eine kontrollierte Dimerisierung der beiden miteinander wechselwirkenden Dimerisierungsdomänen und somit eine kontrollierte Assoziation der N-terminalen(Split)Intein-Domäne und der C-terminale (Split)Intein-Domäne kann beispielsweise dadurch erreicht werden, wenn Liganden-abhängige Dimerisierungsdomänen verwendet werden. Liganden-abhängige Dimerisierungsdomänen sind Dimerisierungsdomänen die ausschließlich in Gegenwart eines bestimmten Liganden, beispielsweise einem kleinen organischen Liganden, dimerisieren. Das bedeutet, dass die N-terminale (Split)Intein-Domäne und die C-terminale (Split)Intein-Domäne erst in Anwesenheit des Liganden assoziieren bzw. besser assoziieren.Especially with split inteins or protein splicing in trans, it is crucial for the splicing activity that the inactive, split intein domains - the N-terminal (split) intein domain and the C-terminal (split) intein domain - first associate , For example, to promote association, the two domains can be modified to have opposite charges. For example, the N-terminal (split) intein domain may be negatively charged and the C-terminal (split) intein domain positively charged, or vice versa. However, an association can also be promoted or controlled by additional fusion of dimerization domains to the N-terminal (split) intein domain and the C-terminal (split) intein domain. A dimerization domain of two interacting dimerization domains may be fused to the N-terminal (split) intein domain and the other dimerization domain of the two interacting dimerization domains may be fused to the C-terminal (split) intein domain. For example, N-terminal (split) intein domains and C-terminal (split) intein domains could also be used and made to associate, which would have little or no association without the dimerization domains. Controlled dimerization of the two interacting dimerization domains and thus controlled association of the N-terminal (split) intein domain and the C-terminal (split) intein domain can be achieved, for example, by using ligand-dependent dimerization domains. Ligand-dependent dimerization domains are dimerization domains exclusively in the presence of a particular ligand, for example a small one organic ligands, dimerize. This means that the N-terminal (split) intein domain and the C-terminal (split) intein domain only associate or better associate in the presence of the ligand.
Für die erfolgreiche Expression der Split-Intein-Domänen auf der Oberfläche von Viren oder viralen Vektoren kann die Aminosäure-Komposition bzw. der isoelektrische Punkt der Domänen (d.h. die Nettoladung) entscheidend sein. In Abhängigkeit des jeweils genutzten Virus oder viralen Vektors können sich die Anforderungen an die (Split-)Intein-Domäne(n) unterscheiden. Entsprechend sind neben dem bisher innerhalb der Beispiele genutztem Npu DnaE Split-Intein-System (SEQ ID NOs: 18, 19) auch insbesondere die folgenden Split-Intein-Systeme oder davon abgeleiteten Split-Intein-Systemen verwendbar: gp41-1 (SEQ ID NOs: 20, 21), gp41-8 (SEQ ID NOs: 22, 23), NrdJ-1 (SEQ ID NOs: 24, 25), IMPDH-1 (SEQ ID NOs: 26, 27), Ssp DnaE (SEQ ID NOs: 28, 29). Neben den oben gelisteten Inteinen/Split-Inteinen und deren in der
Varianten der erfindungsgemäßen Viren und viralen Vektoren sowie VerfahrenVariants of the viruses and viral vectors of the invention and methods
Die hier beschriebenen Fusionskonstrukte des viralen Oberflächenproteins mit der ersten Protein-Domäne bzw. des Proteins von Interesse mit der zweiten Proteinen-Domäne können sowohl aus experimentellen Gründen als auch für die spätere Anwendung modifiziert werden.The fusion constructs of the viral surface protein with the first protein domain or the protein of interest with the second protein domain described here can be modified both for experimental reasons and for later use.
Gemäß der Erfindung können beispielsweise das mindestens eine Oberflächenprotein des Virus oder viralen Vektors mit der mindestens ersten Protein-Domäne und/oder das daran zu koppelnde Protein von Interesse mit der zweiten Protein Domäne zusätzlich mit ein oder mehr Affinitäts-Tags fusioniert sein. Die Affinitätstags können dabei für die immunologische Detektion bzw. Nachweis als auch für die Aufreinigung der mit dem Affinitäts-Tag fusionierten Proteine dienlich sein. Die Affinitäts-Tags können dabei beispielsweise an dem Terminus der ersten Protein-Domäne liegen, der nicht mit dem viralen Oberflächenprotein fusioniert ist. So kann beispielsweise ein an Cden N-Terminus eines viralen Oberflächenproteins fusioniertes (Split)-InteinC N-Terminal mit ein oder mehr Affinitätstags fusioniert sein. Ist ein virales Oberflächenprotein C-Terminal mit einem InteinN fusioniert kann das InteinN C-terminal mit ein oder mehr Affinitätstags fusioniert sein. Die Affinitäts-Tags können auch an dem Terminus der zweiten Protein-Domäne liegen, der nicht mit dem Protein von Interesse fusioniert ist. Ein an den C-Terminus eines Proteins von Interesse fusioniertes (Split)-InteinN kann dabei C-Terminal mit ein oder mehr Affinitätstags fusioniert sein. Ist ein Protein von Interesse N-Terminal mit einem InteinC fusioniert kann das InteinC N-terminal mit ein oder mehr Affinitätstags fusioniert sein. Die ein oder mehr Affinitäts-Tags können beispielsweise aber auch zwischen dem viralen Oberflächenprotein und der ersten Protein-Domäne oder zwischen dem Protein von Interesse und der Protein-Domäne eingefügt sein. Als Affinitäts-Tags können jede aus dem Stand der Technik bekannten Affinitäts-Tags verwendet werden, die der Proteindetektion und/oder -aufreinigung dienen. Beispielhafte, nicht limitierende Beispiele solcher Affinitäts-Tags sind Myc-Tag, Hexa-His-Tag, HA-Tag, Strep-TagII. Solche Affinitäts-Tags ermöglichen beispielsweise die immunologischen Detektion bzw. Nachweis und/oder eine anschließende Aufreinigung erfolgreich modifizierter viraler Vektoren, modifizierter Proteine von Interesse und/oder eines erfolgreich gekoppelten Proteins von Interesse an den Virus oder viralen Vektor nach Protein-trans-Splicing.For example, according to the invention, the at least one surface protein of the virus or viral vector having the at least first protein domain and / or the protein of interest to be coupled thereto may be additionally fused to the second protein domain with one or more affinity tags. The affinity tags may be useful for the immunological detection or detection as well as for the purification of the proteins fused with the affinity tag. For example, the affinity tags may be at the terminus of the first protein domain that is not fused to the viral surface protein. For example, a (split) intein C N -terminal fused to the Cden N-terminus of a viral surface protein may be fused to one or more affinity tags. If a viral surface protein C-terminal is fused to an intein N , the intein N may be fused C-terminally to one or more affinity tags. The affinity tags may also be at the terminus of the second protein domain that is not fused to the protein of interest. A (split) nucleotine N fused to the C-terminus of a protein of interest may be fused to C-terminal with one or more affinity tags. If a protein of interest N-terminal is fused with an intein C , the intein C may be fused N-terminally with one or more affinity tags. However, for example, the one or more affinity tags may also be inserted between the viral surface protein and the first protein domain or between the protein of interest and the protein domain. Affinity tags that can be used are any affinity tag known in the art for protein detection and / or purification. Exemplary, non-limiting examples of such affinity tags are Myc-tag, Hexa-His tag, HA tag, Strep tag II. Such affinity tags, for example, allow the immunological detection or detection and / or subsequent purification of successfully modified viral vectors, modified proteins of interest and / or a successfully coupled protein of interest to the virus or viral vector after protein trans-splicing.
Neben den Affinitäts-Tags können die hier beschrieben Fusionskonstrukte auch zusätzlich Linkersequenzen enthalten. So können das virale Oberflächenprotein mit der ersten Protein-Domäne bzw. des Protein von Interesse mit der zweiten Proteinen-Domäne über einen Linker miteinander verknüpft sein. Ebenso können die oben erwähnten Affinitäts-Tags über Linker an die Fusionskonstrukte an- oder eingebracht sein. Linkersequenzen können aber auch innerhalb des viralen Oberflächenproteins oder des Proteins von Interesse eingebracht werden und sinnvoll sein. Beispielsweise kann eine Linkersequenz zwischen die Einzeldomänen eines scFv eingebracht werden, um die spätere Spleißreaktion mit einem erfindungsgemäßen Virus oder viralen Vektors zu erhöhen. Ein beispielhafter Linker wäre ein G4S-Linker oder vielfache davon.In addition to the affinity tags, the fusion constructs described herein may also contain additional linker sequences. Thus, the viral surface protein with the first protein domain or the protein of interest may be linked to the second protein domain via a linker. Likewise, the above-mentioned affinity tags can be attached or incorporated via linkers to the fusion constructs. However, linker sequences may also be incorporated within the viral surface protein or the protein of interest and may be useful. For example, a linker sequence can be introduced between the single domains of an scFv to increase the subsequent splicing reaction with a virus or viral vector of the invention. An exemplary linker would be a G4S linker or multiple thereof.
Die erfindungsgemäßen Transfervektoren können für ein oder mehr beliebige Transgene kodieren. Beispielsweise kann ein Transfervektor für ein oder mehr Markergene kodieren. Ein erfindungsgemäßer Transfervektor kann beispielsweise für ein fluoreszierendes Protein (z.B. GFP) und/oder therapeutisches Gen kodieren.The transfer vectors according to the invention can code for one or more arbitrary transgenes. For example, a transfer vector can code for one or more marker genes. For example, a transfer vector of the invention may encode a fluorescent protein (e.g., GFP) and / or a therapeutic gene.
Die hier offenbarten Kopplungssysteme können auch für einen Proteintransfer genutzt werden. Damit ein Zelleintritt der viralen Partikel möglich ist, werden dabei nicht-verblindete virale Hüllprotein, wie beispielsweise ein nicht-verblindetes Hämagglutinin, verwendet.The coupling systems disclosed herein can also be used for protein transfer. In order to allow cell entry of the viral particles, non-blinded viral envelope protein, such as a non-blinded hemagglutinin, are used.
Die erfindungsgemäßen (Split-)Intein-Systeme können für den Aufbau jeglicher (Split-)Intein gekoppelten Viren oder viralen Vektoren verwendet werden. Geeignete Viren oder der virale Vektoren können abgeleitet sein von einem Virus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus (RV), Lentivirus (LV), Masernvirus (MV), Vesicular stomatitis virus (VSV) oder adeno-assoziierter Virus (AAV). Weiter können die Viren oder der virale Vektoren pseudotypisierte Viren oder viraler Vektoren sein. Die Viren oder viralen Vektoren können abgeleitet sein von pseudotypisierten Viren oder viralen Vektoren, die von einem Virus abgeleitet sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus (RV), Lentivirus (LV), Masernvirus (MV), Vesicular stomatitis virus (VSV) oder adeno-assoziierter Virus (AAV). Ein geeignetes Pseudotypisierungssystem ist beispielsweise das Masernvirus F (Fusionsprotein) und H (Hämagglutinin) Pseudotypisierungssystem (
Alternative Aufreinigungen der beschriebenen FusionskonstrukteAlternative purification of the described fusion constructs
In den nachfolgenden Beispielen werden die Herstellung und Aufreinigung von Viren und viralen Vektoren mit einem Oberflächenprotein mit einer ersten Protein-Domäne sowie Proteinen von Interesse mit einer zweiten Protein-Domäne beschrieben. Die genannten Aufreinigungsverfahren sind dem Fachmann wohlbekannt und können durch jegliche aus dem Stand der Technik bekannten Aufreinigungsverfahren ersetzt oder ergänzt werden.The following examples describe the preparation and purification of viruses and viral vectors with a surface protein having a first protein domain and proteins of interest with a second protein domain. The above purification methods are well known to those skilled in the art and may be replaced or supplemented by any purification method known in the art.
So können beispielsweise die hergestellten und aufgereinigten Viren/virale Vektoren und/oder Proteine von Interesse zum Abschluss der Aufreinigung bzw. Vorbereitung auf die Kopplungsreaktion in den Spleißpuffer umgepuffert werden. Dies kann mit der Hilfe von Slide-A-Lyzer Dialysekassetten (7,000 Da Molekulargewicht als Cut-Off, Thermo Scientific) gegen Spleißpuffer (50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH7; nach
Die beschriebenen Aufreinigung können mit jedem anderen aus dem Stand der Technik bekannten N- und/oder C-terminaler Affinitäts-Tag bewerkstelligt werden. Je nach fusionierten Affinitäts-Tags können die Fusionskonstrukte auf unterschiedliche Art und Weise aufgereinigt werden. Neben chromatographischen Methoden, wie im Fall des Hexa-His-Tags einsetzbar, können auch magnetische Beads mit für die Affinitätsaufreinigung verwendet werden, z.B. Ni-NTA Funktionalisierung der Beads zur Metall-Chelat-Affinitätsaufreinigung Hexa-His-getaggter Proteine oder anti-Myc, anti-HA Antikörper beschichtete („gecoatete“) Beads, oder Strep-Tactin Beads.The purification described can be accomplished with any other N- and / or C-terminal affinity tag known in the art. Depending on the fused affinity tags, the fusion constructs can be purified in different ways. In addition to chromatographic methods, as used in the case of the hexa-His tag, magnetic beads may also be used for affinity purification, e.g. Ni-NTA Functionalization of Beads for Metal Chelate Affinity Purification of Hexa-His Tagged Proteins or Anti-Myc, Anti-HA Antibody Coated ("Coated") Beads, or Strep-Tactin Beads.
Kopplungsreaktioncoupling reaction
Die in den Beispielen dargestellte Form der Kopplungsreaktion kann auch in anderen im Stand der Technik bekannten experimentellen Ansätzen verwirklicht werden. Beispielsweise kann eine der beiden Kopplungkomponenten (Virus/viraler Vektor oder Protein von Interesse) mittels durch Klonierung (Beispiel 1A bzw. 2A) eingefügten Affinitätstag an einer stationären Phase immobilisiert werden. Durch die Spleißreaktion erfolgt dann die Elution erfolgreich gekoppelter Produkte (siehe Beispiel 3B).The form of the coupling reaction illustrated in the examples can also be realized in other experimental approaches known in the art. For example, one of the two coupling components (virus / viral vector or protein of interest) can be immobilized on a stationary phase by means of an affinity tag inserted by cloning (Example 1A or 2A). The splicing reaction then leads to the elution of successfully coupled products (see Example 3B).
Erfolgt die Kopplunsreaktion in Lösung, so kann ungekoppeltes Protein von Interesse (POI) vorzugsweise über Amicon Filtrationseinheiten oder Dialysekassetten mit entsprechendem molekularen Gewichts-Cut-off abgetrennt (Amicon Ultra-15 MWCO 100 K, 100 kDa cut-off; Spectra-Por Float-A-Lyzer G2 MWCO 100 kDa) werden. Je nach Maßstab der Kopplungsreaktion kann überschüssiges POI alternativ auch über Tangentialflussfiltration („Tangential Flow Filtration“) und entsprechenden molekularen Gewichts-Cut-off oder über eine Dichtegradientenzentrifugation aus der Kopplungsreaktion entfernt werden. Erfolgt die Kopplungsreaktion nach Immobilisation des POI über einen Affinitätstag, der N-terminal (im Fall von Split-InteinC-fusionierten POIs) oder C-terminal (im Fall von Split-InteinN-fusionierten POIs) fusioniert ist, bleibt das ungekoppelte POI an der stationären Phase zurück. Im gleichen Maße können solche POIs auch im Anschluß an eine normale, in Lösung statt gefundene Kopplung (ohne Immobilisation) durch Inkubation mit einer entsprechenden Affinitätstagbindenden Matrix (z.B. Beads o.ä.) abgetrennt werden. Zur Abtrennung ungekoppelter Virus/Vektorpartikel bietet sich insbesondere eine Affinitätschromatographie wie die IMAC (immobilisierte Metall-Chelat-Affinitätschromatographie) an, wenn beispielsweise erst durch die kovalente Kopplung ein Hexa-His-Tag auf der Virus/Vektoroberfläche vorliegt. Alternativ können auch andere Affinitätstags und entsprechende Aufreinigungsverfahren verwendet werden. If the coupling reaction is in solution, uncoupled protein of interest (POI) can preferably be separated off via Amicon filtration units or dialysis cassettes with a corresponding molecular weight cut-off (
BeispieleExamples
Die Erfindung kann durch die folgenden Beispiele beschrieben werden. Sie dienen lediglich erläuternden Zwecken und beschränken nicht den Umfang der Erfindung.The invention can be described by the following examples. They are for illustrative purposes only and do not limit the scope of the invention.
Beispiel 1:Example 1:
Herstellung eines (Split)-InteinC tragenden viralen Vektors (Myc-(Split)-InteinC-VP2-AAV)Preparation of a splice-bearing C- bearing viral vector (Myc (split) intein C -VP2-AAV)
A) Klonierung des pSplit-InteinCVP2 PlasmidsA) Cloning of the pSplit-Intein C VP2 plasmid
Als Grundlage der Klonierung dient die frei zugängliche Split-Intein Sequenz mit der Bezeichnung Npu-PCC73102 DnaE-c (
B) Produktion und Assemblierung des (Split)-InteinC tragenden AAV B) Production and assembly of the (split) coin in C AAV
Die AAV Vektorproduktion erfolgte analog der Adenovirushelfer-freien AAV Verpackungsstrategie in HEK-293T-Zellen (
C) Aufreinigung des (Split)-InteinC tragenden AAVC) Purification of the (split) ion in C- carrying AAV
Die AAV-haltigen Lysate werden mit PBS M/K (2.5 mM KCl, 1 mM MgCl2 in PBS) auf 17 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und in Quick-Seal® Ultracentrifugation Tubes (Beckman Coulter) überführt. Das Lysat wird mit einem Gradienten aus 9 ml 15%, 6 ml 25%, 5 ml 40% und 6 ml 60% OptiPrepTM unterschichtet, um mittels Dichtegradienten-Zentrifugation Genom-haltige von leeren Partikeln abzutrennen. Die Zentrifugation erfolgt für 2 h bei 63.000x rpm und 4°C in einem 70Ti Rotor (Beckman Coulter). Genom-haltige AAV Vektorpartikel liegen in der 40% OptiPrepTM Fraktion vor und können mit einer Kanüle vorsichtig entnommen werden. Die erfolgreich isolierten Vektorpartikel werden aliquotiert und bei –80°C gelagert.The AAV containing lysates with PBS M / K (2.5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 in PBS) made up to 17 ml total volume and in Quick-Seal ® ultracentrifugation tubes (Beckman Coulter) transferred. The lysate is underlaid with a gradient of 9 ml 15%, 6
Zur Überprüfung, ob die genetische Fusion der Intein-Domänen an das VP2 AAV-Kapsidproteine erfolgreich war und die AAV-Assemblierung nicht gestört ist, wurde das Fusionsprotein in den aufgereinigten AAV-Vektoren mittels Western Blot nachgewiesen und der Virustiter bestimmt (
Zur weiteren Charakterisierung der generierten Split-Intein-Domäne tragenden, rekombinanten AAV-Vektoren wurde sowohl der Kapsidtiter mittels ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) als auch der genomische Titer mittels quantitativer PCR wie in
Abschließend wurden die aufgereinigten AAV-Vektoren mit der Hilfe von Slide-A-Lyzer Dialysekassetten (7,000 Da Molekulargewicht als Cut-Off, Thermo Scientific) gegen Spleißpuffer (50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7; nach
Beispiel 2:Example 2:
NHerstellung eines (Split)-InteinN tragenden Fusionsproteins (anti-CD30-scFv)Generation of a (split) ion in N- bearing fusion protein (anti-CD30-scFv)
A) Klonierung des pCR3.1-His-αCD30-Split-InteinN-HA ExpressionskonstruktsA) Cloning of the pCR3.1-His-αCD30 split-intein N- HA expression construct
Als Basis diente die frei zugängliche Split-Intein Sequenz mit der Bezeichnung Npu-PCC73102 DnaE-n (
B) Expression des (Split)-InteinN tragenden antiCD30-scFv B) Expression of the (split) coinein N bearing antiCD30 scFv
2 × 107 HEK-293T-Zellen wurden pro 150 cm2 Zellkultur-Platte ausgesät und am darauffolgenden Tag mit 35 µg Expressionsplasmid pCR3.1-His-aCD30-Split-InteinN-HA transfiziert. 24 h nach Transfektion wurde das Medium durch Serum-freies Panserin 293A (Pan-Biotech) ersetzt. Die Überstände wurden 48 h und 72 h nach Transfektion geerntet, durch einen 0.45 µm Filter geklärt und bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.2 × 10 7 HEK-293T cells were seeded per 150 cm 2 cell culture plate and the following day transfected with 35 ug expression plasmid pCR3.1-His-aCD30-split-intein N -HA. 24 h after transfection, the medium was replaced with serum-free panserin 293A (Pan-Biotech). The supernatants were harvested 48 h and 72 h after transfection, clarified by a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C until further use.
C) Aufreingung des (Split)-InteinN tragenden antiCD30-scFvC) Recovery of the (split) ion in N bearing antiCD30 scFv
Für eine chromatographische Aufreinigung über den Hexa-His-Tag wurde der gesammelte Überstand zunächst mit 1/10 10 × Bindepuffer (500 mM NaH2PO4, 1.5 M NaCl, 100 mM Imidazol, pH8) verdünnt, so dass die exprimierten Proteine final in 1 × Bindepuffer vorlagen. Zu dem Ansatz wurde die zuvor 3 × mit ddH2O gewaschene Ni-NTA Agarose dazu gegeben (1 ml Ni-NTA Agarose-Lösung pro transfizierte Flasche). Die Anbindung der Hexa-His-getaggten Proteine erfolgte über Nacht unter konstantem Rühren auf einem Magnetrührer bei 4°C. Am nächsten Tag wurde die Ni-NTA-Agarose in der gravity flow Säule gesammelt und mit 10 Säulenvolumen Waschpuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol pH 8) gewaschen. Abschließend erfolgt die Elution mit 3 Säulenvolumen Elutionspuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8)(siehe
Für die Aufreinigung im kleinen Maßstab wurden magnetische HisPur NiNTA Magnetic Beads (Thermo Scientific) verwendet. 40 µl der Beadlösung wurden zunächst 2 × mit Äquilibrierungspuffer (30 mM Imidazol, 0.05% TweenTM-20 in PBS, pH 8) gewaschen und im Magneten gesammelt. 0,5 ml des Protein-haltigen Überstands wurden mit 0,5 ml Äquilibrierungspuffer gemischt und für 1 h mit den Beads bei 4°C inkubiert. Der Überstand wurde verworfen und unspezifisch gebundenes Protein durch 2-maliges Waschen mit Waschpuffer (50 mM Imidazol, 0.05% TweenTM-20 in PBS, pH 8) abgetrennt. Die finale Elution der Hexa-His-getaggten Proteine erfolgte durch Zugabe von 2 × 25 µl Elutionspuffer (250 mM Imidazol, 0.05% TweenTM-20 in PBS, pH 8) und kurzer Inkubation für je 15 min. Das Eluat wurde über Amicon-Säulen (MWCO 3.000 Dalton) in Spleißpuffer umgepuffert.For small scale purification, magnetic HisPur NiNTA magnetic beads (Thermo Scientific) were used. 40 μl of the bead solution was first washed 2 × with equilibration buffer (30 mM imidazole, 0.05% Tween ™ -20 in PBS, pH 8) and collected in the magnet. 0.5 ml of the protein-containing supernatant was mixed with 0.5 ml of equilibration buffer and incubated for 1 h with the beads at 4 ° C. The supernatant was discarded and nonspecifically bound protein was separated by washing twice with wash buffer (50 mM imidazole, 0.05% Tween ™ -20 in PBS, pH 8). The final elution of the hexa-His tagged proteins was carried out by adding 2 × 25 μl elution buffer (250 mM imidazole, 0.05% Tween ™ -20 in PBS, pH 8) and a short incubation for 15 min each. The eluate was rebuffered through Amicon columns (MWCO 3,000 daltons) in splice buffer.
Beispiel 3:Example 3:
Split-Intein vermittelte Kopplung des anti-CD30-scFv an das AAV-VP2Split-intein mediated coupling of the anti-CD30 scFv to the AAV-VP2
-
A) Die Kopplungsreaktionen wurden wie folgt durchgeführt. Im Detail wurden in einem 40 µl Reaktionsansatz je 10 µl aufgereinigte Split-InteinC tragende AAV-Partikel und 10 µl aufgereinigter Split-InteinN-tragender anti-CD30-scFv Überstand mit 20 µl 2 × Spleißpuffer (100 mM Tris/HCl, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.2) vermischt und für 30 min bei 37°C unter kontinuierlichem invertieren inkubiert. Zum Abtrennen der überschüssigen His-anti-CD30-scFv-Split-InteinN-HA Fusionsproteine wurde die Kopplungsreaktion über eine Amicon-Säulen (MWCO 100kDalton) aufgereinigt und mehrfach mit 1 × Spleißpuffer gewaschen (50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.2). Während die AAV-Kapside zurück bleiben, wird die Targeting-Domäne effizient abgetrennt. Die Aufreinigung der erfolgreich gekoppelten AAVs erfolgt im Anschluß chromatographisch, da die AAV-Vektoren durch die Kopplung einen His-Tag auf der Oberfläche tragen. Diese Partikel können durch immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) selektiv angereichert werden. Zu diesem Zweck wurden HisTrap HP Säulen (GE Healthcare) als stationäre Phase verwendet. Die Kopplungsreaktion wird 1:8 mit 8-fach Bindepuffer verdünnt, so dass die Vektoren final in 1 × Bindepuffer (20 mM Imidazol, 20 mM Natriumphosphat, 0.5 M NaCl) vorlagen. Die Vektor-haltige Lösung wurde mit einer Flussrate von 0.1 ml/min auf die Säule geladen und im Anschluss mit 10 Säulenvolumen 1 × Bindepuffer gewaschen. Nach weiteren 2 Säulenvolumen 1 × Bindepuffer erfolgte die Elution Hexa-His-Tag-haltiger anti-CD30-scFv-gekoppelter AAV-Vektorpartikel mit 5 Volumen 1 × Elutionspuffer (300 mM Imidazol, 20 mM Natriumphosphat, 0.5 M NaCl) bei einer Flussrate von 0,2 ml/min. Während der Lade-, Wasch-, und Elutionsprozedur werden alle Fraktionen durch einen Fraktionssammler aufgefangen (generelle Beschreibung des Prozesses in
Münch et al., Nat Comms, 2015 Münch et al., Nat Comms, 2015 - B) Alternativ wurde die Kopplungs- bzw- Speißreaktion an einer stationären Phase durchgeführt. Dabei wurde das in Beispiel 2 hergestellte (Split)-InteinN tragende antiCD30-scFv über den C-terminalen Affinitätstag (HA-Tag) auf magnetischen anti-HA Magnetic Beads (Thermo Scientific) immobilisiert. Genauer wurden 40 µl der Beadlösung zunächst 2 × mit Äquilibrierungspuffer (0.05% TweenTM-20 in PBS, pH 8) gewaschen und im Magneten gesammelt. 25 µl aufgereinigtes His-anti-CD30-NpuN-HA-Fusionsprotein (siehe Aufreinigung von Beispiel 2) wurden mit 0,5 ml Äquilibrierungspuffer gemischt und für 1 h mit den Beads bei 4°C inkubiert. Der Überstand wurde verworfen und unspezifisch gebundenes Protein durch 2-maliges Waschen mit Äquilibrierungspuffer abgetrennt. Anschließend wurden die Beads in 10 µl 2 × Spleißpuffer (100 mM Tris/HCl, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.2) resuspendiert, mit 10 µl aufgereinigten Split-InteinC tragende AAV-Partikeln vermischt und für 30 min bei 37°C unter kontinuierlichem Invertieren inkubiert. Nicht gekoppelte antiCD30-scFv verbleiben immobilisiert an den magnetischen Beads konnten am Magneten gesammelten werden, während die erfolgreich an die AAV-VP2 gekoppelten antiCD30-scFv durch die Spleißreaktion in Lösung gegangen sind und einfach durch Pipettieren von den am Magneten immobilisierten Beads getrennt werden konnten. Das Abtrennen nicht-gekoppelter AAV-Vektoren erfolgte wie unter Beispiel 3 Schritt A beschrieben via IMAC.B) Alternatively, the coupling or Speißreaktion was carried out on a stationary phase. Incidentally, the (split) intein-carrying antiCD30-scFv prepared in Example 2 was immobilized on the C-terminal affinity tag (HA tag) on magnetic anti-HA magnetic beads (Thermo Scientific). More specifically, 40 μl of the bead solution was first washed 2 × with equilibration buffer (0.05% Tween ™ -20 in PBS, pH 8) and collected in the magnet. 25 μl of purified His-anti-CD30-NpuN-HA fusion protein (see purification of Example 2) were mixed with 0.5 ml of equilibration buffer and incubated for 1 h with the beads at 4 ° C. The supernatant was discarded and non-specifically bound protein separated by washing twice with equilibration buffer. Subsequently, the beads were resuspended in 10 μl of 2 × splice buffer (100 mM Tris / HCl, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.2), mixed with 10 μl of purified split-inte- C carrying AAV particles and incubated for 30 incubated at 37 ° C with continuous inversion. Uncoupled antiCD30 scFv remain immobilized on the magnetic beads could be collected on the magnet while the antiCD30 scFv successfully coupled to the AAV VP2 went into solution by the splicing reaction and could be easily separated by pipetting from the beads immobilized on the magnet. The separation of uncoupled AAV vectors was carried out as described in Example 3 step A via IMAC.
Beispiel 4:Example 4:
Bestimmung der KopplungseffizienzDetermination of coupling efficiency
Auf molekularer Ebene kann der Nachweis einer erfolgreichen Kopplung durch Western Blot und ELISA durchgeführt werden:
Für die Western Blot-Analyse wurden 12 µl einer 40 µl Kopplungsreaktion (10 µl aufgereinigte Split-InteinC tragende AAV-Partikel und 10 µl aufgereinigter Split-InteinN-tragender anti-CD30-scFv Überstand mit 20 µl 2 × Spleißpuffer (100 mM Tris/HCl, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.2) siehe Beispiel 3) und 12 µl einer Kontrollreaktion ohne Split-InteinN-tragendem anti-CD30-scFv Überstand mit 4 µl 4 × Probenpuffer (277.8 mM Tris/HCl, 4.4% SDS, 44.4% (w/v) Glycerol, 0.02% Bromphenolblau, pH 6.8) und 4 µl 10% SDS in dH2O versetzt. Die Proben wurden für 10 min bei 95°C aufgekocht und die Proteine in einer denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in einem 8%-igen Polyacrylamidgel nach Größe aufgetrennt. Im Anschluss wurden die Proteine von dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Die Membran wurde mit 5% (w/v) Milchpulver in TBS-T (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) für 1 h bei Raumtemperatur geblockt. Im Anschluss erfolgte eine Beprobung der Membran mit 1:20 Maus anti-AAV VP1/VP2/VP3 Antikörpern (Klon B1, Progen) verdünnt in 5% (w/v) Milchpulver in TBS-T für 2 h bei Raumtemperatur. Nach 5 Waschschritten mit je 50 ml TBS-T erfolgte die Zugabe des sekundären 1:2000 in 5% (w/v) Milchpulver in TBS-T verdünnten HRP-konjugierten Ziege anti-Maus Antikörpers (Dako). Nach einer weiteren Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur wurde wieder 5-mal mit 50 ml TBS-T gewaschen und im Anschluss die Proteinbanden durch Zugabe des PierceTM ECL Western Blot Substrats in Kombination mit der Auflage auf ein Röntgenfilm (X-Ray Film for Western Blot Detection, Thermo Scientific) visualisiert (siehe
For Western blot analysis, 12 μl of a 40 μl coupling reaction (10 μl purified split-intein C carrying AAV particle and 10 μl purified split-intein N- carrying anti-CD30-scFv supernatant were mixed with 20
Für den Nachweis mittels ELISA wurden MaxiSorp 96-well Platten (Nunc) mit je 1µg CD30-huFc bzw. GluRD-huFc als Negativkontrolle (jeweils Fusionsproteine aus der Rezeptorektodomäne und einem humanen Fc-Tag) in einem Gesamtvolumen von 100 µl verdünnt in PBS für 2,5 h bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln beschichtet („gecoatet“). Der Protein-haltige Überstand wurde abgenommen und die Platten 2 × für 5 min mit 200 µl PBS gewaschen. Unspezifische Bindestellen wurden anschließend durch die Zugabe von 200 µl Blockingpuffer (PBS, 0.05% Tween-20, 3% BSA, 5% Sucrose) für 2 h bei Raumtemperatur abgesättigt. Nach 2 weiteren 5-minütigen Waschschritten wurde je 40 µl Kopplungsreaktion (10 µl aufgereinigte Split-InteinC tragende AAV-Partikel und 10 µl aufgereinigter Split-InteinN-tragender anti-CD30-scFv Überstand mit 20 µl 2 × Spleißpuffer (100 mM Tris/HCl, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.2) siehe Beispiel 3) verdünnt mit 60 µl Blockingpuffer in die wells pipettiert und für 16 h bei 4°C inkubiert. Ungebundene, ungekoppelte AAV-Partikel wurden durch 3-maliges Waschen mit 200 µl Waschpuffer (PBS, 0.05% Tween-20) entfernt und 100 µl des 1:4 verdünnten Erstantikörpers Maus α-AAV intakte Partikel (Klon A20, Progen) in Blockingpuffer zugegeben. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur folgten erneut 3 Waschschritte mit 200 µl Waschpuffer und die anschließende Zugabe von 100 µl des 1:25.000 in Blockingpuffer verdünnten Zweitantikörpers Esel α-Maus-Biotin (Jackson ImmunoResearch). Der Zweitantikörper wurde ebenfalls für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und durch 3-maliges Waschen mit 200 µl Waschpuffer der überschüssige Zweitantikörper entfernt. Abschließend wurde je 100 µl einer 1:500 mit Blockingpuffer verdünnten Streptavidin-HRP Lösung (Jackson ImmunoResearch) dazu gegeben und erneut für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit je 200 µl Waschpuffer und 2 weiteren Waschschritten mit 200 µl dH2O wurde die Nachweisreaktion durch Zugabe von 50 µl TMB-Substrat (Sigma-Aldrich) gestartet und bis zu einem eindeutigen Farbumschlag gewartet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl Stop-Lösung für TMB Substrate (Thermo Scientific) abgestoppt und in einem ELISA-Reader bei 450 nm gegenüber 650 nm als Referenzwellenlänge ausgelesen. Die Ergebnisse sind in
Ob die erfolgreiche Kopplung des αCD30scFv-Fragments an das AAV auch in einer selektiven Transduktionsfähigkeit des Vektors resultiert, konnte durch Transduktionsexperimente auf Zielzellen im Vergleich zu Nicht-Zielzellen durchgeführt werden. Dazu wurden je 5 × 103 CD30-transgene CHO-Zellen (CHO-CD30) als Zielzelle bzw. die parentalen CHO Zellen als Nicht-Zielzellen je 96-well ausgesät. Am darauffolgenden Tag erfolgte die Transduktion mit je 4 µl Spleißreaktion (Spleißprotokoll siehe Beispiel 3) und die finale Auswertung 4 Tage nach Transduktion durch durchflusszytometrische Analyse auf GFP-positive Zellen, da die AAV-Vektoren für GFP als Markerprotein kodierten. Die Ergebnisse dieses Transduktionserxperiments sind in
Beispiel 5:Example 5:
Weitere KopplungenFurther couplings
Die erfingungsgemäßen Viren oder viralen Vektoren und Verfahren beschränken sich nicht auf die in den Beispielen 1–4 verwendeten Viren oder viralen Vektoren und Proteinen von Interesse. Gemäß der Erfindung können auch andere Intein-Kopplungssysteme verwendet werden. Im Folgenden sind weitere beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung gezeigt: The viruses or viral vectors and methods of the invention are not limited to the viruses or viral vectors and proteins of interest used in Examples 1-4. According to the invention, other intein coupling systems may also be used. In the following, further exemplary embodiments of the invention are shown:
A) Split-Intein vermittelte Kopplung der 9.29-DARPin-Domäne an das AAV-VP2A) Split-intein-mediated coupling of the 9.29-DARPin domain to the AAV-VP2
Analog zu Beispiel 3 wurde als Protein von Interesse die Targetingdomäne 9.29-DAPRin („Designed Ankyrin Repeat Protein“) ausgehend von einem 9.29-Split-InteinN-Fusionsprotein an ein Split-InteinC-VP2-AAV gekoppelt. Das 9.29-Protein ist ein Her2/neu spezifisches DARPin (
B) Andere virale VektorsystemeB) Other viral vector systems
Neben dem oben etablierten Split-Intein-System für AAV Vektoren soll im Folgenden auch der Aufbau Split-Intein koppelbarer lentiviraler Vektoren gezeigt werden. Dazu wurde das Masernvirus F und H Pseudotypisierungssystem verwendet (
Nach dem Verdau mittels der SmaI/SpeI Restriktionsschnittstellen konnte die Split-InteinN-Sequenz in das pCG-Hmut Vektorgerüst („Vector Backbone“) (
Oberflächenexpressionstest wurden durch Transfektion von 2 µg des pCG-Hmut-Split-InteinN Plasmids in 2 × 105 HEK293T-Zellen im 24-well Format durchgeführt. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen mit PBS ohne Kalzium/Magnesium, 1 mM EDTA abgelöst und durchflusszytometrisch bzgl. der Split-InteinN fusionierten Affinitätstags hin untersucht (Verwendung PE-gekoppelter Maus anti-Myc und Maus anti-His Primärantikörper). Die Ergebnisse sind in
Als Kopplungspartner für das Split-InteinN-fusionierte virale Hüllprotein wurde ein entsprechendes Split-InteinC-fusioniertes αCD30scFv-Fragment kloniert. Zu diesem Zweck wurde mit dem pSplitInteinC-VP2 Plasmid als Vorlage („Template“) und den Primern Signalpeptid-NpuC-for-in (SEQ ID NO: 15) mit Signalpeptid-NpuC-for-out (SEQ ID NO: 16) und Signalpeptid-NpuC-rev (SEQ ID NO: 17) die Split-InteinC-Sequenz amplifiziert und dabei N-terminal eine HindIII Schnittstelle, sowie das für die Sekretion notwendige Signalpeptid und die zum Nachweis wichtigen Affinitätstags Hexa-His- und Myc-Tag vor die Kopplungs-Domäne insertiert. Durch den reverse Primer wurden die für die spätere Insertion des αCD30scFv wichtigen SfiI/NotI Schnittstelle sowie eine C-terminale XbaI Schnittstelle eingeführt. Durch HindIII/XbaI-Verdau wurde das Amplikon in das pCR3.1-HRS3 Konstrukt einkloniert (
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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