DE102015107307B3 - Optical method for assaying hyaluronic acid - Google Patents

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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/82—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity

Abstract

Die Erfindung betrifft ein optisches Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure in Pharmazeutika, Medizinprodukten, Kosmetika und Rohstoffen, umfassend die Schritte: a) Herstellen einer Testlösung, die eine Probe enthält, deren Gehalt an Hyaluronsäure zu bestimmen ist, b) Messen der Trübung oder Absorption der Testlösung, c) Auswerten der gemessenen Trübung oder Absorption unter Zuhilfenahme einer Kalibrierkurve, wobei eine Testlösung verwendet wird, die ein Reaktionsprodukt umfasst, das aus nativer Hyaluronsäure und Serumalbumin als Reaktanden hervorgeht, wobei insbesondere eine enzymatische Reaktion der nativen Hyaluronsäure vermindert oder verhindert wird.The invention relates to an optical method for determining the content of hyaluronic acid in pharmaceuticals, medical devices, cosmetics and raw materials, comprising the steps of: a) preparing a test solution containing a sample whose content of hyaluronic acid is to be determined; b) measuring the turbidity or absorption of the Test solution; c) evaluating the measured turbidity or absorption using a calibration curve using a test solution comprising a reaction product resulting from native hyaluronic acid and serum albumin as reactants, in particular reducing or preventing enzymatic reaction of the native hyaluronic acid.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein optisches Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure in Pharmazeutika, Medizinprodukten, Kosmetika und Rohstoffen, umfassend die Schritte:

  • a) Herstellen einer Testlösung, die eine Probe enthält, deren Gehalt an Hyaluronsäure zu bestimmen ist,
  • b) Messen der Trübung oder Absorption der Testlösung,
  • c) Auswerten der gemessenen Trübung oder Absorption unter Zuhilfenahme einer Kalibrierkurve.
The present invention relates to an optical method for assaying hyaluronic acid in pharmaceuticals, medical devices, cosmetics and raw materials, comprising the steps of:
  • a) preparing a test solution containing a sample whose content of hyaluronic acid is to be determined,
  • b) measuring the turbidity or absorption of the test solution,
  • c) Evaluation of the measured turbidity or absorption with the aid of a calibration curve.

Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure sind aus dem Stand der Technik bekannt. Drei wichtige Verfahren bestimmen hierbei quantitativ die Abbauprodukte der Hyaluronsäure: Bei der als Carbazol-Methode bekannten Reaktion wird Hyaluronsäure durch Schwefelsäure in seine Monomere hydrolysiert. Diese reagieren dann weiter zu Aldehyden, die mit Carbazol einen farbigen Komplex bilden. Der genaue Reaktionsmechanismus ist unklar, ebenso mögliche Störfaktoren, so dass es großer Erfahrung bedarf, nach dieser Konventionsmethode zu arbeiten. Nachdem diese Methode in einem Labor validiert wurde, gestaltet sich der Transfer dieser Methode in ein anderes Labor als schwierig. Aus der US 4,617,299 A ist ein weiteres Verfahren zur Bestimmung des Hyaluronsäuregehaltes einer Probe bekannt. Bei diesem Verfahren wird eine Testlösung hergestellt, die Enzyme und die Probe enthält, deren Hyaluronsäuregehalt bestimmt werden soll. Der Hyalurosäuregehalt wird durch die bei der Reaktion mit dem Enzym Streptomyces hyaluronate lyase entstehenden Abbauprodukte bestimmt. Die Testlösung wird chromatografisch untersucht. Anschließend wird die Absorption des dabei entstehenden Eluents bei 232 nm gemessen. Anhand der gemessenen Absorption wird unter Zuhilfenahme einer Kalibrierkurve der Hyaluronsäuregehalt der Probe bestimmt. Ein anderes Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC). Mittels dieser Methoden kann Hyaluronsäure nach enzymatischem Abbau quantifiziert werden. Diese Verfahren benötigen jedoch umfangreiche Expertise, da die enzymatische Reaktion zu einem Gemisch von Abbauprodukten führt, deren Verhältnis zueinander schwanken kann.Methods for assaying hyaluronic acid are known in the art. Three important processes quantitatively determine the degradation products of hyaluronic acid. In the reaction known as the carbazole method, hyaluronic acid is hydrolyzed by sulfuric acid into its monomers. These then react further to aldehydes, which form a colored complex with carbazole. The exact reaction mechanism is unclear, as are possible confounding factors, so it takes a lot of experience to work according to this convention method. Once this method has been validated in a laboratory, transferring this method to another laboratory is difficult. From the US 4,617,299 A Another method for determining the hyaluronic acid content of a sample is known. In this method, a test solution is prepared containing enzymes and the sample whose hyaluronic acid content is to be determined. The hyaluronic acid content is determined by the degradation products resulting from the reaction with the enzyme Streptomyces hyaluronate lyase. The test solution is analyzed chromatographically. Subsequently, the absorption of the resulting eluent is measured at 232 nm. Based on the measured absorption, the hyaluronic acid content of the sample is determined with the aid of a calibration curve. Another method for assaying hyaluronic acid is high performance liquid chromatography (HPLC). Using these methods, hyaluronic acid can be quantified after enzymatic degradation. However, these methods require extensive expertise, since the enzymatic reaction leads to a mixture of degradation products, the ratio of which may vary with each other.

Mittels Kapillarelektrophorese und Größenausschluss-Chromatographie ist es möglich native Hyaluronsäure zu quantifizieren. Diese Verfahren sind aufgrund der benötigten Geräte recht kostspielig. Im klinischen Bereich werden Testkits eingesetzt, die auf der Affinität der Hyaluronsäure zu bestimmten Proteinen beruhen. Diese Testkits sind für die Analytik von geringsten Konzentrationen aus einer komplexen biologischen Matrix heraus entwickelt worden und daher recht kostspielig.By means of capillary electrophoresis and size exclusion chromatography it is possible to quantify native hyaluronic acid. These methods are quite expensive due to the equipment needed. In the clinical area, test kits based on the affinity of hyaluronic acid for certain proteins are used. These test kits have been developed for the analysis of lowest concentrations out of a complex biological matrix and are therefore quite costly.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren der eingangs genannten Art anzugeben, welches kostengünstig ist, für Stabilitätsstudien geeignet ist und ortsunabhängig eine zuverlässige Reproduzierbarkeit und Robustheit bei der Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure erlaubt.Based on this prior art, it is an object of the present invention to provide a method of the type mentioned, which is inexpensive, suitable for stability studies and location-independent reliable reproducibility and robustness in the content determination of hyaluronic allowed.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, dass eine Testlösung verwendet wird, die ein Reaktionsprodukt umfasst, das aus nativer Hyaluronsäure und Serumalbumin als Reaktanden hervorgeht, wobei eine enzymatische Reaktion der nativen Hyaluronsäure vermindert oder verhindert wird.This object is achieved in a method of the type mentioned above in that a test solution is used which comprises a reaction product resulting from native hyaluronic acid and serum albumin as reactants, wherein an enzymatic reaction of the native hyaluronic acid is reduced or prevented.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Überlegung zugrunde, durch die Verwendung von nativer Hyaluronsäure ohne Hyaluronidase bei der Gehaltsbestimmung Störfaktoren, wie beispielsweise ein schwankendes Verhältnis von Abbauprodukten nach einer enzymatischen Reaktion, zu vermeiden und damit die Reproduzierbarkeit und Robustheit der Messung zu verbessern und ein für Stabilitätsstudien geeignetes Verfahren anzugeben. Da bei dem vorliegenden Verfahren keine speziell für dieses Verfahren entwickelten Geräte eingesetzt werden, sondern lediglich im Labor übliche Geräte wie Photometer, Turbidimeter oder Nephelometer, Vortexer, Ultraschallbad und Magnetrührer, ist eine kostengünstige Gehaltsbestimmung mit diesem Verfahren möglich.The present invention is therefore based on the consideration to avoid by the use of native hyaluronic acid without hyaluronidase in the content determination interfering factors, such as a fluctuating ratio of degradation products after an enzymatic reaction, and thus to improve the reproducibility and robustness of the measurement, and one for stability studies specify appropriate method. Since in the present method, no devices specially developed for this method are used, but only common in the laboratory equipment such as photometer, turbidimeter or nephelometer, vortexer, ultrasonic bath and magnetic stirrer, a cost content determination is possible with this method.

Bevorzugt ist vorgesehen, dass das Messen der Trübung bzw. Absorption der Testlösung in Schritt b) mittels eines Photometers, eines Turbidimeters oder eines Nephelometers erfolgt. Bei dem Turbidimeter und dem Photometer wird die Absorption der Testlösung gemessen, während bei dem Nephelometer das seitlich austretende Streulicht gemessen wird, um die Trübung bzw. Absorption der Testlösung zu bestimmen.It is preferably provided that the measurement of the turbidity or absorption of the test solution in step b) takes place by means of a photometer, a turbidimeter or a nephelometer. For the turbidimeter and the photometer, the absorbance of the test solution is measured, while for the nephelometer, the laterally emitted scattered light is measured to determine the turbidity or absorption of the test solution.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Trübung oder Absorption der Testlösung bei einer Wellenlänge von 200 nm bis 800 nm, bevorzugt bei 550 nm bis 650 nm, besonders bevorzugt bei 600 nm, gemessen wird. Die Trübung oder Absorption der Testlösung ist proportional zu dem in der Testlösung enthaltenen Gehalt an Hyaluronsäure.According to a preferred embodiment of the invention, it is provided that the turbidity or absorption of the test solution is measured at a wavelength of 200 nm to 800 nm, preferably 550 nm to 650 nm, particularly preferably 600 nm. The turbidity or absorption of the test solution is proportional to the content of hyaluronic acid contained in the test solution.

In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testlösung folgende Komponenten umfasst:

  • a) eine Phosphatpuffer-Komponente, die bevorzugt 0,3 molar ist und besonders bevorzugt einen pH-Wert von 5,3 aufweist,
  • b) eine Natriumphosphatpuffer-Komponente, die bevorzugt 0,02 molar ist und besonders bevorzugt einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 aufweist, und
  • c) eine Albumin-Komponente, die Serumalbumin umfasst und die bevorzugt einen pH-Wert von 3,72 bis 3,78 aufweist.
In a development of the invention, it is provided that the test solution comprises the following components:
  • a) a phosphate buffer component which is preferably 0.3 molar and particularly preferably has a pH of 5.3,
  • b) a sodium phosphate buffer component, which is preferably 0.02 molar and more preferably has a pH of 6.8 to 7.0, and
  • c) an albumin component comprising serum albumin and preferably having a pH of from 3.72 to 3.78.

Hierdurch wird vorteilhaft ermöglicht, dass eine Trübung oder Absorption der Testlösung hervorgerufen wird, anhand derer der Gehalt an Hyaluronsäure in der Testlösung bestimmt werden kann.This advantageously makes it possible to cause turbidity or absorption of the test solution, by means of which the content of hyaluronic acid in the test solution can be determined.

Das Herstellen der Testlösung umfasst dabei bevorzugt folgende Schritte:

  • a) Lösen der Probe in der Phosphatpuffer-Komponente,
  • b) Hinzugeben der Natriumphosphatpuffer-Komponente,
  • c) eine erste Inkubation der Testlösung,
  • d) Hinzugeben der Albumin-Komponente und
  • e) eine zweite Inkubation der Testlösung.
The preparation of the test solution preferably comprises the following steps:
  • a) dissolving the sample in the phosphate buffer component,
  • b) adding the sodium phosphate buffer component,
  • c) a first incubation of the test solution,
  • d) adding the albumin component and
  • e) a second incubation of the test solution.

Durch dieses Vorgehen wird vorteilhaft ermöglicht, dass die Messung ortsunabhängig eine zuverlässige Reproduzierbarkeit und Robustheit bei der Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure erlaubt.This procedure advantageously makes it possible for the measurement to permit reliable reproducibility and robustness in the determination of the content of hyaluronic acid, regardless of location.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die erste Inkubation für eine Zeitdauer von 2 min bis 10 min, bevorzugt 5 min bis 10 min, besonders bevorzugt 5 min, und bei einer Temperatur von 20°C bis 60°C, bevorzugt bei 37°C, erfolgt.According to one embodiment of the invention, it is provided that the first incubation is for a period of 2 min to 10 min, preferably 5 min to 10 min, more preferably 5 min, and at a temperature of 20 ° C to 60 ° C, preferably 37 ° C, takes place.

Die Erfindung sieht ferner vor, dass die zweite Inkubation für eine Zeitdauer von 5 bis 60 min, bevorzugt 10 min, erfolgt und bevorzugt bei einer Temperatur von 20°C bis 60°C, bevorzugt bei 37°C, erfolgt.The invention further provides that the second incubation is carried out for a period of 5 to 60 minutes, preferably 10 minutes, and preferably at a temperature of 20 ° C to 60 ° C, preferably at 37 ° C, takes place.

Durch das exakte Einhalten der Zeitdauer und Temperatur bei der ersten und zweiten Inkubation wird vorteilhaft ermöglicht, dass Testlösungen, die den gleichen Gehalt an Hyaluronsäure aufweisen, auch die gleiche Trübung oder Absorption aufweisen.By precisely maintaining the time duration and temperature during the first and second incubation, it is advantageously possible for test solutions which have the same content of hyaluronic acid to also have the same turbidity or absorption.

In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Erstellen der Kalibrierkurve folgende Schritte umfasst:

  • a) Herstellen von Standardlösungen mit verschiedenen Hyaluronsäurekonzentrationen, wobei zur Herstellung der Standardlösungen Hyaluronsäure in der Phosphatpuffer-Komponente gelöst wird, bevorzugt werden Standardlösungen mit einer Hyaluronsäurekonzentration von 0 μg/ml bis 1,0 mg/ml hergestellt, besonders bevorzugt werden Standardlösungen mit Hyaluronsäurekonzentrationen von 0 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml 300 μg/ml, 500 μg/ml und 700 μg/ml hergestellt,
  • b) Hinzugeben der Natriumphosphatpuffer-Komponente zu den Standardlösungen,
  • c) eine erste Inkubation der Standardlösungen,
  • d) Hinzugeben der Albumin-Komponente zu den Standardlösungen,
  • e) eine zweite Inkubation der Standardlösungen,
  • f) Messen der Trübung oder Absorption der Standardlösungen und
  • g) graphisches Auftragen der gemessenen Trübung oder Absorption gegen die Hyaluronsäurekonzentration.
In a development of the invention, it is provided that the creation of the calibration curve comprises the following steps:
  • a) Preparation of standard solutions with different Hyaluronsäurekonzentrationen, wherein for the preparation of the standard solutions hyaluronic acid is dissolved in the phosphate buffer component, preferably standard solutions are prepared with a hyaluronic acid concentration of 0 ug / ml to 1.0 mg / ml, particularly preferred are standard solutions with Hyaluronsäurekonzentrationen of 0 μg / ml, 100 μg / ml, 150 μg / ml, 200 μg / ml, 250 μg / ml 300 μg / ml, 500 μg / ml and 700 μg / ml,
  • b) adding the sodium phosphate buffer component to the standard solutions,
  • c) a first incubation of the standard solutions,
  • d) adding the albumin component to the standard solutions,
  • e) a second incubation of the standard solutions,
  • f) measuring the turbidity or absorption of the standard solutions and
  • g) plotting the measured turbidity or absorption against the hyaluronic acid concentration.

Hierdurch wird vorteilhaft ermöglicht, dass einer Testlösung bei der die Trübung oder Absorption gemessen wurde, ein bestimmter Gehalt an Hyaluronsäure zugeordnet werden kann.This advantageously makes it possible to assign a specific content of hyaluronic acid to a test solution in which the turbidity or absorption was measured.

Das Lösen der Hyaluronsäure in der Phosphatpuffer-Komponente kann unter Erwärmung, insbesondere auf eine Temperatur von 30°C bis 60°C, durchgeführt werden. Hierdurch wird das Lösen der Hyaluronsäure in der Phosphatpuffer-Komponente erleichtert.The dissolution of the hyaluronic acid in the phosphate buffer component can be carried out with heating, in particular to a temperature of 30 ° C to 60 ° C. This facilitates the dissolution of the hyaluronic acid in the phosphate buffer component.

In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Lösen der Hyaluronsäure in der Phosphatpuffer-Komponente mittels eines Ultraschallbades, eines Vortexers, Schütteln und/oder eines Magnetrührers durchgeführt wird. Hierdurch wird vorteilhaft ermöglicht, dass die Hyaluronsäure vollständig in der Phosphatpuffer-Komponente gelöst wird.In a development of the invention, it is provided that the dissolution of the hyaluronic acid in the phosphate buffer component is carried out by means of an ultrasonic bath, a vortexer, shaking and / or a magnetic stirrer. This advantageously makes it possible for the hyaluronic acid to be completely dissolved in the phosphate buffer component.

Eine Ausführungsform der Erfindung sieht ferner vor, dass die Erstellung der Kalibrierkurve vor, nach oder gleichzeitig mit dem Herstellen der Testlösung und dem Messen der Trübung oder Absorption der Testlösung erfolgt. Bei Erstellung der Kalibierkurve gleichzeitig mit dem Herstellen der Testlösung wird vorteilhaft ermöglicht, dass die Rahmenbedingung bei der Herstellung und Messung sowohl für die Testlösung als auch für die Standardlösungen exakt gleich sind, wodurch die Robustheit des Verfahrens hoch ist. An embodiment of the invention further provides that the preparation of the calibration curve before, after or simultaneously with the preparation of the test solution and measuring the turbidity or absorption of the test solution. When the calibration curve is created simultaneously with the preparation of the test solution, it is advantageously made possible that the framework conditions in the production and measurement for both the test solution and for the standard solutions are exactly the same, whereby the robustness of the method is high.

Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen der Erfindung wird auf die Unteransprüche sowie die nachfolgende Beschreibung eines Ausführungsbeispiels verwiesen.With regard to further advantageous embodiments of the invention, reference is made to the dependent claims and the following description of an embodiment.

Zur Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure in einer Probe wird eine Testlösung hergestellt, die neben einer Probe ein Reaktionsprodukt umfasst, das aus nativer Hyaluronsäure und Serumalbumin als Reaktanden hervorgeht. Weiterhin enthält die Testlösung eine Phosphatpuffer-Komponente und eine Natriumphosphatpuffer-Komponente. Außerdem wird mit Standardlösungen verschiedener Hyaluronsäurekonzentrationen eine Kalibrierkurve erstellt, mittels derer der Gehalt an Hyaluronsäure in der Probe bestimmt wird.To assay for hyaluronic acid in a sample, a test solution is prepared which, in addition to a sample, comprises a reaction product derived from native hyaluronic acid and serum albumin as reactants. Furthermore, the test solution contains a phosphate buffer component and a sodium phosphate buffer component. In addition, standard solutions of various hyaluronic acid concentrations are used to create a calibration curve that determines the level of hyaluronic acid in the sample.

Die Phosphatpuffer-Komponente ist 0,3 molar und verfügt über einen pH-Wert von 5,3. Die Phosphatpuffer-Komponente wird durch Lösen von 36,77 g KH2PO4 und 0,873 g Na2HPO4 in 800 ml H2O R hergestellt, wobei R eine pharmazeutische Bezeichnung ist, die darauf hinweist, dass die Substanz im europäischen Arzneibuch beschrieben ist. Anschließend wird der pH-Wert überprüft und gegebenenfalls auf einen pH-Wert von 5,3 eingestellt. Dann wird die Lösung auf 1000 ml mit H2O R aufgefüllt.The phosphate buffer component is 0.3 molar and has a pH of 5.3. The phosphate buffer component is prepared by dissolving 36.77 g KH 2 PO 4 and 0.873 g Na 2 HPO 4 in 800 ml H 2 OR, where R is a pharmaceutical name indicating that the substance is described in the European Pharmacopoeia , Subsequently, the pH is checked and optionally adjusted to a pH of 5.3. Then the solution is made up to 1000 ml with H 2 OR.

Die Natriumphosphatpuffer-Komponente ist 0,02 molar und verfügt über einen pH-Wert von 6,9. Der Anteil von NaCl beträgt 0,45%. Die Natriumphosphatpuffer-Komponente wird hergestellt durch Lösen von 1,40 g NaH2PO4 × 2H2O, 1,56 g Na2HPO4 und 4,5 g NaCl in 800 ml H2O R. Anschließend wird der pH-Wert überprüft und gegebenenfalls auf einen pH-Wert zwischen 6,8 bis 7,0 eingestellt. Dann wird die Lösung mit H2O R auf 1000 ml aufgefüllt.The sodium phosphate buffer component is 0.02 molar and has a pH of 6.9. The proportion of NaCl is 0.45%. The sodium phosphate buffer component is prepared by dissolving 1.40 g of NaH 2 PO 4 .2H 2 O, 1.56 g of Na 2 HPO 4, and 4.5 g of NaCl in 800 mL of H 2 O R. Thereafter, the pH becomes checked and adjusted if necessary to a pH between 6.8 to 7.0. Then the solution is made up to 1000 ml with H 2 OR.

Die Albumin-Komponente verfügt über einen pH-Wert zwischen 3,72 und 3,78 und sollte täglich frisch hergestellt werden. Zur Herstellung der Albumin-Komponente werden 4,56 ml Eisessig zu 900 ml H2O R gegeben und gut vermischt. Darin werden 5,4 g Natriumacetat (CH3COONa × 3H2O) gelöst. Der pH-Wert wird mittels 18,5%-iger Salzsäure (konzentrierte Salzsäure, 1:1 verdünnt) auf einen Wert zwischen 3,72 und 3,78 eingestellt. Des Weiteren wird 1 mg Bovine Serumalbumin pro ml in der Lösung gelöst. Die 18,5%-ige Salzsäure wird durch Mischen von 50 ml H2O R mit 50 ml konzentrierter Salzsäure hergestellt.The albumin component has a pH between 3.72 and 3.78 and should be freshly prepared daily. To prepare the albumin component, 4.56 ml of glacial acetic acid are added to 900 ml of H 2 OR and mixed well. In it, 5.4 g of sodium acetate (CH 3 COONa × 3H 2 O) are dissolved. The pH is adjusted to between 3.72 and 3.78 using 18.5% hydrochloric acid (concentrated hydrochloric acid diluted 1: 1). Furthermore, 1 mg bovine serum albumin per ml is dissolved in the solution. The 18.5% hydrochloric acid is prepared by mixing 50 ml H 2 OR with 50 ml concentrated hydrochloric acid.

Die Standardlösungen werden mit einer Hyaluronsäurekonzentration von 0 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 300 μg/ml, 500 μg/ml und 700 μg/ml hergestellt. Durch Hinzufügen der Phosphatpuffer-Komponente zu einer Standardstocklösung werden die Standardlösungen hergestellt, wie in Tabelle 1 dargestellt ist. Die Standardstocklösung besteht aus 50 mg Hyaluronsäure, die in 50 ml der Phosphatpuffer-Komponente gelöst wird. Die Hyaluronsäure wurde zuvor 6 Stunden bei 105°C getrocknet über Phosphor-(V)-oxid R. Zum Lösen der Hyaluronsäure in der Phosphatpuffer-Komponente werden beide in einen Kolben gegeben und kräftig geschüttelt. Die Lösung wird im Wasserbad auf maximal 60°C für ca. 30 min erwärmt. Mittels eines Ultraschallbades, eines Vortexers oder kräftigen Schüttelns wird die Hyaluronsäure weiter gelöst. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird gegebenenfalls mit einem Magnetrührer so lange gerührt bis die Hyaluronsäure vollständig gelöst ist und keine Klumpen mehr sichtbar sind. Konzentration Hyaluronsäure (μg/ml) Standardstocklösung [ml] Phosphatpuffer-Komponente pH 5,3 ad [ml] 0 0 10 100 1,0 10 150 1,5 10 200 2,0 10 250 2,5 10 300 3,0 10 500 5,0 10 700 7,0 10 The standard solutions are prepared with a hyaluronic acid concentration of 0 μg / ml, 100 μg / ml, 150 μg / ml, 200 μg / ml, 250 μg / ml, 300 μg / ml, 500 μg / ml and 700 μg / ml. By adding the phosphate buffer component to a standard stock solution, the standard solutions are prepared as shown in Table 1. The standard stick solution consists of 50 mg hyaluronic acid, which is dissolved in 50 ml of the phosphate buffer component. The hyaluronic acid was previously dried for 6 hours at 105 ° C over phosphorus (V) oxide R. To dissolve the hyaluronic acid in the phosphate buffer component, both are placed in a flask and shaken vigorously. The solution is heated in a water bath to a maximum of 60 ° C for about 30 min. The hyaluronic acid is further dissolved by means of an ultrasonic bath, vortexer or vigorous shaking. After cooling to room temperature, stirring is continued with a magnetic stirrer until the hyaluronic acid is completely dissolved and no more lumps are visible. Concentration of hyaluronic acid (μg / ml) Standard stick solution [ml] Phosphate buffer component pH 5.3 ad [ml] 0 0 10 100 1.0 10 150 1.5 10 200 2.0 10 250 2.5 10 300 3.0 10 500 5.0 10 700 7.0 10

Die Testlösung wird hergestellt durch Verdünnung der Probe mit einer Phosphatpuffer-Komponente auf eine Hyaluronsäurekonzentration zwischen 100 μg/ml bis 700 μg/ml.The test solution is prepared by diluting the sample with a phosphate buffer component to a hyaluronic acid concentration between 100 μg / ml to 700 μg / ml.

Unmittelbar nach der Herstellung der Standardlösungen und der Testlösung werden jeweils 0,5 ml der Standardlösungen und der Testlösung mit 0,5 ml der 0,02 molaren Natriumphosphatpuffer-Komponente vermischt. Im Anschluss erfolgt eine erste Inkubation der Standardlösungen und der Testlösung bei einer Temperatur von 37°C für eine Dauer von 5 min. Unmittelbar danach werden 5 ml der Albumin-Komponente zu den Standardlösungen und der Testlösung hinzugefügt. Anschließend erfolgt eine zweite Inkubation mit einer Dauer von 10 min und bei einer Temperatur von 37°C. Direkt im Anschluss an die zweite Inkubation wird die Trübung der Standardlösungen und der Testlösung bei einer Wellenlänge von 600 nm mittels eines Photometers gemessen, wobei alternativ die Messung auch mit einem Turbidimeter oder Nephelometer erfolgen kann. Durch graphisches Auftragen der gemessenen Trübung bzw. Absorption der Standardlösungen gegen die Hyaluronsäurekonzentrationen der Standardlösungen wird eine Kalibrierkurve erstellt. Unter zu Hilfenahme der Kalibrierkurve wird der Gehalt an Hyaluronsäure der Probe aus der gemessenen Trübung bzw. Absorption der Testlösung bestimmt.Immediately after the preparation of the standard solutions and the test solution, 0.5 ml each of the standard solutions and the test solution are mixed with 0.5 ml of the 0.02 molar sodium phosphate buffer component. This is followed by a first incubation of the standard solutions and the test solution at a temperature of 37 ° C for a period of 5 min. Immediately thereafter, 5 ml of the albumin component is added to the standard solutions and the test solution. This is followed by a second incubation with a duration of 10 minutes and at a temperature of 37 ° C. Immediately following the second incubation, the turbidity of the standard solutions and the test solution at a wavelength of 600 nm is measured by means of a photometer, alternatively, the measurement can also be carried out with a turbidimeter or nephelometer. By plotting the measured turbidity or absorption of the standard solutions against the hyaluronic acid concentrations of the standard solutions, a calibration curve is created. With the aid of the calibration curve, the content of hyaluronic acid of the sample is determined from the measured turbidity or absorption of the test solution.

Claims (13)

Optisches Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Hyaluronsäure in Pharmazeutika, Medizinprodukten, Kosmetika und Rohstoffen, umfassend die Schritte: a) Herstellen einer Testlösung, die eine Probe enthält, deren Gehalt an Hyaluronsäure zu bestimmen ist, b) Messen der Trübung oder Absorption der Testlösung, c) Auswerten der gemessenen Trübung oder Absorption unter Zuhilfenahme einer Kalibrierkurve, dadurch gekennzeichnet, dass eine Testlösung verwendet wird, die ein Reaktionsprodukt umfasst, das aus nativer Hyaluronsäure und Serumalbumin als Reaktanden hervorgeht, wobei eine enzymatische Reaktion der nativen Hyaluronsäure vermindert oder verhindert wird.Optical method for assaying hyaluronic acid in pharmaceuticals, medical devices, cosmetics and raw materials, comprising the steps of: a) preparing a test solution containing a sample to be assayed for hyaluronic acid content, b) measuring the turbidity or absorption of the test solution, c) Evaluating the measured turbidity or absorption using a calibration curve, characterized in that a test solution is used which comprises a reaction product resulting from native hyaluronic acid and serum albumin as reactants whereby an enzymatic reaction of the native hyaluronic acid is reduced or prevented. Optisches Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Messen der Trübung oder Absorption der Testlösung in Schritt b) mittels eines Photometers, Turbidimeters oder eines Nephelometers erfolgt.An optical method according to claim 1, characterized in that the measurement of turbidity or absorption of the test solution in step b) by means of a photometer, turbidimeter or a nephelometer. Optisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trübung oder Absorption der Testlösung bei einer Wellenlänge von 200 nm bis 800 nm, bevorzugt bei 550 nm bis 650 nm, besonders bevorzugt bei 600 nm, gemessen wird.Optical method according to one of the preceding claims, characterized in that the turbidity or absorption of the test solution at a wavelength of 200 nm to 800 nm, preferably 550 nm to 650 nm, more preferably at 600 nm, is measured. Optisches Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Testlösung folgende Komponenten umfasst: a) eine Phosphatpuffer-Komponente, die bevorzugt 0,3 molar ist und besonders bevorzugt einen pH-Wert von 5,3 aufweist, b) eine Natriumphosphatpuffer-Komponente, die bevorzugt 0,02 molar ist und besonders bevorzugt einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 aufweist, und c) eine Albumin-Komponente, die Serumalbumin umfasst, und die bevorzugt einen pH-Wert von 3,72 bis 3,78 aufweist.Optical method according to one of the preceding claims, characterized in that the test solution comprises the following components: a) a phosphate buffer component which is preferably 0.3 molar and particularly preferably has a pH of 5.3, b) a sodium phosphate buffer Component which is preferably 0.02 molar, more preferably has a pH of 6.8 to 7.0, and c) an albumin component comprising serum albumin, and preferably has a pH of 3.72 to 3.78. Optisches Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Herstellen der Testlösung folgende Schritte umfasst: a) Lösen der Probe in der Phosphatpuffer-Komponente, b) Hinzugeben der Natriumphosphatpuffer-Komponente, c) eine erste Inkubation der Testlösung, d) Hinzugeben der Albumin-Komponente und e) eine zweite Inkubation der Testlösung.An optical method according to claim 3, characterized in that the preparation of the test solution comprises the steps of: a) dissolving the sample in the phosphate buffer component, b) adding the sodium phosphate buffer component, c) a first incubation of the test solution, d) adding the albumin Component and e) a second incubation of the test solution. Optisches Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Inkubation für eine Zeitdauer von 2 min bis 10 min, bevorzugt 5 min bis 10 min, besonders bevorzugt 5 min, erfolgt.Optical method according to claim 5, characterized in that the first incubation for a period of 2 min to 10 min, preferably 5 min to 10 min, more preferably 5 min, takes place. Optisches Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Inkubation bei einer Temperatur von 20°C bis 60°C, bevorzugt bei 37°C, erfolgt.Optical method according to claim 5, characterized in that the first incubation at a temperature of 20 ° C to 60 ° C, preferably at 37 ° C, takes place. Optisches Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Inkubation für eine Zeitdauer von 5 bis 60 min, bevorzugt 10 min, erfolgt. Optical method according to one of claims 5 to 6, characterized in that the second incubation for a period of 5 to 60 minutes, preferably 10 minutes, takes place. Optisches Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Inkubation bei einer Temperatur von 20°C bis 60°C, bevorzugt bei 37°C, erfolgt.Optical method according to one of claims 5 to 7, characterized in that the second incubation at a temperature of 20 ° C to 60 ° C, preferably at 37 ° C, takes place. Optisches Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Erstellen der Kalibrierkurve folgende Schritte umfasst: a) Herstellen von Standardlösungen mit verschiedenen Hyaluronsäurekonzentrationen, wobei zur Herstellung der Standardlösungen Hyaluronsäure in der Phosphatpuffer-Komponente gelöst wird, bevorzugt werden Standardlösungen mit einer Hyaluronsäurekonzentration von 0 µg/ml bis 1,0 mg/ml hergestellt, besonders bevorzugt werden Standardlösungen mit Hyaluronsäurekonzentrationen von 0 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml, 250 µg/ml, 300 µg/ml, 500 µg/ml und 700 µg/ml hergestellt, b) Hinzugeben der Natriumphosphatpuffer-Komponente zu den Standardlösungen, c) eine erste Inkubation der Standardlösungen, d) Hinzugeben der Albumin-Komponente zu den Standardlösungen, e) eine zweite Inkubation der Standardlösungen, f) Messen der Trübung oder Absorption der Standardlösungen und g) graphisches Auftragen der gemessenen Trübung oder Absorption gegen die Hyaluronsäurekonzentration.Optical method according to one of claims 4 to 8, characterized in that the preparation of the calibration curve comprises the following steps: a) Preparation of standard solutions with different Hyaluronsäurekonzentrationen, wherein for the preparation of the standard solutions hyaluronic acid is dissolved in the phosphate buffer component, preferred are standard solutions with a Hyaluronic acid concentration from 0 μg / ml to 1.0 mg / ml are prepared, particularly preferred are standard solutions with hyaluronic acid concentrations of 0 μg / ml, 100 μg / ml, 150 μg / ml, 200 μg / ml, 250 μg / ml, 300 μg / b) adding the sodium phosphate buffer component to the standard solutions, c) a first incubation of the standard solutions, d) adding the albumin component to the standard solutions, e) a second incubation of the standard solutions , f) measuring the turbidity or absorption of the standard solutions and g) plotting the measured turbidity or Abso against the hyaluronic acid concentration. Optisches Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösen der Hyaluronsäure in der Phosphatpuffer-Komponente unter Erwärmung durchgeführt wird, insbesondere auf eine Temperatur von 30°C bis 60°C.Optical method according to claim 9, characterized in that the dissolution of the hyaluronic acid in the phosphate buffer component is carried out under heating, in particular to a temperature of 30 ° C to 60 ° C. Optisches Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösen der Hyaluronsäure in der Phosphatpuffer-Komponente mittels eines Ultraschallbades, eines Vortexers, Schütteln und/oder eines Magnetrührers durchgeführt wird.Optical method according to claim 9 or 10, characterized in that the dissolution of the hyaluronic acid in the phosphate buffer component by means of an ultrasonic bath, a vortexer, shaking and / or a magnetic stirrer is performed. Optisches Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Erstellung der Kalibrierkurve vor, nach oder gleichzeitig mit dem Herstellen der Testlösung und dem Messen der Trübung oder Absorption der Testlösung erfolgt.An optical method according to claim 9, 10 or 11, characterized in that the preparation of the calibration curve before, after or simultaneously with the preparation of the test solution and measuring the turbidity or absorption of the test solution.
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