DE102015011530B4

DE102015011530B4 - Identifizierung des Enzyms RosB und Verfahren zur Umwandlung eines Methyl-substituierten Aromaten in einen Amino-substituierten Aromaten unter Verwendung dieses Enzyms

Info

Publication number: DE102015011530B4
Application number: DE102015011530.8A
Authority: DE
Inventors: Matthias Mack; Julia Schwarz; Valentino Konjik
Original assignee: Hochschule fur Angewandte Wissenschaften Mannheim; Hochschule fur Angewandte Wss Mannheim
Current assignee: Hochschule fur Angewandte Wissenschaften Mannheim; Hochschule fur Angewandte Wss Mannheim
Priority date: 2015-09-03
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2018-02-15
Anticipated expiration: 2035-09-04
Also published as: DE102015011530A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten, umfassend den Schritt des Umsetzens eines Methyl-substituierten Aromaten, eines Formyl-substituierten Aromaten oder eines Carboxyl-substituierten Aromaten mit einem rekombinanten und/oder isolierten Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat dieses Polypeptids, wobei die Umsetzung in vitro und in Anwesenheit von Glutamat bzw. Glutaminsäure, NAD+ und Thiamin und/oder Thiaminpyrophosphat erfolgt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Aminosubstituierten Aromaten, ein Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat, ein Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Roseoflavin.
Antiinfektiva sind niedermolekulare Verbindungen, die das Wachstum von Mikroorganismen hemmen. Eine wesentliche Eigenschaft von Antiinfektiva ist deren Spezifität. Antiinfektiva sollen gezielt das Wachstum der Krankheitserreger eindämmen und dürfen gleichzeitig den menschlichen Körperzellen nicht schaden. Dies bedeutet, dass die Zielmoleküle für die Antiinfektiva im Menschen oder Tier nicht vorkommen dürfen. Es gibt zurzeit nur wenige Klassen von Verbindungen, die die oben angeführten Anforderungen vollständig erfüllen.
Eine neue Klasse von Antiinfektiva stellen die Flavinanaloga dar. Wichtig für die industrielle Produktion von Flavinanaloga ist das Verständnis von deren Biosynthese.
Die Arbeitshypothese zur Wirkung von Flavinanaloga ist, dass diese Verbindungen aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu Riboflavin zwar in Flavoenzyme eingebaut werden, dort aber keine (oder eine stark reduzierte) biochemische Wirkung haben bzw. den Wasserstofftransfer nicht mehr korrekt durchführen können. Somit werden die betroffenen Flavoenzyme durch die Bindung an Flavinanaloga inaktiviert. Die für den zellulären Energiestoffwechsel so wichtigen Redoxreaktionen können nicht mehr stattfinden und die Zelle kann aufgrund von ATP-Mangel nicht mehr oder nur verlangsamt wachsen. Ungefähr 1–3% aller Enzyme in einer Zelle sind abhängig von Riboflavin. Eine Inaktivierung dieser Enzyme wäre ein sicherer Weg, das Wachstum von Krankheitserregern zu hemmen. Darüber hinaus ist die Ausbildung von Resistenzen bei der Verwendung von Flavinanaloga deutlich weniger wahrscheinlich, da eine hemmende Wirkung an vielen verschiedenen Steilen gleichzeitig erzielt wird.
Viele klassische Antibiotika haben dagegen nur ein Zielmolekül. Eine Resistenz ist aus diesem Grund wesentlich wahrscheinlicher.
Darüber hinaus sind FMN-RNA-Schalter Zielmoleküle für Flavinanaloga. RNA-Schalter sind genetische Elemente, die die Synthese wichtiger Moleküle in der Zelle steuern.
Das Gram-positive Bakterium Streptomyces davawensis wurde im Rahmen eines Screening-Programms nach bioaktiven Naturstoffen aus einer philippinischen Bodenprobe isoliert. Strep tomyces davawensis synthetisiert das Antibiotikum Roseoflavin (8-Demethyl-8-dimethylamino-riboflavin). Roseoflavin wirkt wachstumshemmend auf Gram-positive Mikroorganismen (z. B. Bacillus subtilis MHK 1.56 μg/ml). Die direkte Vorstufe von Roseoflavin ist 8-Demethyl-8-amino-riboflavin, welches ebenfalls antibiotische Wirkung hat.
Roseoflavin und 8-Demethyl-8-amino-riboflavin sind die einzigen bekannten natürlichen Flavinanaloga, die antibiotische Aktivität aufweisen.
Wachstumsversuche mit ¹⁴C-markierten GTP bzw. Riboflavin zeigten, dass Roseoflavin in S. davawensis aus Riboflavin (Vitamin B₂) synthetisiert wird (1).
Weiter ist bekannt, dass das Enzym RosA aus S. davawensis die zweifache Methylierung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin katalysiert und Roseoflavin bildet (2). Unbekannt sind im Stand der Technik bisher die Gene/das Gen für die Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin.
Schwarz, J. beschreibt in ihrer Dissertation an der medizinischen Fakultät Mannheim der Ruprecht-Karls-Universität zu Heidelberg Studien zur Aufklärung der Biosynthese von Roseoflavin aus Streptomyces davawensis.
Jankowitsch, F. et al. beschreiben die Genomsequenz des Bakteriums Streptomyces davawensis JCM 4913 und die heterologe Produktion des Antibiotikums Roseoflavin (in J. Bacteriol., Vol. 194, 2012, pp. 6818 to 6827).
Roseoflavin und 8-Demethyl-8-amino-riboflavin wurden vielfach für die Analyse flavinabhängiger Enzyme eingesetzt. Darüber hinaus wurde Roseoflavin für die Optimierung biotechnologischer Riboflavin-Produktionsprozesse genutzt. Das kommerziell erhältliche Roseoflavin wird synthetisch hergestellt (ca. € 5.000/g). 8-Demethyl-8-amino-riboflavin ist bisher nicht kommerziell erhältlich.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein rekombinantes und/oder isoliertes Polypeptid, welches in der Lage ist, einen Methyl-substituierten Aromaten oder einen Formyl-substituierten Aromaten oder einen Carboxyl-substituierten Aromaten in einen Amino-substituierten Aromaten umzusetzen, sowie insbesondere Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat, 8-Demethyl-8-amino-riboflavin und Roseoflavin bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Insbesondere wird in der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes und/oder isoliertes Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder ein biologisch aktives Fragment oder Derivat dieses Polypeptids verwendet. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 entspricht der Aminosäuresequenz des Proteins RosB aus Streptomyces davawensis. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht dieses Polypeptid aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Gendeletionsexperimente zeigen, dass ein ganz bestimmtes Gencluster („clus 2”; 4) aus Streptomyces davawensis für die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich ist. Nur die Ausschaltung dieses Genclusters produzierte Mutanten, die kein 8-Demethyl-8-amino-riboflavin und kein Roseoflavin mehr bilden konnten.
Essentielle Gene für die Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin müssen auf dem Gencluster „clus 2” zu finden sein (5).
Lediglich ein einziges Gen (BN159_7989) des Genclusters „clus 2” ist für die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich. Die Ausschaltung der übrigen Gene führte nicht zu dem Verlust der Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin (6).
Das Gen BN159_7989 wurde daraufhin in S. coelicolor exprimiert. S. coelicolor kann als Wildtyp kein Roseoflavin und kein 8-Demethyl-8-amino-riboflavin produzieren. Nach Einführung von BN159_7989 in das Chromosom von S. coelicolor wurde die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin mittels HPLC festgestellt (7 und 11). Dies bedeutet, dass die Einführung des Gens BN159_7989 in das Chromosom von S. coelicolor alleine für die Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich ist (7). Das Gen BN159_7989 wurde rosB genannt.
Das Protein RosB wurde im heterologen Wirt Escherichia coli produziert und wurde aus E. coli zur Homogenität gereinigt. RosB zeigt in vitro unter Zugabe von Thiaminpyrophosphat (TPP; Phosphatester des Thiamins (Vitamin B1)), NAD (alternative Abkürzung: NAD⁺; oxidierte Form von Nicotinamidadenindinukleotid) und Glutamat die Umsetzung von Flavinmononukleotid (Riboflavin-5'-phosphat) zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat (AFMN) (8). Thiaminpyrophosphat (TPP), NAD und Glutamat sind Kofaktoren/Kosubstrate von RosB. Pro produziertem Molekül AFMN werden ein Molekül TPP, drei Moleküle NAD und ein Molekül Glutamat benötigt.
8 zeigt die Umwandlung von Flavinmononukleotid (FMN) in 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat und in Roseoflavin durch die Enzyme RosB und RosA. Damit ist die Biosynthese von Roseoflavin (bis auf die Dephosphorylierung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin) aufgeklärt. Die m/z-Werte der Intermediate sind in 8 gezeigt. Im ersten Reaktionsschritt (katalysiert von RosB in Anwesenheit von Sauerstoff) wird FMN zu 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat umgewandelt. Dieses Intermediat wurde mittels LC/MS, Derivatisierung und Fragmentierung nachgewiesen (10). 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat wird dann zu 8-Demethyl-8-carboxyl-dihydro-riboflavin-5'-phosphat (katalysiert von RosB in Anwesenheit von Thiamin oder Thiaminpyrophosphat) umgesetzt. Mittels LC/MS lässt sich dabei die oxidierte Verbindung 8-Demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5'-phosphat detektieren. Die Oxidation erfolgt dabei durch die oxischen Bedingungen, welche während des LC/MS Verfahrens vorliegen. 8-Demethyl-8-carboxyl-dihydro-riboflavin-5'-phosphat decarboxyliert und anschließend oder parallel dazu erfolgt die Übertragung der Aminogruppe von Glutamat (Glu) und die Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat (katalysiert von RosB in Anwesenheit von Glutamat und 3 NAD⁺). NAD nimmt den Wasserstoff auf, der durch Oxidation zu 8-Demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5'-phosphat frei wird. Die Freisetzung von CO₂ führt wiederum zur Bildung von Wasserstoff. Auch die Oxidation von Glutamat zu 2-Oxoglutarat setzt Wasserstoff frei. Daher werden formal 3 NAD als Akzeptor notwendig. Die komplette Reaktion findet an einem Enzym (RosB) statt. Die Intermediate konnten identifiziert werden, da ohne TPP nur 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat aus FMN gebildet wird. Mit TPP geht die Reaktion bis 8-Demethyl-8-carboxyl-dihydro-riboflavin-5'-phosphat, welches unter oxischen Bedingungen als 8-Demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5'-phosphat nachgewiesen wurde. Mit Glutamat und NAD wird dann 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat gebildet. Glutamat wird dabei zu 2-Oxoglutarat (2-OG) umgewandelt. 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat (Struktur in 8 nicht gezeigt) wird zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin dephosphoryliert. Die dabei beteiligte Phosphatase ist noch unbekannt. 8-Demethyl-8-amino-riboflavin ist Substrat für die nachfolgende Umsetzung zu Roseoflavin durch RosA.
Die Intermediate der von RosB katalysierten Reaktion, d. h. 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat (10) und 8-Demethyl-8-carboxy-dihydro-riboflavin-5'-phosphat (als 8-Demethyl-8-carboxy-riboflavin-5'-phosphat) wurden eindeutig mittels HPLC/MS, Derivatisierung und Fragmentierung identifiziert.
Wie vorstehend beschrieben synthetisiert das Enzym RosB phosphoryliertes 8-Demethyl-8-amino-riboflavin (8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat; AFMN) aus FMN (Flavinmononukleotid, Riboflavin-5'-phosphat). Das Enzym RosA akzeptiert nur 8-Demethyl-8-amino-riboflavin (AF) als Substrat (nicht AFMN). Die Umwandlung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin erfolgt in Streptomyces davawensis entweder durch eine unspezifische (unbekannte) Phosphatase oder durch eine spezifische (unbekannte) Phosphatase. In S. coelicolor erfolgt die Umwandlung mittels einer unspezifischen Phosphatase.
Die Expression von rosA und rosB führt auch in Escherichia coli zur Bildung von Roseoflavin. Auch in E. coli gibt es eine unspezifische Phosphatase, die 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin umsetzt.
Die alkalische Phosphatase (z. B. calf-intestinal alkaline phosphatase, CIP, alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm) ist beispielsweise geeignet, in vitro die Umwandlung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin zu katalysieren.
RosB katalysiert eine vollkommen neue Reaktion, die Demethylierung von FMN und die Einführung einer Aminogruppe über entsprechende Formyl- und Carboxyl-FMN-Derivate. Auf Basis dieses Enzyms können vollkommen neue Synthesestrategien gefahren werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „rekombinantes und/oder isoliertes Polypeptid” sowohl rekombinantes Polypeptid, isoliertes Polypeptid, als auch rekombinantes, isoliertes Polypeptid verstanden.
Hier bezeichnet der Begriff „biologisch aktives Fragment” Fragmente des Polypeptids, welche eine oder mehrere Aminosäure-Deletionen im Vergleich zum Polypeptid aufweisen. Der Begriff „biologisch aktiv” bezeichnet dabei die Fähigkeit dieser Fragmente, Methyl-substituierte Aromaten in Amino-substituierte Aromaten, vorzugsweise Flavinmononukleotid in 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat umzuwandeln. Ferner bezeichnet der Begriff „biologisch aktives Derivat” Derivate, die sich durch eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen vom Polypeptid unterscheiden. Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität des Polypeptids oder eines Fragments oder Derivats dieses Polypeptids unterliegen keinen bestimmten Beschränkungen und sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Obwohl die Zahl an Aminosäure-Substitutionen und/oder -Insertionen und/oder -Deletionen grundsätzlich nur beschränkt wird durch die obige Vorgabe bezüglich der biologischen Aktivität des jeweils resultierenden Fragments oder Derivats, zeigen die Fragmente oder Derivate zum Polypeptid bevorzugt eine Sequenzidentität von mindestens 50%, mindestens 52.5%, mindestens 55%, mindestens 57.5%, mindestens 60%, mindestens 62.5%, mindestens 65%, mindestens 67.5%, mindestens 70%, mindestens 72.5%, mindestens 75%, mindestens 76.25%, mindestens 77.5%, mindestens 78.75%, mindestens 80%, mindestens 81.25%, mindestens 82.5%, mindestens 83.75%, mindestens 85%, mindestens 86.25%, mindestens 87.5%, mindestens 88%, mindestens 88.5%, mindestens 89%, mindestens 89.5%, mindestens 90%, mindestens 90.5%, mindestens 91%, mindestens 91.5%, mindestens 92%, mindestens 92.5%, mindestens 93%, mindestens 93.5%, mindestens 94%, mindestens 94.5%, mindestens 95%, mindestens 95.25%, mindestens 95.5%, mindestens 95.75%, mindestens 96%, mindestens 96.25%, mindestens 96.5%, mindestens 96.75%, mindestens 97%, mindestens 97.25%, mindestens 97.5%, mindestens 97.75%, mindestens 98%, mindestens 98.25%, mindestens 98.5%, mindestens 98.75%, mindestens 99%, mindestens 99.25% oder mindestens 99.5%.
Verfahren zur Herstellung und/oder Isolierung von Polypeptiden sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise chemisch-synthetische oder enzymatische Verfahren, sowie die rekombinante Expression und nachfolgende Aufreinigung und Isolierung der Polypeptide.
Ein allgemein beschriebener Aspekt betrifft eine isolierte Nukleinsäure, welche das beschriebene Polypeptid kodiert. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen sind auch auf diesen Aspekt in analoger Weise anwendbar.
Der Begriff „Nukleinsäure” bezeichnet ein natives, halbsynthetisches, synthetisches oder modifiziertes, einzel- oder doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden. Geeignete modifizierte Nukleotide umfassen Nukleotide mit modifizierten Basen, Zuckern und/oder Phosphatgruppen.
Verfahren zur Herstellung und/oder Isolierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise chemisch-synthetische oder enzymatische Verfahren, sowie die intrazelluläre Expression und nachfolgende Aufreinigung der Oligonukleotide.
Wird die beschriebene Nukleinsäure in das Genom einer transgenen Zelle eingebaut, so ist es besonders vorteilhaft, wenn die Nukleinsäure je nach verwendeter Wirtszelle codon-optimiert wurde.
Vorzugweise umfasst die beschriebene Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder ein biologisch aktives Fragment oder Derivat dieser Nukleinsäuresequenz. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen bezüglich der biologischen Aktivität und der Sequenzidentität sind auch auf diesen Aspekt in analoger Weise anwendbar. Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 entspricht der Nukleinsäuresequenz des Gens rosa aus Streptomyces davawensis. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die beschriebene Nukleinsäure aus der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
Ein weiterer allgemein beschriebener Aspekt betrifft einen Vektor, umfassend die beschriebene Nukleinsäure. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen sind auch auf diesen Aspekt in analoger Weise anwendbar. Der beschriebene Vektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wobei geeignete Vektoren im Stand der Technik bekannt sind. Der Vektor ist vorzugsweise zur Expression in einer eukaryontischen oder prokaryontischen Zelle befähigt. Dazu enthält der Vektor beispielsweise einen Promotor und gegebenenfalls geeignete regulatorische Elemente, wie Enhancer und Terminationssequenzen. Der Vektor kann auch zur stabilen Integration der beschriebenen Nukleinsäure in das genetische Material einer Zelle verwendet werden. Vektoren können beispielswiese Plasmide oder virale Vektoren sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der beschriebene Vektor ein Plasmid. Besonders bevorzugt ist der beschriebene Vektor ein high-copy Plasmidvektor, da ein high-copy Plasmidvektor vorteilhafterweise die Kopienzahl und Expressionsrate erhöht.
Die Expression der Gene rosB und rosA reicht aus, um Roseoflavin in einer Wirtszelle zu bilden (9). Dies bedeutet, dass die Roseoflavinbiosynthese nur zwei Gene (rosA und rosB) benötigt.
Daher umfasst der Vektor in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weiter eine Nukleinsäure, welche das Gen rosA kodiert. Durch Expression der Gene rosA und rosB ist es möglich, in einer Zelle Roseoflavin aus Flavinmononukleotid herzustellen. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die entsprechenden Nukleinsäuren je nach verwendeter Wirtszelle codon-optimiert wurden.
Gegebenenfalls kann ein geeignetes Phosphatase-Gen in das Genom einer Wirtszelle eingeführt werden, falls keine anderweitige Dephosphorylierung von AFMN zu AF in der Wirtszelle erfolgt oder um die Dephosphorylierungsrate von AFMN zu AF in der Wirtszelle zu erhöhen.
Daher umfasst der Vektor in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Nukleinsäure, welche für ein Gen einer Phosphatase kodiert, die AFMN zu AF dephosphorylieren kann. Beispielsweise kann das Gen der alkalischen Phosphatase (z. B. calf-intestinal alkaline phosphatase, CIP, alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm) in das Genom der Wirtszelle eingeführt werden.
Ein weiterer allgemein beschriebener Aspekt betrifft eine Wirtszelle, umfassend den beschriebenen Vektor oder die beschriebene Nukleinsäure. Da die Wirtszelle den beschriebenen Vektor oder die beschriebene Nukleinsäure umfasst, handelt es sich bei der Wirtszelle um eine transgene Zelle wie aus dem Stand der Technik bekannt. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen sind auch auf diesen Aspekt in analoger Weise anwendbar. Die beschriebene Wirtszelle unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, solange die Zelle das beschriebene Polypeptid produzieren kann. Beispiele geeigneter Wirtszellen sind Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae. Vorzugsweise handelt es sich bei der Wirtszelle um ein mikrobielles System mit hohen Wachstumsraten.
In einer bevorzugten Ausführungsform, umfasst das Genom der Wirtszelle eine Nukleinsäure, welche das Gen rosA kodiert. Durch Expression der Gene rosA und rosB ist es möglich in der Wirtszelle Roseoflavin aus Flavinmononukleotid herzustellen. Dabei kann das rosA Gen ein exogenes oder endogenes Gen der Wirtszelle sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Genom der Wirtszelle eine Nukleinsäure, welche für ein Gen einer Phosphatase kodiert, die AFMN zu AF dephosphorylieren kann. Beispielsweise kann das Gen der alkalischen Phosphatase (z. B. calf-intestinal alkaline phosphatase, CIP, alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm) in das Genom der Wirtszelle eingeführt werden.
Wie vorstehend beschrieben, wurde im Bakterium Streptomyces davawensis ein Protein identifiziert (RosB), das die Umwandlung von Flavinmononukleotid (FMN) in 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat katalysiert. Die Reaktion verläuft in vitro in einem einzigen enzymatischen Schritt unter Verwendung von Glutamat, NAD und Thiaminpyrophosphat als Kofaktoren. Ebenso kann diese Reaktion in einer beschriebenen Wirtszelle erfolgen. Der Austausch einer Methylgruppe oder einer Formylgruppe oder einer Carboxylgruppe gegen eine Aminogruppe an einem Aromaten ist mechanistisch schwierig. Entsprechende Umsetzungen über chemisch-synthetische Verfahren wären sehr aufwendig und daher mit hohen Kosten verbunden. Vorteilhafterweise ist es durch das beschriebene Polypeptid jedoch möglich, diese Umsetzungen mit geringem Aufwand und daher kostensparend zu erreichen. Bisher war kein Enzym bekannt, das solche Reaktionen durchführt. Grundsätzlich sind diese über das beschriebene Polypeptid vermittelten Umsetzungen für die großtechnische Synthese pharmakologisch relevanter Verbindungen nutzbar, während entsprechende chemisch-synthetische Verfahren im Vergleich zu kostenintensiv wären.
Daher betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten, umfassend den Schritt des Umsetzens eines Methyl-substituierten Aromaten, eines Formyl-substituierten Aromaten oder eines Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen rekombinanten und/oder isolierten Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat dieses Polypeptids, wobei die Umsetzung in vitro und in Anwesenheit von Glutamat bzw. Glutaminsäure, NAD⁺ und Thiamin und/oder Thiaminpyrophosphat erfolgt. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen sind auf diesen Aspekt der Erfindung in analoger Weise anwendbar. Als Intermediate der Umsetzung des Methyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid zur Herstellung des Amino-substituierten Aromaten entstehen der Formyl-substituierte Aromat und der Carboxyl-substituierte Aromat. Als Intermediat der Umsetzung des Formyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid zur Herstellung des Amino-substituierten Aromaten entsteht der Carboxyl-substituierte Aromat.
Hier bezeichnet der Begriff „Amino-substituierter Aromat” eine Verbindung, in welcher mindestens eine Aminogruppe (NH₂-Gruppe) an ein Gerüstatom, welches vorzugsweise Kohlenstoff ist, eines aromatischen Rings gebunden ist. Weiter umfasst dieser Begriff alle entsprechenden Salze dieser Verbindung.
Hier bezeichnet der Begriff „entsprechende Salze” die sich von der Ausgangsverbindung beispielsweise durch H⁺-Aufnahme und/oder H⁺-Abgabe, ableitenden Salze, wie beispielsweise die entsprechenden Halogenide, Oxide, Sulfide, Carbonate, Sulfate, Phosphate, Nitrate und/oder, Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Ammonium-, und Übergangsmetallsalze, und die entsprechenden gemischten Salze.
Die weiteren möglichen Substituenten des aromatischen Rings unterliegen keiner besonderen Beschränkung, d. h. anstelle von Wasserstoffatomen können sämtliche im Stand der Technik bekannten Substituenten an den weiteren Positionen des aromatischen Rings gebunden sein. Vorzugsweise sind die weiteren Substituenten ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, -NR¹R², -NO₂, -CN, -OR³, -C(O)R⁴, -C(O)NR⁵R⁶, C₁-C₆ Alkyl, C₂-C₆ Alkenyl, Aryl, Heteroaryl, 1-Ribityl (Formel (1)), 1-Ribit-5-phospho-ylen (Formel (2)) und -COOR⁷, wobei jedes von R¹ bis R⁷ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₆ Alkylgruppe sein kann.
Hier bezeichnet der Begriff „Halogen” insbesondere Fluoratome, Chloratome und Bromatome.
Ferner bezeichnet der Begriff „C₁-C₆ Alkyl” eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei die Alkylgruppe gegebenenfalls wie vorstehend definiert substituiert sein kann.
Der Begriff „C₂-C₆ Alkenyl” bezeichnet eine verzweigte oder unverzweigte Alkenylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei die Alkenylgruppe gegebenenfalls wie vorstehend definiert substituiert sein kann.
Der Begriff „Aryl” bezeichnet eine Arylgruppe, bestehend aus beispielsweise 1 bis 3 Ringen, wie beispielsweise eine Phenylgruppe oder eine Naphthylgruppe, wobei die Arylgruppe wie vorstehend definiert substituiert sein kann.
Der Begriff „Heteroaryl” bezeichnet eine Heteroarylgruppe, bestehend aus beispielsweise 1 bis 3 Ringen, wie beispielsweise eine Pyridylgruppe, eine Pyrimidinylgruppe, eine Thienylgruppe, eine Furylgruppe oder eine Pyrrolylgruppe, wobei die Heteroarylgruppe wie vorstehend definiert substituiert sein kann.
Der aromatische Ring, an dem die mindestens eine Aminogruppe gebunden ist, kann gegebenenfalls Teil eines polycyclischen Moleküls sein, wobei das polycyclische Molekül ein polykondensierter Aromat mit vollständiger Konjugation im polycyclischen Ringsystem oder ein polycyclisches Molekül mit aromatischen und nicht-aromatischen Ringen sein kann. Das polycyclische Molekül kann die vorstehend genannten Substituenten aufweisen und/oder Kohlenstoffatom(e) des polycyclischen Moleküls kann/können Teil einer Carbonylgruppe sein. Beispiele für aromatische Ringe, an welche die mindestens eine Aminogruppe gebunden sein kann, bzw. für polycyclische Moleküle mit einem aromatischen Ring, an den die mindestens eine Aminogruppe gebunden sein kann, sind Benzol, Naphthalin, Fluoren, Phenalen, Anthracen, Phenanthren, Tetracen, Chrysen, Pyren, Perylen, Pentacen, Pentaphen, Inden und die reduzierten Derivate dieser Verbindungen, wobei mindestens ein aromatischer Ring in diesen reduzierten Derivaten nicht reduziert ist und an diesen Ring die mindestens eine Aminogruppe gebunden ist.
Der aromatische Ring ist bevorzugt Teil eines polycyclischen Moleküls. Besonders bevorzugt ist der aromatische Ring Teil eines polycyclischen Moleküls mit 2 bis 5 annelierten Ringen, am bevorzugtesten ist er Teil eines polycyclischen Moleküls mit 3 annelierten Ringen.
Weiter können Kohlenstoffatome des aromatischen Rings und/oder des polycyclischen Moleküls gegen Heteroatome ausgetauscht sein, d. h. der aromatische Ring kann auch ein heteroaromatischer Ring sein und das polycyclische Molekül kann auch Heterocyclen umfassen. Beispiele für Heteroatome sind in diesem Zusammenhang Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, vorzugsweise Sauerstoff und Stickstoff. Die vorstehend genannten Definitionen bezüglich der Gruppe an Substituenten des aromatischen Rings bzw. des polycyclischen Moleküls und bezüglich der Größe des polycyclischen Moleküls gelten entsprechend. Die Substituenten können dabei nicht nur an die Kohlenstoffatome des aromatischen Rings und/oder des polycyclischen Moleküls sondern auch an die Heteroatome gebunden sein. Vorzugsweise ist eine 1-Ribitylgruppe (Formel (1)) oder eine 1-Ribit-5-phospho-ylengruppe (Formel (2)) an ein Stickstoffatom im Gerüst eines aromatischen Rings und/oder eines polycyclischen Moleküls gebunden. Aromatische Ringe, an welchen die mindestens eine Aminogruppe gebunden seien kann und bei welchen ein oder mehrere Kohlenstoffatome gegen Heteroatome ausgetauscht sind, bzw. polycyclische Moleküle mit einem aromatischen Ring, an den die mindestens eine Aminogruppe gebunden sein kann und bei welchen ein oder mehrere Kohlenstoffatome gegen Heteroatome ausgetauscht seien können, sind beispielsweise Furan, Thiophen, Pyrrol, Oxazol, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Benzofuran, Indol, Chinolin, Isochinolin, Purin, Pteridin, Acridin, Phenazin, 1,3,9,10-Tetraazaanthracene und Isoalloxazin, vorzugsweise 1,3,9,10-Tetraazaanthracene und Isoalloxazin, besonders bevorzugt Isoalloxazin. Der aromatische Ring ist bevorzugt Teil eines polycyclischen Moleküls, welches Heterocyclen umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten ein Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat, d. h. der Amino-substituierte Aromat ist 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat. Der Begriff „8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat” umfasst erfindungsgemäß 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-dihydrogenphosphat (Formel (3)) und entsprechende Salze davon.
Hier bezeichnet der Begriff „Methyl-substituierter Aromat” eine Verbindung, in welcher mindestens eine Methylgruppe (CH₃-Gruppe) an ein Gerüstatom, welches vorzugsweise Kohlenstoff ist, eines aromatischen Rings gebunden ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird diese mindestens eine Methylgruppe in eine Aminogruppe umgewandelt. Die vorstehend genannten Definitionen bezüglich des Amino-substituierten Aromaten gelten daher auch analog für den Methyl-substituierten Aromaten mit dem Unterschied, dass statt einer Aminogruppe eine Methylgruppe an den aromatischen Ring gebunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Methyl-substituierte Aromat Flavinmononukleotid (FMN). Der Begriff „Flavinmononukleotid” umfasst erfindungsgemäß Riboflavin-5'-dihydrogenphosphat) Formel (4) und entsprechende Salze davon.
Hier bezeichnet der Begriff „Formyl-substituierter Aromat” eine Verbindung, in welcher mindestens eine Formylgruppe (C(O)H-Gruppe) an ein Gerüstatom, welches vorzugsweise Kohlenstoff ist, eines aromatischen Rings gebunden ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird diese mindestens eine Formylgruppe in eine Aminogruppe umgewandelt. Die vorstehend genannten Definitionen bezüglich des Amino-substituierten Aromaten gelten daher auch analog für den Formyl-substituierten Aromaten mit dem Unterschied, dass statt einer Aminogruppe eine Formylgruppe an den aromatischen Ring gebunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Formyl-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat. Der Begriff „8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat” umfasst erfindungsgemäß 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-dihydrogenphosphat (Formel (5)) und entsprechende Salze davon.
Hier bezeichnet der Begriff „Carboxyl-substituierter Aromat” eine Verbindung, in welcher mindestens eine Carboxylgruppe (C(O)OH-Gruppe) an ein Gerüstatom, welches vorzugsweise Kohlenstoff ist, eines aromatischen Rings gebunden ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird diese mindestens eine Carboxylgruppe in eine Aminogruppe umgewandelt. Die vorstehend genannten Definitionen bezüglich des Amino-substituierten Aromaten gelten daher auch analog für den Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem Unterschied, dass statt einer Aminogruppe eine Carboxylgruppe an den aromatischen Ring gebunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Carboxyl-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-carboxyl-dihydro-riboflavin-5'-phosphat. Der Begriff „8-Demethyl-8-carboxyl-dihydro-riboflavin-5'-phosphat” umfasst erfindungsgemäß 8-Demethyl-8-carboxyl-dihydro-riboflavin-5'-dihydrogenphosphat (Formel (6)) und entsprechende Salze davon.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist der Carboxyl-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5'-phosphat. Der Begriff „8-Demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5'-phosphat” umfasst erfindungsgemäß 8-Demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5'-dihydrogenphosphat (Formel (7)) und entsprechende Salze davon.
Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt die Umsetzung des Methyl-substituierten Aromaten, des Formyl-substituierten Aromaten oder des Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid in vitro. Beispielsweise kann die Herstellung des Amino-substituierten Aromaten mit immobilisiertem oder auch freiem Polypeptid in z. B. einem Festbettreaktor oder mit verkapseltem Polypeptid erfolgen.
Das (Reaktions-) bzw. (Nähr-)Medium für das erfindungsgemäße Verfahren unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Geeignete Medien sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann es sich bei dem Medium um ein wässriges Medium, ein Medium auf Basis eines oder mehrerer organischer Lösungsmittel oder um ein Medium auf Basis eines Gemisches aus Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln handeln. Gegebenenfalls kann das beschriebene Polypeptid je nach verwendetem Medium entsprechend optimiert oder verkapselt/stabilisiert werden.
Das Medium kann z. B. Salze und Substrat(e) enthalten und einen spezifischen pH besitzen. Beispielsweise können in dem Medium Wasser, Guanin, Guanosin, GTP, Riboflavin bzw. FMN, Glutamat, Nikotinsäure, Thiamin und/oder Oxidationsmittel, wie etwa NAD, enthalten sein. Durch die Anwesenheit von Wasser, Guanin, Guanosin, GTP, Riboflavin bzw. FMN, Glutamat, Nikotinsäure, Thiamin und/oder Oxidationsmittel, wie etwa NAD, kann die Produktionsrate erhöht werden. Die Zugabe des Reduktionsmittels Dithiotreitol (DTT) reduziert jedoch die Enzymaktivität drastisch (0% Aktivität). Verschiedene Substrate können als Kohlenstoffquelle in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Besonders geeignete Kohlenstoffquellen können ausgewählt werden aus Verbindungen mit 3, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, so z. B. Glucose, D-Glucose, Glyzerin, ”thick juice”, Melassen, Stärkehydrolysate, Dextrose, Stärke, Saccharose, oder Ribose. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt in Anwesenheit von Glutamat bzw. Glutaminsäure, NAD⁺ und Thiamin und/oder Thiaminpyrophosphat.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten kann das beschriebene Polypeptid beispielsweise in einer Konzentration von 1 nM bis 10 mM, insbesondere von 10 nM bis 1 mM, von 100 nM bis 500 μM, von 500 nM bis 250 μM, von 1 μM bis 150 μM, von 5 μM bis 100 μM, von 10 μM bis 75 μM, und am meisten bevorzugt von 20 μM bis 50 μM vorliegen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten kann der Methyl-substituierte Aromat, der Formyl-substituierte Aromat oder der Carboxyl-substituierte Aromat beispielsweise in einer Konzentration von 10 nM bis 1 M, insbesondere von 100 nM bis 100 mM, von 1 μM bis 50 mM, von 5 μM bis 10 mM, von 10 μM bis 5 mM, von 50 μM bis 1 mM, von 100 μM bis 500 μM, und am meisten bevorzugt von 200 μM bis 300 μM vorliegen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt die Umsetzung des Methyl-substituierten Aromaten, des Formyl-substituierten Aromaten oder des Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid in Anwesenheit mindestens einer L-α-Aminosäure. Beispielsweise kann die mindestens eine L-α-Aminosäure in einer Konzentration von 1 μM bis 1 M, insbesondere von 10 μM bis 250 mM, von 100 μM bis 100 mM, von 500 μM bis 25 mM, von 1 mM bis 10 mM, und am meisten bevorzugt von 3 mM bis 7 mM vorliegen. Die mindestens eine L-α-Aminosäure dient als Überträger einer Aminogruppe. Die mindestens eine L-α-Aminosäure ist neben Glutamat bzw. Glutaminsäure vorzugsweise Asparagin. Besonders bevorzugt ist die mindestens eine L-α-Aminosäure Glutamat bzw. Glutaminsäure. Als Kofaktor/Kosubstrat des beschriebenen Polypeptids erlaubt Glutamat bzw. Glutaminsäure die Synthese des Amino-substituierten Aromaten, wobei 2-Oxoglutarat bzw. 2-Oxoglutarsäure entsteht.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt die Umsetzung des Methyl-substituierten Aromaten, des Formyl-substituierten Aromaten oder des Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid in Anwesenheit von Thiamin und/oder Thiaminpyrophosphat. Beispielsweise können Thiamin und/oder Thiaminpyrophosphat in einer Konzentration von 1 μM bis 1 M, insbesondere von 10 μM bis 500 mM, von 100 μM bis 250 mM, von 250 μM bis 100 mM, von 500 μM bis 50 mM, von 1 mM bis 25 mM, und am meisten bevorzugt von 5 mM bis 15 mM vorliegen. Der Formyl-substituierte Aromat wird, katalysiert von dem beschriebenen Polypeptid in Anwesenheit von Thiamin und/oder Thiaminpyrophosphat, zu dem Carboxyl-substituierten Aromaten umgesetzt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt die Umsetzung des Methyl-substituierten Aromaten, des Formyl-substituierten Aromaten oder des Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid in Anwesenheit eines Oxidationsmittels, insbesondere in Anwesenheit von NAD⁺ (oxidierte Form von NADH+H⁺). Beispielsweise kann das Oxidationsmittel in einer Konzentration von 1 μM bis 1 M, insbesondere von 10 μM bis 250 mM, von 100 μM bis 100 mM, von 500 μM bis 25 mM, von 1 mM bis 10 mM, und am meisten bevorzugt von 3 mM bis 7 mM vorliegen. Als Kofaktor/Kosubstrat des beschriebenen Polypeptids erlaubt NAD⁺ die Synthese des Amino-substituierten Aromaten, wobei NADH+H⁺ entsteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt die Umsetzung des Methyl-substituierten Aromaten, des Formyl-substituierten Aromaten oder des Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid in Anwesenheit von CaCl₂. Beispielsweise kann CaCl₂ in einer Konzentration von 10 μM bis 10 M, insbesondere von 100 μM bis 1 M, von 500 μM bis 250 mM, von 1 mM bis 100 mM, von 5 mM bis 50 mM, und am meisten bevorzugt von 10 mM bis 30 mM vorliegen. Durch die Zugabe von CaCl₂ wird die Aktivität des beschriebenen Polypeptids vorteilhafterweise um den Faktor 1,2 erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt die Umsetzung des Methyl-substituierten Aromaten, des Formyl-substituierten Aromaten oder des Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid in Anwesenheit einer Phosphatase, insbesondere in Anwesenheit einer Phosphatase die 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin dephosphorylieren kann, und am meisten bevorzugt in Anwesenheit der alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm. Beispielsweise kann die Phosphatase in einer Konzentration von 1 U bis 100.000 U, insbesondere von 10 U bis 10.000 U, und am meisten bevorzugt von 100 U bis 1.000 U vorliegen. Hier ist 1 U definiert als die Menge an Enzym, die 1 μmol an p-Nitrophenylphosphat, PNPP (NEB #P0757), in einem Gesamtreaktionsvolumen von 1 mL in einer Minute bei 37°C und pH 8.0 hydrolysiert.
Durch die Anwesenheit einer Phosphatase können Dephosphorylierungen ermöglicht werden oder Dephosphorylierungsraten erhöht werden. Falls die Präsenz eines Phosphorsäurerests bzw. eines Phosphatrests in dem Edukt und/oder den Intermediaten die Aktivität des beschriebenen Polypeptids begünstigt, ist es insbesondere vorteilhaft, wenn die Phosphatase nicht mit den Edukten bzw. Intermediaten, sondern erst mit dem durch das beschriebene Polypeptid hergestellten Produkt in Kontakt gebracht wird. Insbesondere ist die Anwesenheit einer Phosphatase vorteilhaft, wenn der Amino-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat ist und dieser weiter zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin umgesetzt werden soll.
Das Medium kann weiter einen Puffer umfassen. Geeignete Puffer sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann das Medium einen Bis-Tris-Propan(BTP)-Puffer oder einen 0.1 M Kaliumphosphatpuffer mit pH 7 oder basischer umfassen.
Ein Puffer kann beispielsweise in dem Medium in einer Konzentration von 10 μM bis 10 M, insbesondere von 100 μM bis 2 M, von 1 mM bis 1 M, von 10 mM bis 500 mM, von 25 mM bis 250 mM, und am meisten bevorzugt von 50 mM bis 150 mM vorliegen.
RosB zeigt ein Reaktionsoptimum bei 39°C. Daher erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten die Umsetzung bei einer Temperatur von mindestens 4°C und höchstens 80°C, vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 15°C bis 65°C, noch bevorzugter von 25°C bis 55°C, noch bevorzugter von 35°C bis 45°C und am bevorzugtesten bei 39°C.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt die Umsetzung bei einem pH-Wert von mindestens 7, da RosB in diesem Bereich besonders aktiv ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten erfolgt die Umsetzung des Methyl-substituierten Aromaten, des Formyl-substituierten Aromaten oder des Carboxyl-substituierten Aromaten mit dem beschriebenen Polypeptid in Anwesenheit von Sauerstoff. Dabei kann beispielsweise Umgebungsluft verwendet werden und/oder Sauerstoff in das Medium geleitet werden. Bevorzugt wird Umgebungsluft verwendet. RosB katalysiert in Anwesenheit von Sauerstoff die Umsetzung von FMN zu 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat, umfassend das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten, wobei der Methyl-substituierte Aromat Flavinmononukleotid ist, der Formyl-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat ist oder der Carboxyl-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-carboxyl-dihydro-riboflavin-5'-phosphat ist. Außerdem kann der Carboxyl-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5'-phosphat sein. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen sind auch auf diesen Aspekt der Erfindung in analoger Weise anwendbar.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin (Formel (8)), umfassend das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat und einen Schritt der Dephosphorylierung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen sind auch auf diesen Aspekt der Erfindung in analoger Weise anwendbar. Beispielsweise kann die Dephosphorylierung durch die beschriebene Wirtszelle, durch eine Phosphatase und/oder über chemisch-synthetische oder enzymatische Verfahren, wie dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt, erfolgen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Roseoflavin, umfassend das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin und das zweimalige Methylieren von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin zum Erhalt von Roseoflavin. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen sind auch auf diesen Aspekt der Erfindung in analoger Weise anwendbar. Das zweimalige Methylieren von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin zu Roseoflavin erfolgt mit Hilfe von RosA wie dies dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Gemäß einer Ausführungsform erfolgt das Verfahren zur Herstellung von Roseoflavin in vitro. Vorzugsweise erfolgt das in vitro Verfahren unter Anwesenheit von RosA. Beispielsweise kann die Herstellung von Roseoflavin mit immobilisiertem oder auch freiem RosA in z. B. einem Festbettreaktor oder mit verkapseltem RosA erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Roseoflavin erfolgt das zweimalige Methylieren von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin zu Roseoflavin in Anwesenheit von S-Adenosylmethionin. Beispielsweise kann S-Adenosylmethionin (KM für SAM ist 28 μM) in einer Konzentration von 1 μM bis 1000 μM, am meisten bevorzugt von 30 μM bis 60 μM vorliegen. S-Adenosylmethionin dient als Überträger einer Methylgruppe. Als Kofaktor/Kosubstrat von RosA erlaubt S-Adenosylmethionin die Synthese von Roseoflavin (2), wobei S-Adenosylhomocystein entsteht.
Ein weiterer allgemein beschriebener Aspekt betrifft die Verwendung des beschriebenen rekombinanten und/oder isolierten Polypeptids zur Umsetzung eines Methyl-substituierten Aromaten, eines Formyl-substituierten Aromaten oder eines Carboxyl-substituierten Aromaten in einen Amino-substituierten Aromaten. Die vorstehend genannten Ausführungen und Definitionen sind auch auf diesen Aspekt in analoger Weise anwendbar.
Die Figuren zeigen:
1: Die Bildung von Roseoflavin aus Guanin bzw. Riboflavin in Streptomyces davawensis, wie von Matsui, K. et al. postuliert (Journal of biochemistry, 86(1), 167–175).
2: Die Bildung von Roseoflavin (rechts) aus 8-Demethyl-8-amino-riboflavin. Beide Reaktionen werden von einem einzigen Enzym (RosA) durchgeführt (SAM, S-Adenosylmethionin; AHC, S-Adenosylhomocystein).
3: (A) Ein ca. 100 kb großes chromosomales Fragment aus Streptomyces davawensis erlaubt die Synthese von Roseoflavin in einem heterologen Wirt (in Streptomyces coelicolor oder Streptomyces lividans oder auch anderen Streptomycetenarten). (B) Das entsprechende HPLC-Chromatogramm (links) zeigt das Signal für Roseoflavin (RoF; ca. 13,5 min), welches mittels Massenspektrometrie analysiert wurde (Einschub links). Der m/z-Wert entspricht dem des Roseoflavin-Standards. Das HPLC-Chromatogramm zu einem Kontrollexperiment (rechts) zeigt, dass ein Streptomyces coelicolor M1152 Stamm, der den Leervektor pESAC1 ohne das 100 kb große chromosomale Fragment aus Streptomyces davawensis trägt, kein Roseoflavin bildet.
4: Gendeletionsexperimente in Streptomyces davawensis ergaben, dass „clus2” in dem ca. 100 kb großen chromosomalen Fragment aus Streptomyces davawensis (3A) für die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich ist bzw. für dazu notwendige Enzyme kodiert.
5: Das Gencluster „clus 2” wurde in Streptomyces coelicolor exprimiert, was zur Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin führte. Dies zeigt, dass dieses Cluster für die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich ist bzw. für dazu notwendige Enzyme kodiert. Das Gencluster „clus 2” umfasst die Gene BN159_7985, ribC3, BN159_7987, BN159_7988 und BN159_7989 (rosB).
6: Sämtliche Gene auf dem Gencluster „clus 2” aus Streptomyces davawensis wurden nacheinander ausgeschaltet (oben). Das Diagramm unten zeigt die Menge und die Art der Flavine, welche von den Deletionsmutanten gebildet werden. Nur das Ausschalten des Gens BN159_7989 führte zum Verlust der Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin und Roseoflavin.
7: Nach Einführung von BN159_7989 in das Chromosom von S. coelicolor wurde die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin mittels HPLC (rechts) festgestellt. Das Bild zeigt ein Chromatogramm der Analyse des Kulturüberstands von 4 verschiedenen Exkonjuganten. Diese unabhängigen Stämme zeigen alle den gleichen (neuen) Phänotyp, Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin. Die Linie mit den stärksten Signalen („peaks”) zeigt Standardsubtanzen, die parallel analysiert wurden (AF, 8-Demethyl-8-amino-riboflavin; RF, Riboflavin; RoF, Roseoflavin).
8: 8 zeigt die Umwandlung von Flavinmononukleotid (FMN) in 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat und in Roseoflavin durch die Enzyme RosB und RosA und die m/z-Werte einzelner Intermediate.
9: Nach Einführung von rosB und rosA in das Chromosom von S. coelicolor wurde die Bildung von Roseoflavin mittels HPLC festgestellt (Kreis, RoF, Roseoflavin). Der Einschub zeigt den dazugehörigen m/z-Wert für Roseoflavin von 406,2 (MAF, 8-Demethyl-8-methylamino-riboflavin; das Gen rosB wird auch als BN159_7989 bezeichnet).
10: Diese Abbildung zeigt die Derivatisierung der Verbindung mit m/z von 471 mit Phenylhydrazin (10 oben) und jeweils ein LCMS-Chromatogramm vor Behandlung mit Phenylhydrazin und 10 min. nach Behandlung mit Phenylhydrazin (10 unten).
11: Sämtliche Gene auf dem Gencluster „cluster 2” aus Streptomyces davawensis wurden nacheinander ausgeschaltet. Nur das Ausschalten des Gens BN159_7989 führte zum Verlust der Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin (HPLC Diagramm: Linie a = Wildtyp Streptomyces davawensis; Linie b = Streptomyces davawensis ΔBN159_7989 bzw. ΔrosB; Linie c = Wildtyp Streptomyces coelicolor; Linie d = Streptomyces coelicolor BN159_7989+ bzw. rosB+).
Die vorliegende Erfindung offenbart die folgende Aminosäuresequenz und die folgende Nukleinsäuresequenz: Primärstruktur Protein RosB (SEQ ID NO: 1)
Nukleinsäuresequenz des Gens rosB (SEQ ID NO: 2)
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele näher erläutert.
Allgemeines:
Zellkulturen wurden mit Sporen beimpft und wuchsen auf einem Hefe-Stärke-Medium 7 Tage lang bei 30°C und 150 rpm. Der Überstand wurde mit 5% (w/V) Trichloressigsäure versetzt und durch einen 0,2 μm regenerierten Cellulosefilter gefiltert.
HPLC Analysen wurden mit einem Agilent 1260 Infinity LC MS-Gerät und einer Phenomenex Biphenyl 2.6 μM 150 × 2.1 mm Säule ausgeführt. Es wurde die Absorption bei λ = 480 nm bestimmt. Mobile Phase: 10 mM Ammoniumformiat in Wasser pH = 3.7 und Methanol. Durchflussgeschwindigkeit = 0.2 mL/min, 10 μL Injektionsvolumen.
Beispiel 1: Genexpressionsexperimente zum Nachweis der Präsenz der Roseoflavinsvnthesegene in einem chromosomalen Fragment von Streptomyces davawensis
Ein ca. 100 kb großes chromosomales Fragment aus Streptomyces davawensis erlaubt die Synthese von Roseoflavin in einem heterologen Wirt (in Streptomyces coelicolor oder Streptomyces lividans oder auch anderen Streptomycetenarten) (3). Die heterologen Wirte produzieren als Wildtyp unter Laborbedingungen kein Roseoflavin und auch kein 8-Demethyl-8-amino-riboflavin.
Der Kulturüberstand eines rekombinanten Streptomyces coelicolor M1152 Stammes, der das ca. 100 kb große chromosomale Fragment aus Streptomyces davawensis mittels des Cosmids pESAC1 exprimiert, wurde mittels HPL/MS analysiert (3B) Das entsprechende HPLC-Chromatogramm (3B links) zeigt das Signal für Roseoflavin (RoF; ca. 13,5 min) welches mittels Massenspektrometrie analysiert wurde. Der m/z-Wert entspricht dem des Roseoflavin-Standards. Ein Kontrollexperiment hat gezeigt, dass ein Streptomyces coelicolor M1152 Stamm, der den Leervektor pESAC1 ohne das 100 kb große chromosomale Fragment aus Streptomyces davawensis trägt, kein Roseoflavin bildet (3B, rechts).
Beispiel 2: Gendeletionsexperimente zum Nachweis der Präsenz der Gene/des Gens zur Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin im Gencluster „clus 2”
Es wurden Gendeletionsexperimente in Streptomyces davawensis (Wildtyp) durchgeführt. Sämtliche in 4 dargestellten Gencluster (farbig bzw. schwarz markiert) wurden einzeln ausgeschaltet. Neun verschiedene Deletionsmutanten wurden erzeugt. Die Deletionsmutanten wurden erzeugt, indem die Gene durch eine Apramycin-Resistenzkassette ersetzt wurden. Die Methode, die zur Genclusterdeletion bzw. zur Gendeletion verwendet wurde, ist in einer Publikation beschrieben (Gust, Bertolt, et al. ”PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.” Proceedings of the National Academy of Sciences 100.4 (2003): 1541–1546) und kann von einem Fachmann reproduziert werden. Im Folgenden wird das Verfahren verkürzt dargestellt.
Zunächst wurde ein spezieller Escherichia coli Stamm (E. coli DH106 mit pIJ790), der eine Rekombinase produziert („λ-Red-Rekombinase”) mit dem pESAC13 Cosmid, welches das 100 kb chromosomale Gencluster aus 4 enthielt, transformiert. Der resultierende Stamm wird im Folgenden als E. coli DH10B-pIJ790-pESAC13-100 bezeichnet. Die Gendisruptionskassette aac (3)IV (vermittelt eine Apramycin Resistenz) aus dem Plasmid pIJ773 wurde dahingehend modifiziert, dass oriT eliminiert wurde. Homologe Bereiche der Gencluster, die ausgeschaltet werden sollten, wurden mittels Polymerasekettenreaktion und geeigneter Oligonukleotide an die Gendisruptionskassette aac (3)IV gekoppelt. Das resultierende PCR-Produkt wurde verwendet, um E. coli DH106-pIJ790-pESAC13-100 zu transformieren. Die Rekombinase wurde durch Arabinose induziert, was zum Austausch der Gencluster durch die Gendisruptionskassette aac (3)IV führte. Die resultierenden E. coli DH10BpIJ790-pESAC13-100 Stämme wurden mittels PCR auf den korrekten Austausch der Gencluster hin geprüft. Die resultierenden Cosmide wurden dann in E. coli GM2163 mittels „triparentalem Mating” eingeführt. Anschließend wurden die Cosmide aus E. coli GM2163 in Streptomyces davawensis mittels Konjugation eingeführt. In den resultierenden Apramyin-resistenten Exkonjuganten wurden die entsprechenden Gencluster durch Doppelcrossover-Rekombination ersetzt.
Dabei wurde gezeigt, dass ein ganz bestimmtes Gencluster („clus 2”, 4) für die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich ist. Nur die Ausschaltung dieses Genclusters produziert Mutanten, die kein 8-Demethyl-8-amino-riboflavin und kein Roseoflavin mehr bilden können (11).
Beispiel 3: Genexpressionsexperimente zum Nachweis der Präsenz der Gene/des Gens zur Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin im Gencluster „clus 2”
Das Gencluster „clus 2” wurde in S. coelicolor mittels dem Expressionsplasmid pSET152 exprimiert. S. coelicolor kann als Wildtyp kein Roseoflavin und kein 8-Demethyl-8-amino-riboflavin produzieren. Nach Einführung der Gene (clus2) in das Chromosom von S. coelicolor wurde die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin mittels HPLC festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass essentielle Gene für die Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin auf diesem Gencluster zu finden sein müssen (5).
Beispiel 4: Gendeletionsexperimente zur Identifikation des Gens, welches für die Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich ist
Sämtliche Gene auf dem Gencluster „clus 2” aus Streptomyces davawensis wurden nacheinander ausgeschaltet (6 oben). Dabei wurden die Deletionsmutanten mit derselben Methode wie in Beispiel 2 beschrieben, erzeugt.
Nur das Ausschalten des Gens BN159_7989 führte zum Verlust der Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin. Dies deutet darauf hin, dass BN159_7989 für die Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich ist. 6 zeigt unten die Menge und die Art der Flavine, welche von den Deletionsmutanten gebildet werden. Der Streptomyces davawensis Wildtyp bildet Roseoflavin. Die Deletion von BN159_7985 führt zu einem rekombinanten Streptomyces davawensis-Stamm, der Roseoflavin bildet. Die Deletion von ribC3 führt zu einem rekombinanten Streptomyces davawensis-Stamm, der Roseoflavin bildet. Die Deletion von BN159_7987 führt zu einem rekombinanten Streptomyces davawensis-Stamm, der Roseoflavin bildet. Die Deletion von BN159_7988 führt zu einem rekombinanten Streptomyces davawensis-Stamm, der Roseoflavin bildet. Die Deletion von BN159_7989 (rosB) führt zu einem rekombinanten Streptomyces davawensis-Stamm, der kein Roseoflavin bildet (6 unten und 11, linkes Diagramm, b). Dies deutet darauf hin, dass BN159_7989 an der Roseoflavinsynthese beteiligt ist. Da keine anderen Flavinintermediate mittels LCMS in dieser Mutante gefunden werden, deutet dies darauf hin, dass die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin von einem einzigen Enzym (Gen), kodiert auf dem Gencluster „clus 2”, abhängig ist. Die Ausschaltung der übrigen Gene führte nicht zu dem Verlust der Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin (6).
Beispiel 5: Genexpressionsexperimente zum Nachweis, dass das Gen BN159_7989 (rosB) alleine für die Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin verantwortlich ist
Nach Einführung von BN159_7989 (rosB) in das Chromosom von S. coelicolor wurde die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin mittels HPLC (7 rechts und 11, rechtes Diagramm, d) festgestellt. 7 zeigt rechts ein Chromatogramm der Analyse des Kulturüberstands von 4 verschiedenen Exkonjuganten. Diese Stämme wurden auf einem flüssigen Nährmedium kultiviert. Diese unabhängigen Stämme zeigen alle den gleichen (neuen) Phänotyp, Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin.
Beispiel 6: Genexpressionsexperimente zum Nachweis, dass die Gene rosA und rosB ausreichen um Roseoflavin zu bilden
Die Gene rosB und rosA wurden zusammen in S. coelicolor mittels pSET152 exprimiert. Dieses Plasmid integriert in das Chromosom des Wirtsstamms. S. coelicolor kann als Wildtyp kein Roseoflavin und kein 8-Demethyl-8-amino-riboflavin produzieren. Nach Einführung von rosB und rosA in das Chromosom von S. coelicolor wurde die Bildung von Roseoflavin mittels HPLC festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass rosB und rosA ausreichen können um Roseoflavin in einem heterologen Wirt zu bilden (9) und dass die Roseoflavinbiosynthese nur zwei Gene (rosA und rosB) benötigt.
Beispiel 7: in vitro-Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin durch RosB
Das Protein RosB aus S. davawensis wurde im heterologen Wirt Escherichia coli Rosetta (ohne Anpassung des Codongebrauchs des dazugehörigen Gens) produziert und wurde aus E. coli zur Homogenität gereinigt. RosB zeigt in vitro unter Zugabe von Flavinmononukleotid (Riboflavin-5'-phosphat), Thiaminpyrophosphat (TPP; Phosphatester des Thiamins (Vitamin B1)) und Glutamat die Bildung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat. Das Reaktionsschema ist in 8 gezeigt. Wichtig ist, dass nicht Riboflavin direkt sondern phosphoryliertes Riboflavin (Riboflavin-5'-phosphat) das Substrat von RosB ist. Die Intermediate der Reaktion, 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat bzw. 8-Demethyl-8-carboxy-dihydro-riboflavin-5'-phosphat (als 8-Demethyl-8-carboxy-riboflavin-5'-phosphat) wurden eindeutig mittels HPLC/MS und Fragmentierung identifiziert.
Beispiel 8: Identifizierung von 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat als Intermediat der von RosB katalysierten Umsetzung von Flavinmononukleotid zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat
LC/MS Untersuchungen zeigen, dass bei der Umsetzung von FMN mit RosB bei Abwesenheit von TPP eine Verbindung mit m/z von 471 gebildet wird. Diese Verbindung wurde mit Phenylhydrazin derivatisiert. Über das dazugehörige Phenylhydrazon wurde mittels MS/MS 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-dihydrogenphosphat als die Verbindung mit m/z von 471 identifiziert (10).
Durch Zugabe von TPP lässt sich 8-Demethyl-8-carboxyl-riboflavin-5'-phosphat mittels LC/MS nachweisen. Das Enzym, welches Riboflavin zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat umsetzt, wurde identifiziert bzw. charakterisiert. Der Roseoflavinbiosyntheseweg wurde vollständig aufgeklärt.
Das bisher unbekannte Gen BN159_7989 (rosB) aus Streptomyces davawensis kodiert für ein Protein, welches die Umwandlung von Flavinmononukleotid in 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat katalysiert. Folgende Befunde zeigen dies eindeutig. 1. Nach Deletion von BN159_7989 (rosB) kann S. davawensis weder 8-Demethyl-8-amino-riboflavin noch Roseoflavin bilden. 2. Die Expression von BN159_7989 (rosB) führt zur Synthese von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin in S. coelicolor. 3. Gereinigtes RosB führt die Reaktion von FMN zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat auch in vitro durch. Kofaktoren/Kosubstrate sind Thiaminpyrophosphat, NAD und Glutamat.
RosB katalysiert eine vollkommen neue Reaktion, die Demethylierung von FMN und die Einführung einer Aminogruppe. Auf Basis dieses Enzyms können vollkommen neue Synthesestrategien gefahren werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Amino-substituierten Aromaten, umfassend den Schritt des Umsetzens eines Methyl-substituierten Aromaten, eines Formyl-substituierten Aromaten oder eines Carboxyl-substituierten Aromaten mit einem rekombinanten und/oder isolierten Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder einem biologisch aktiven Fragment oder Derivat dieses Polypeptids, wobei die Umsetzung in vitro und in Anwesenheit von Glutamat bzw. Glutaminsäure, NAD⁺ und Thiamin und/oder Thiaminpyrophosphat erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Umsetzung in Anwesenheit von Sauerstoff erfolgt.
Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat, umfassend das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Methyl-substituierte Aromat Flavinmononukleotid ist, der Formyl-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-formyl-riboflavin-5'-phosphat ist oder der Carboxyl-substituierte Aromat 8-Demethyl-8-carboxyl-dihydro-riboflavin-5'-phosphat ist.
Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin, umfassend das Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat nach Anspruch 3 und einen Schritt der Dephosphorylierung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin-5'-phosphat zu 8-Demethyl-8-amino-riboflavin.
Verfahren zur Herstellung von Roseoflavin, umfassend das Verfahren zur Herstellung von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin nach Anspruch 4 und das zweimalige Methylieren von 8-Demethyl-8-amino-riboflavin mit Hilfe von RosA zum Erhalt von Roseoflavin.