DE102015006335A1 - Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen - Google Patents

Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Konstrukte zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zielstruktur. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Konstrukte zur direkten Gewinnung einer Pflanze oder von Pflanzenmaterial, welche eine zuvor gezielt in eine meristematische Zelle eingebrachte Editierung einer Nukleinsäure, jedoch nicht die hierfür zur Erzeugung der gezielten Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion zuvor eingebrachten rekombinanten Konstrukte, umfasst.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle umfassend die Bereitstellung und Einbringung mindestens einer gRNA sowie einer einer Cas-Nuklease und/oder einer Effektor-Domäne oder mindestens eines rekombinanten Konstruktes, umfassend eine gRNA sowie eine Cas-Nuklease und/oder eine Effektor-Domäne, oder die dafür kodierenden Sequenzen, sowie mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz, in eine pflanzliche Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, wodurch direkt eine Pflanze, ein Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle gewonnen werden kann, wobei das mindestens eine rekombinante Konstrukt vorzugsweise nicht chromosomal oder extrachromosomal integriert wird. Zudem werden geeignete rekombinante Konstrukte und Vektoren sowie Verfahren zur Einbringung dieser Konstrukte und Vektoren in eine pflanzliche Zielstruktur von Interesse offenbart. Schließlich wird die Verwendung eines rekombinanten Konstrukts zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zelle offenbart, sowie Pflanzen, Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich oder erhalten sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Genom Editierung stellt ein molekularbiologisches Verfahren dar, durch welches gezielte Modifikationen wie Insertionen, Deletionen oder Punktmutationen oder Kombinationen davon in das Genom eines lebenden Organismus eingebracht werden können. Hierfür werden gezielte molekulare Instrumente benötigt, welche zum einen Nukleaseaktivität besitzen, darüber hinaus aber auch mit ausreichender Spezifität zu der zu verändernden Zielsequenz geleitet werden können, um eine gezielte und ortsgerichtete Mutagenese planen und durchführen zu können. In der Pflanzenbiotechnologie hat sich die gezielte Genome Editierung in den letzten Jahren zu einer Alternative im Vergleich zur klassischen Züchtung und zu transgenen Ansätzen entwickelt. Die bisher verfügbaren Tools wie Zink-Finger Nukleasen (ZFNs) oder „transcription activator-like effector nucleases” (TALENs) sind im Bereich der Pflanzenbiotechnologie allerdings nur begrenzt eingesetzt worden, was an der teilweise niedrigen Effizienz, aber auch an schwierigem und aufwendigem Design der Konstrukte liegt.
  • Ein weiteres molekulares Werkzeug, welches in den letzten Jahren gehäuft zur präzisen und ortsgerichteten Genommodifikation eingesetzt wurde, sind Cas-Nuklease-basierte Systeme. Diese Nukleasen sind Teil des nunmehr in der Literatur als „CRISPR/Cas” bezeichneten Systems (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-assoziierte Gene). Dieses System wurde ursprünglich 1987 bei Analyse des iap Gens von E. coli identifiziert, wobei natürlich vorkommende Wiederholungssequenzen im bakteriellen Genom identifiziert wurden. Später wurde herausgefunden, dass diese palindromischen DNA-Widerholungssequenzen von 20 bis 50 Nukleotiden einem Muster folgen. Hierauf wurde das Akronym CRISPR geprägt (Jansen, R. et al., „Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes", Mol. Microbiol., 2002, 43(6), 1565–1575), wobei sich die Forschung nach wie vor auf Bakterien fokussierte. Schließlich wurde beschrieben, dass der CRISPR-Lokus eine Art bakterielles Immunsystem darstellt und erworbene Immunität gegen Phagen verleihen kann (Barrangou et al. "CRISPR provides acquired resistance against viruses in procaryotes" Science 2007, 315: 1709.1712), indem die invadierende Phagen-DNA zunächst als Protospacer in einen CRISPR Lokus eingebaut, der Lokus dann transkribiert und schließlich der CRISPR-vermittelte Silencing Mechanismus aktiviert wird.
  • Durch die funktionelle Charakterisierung erfolgte auch die schrittweise Nutzung des Systems als universelles Werkzeug zur Genommodifikation höherer Organismen. Zwischenzeitlich ist eine Vielzahl von CRISPR/Cas Systemen, einschließlich eines Typ-II Systems, beschrieben (siehe etwa Van der Oost et al. "Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems" Nature 2014, 482: 331–338), wobei die Analysen bei weitem noch nicht abgeschlossen sind.
  • Durch die Entdeckung und Nutzbarmachung des bakteriellen Typ-II CRISPR Systems steht ein weiteres „Genome Editing” System mit großem Potential zur Verfügung.
  • Das CRISPR/Cas System erlaubt es, durch eine kleine individuell anpassbare nicht kodierende RNA (guide RNA bzw. gRNA) in Kombination mit einer Cas-Nuklease einen gezielten DNA Doppelstrangbruch zu erzeugen. Die in natürlichen Systemen durch CRISPR/Cas vermittelte Immunantwort benötigt CRISPR-RNA (crRNA), wobei die Maturierung dieser Leit-RNA, welche die gezielte Aktivierung der Cas-Nuklease steuert, zwischen den unterschiedlichen derzeit charakterisierten CRISPR Systemen deutlich variiert. Zunächst wird die invadierende DNA, welche auch „Spacer” genannt wird, zwischen zwei aneinander liegenden Repeat-Regionen am proximalen Ende des CRISPR Lokus integriert. Typ-II CRISPR Systeme kodieren als Schlüsselenzym für den Interferenzschritt eine Cas9-Nuklease, welche sowohl eine crRNA als auch eine trans-aktivierende RNA (tracrRNA) als Leitmotiv benötigt. Diese hybridisieren und bilden doppelsträngige (ds) RNA Regionen, welche von RNAseIII erkannt und gespalten werden können, um reife crRNAs zu bilden. Diese wiederum assoziieren dann mit dem Cas-Molekül, um die Nuklease gerichtet zur Nukleinsäure-Zielregion zu führen. Rekombinante gRNA Moleküle können sowohl die variable DNA-Erkennungs- als auch die Cas-Interaktionsregion umfassen und somit abhängig von der konkreten Ziel-Nukleinsäure und der gewünschten Cas-Nuklease gezielt entworfen werden. Als weiterer Sicherheitsmechanismus müssen in der Nukleinsäure-Zielregion zudem PAMs (protospacer adjacent motifs), DNA-Sequenzen, welche direkt vom Cas9/RNA-Komplex erkannter DNA folgen, vorhanden sein. So lautet die PAM-Sequenz für die Cas9 aus Streptococcus pyogenes etwa „NGG” oder „NAG” (Standard IUPAC Nukleotid-Code)(Jinek et al., „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 2012, 337: 816–821). Die PAM-Sequenz für Cas9 aus Staphylococcus aureus lautet „NNGRRT” oder „NNGRR(N)”. Weitere variante CRISPR/Cas9 Systeme sind bekannt. So schneidet eine Neisseria meningitidis Cas9 bei der PAM Sequenz NNNNGATT. Eine Streptococcus thermophilus Cas9 schneidet bei der PAM-Sequenz NNAGAAW. Durch Einsatz von modifizierten Cas-Polypeptiden lassen sich ferner gezielte Einzelstrangbrüche erzielen. Der kombinierte Einsatz von Cas-Nickasen mit unterschiedlichen rekombinanten gRNAs kann durch doppeltes DNA-Nicking ebenfalls hochgezielte DNA-Doppelstrangbrüche induzieren. Durch den Einsatz von zwei gRNAs kann darüber hinaus die Spezifität der DNA-Bindung und dadurch der DNA-Spaltung optimiert werden.
  • Durch den natürlichen Reparaturmechanismus der Pflanzenzelle wird der DNA Doppelstrangbruch entweder durch „non-homologous end joining” (NHEJ) oder „homology-directed repair” (HDR) bzw. homologe Rekombination (HR) repariert. Darüber hinaus wurden in Pflanzen auch sogenannte Alternative end joining Wege (AEJ) beschrieben (Charbonnel C, Allain E, Gallego ME, White Cl (2011) Kinetic analysis of DNA double-strand break repair pathways in Arabidopsis. DNA Repair (Amst) 10: 611–619).
  • Anders als die genetische Veränderung bakterieller Genome stellt die Modifikation von komplexen eukaryontischen Genomen eine größere Herausforderung dar, da auf Grund der Komplexität dieser Genome molekulare Werkzeuge bereitgestellt werden müssen, welche eine zielgenaue Genommodifikation ohne unerwünschte Off-Target-Effekte, d. h. unerwünschte Mutationen oder Modifikationen innerhalb des Genoms oder der nicht genomischen DNA der Zielzelle, bewirken.
  • Aus US 8,697,359 B1 ist bekannt, dass unter Einsatz der CRISPR/Cas Technologie eukaryontische Genome, speziell Säugergenome und diese bevorzugt zu therapeutischen Zwecken, verändert werden können. Hierbei wird die Expression eines Zielgens durch gezielte Einführung einer Cas9 Endonuklase sowie einer guide RNA (gRNA) programmierbar unterdrückt. Diese gRNA ist ein wesentliches Element eines jeden Cas9-CRISPR-Systems, da sie die eigentliche Cas-Nuklease gerichtet zur (genomischen) Ziel-DNA leitet. Hierzu wird für Cas9-CRISPR-Systeme zudem eine tracr (trans-activating CRISPR RNA) Sequenz und eine tracr mate Sequenz offenbart, welche von der gRNA umfasst sein kann, wobei die tracr Sequenzen hybridisieren, um so erkannt zu werden. Der Einsatz der CRISPR-Technologie zur Modifikation von komplexen pflanzlichen Genomen sowie dafür erforderliche molekulare Werkzeuge werden jedoch nicht offenbart.
  • WO 2015/026885 A1 hingegen widmet sich speziell der Anwendung der CRISPR/Cas Technologie in Pflanzen. Jedoch wird/werden hier ausschließlich eine Herangehensweise und geeignete molekulare Werkzeuge offenbart, welche zwingend die Subkultivierung, Selektion und Regeneration von Pflanzenkalli nach erfolgter Einführung der CRISPR/Cas Werkzeuge benötigen und somit nicht die direkte Gewinnung einer Pflanze oder von Pflanzenmaterial, enthaltend die gewünschte DNA-Veränderung ermöglicht, welche/welches die gewünschte DNA-Veränderung enthält.
  • Eine Übersicht zum aktuellen Status der Entwicklung des Einsatzes der CRISPR/Cas Technologie zur Genom Editierung von Pflanzengenomen findet sich in Bortesi & Fischer („The CR/SPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond", Biotechnology Advances, 33, Seiten 41–52, 20.12.2014). Hier wird u. a. über die Problematik der Bereitstellung spezifischer gRNAs für das Targeting in Mais berichtet. Ferner wird die Problematik der hohen „Off-target” Mutationsraten thematisiert, welche nicht nur beim Einsatz von CRISPR/Cas bei Säugerzellen, sondern auch beim Einsatz in Pflanzenzellen beobachtet wird, wobei hier das Design der einzelnen CRISPR/Cas Werkzeuge entscheidend ist, um in der jeweiligen Zielzelle/dem jeweiligen Zielorganismus eine ortsgerichtete gezielte Veränderung ohne „Off-target” Wirkungen zu erzielen. Ferner erkennt Bortesi & Fischer, dass das CRISPR/Cas System auch zur epigenetischen Veränderung von DNA eingesetzt werden kann, da das CRISPR/Cas System auch zur Spaltung methylierter DNA verwendet werden kann, stellt jedoch fest, dass hierzu noch keine Anwendungen in Pflanzen bekannt sind.
  • Weiterhin beschreibt Guilinger et al. Fokl-Nukleasen, welche wie Nickasen verwendet werden, und damit eine höhere Spezifität erzeugen (Guilinger et al.; Fusion of catalytically inactive Cas9 to Fokl nuclease improves the specificity of genome modification, doi:10.1038/nbt.2909). Guilinger et al. präsentieren jedoch ausschließlich Daten für humane Zellen, nicht für Pflanzenzellen.
  • Mali et al 2013 bezieht sich auf die Verwendung des CRISPR/Cas Systems in humanen Zellen, wobei hier Nuklease-Null Varianten von Cas9 oder Aptamer-gekoppelte gRNAs zum Einsatz kommen, welche an transkriptionelle Aktivatordomänen fusioniert sein können (Mali, P., et al. (2013). "CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering). Mali et al. erwähnt jedoch nicht, wie und in welchem Umfang ein entsprechendes System in Pflanzenzellen zum Einsatz kommen könnte.
  • Zusammenfassend sind viele der heute verwendeten Ansätze im pflanzlichen Bereich nur temporär und/oder räumlich begrenzt (transient) dahingehend, dass Mutationen in bereits ausdifferenzierten Zellen, z. B. in Blättern, bewirkt werden, diese Mutationen jedoch nicht über die Keimbahn weitervererbt werden. Des Weiteren gibt es Ansätze, die eine stabile Integration der kodierenden Sequenzen inklusive der hierfür erforderlichen regulatorischen Sequenzen wie Promotoren und Terminatoren ins Genom voraussetzen, über diese dann eine stabile Mutation erzeugt werden kann, die von Generation zu Generation vererbt wird. Hierbei sind jedoch die CRISPR/Cas Werkzeuge nach wie vor im Genom der Pflanze und dadurch auch potentieller Pflanzenprodukte wie Früchte und Samen enthalten, was bzgl. der Risikobewertung der entsprechenden Produkte unerwünscht ist.
  • Demnach ist der CRISPR/Cas Ansatz in der Pflanzenbiotechnologie nach wie vor von einer niedrigen Effizienz, aber auch einem schwierigen und aufwendigen Design der Konstrukte gekennzeichnet, sowie dem häufigen Auftreten von Off-Target Effekten. Zudem basieren viele der derzeitigen Ansätze darauf, die CRISPR/Cas Werkzeuge entweder stabil in das Genom einer Pflanzenzelle zu integrieren oder in Zellen eines ausdifferenzierten Gewebes, etwa in Blätter, einzuführen. Folglich werden bei dem stabilen Ansatz zum einen auch die einzelnen Werkzeuge wie beispielsweise die Cas9, und nicht nur die von ihnen bewirkten gezielten DNA-Veränderungen, an die Nachkommen vererbt. Bei der Transformation in ausdifferenzierte Zellen und Gewebe wird die durch die CRISPR/Cas Werkzeuge eingeführte Mutation nur in den jeweiligen Zellen wirksam, kann jedoch nicht über die Keimbahn weitervererbt werden.
  • Es besteht somit ein anhaltendes Bedürfnis nach der Etablierung von transienten und zudem optional induzierbaren Verfahren und Konstrukten, basierend u. a. auf gRNAs und Cas-Nukleasen oder gRNAs und anderen Effektor-Domänen, zur Erwirkung einer gewünschten Veränderung einer Zielsequenz in einer pflanzlichen Zielzelle, wobei nur die Veränderung der Zielsequenz, jedoch nicht die Konstrukte an die Nachkommen weitergegeben werden. Zudem besteht ein großes Bedürfnis danach, ein CRISPR/Cas basiertes Verfahren bereitzustellen, das die Möglichkeit eröffnet, direkt eine Keimbahnveränderung in einer pflanzlichen Zelle oder einem pflanzlichen Gewebe durchzuführen, sodass die Veränderung vererbbar ist und an der Pflanze, die aus der veränderten Pflanzenzelle oder dem Gewebe resultiert, unmittelbar Saatgut geerntet werden kann, welches die gezielte Genommodifikation enthält, ohne aufwendige und kostspielige Zwischenschritte beschreiten zu müssen. Schließlich besteht ein Bedürfnis, das RNA-dirigierte DNA-Modifikationssystem, welches durch die CRISPR/Cas Werkzeuge bereitgestellt wird, gezielt zu erweitern, indem nicht nur genomische Zielstrukturen, sondern jegliche Nukleinsäure als Zielstruktur, nicht nur im Genom einer Zelle, sondern etwa auch im Zytosol oder in Plastiden, kontrolliert modifiziert werden kann.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, Verfahren und molekulare Werkzeuge bereitzustellen, welche die transiente Transformation von pflanzlichem Gewebe oder von pflanzlichen Zellen, speziell von meristematischen Zellen, und dadurch die kontrollierte Veränderung einer beliebigen Nukleinsäure-Zielregion in einem beliebigen pflanzlichen zellulären Kompartiment zu erlauben.
  • Es war Ziel, die oben genannten Vorteile in einem System, welches breit in der Pflanzenbiotechnologie anwendbar ist, zu vereinigen.
  • Diese Aufgabe wird durch die hierin bereitgestellten Verfahren und Konstrukte gemäß dem Gegenstand der beigefügten Ansprüche und ferner wie hierin in der Beschreibung, den Figuren und dem beigefügten Sequenzprotokoll detailliert dargelegt, gelöst. Die Aufgabe wird speziell durch die Bereitstellung eines Verfahrens umfassend die Transformation oder Transfektion von mindestens einer meristematischen Zelle gelöst. Darüber hinaus wird die Aufgabe durch die Bereitstellung von rekombinanten Konstrukten gelöst, welche gezielt modifizierte CRISPR/Cas-Werkzeuge und/oder weitere Effektor-Domänen umfassen. Schließlich wird die Aufgabe durch die Bereitstellung von geeigneten regulatorischen Sequenzen und Lokalisationssequenzen gelöst, welche es erlauben, das rekombinante Konstrukt von Interesse kontrolliert in ein beliebig ansteuerbares Kompartiment einer pflanzlichen Zielstruktur von Interesse zu dirigieren.
  • Hierdurch kann mindestens eine gezielte Veränderung in jeglicher Nukleinsäure-Zielregion in einem beliebigen Kompartiment einer pflanzlichen Zelle, insbesondere einer meristematischen pflanzlichen Zelle, erzielt werden. Da die so veränderte mindestens eine meristematische Zelle die gezielte Veränderung in der Nukleinsäure-Zielregion durch die anschließende Zellteilung und Differenzierung unmittelbar und direkt an ihre Nachkommen weitergeben kann und/oder sie das Potential besitzt, dass aus der meristematischen Zelle ein ganzer veränderter pflanzlicher Organismus heranreift, kann so die Bereitstellung einer Pflanze oder von Pflanzenmaterial oder einer pflanzlichen Zelle erreicht werden, ohne komplexe weitere Kultivierungs- oder Kreuzungs- und Selektionsschritte (vor allem komplexe Rückkreuzungsregime) einschlagen zu müssen. Vielmehr kann aus der mindestens einen so veränderten meristematischen Zielzelle unmittelbar und direkt eine Pflanze, Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle gewonnen werden. Hierdurch ist es möglich, gRNA(s) und/oder Cas-Nukleasen) und/oder weitere Effektor-Domänen) nur transient in den Meristemen zu produzieren bzw. bereitzustellen bzw. aktivieren, wobei diese rekombinanten Makromoleküle vorzugsweise anschließend, d. h. nachdem gRNA(s) und/oder Cas-Nuklease(n) und/oder weitere Effektor-Domäne(n) die gewünschte Wirkung erfüllt haben, degradiert werden, da keine Integration davon ins Genom oder endogene extrachromosomale DNA stattfindet, was auf Grund regulatorischer Aspekte und der Risikobewertung des Pflanzenprodukts vorteilhaft sein kann. Die hierin verwendeten Cas-Nukleasen können auch eine oder mehrere Mutation(en) in der katalytischen Domäne, welche für die DNA-(Doppel- bzw. Einzelstrang)spaltung verantwortlich ist, enthalten. Dies resultiert in einem breiten Anwendungsspektrum der Cas-Nuklease und, etwa im Fall von Cas-basierten Nickasen, auf einer höheren Spezifität der Bindung, da zwei CRISPR/Cas Konstrukte zum Einsatz kommen, um beide Einzelstränge des DNA-Doppelstrangs an der gewünschten Stelle zu spalten. Auch Cas-null Varianten werden hierin vorgeschlagen sowie deren kombinierter Einsatz mit weiteren Effektor-Domänen zur Optimierung einer gezielten Nukleinsäure-Editierung.
  • Darüber hinaus wurde gefunden, dass durch die Ausnutzung des Wirkmechanismus der CRISPR/Cas-Werkzeuge auch weitere Effektor-Domänen wie DNA- bzw. RNA- bzw. Histon-modifizierende oder DNA- bzw. RNA- bzw. Histon-bindende Polypeptide oder Nukleinsäuren, umfassend zum Beispiel alle Arten von monomeren, dimeren oder multimeren Nukleasen, umfassend Nickasen, Aktivatoren und Repressoren der Transkription, Phosphatasen, Glykosylasen, oder Enzyme, welche epigenetische Veränderungen bewirken können, wie Methylasen, Acetylasen, Methyltransferasen oder Histon-Deacetylasen, Aptamere, umfassend einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenzen sowie Peptide, fluoreszierende Proteine, Proteine zur Biolumineszenz, Markernukleinsäure- oder Markeraminosäuresequenzen, und dergleichen, und Kombinationen davon gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren eingesetzt werden können, wodurch sich das Spektrum der bekannten gezielten Genom-Editierung hin zu einer allgemeinen Nukleinsäure-Editierung, die nicht auf genomische DNA per se beschränkt ist, verbreitern lässt.
  • Die vorliegende Offenbarung bietet somit die Möglichkeit, den CRISPR/Cas-Mechanismus dahingehend auszuweiten, dass nicht nur die nukleolytische Spaltung von DNA, sondern auch eine beliebige Modifikation von genomischer DNA, z. B. die epigenetische Veränderung, sowie von RNA in pflanzlichen Zellen (wie beispielsweise mRNA) ermöglicht wird.
  • Durch den Einsatz weiterer regulatorischer Sequenzen, umfassend Promotoren, Teminatoren, Transkriptionsfaktorbindestellen oder Introns, und/oder von Lokalisationssequenzen, umfassend Kern-, Mitochondrien- und Plastidenlokalisationssequenzen, stellt die vorliegende Offenbarung zudem die Möglichkeit bereit, jegliche Nukleinsäure-Zielregion einer pflanzlichen Zielstruktur gezielt zu modifizieren, wodurch zum Beispiel auch mitochondriale und Plastiden-DNA als Ziel der Editierung fungieren kann. Darüber hinaus eröffnet sich auch die Möglichkeit der gezielten Veränderung von RNA, z. B. von mRNA, wobei auch hier die gRNA-dirigierte Sequenzerkennung, welche dem CRISPR/Cas-System zu Grunde liegt, ausgenutzt und gemäß der vorliegenden Offenbarung „umprogrammiert” wird, um den Anwendungsbereich der CRISPR/Cas-Technologie zu erweitern.
  • Hierin werden auch Verfahren und Konstrukte bereitgestellt, bei welchen gRNA und/oder Cas-Nuklease bereits verknüpft mit einer weiteren Effektor-Domäne auf einem rekombinanten Konstrukt bereitgestellt werden.
  • Weiterhin wird ein Verfahren bereitgestellt, bei welchem die mindestens eine gRNA sowie die mindestens eine Cas-Nuklease und/oder die mindestens eine weitere Effektor-Domäne separat auf unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten bereitgestellt werden. Gemäß dieses Verfahrens kann die gRNA-Komponente als DNA oder RNA bereitgestellt werden, die Cas-Nuklease oder Variante davon kann als DNA oder RNA oder als Polypeptidsequenz bereitgestellt werden und die Effektor-Domäne kann als DNA oder RNA oder als Polypeptidsequenz bereitgestellt werden.
  • Zudem war es eine Aufgabe, durch die Etablierung pflanzenspezifischer Konstrukte und Verfahren die Möglichkeit bereitzustellen, die Konstrukte gezielt, etwa induzierbar oder gewebe- oder organellspezifisch, bereitzustellen und unerwünschte Off-Target Effekte zu minimieren. Schließlich stellte es eine Aufgabe dar, Verfahren und Konstrukte zu entwerfen, die nicht nur die Möglichkeit effizienter Gen-Knock-Ins, sondern beispielweise auch gerade die Möglichkeit spezifischer Gen-Knock-Outs, von Insertionen von genetischen Fragmenten, spezifischer epigenetischer Modifikationen, der Einführung von Punktmutationen, Acetylierungen, Methylierungen, Phosphorylierung, Glykosylierungen, Markierungen durch Resistenzmarker oder fluoreszierende Proteine, Aktivierung oder Reprimierung der Transkription, gezielter Spaltung von doppelsträngiger oder einzelsträngiger Nukleinsäuren, der Bindung von Nukleinsäuren und dergleichen bieten, sodass ein breiter Einsatzbereich in der Pflanzenzüchtung eröffnet wird. Aus züchterischer wie regulatorischer Sicht ist es wünschenswert, sowohl eine stabile Vererbbarkeit eines durch die Modifikation bewirkten Merkmals über mindestens eine Generation hinweg bei gleichzeitiger Abwesenheit der hierfür erforderlichen Konstrukte des CRISPR/Cas-Systems in der resultierenden Pflanze oder den resultierenden pflanzlichen Zellen zu ermöglichen.
  • Konkrete Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Beispielen, den Figuren, dem Sequenzprotokoll sowie insbesondere den beigefügten Patentansprüchen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A–F zeigen Maisembryonen von unterschiedlicher Größe. In den hier analysierten Embryonen ist das Meristem eindeutig als scheibenförmige Struktur im Zentrum des Embryos zu erkennen. Abhängig von der Größe und des Entwicklungsstadiums der Embryonen ist das Meristem unterschiedlich entwickelt und unterschiedlich gut erkennbar. Das Meristem ist zusätzlich noch durch einen Stern (*) markiert.
  • 2A und B zeigen einen direkten Vergleich der Meristeme eines 0,5 mm großen und eines 1 mm großen Mais-Embryos. In beiden Fällen ist das Meristem als scheibenförmige Struktur im Zentrum des Embryos zu erkennen, allerdings ist in dem 1 mm großen Embryo das Meristem bereits sehr stark von Blattgewebe umgeben. Dies erschwert die Zugänglichkeit des Meristems, so dass kleinere Embryonen mit einem exponierteren Meristem zu bevorzugen sind.
  • 3A–D geben präparierte Meristeme in Mais-Keimlingen wieder. Da das Meristem in Keimlingen komplett von Blättern umgeben ist, muss es freipräpariert werden, um für einen Beschuss, Mikroinjektion etc. zugänglich zu sein. Dazu werden die äußeren Gewebestrukturen vollständig entfernt, so dass das Meristem (Pfeile) frei liegt.
  • 4A–C zeigen präparierte Meristeme in älteren Maispflanzen. Da das Meristem in älteren Pflanzen, wie auch bei Keimlingen komplett von Blättern umgeben ist, muss es präpariert werden, um für einen Beschuss, Mikroinjektion etc. zugänglich zu sein. Dazu werden die äußeren Blätter vollständig entfernt, so dass das Meristem (Pfeile) frei liegt.
  • 5 zeigt den biolistischen Testbeschuss der Mais-Embryo-Meristeme. Links ist ein schematisches Bild eines Embryos mit der scheibenförmigen Meristemstruktur (hervorgehoben durch einen doppelten Ring und einen Pfeil) wiedergegeben. Rechts zeigt die Fluoreszenz von RFP nach Testbeschuss. Für den Testbeschuss wurde ein für ein RFP (rot fluoreszierendes Protein) codierendes Gen verwendet. Es ist eine eindeutige Expression des Proteins in den meristematischen Regionen (doppelter Ring) detektierbar.
  • 6 verdeutlicht die Präparation von „Tassel”-Meristemen an adulten Maispflanzen. Durch eine fensterartige Öffnung werden die Meristeme (Pfeil) halbseitig freigelegt. Die rekombinanten Kontrukte können dann z. B. über Bombardment oder Mikroinjektion eingebracht werden. Vorteilhaft ist, dass die Pflanze nicht stark geschädigt wird und die Meristeme nicht vollständig frei liegen (etwa 1–2 Tage später ist das „Tassel-Meristem” bereits nicht mehr durch die Öffnung zu sehen, da es weiter nach oben geschoben wird) und dadurch eine Oxidation und weiterer Schaden reduziert wird.
  • 7 zeigt den biolistischen Testbeschuss eines freigelegten „Tassel”-Meristems aus Mais. Links ist ein schematisches Bild der Meristemgewebe der Maisfahne („Tassel”) wiedergegeben. Rechts zeigt die Fluoreszenz von RFP nach Testbeschuss. Für den Testbeschuss wurde ein für ein RFP (rot fluoreszierendes Protein) kodierendes Gen verwendet. Es ist eine eindeutige Expression des Proteins in den meristematischen Geweben detektierbar.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Definitionen
  • Der Begriff Pflanze oder pflanzliche Zelle, wie hierin verwendet, bezieht sich auf pflanzliche Organismen, Pflanzenorgane, differenzierte und undifferenzierte Pflanzengewebe, Pflanzenzellen, Samen und deren Abkömmlinge oder Nachkommen. Pflanzliche Zellen umfassen z. B. Zellen von Samen, reifen und unreifen Embryonen, meristematischen Geweben, Keimlingen, Kallusgeweben, Blättern, Blüten, Wurzeln, Pflanzensprossen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, Protoplasten, Makroalgen und Mikroalgen.
  • Pflanzenmaterial, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliches Material, das von einer Pflanze in einem beliebigen Entwicklungsstadium gewonnen werden kann. Der Begriff umfasst somit pflanzliche Zellen, Gewebe und Organe sowie ausgebildete Pflanzenstrukturen sowie ebenfalls subzelluläre Komponenten wie Nukleinsäuren, Polypeptide, sowie alle chemischen Pflanzenstoffe, die innerhalb einer Pflanzenzelle vorliegen und/oder von dieser produziert werden können.
  • Der Begriff chromosomal oder extrachromosomal integriert, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die transiente Einbringung und/oder die Gestaltung des einen bzw. der mehreren rekombinanten Konstrukts/Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung und damit auf das anschließende Schicksal des einen bzw. der mehreren rekombinanten Konstrukts/Konstrukte in einer pflanzliche Zielstruktur, z. B. einer Zelle, wobei sowohl das eine bzw. die mehreren rekombinanten Konstrukt(e) als auch die Bedingungen zur Einbringung davon derart gehalten sind, dass keine Integration des mindestens einen rekombinanten Konstrukts in das endogene Nukleinsäurematerial einer pflanzlichen Zielstruktur, umfassend das Genom oder extrachromosomale Nukleinsäuren der pflanzlichen Zielstruktur, z. B. einer Zelle, stattfindet, sodass das mindestens eine rekombinante Konstrukt nicht chromosomal oder extrachromosomal integriert in die endogene DNA/RNA der Zielzelle und somit nicht an die Nachkommen der Zelle weitergegeben wird. Das eine bzw. die mehreren rekombinante(n) Konstrukt(e) oder dessen Transkriptions- bzw. Translationsprodukte liegen somit nur vorübergehend, d. h. transient, konstitutiv oder induzierbar, aktiv in der Zielzelle vor, sind aber nicht an die Nachkommen der Zielzelle vererbbar, d. h. sie liegen auch nicht in den Nachkommen einer Zielzelle aktiv vor.
  • Der Begriff Abkömmling oder Nachkomme, wie hierin verwendet, bezeichnet im Kontext eines rekombinanten Mikroorganismus, einer Pflanze oder einer Zelle gemäß der vorliegenden Offenbarung die Nachkommen eines solchen Organismus oder einer solchen Zelle, welche durch natürliche reproduktive ungeschlechtliche Zellteilungs- und Differenzierungsvorgänge aus dem Ursprungsorganismus oder der Ursprungszelle hervorgehen. Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, dass im Zuge der Zellteilung und Differenzierung auf natürliche Weise Mutationen ins Genom eines Organismus eingeführt werden können, wodurch sich der Abkömmling oder der Nachkomme genomisch vom Elternorganismus unterscheidet, jedoch nach wie vor der gleichen (Sub-)Spezies zugeordnet werden kann. Auch derartige durch natürliche Vorgänge veränderte Abkömmlinge, welche neben der gezielt eingebrachten Veränderung weitere Veränderungen in anderen DNA-Regionen tragen sind daher vom Begriff Abkömmling oder Nachkomme gemäß der vorliegenden Offenbarung umfasst.
  • Der Begriff Vektor oder Vektorsystem, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Transportmittel, um ein rekombinantes Konstrukt, umfassend Nukleinsäuren oder auch Polypeptide sowie gegebenenfalls weitere Sequenzen wie regulatorische Sequenzen oder Lokalisationssequenzen, direkt oder indirekt in eine gewünschte Zielzelle bzw. pflanzliche Zielstruktur in das erwünschte zelluläre Kompartiment einbringen zu können. Die direkte Einbringung erfolgt direkt in eine pflanzliche Zielzelle bzw. pflanzliche Zielstruktur, welche Nukleinsäuren enthält, die gemäß der vorliegenden Offenbarung gezielt verändert werden sollen. Die indirekte Einbringung umfasst die Einbringung in eine Struktur, z. B. Zellen von Blätter oder weitere pflanzliche Organe und Gewebe, welche zwar nicht direkt die pflanzliche Zielzelle von Interesse umfassen, wodurch jedoch die systemische Ausbreitung und Weiterleitung des Vektors, umfassend ein rekombinantes Konstrukt gemäß der vorliegenden Offenbarung, in die pflanzliche Zielstruktur, z. B. meristematische Gewebe oder Zellen oder Stammzellen, gewährleistet wird. Der Begriff Vektor oder Vektorsystem, wie hierin verwendet, umfasst im Kontext der Transfektion von Aminosäuresequenzen geeignete Agenzien zur Peptid- oder Proteintransfektion wie z. B. ionische Lipidmischungen oder Agenzien, die zur Transfektion einer Nukleinsäure geeignet sind, wie z. B. Trägermaterialen, durch welche Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen mittels Partikel-Beschuss in eine Zelle eingeführt werden können, wie z. B. Gold- und Wolframpartikel. Ferner umfasst dieser Begriff speziell bei der Anwendung der hierin offenbarten Verfahren und Konstrukte auch virale Vektoren, d. h. modifizierte Viren, wie zum Beispiel solche, welche aus einem der folgenden Viren stammen: Maize Streak Virus (MSV), Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV), Brome Mosaic virus (BMV), Maize stripe virus (MSpV), Maize rayado fino virus (MYDV), Maize yellow dwarf virus (MYDV), Maize dwarf mosaic virus (MDMV) und bakterielle Vektoren, wie zum Beispiel Agrobacterium spp., wie zum Beispiel Agrobacterium tumefaciens. Schließlich umfasst der Begriff auch geeignete Transportmittel zur Einführung von linearen Nukleinsäuren (einzel- oder doppelsträngig) in eine Zielzelle. Dem Fachmann auf dem Gebiet sind in Kenntnis der hierin offenbarten Konstrukte alle weiteren Sequenzen bekannt, über welche ein Vektor verfügen muss, um in einer erwünschten Zielzelle funktional zu sein. Auch die gängige Herstellung, Aufarbeitung und Anwendung derartiger Vektoren ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • Der Begriff Vektorsystem, wie hierin verwendet, bezeichnet ein System, das aus mindestens einem oder mehreren Vektor(en) besteht oder diese(n) enthält. So kann ein Vektorsystem einen Vektor aufweisen, welcher zwei unterschiedliche rekombinante Konstrukte, umfassend Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenzen, enthält/kodiert. Ein Vektorsystem kann darüber hinaus auch mehrere Vektoren enthalten, die ihrerseits mindestens eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Offenbarung enthalten/kodieren.
  • Der Begriff Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz, wie hierin verwendet, bezieht sich auf natürliche wie synthetische Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA), welche auch synthetische Nukleotidanaloga enthalten können. Die Nukleinsäuren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung zur Synthese eines gewünschten Produkts wie Protein oder RNA oder zur gezielten Steuerung davon verwendet werden, z. B. eine Cas-Nuklease oder eine gRNA, können gegebenenfalls „auf die Anwendung in einer pflanzlichen Zielstruktur angepasst” sein. In einer Ausführungsform können die vorgenannten Sequenzen Codon-optimiert sein, d. h. die Codon-Verwendung eines Genes oder einer RNA wird spezifisch auf die der Zielzelle/Zielorganismus angepasst. Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, dass ein gewünschtes Zielgen, welches ein Protein von Interesse kodiert, ohne Änderung der translatierten Proteinsequenz modifiziert werden kann, um der spezifischen Spezies-abhängigen Codon-Verwendung Rechnung zu tragen. So sind/können die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung spezifisch auf die Codon-Verwendung von Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Secale cereale, Triticale, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italic, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Triticum durum, Hordeum bulbosum, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Malus domestica, Beta vulgaris, Helianthus annuus, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis arenosa, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa-pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica juncacea, Brassica nigra, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Glycine max, Gossypium ssp. oder Populus trichocarpa angepasst (werden). Ferner muss gemäß der vorliegenden Offenbarung die Sequenz der gRNA oder der die gRNA kodierenden Sequenz an die Nukleinsäure-Zielregion innerhalb einer pflanzlichen Zielstruktur angepasst werden. In einer weiteren Ausführungsform kann die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz zudem in der Region angepasst werden, welche für die Interaktion oder Kopplung mit einer Cas-Nuklease und/oder einer Effektor-Domäne verantwortlich ist.
  • Der Begriff Sequenzen, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen sowie Aminosäuresequenzen, wobei die jeweilige Sequenz neben natürlichen Nukleotiden und Aminosäuren auch synthetische Analoga oder synthetische Verknüpfungen als Bausteine enthalten können.
  • Die Begriffe Polypeptid, Polypeptidsequenz, Proteinsequenz und Aminosäuresequenz werden hierin austauschbar verwendet.
  • Der Begriff regulatorische Sequenz, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure- oder eine Protein-Sequenz, welche die Transkription und/oder Translation der einer offenbarten Nukleinsäure-Sequenzen in cis oder trans steuern kann.
  • Der Begriff Konstrukt oder rekombinantes Konstrukt (hierin austauschbar verwendet) wie hierin verwendet bezieht sich auf ein einen Plasmidvektor, umfassend unter anderen Plasmide, Cosmide, künstliche Hefe- oder bakterielle Chromosomen (YACs und BACs), eine Expressionskassette, einzelsträngige oder lineare Nukleinsäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen, welche in eine Zielzelle gemäß der vorliegenden Offenbarung eingebracht werden können. Ein erfindungsgemäßes rekombinante Konstrukt kann CRISPR/Cas Werkzeuge oder Teile davon, umfassend mindestens eine gRNA oder mindestens eine Cas-Nuklease Variante und/oder mindestens eine weitere Effektor-Domänen entweder in der Form einer Nukleinsäure oder einer Aminosäuresequenz. Ferner kann das rekombinante Konstrukt regulatorische Sequenzen und/oder Lokalisationssequenzen umfassen. Das rekombinante Konstrukt kann in einen Plasmidvektor integriert vorliegen und/oder isoliert von einem Plasmidvektor vorliegen, z. B. in der Form einer Polypeptidsequenz oder einer nicht-Plasmidvektor verknüpften einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäure vorliegen. Nach Einbringung liegt das Konstrukt vorzugsweise extrachromosomal und nicht in das Genom integriert und gewöhnlich in der Form einer doppelsträngigen oder einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen oder einzelsträngigen RNA oder eines Polypeptids vor. Rekombinant wie hierin verwendet bedeutet eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzabfolge, wie sie so insbesondere in ihrer Gesamtheit nicht natürlich vorkommt.
  • Wann immer die vorliegende Offenbarung auf Sequenzhomologien oder Sequenzidentitäten von Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen in Form von Prozentangaben Bezug nimmt, beziehen sich diese Angaben auf Werte, wie sie unter Verwendung von EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Nucleotide) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html) für Nukleinsäuresequenzen bzw. EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Protein) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) für Aminosäuresequenzen berechnet werden können. Bei vom European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Institute (EBI) zur Verfügung gestellten Tools für lokale Sequenzalignments verwenden einen modifizierten Smith-Waterman Algorithmus (siehe http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ und Smith, T. F. & Waterman, M. S. "Identification of common molecular subsequences" Journal of Molecular Biology, 1981 147 (1): 195–197). Ferner wird hierbei bei der Durchführung des jeweiligen paarweisen Alignments zweier Sequenzen unter Verwendung des modifizierten Smith-Waterman Algorithmus auf die vom EMBL-EBI derzeit angegebenen Default Parameter Bezug genommen. Diese lauten (i) für Aminosäuresequenzen: Matrix = BLOSUM62, Gap open penalty = 10 und Gap extend penalty = 0,5 sowie (ii) für Nukleinsäuresequenzen: Matrix = DNAfull, Gap open penalty = 10 und Gap extend penalty = 0,5.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter „homologen Sequenzen” oder „Homologe” oder vergleichbaren Termini Nukleinsäuresequenzen verstanden, welche den gleichen phylogenetischen Ursprung haben. Vorzugsweise üben Proteine, die durch diese Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die gleiche Funktion aus. Homologe Nukleinsäuresequenzen weisen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität auf.
  • Nukleinsäure-Zielregion, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliche genomische sowie extrachromosomale DNA oder RNA, insbesondere mRNA, eines Zielorganismus oder einer Zielzelle, deren Modifikation erwünscht ist und die durch die hierin offenbarten Verfahren und Konstrukte bewirkt werden kann und ist bewusst nicht auf Gen-Regionen, d. h. Regionen, welche die Information zur Transkription einer mRNA tragen, beschränkt.
  • Komplementär oder Komplementarität, wie hierin verwendet, beschreibt die Beziehung zwischen zwei DNA- oder RNA-Nukleinsäureregionen, welche auf Grund ihrer Nukleobasen nach dem Schlüssel-und-Schloss Prinzip zueinander passen und Wasserstoffbrücken untereinander eingehen (hybridisieren). Hierbei gelten nach der Watson-Crick Basenpaarung die Basen Adenin und Thymin/Uracil bzw. Guanin und Cytosin als komplementär. Auch weitere Nicht-Watson-Crick-Paarungen, wie Reverse-Watson-Crick-, Hoogsteen-, Reverse-Hoogsteen und Wobble-Paarung sind vom Begriff komplementär umfasst, sofern die entsprechenden Basenpaare Wasserstoffbrücken zueinander eingehen, d. h. zwei unterschiedliche Nukleinsäurestränge miteinander auf Grund ihrer Komplementarität hybridisieren können.
  • Unter „Hybridisieren” oder „Hybridisierung” wird ein Vorgang verstanden, bei dem sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül an einen weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang anlagert, d. h. Basenpaarungen eingeht. Standardverfahren zur Hybridisierung sind beispielsweise in Sambrook et al. 2001 beschrieben. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 60%, weiter bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen der Nukleinsäuresequenz eine Basenpaarung mit dem weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Der Begriff „Stringenz” bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. Ionenstärke und der Temperatur ab. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen” sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuresequenzen stattfindet. Der Begriff „Hybridisierungsbedingungen” bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf die bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuren hybridisieren, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität aufweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 × SSC bei 65°C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C für insgesamt etwa 1 Stunde. Der hier verwendete Begriff ”stringente Hybridisierungsbedingungen” kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68°C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA und 1% BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 × SSC und 0,1% SDS bei 68°C. Bevorzugt findet eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen statt.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle, umfassend die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen einer pflanzlichen Zielstruktur, welche mindestens eine meristematische Zelle umfasst, wobei die mindestens eine meristematische Zelle mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion umfasst; (ii) Bereitstellen mindestens einer gRNA oder Bereitstellen eines oder mehrerer rekombinanten Konstrukts/Konstrukte, wobei das bzw. die rekombinanten) Konstrukt(e) mindestens eine gRNA oder eine für eine gRNA kodierende Sequenz, und optional mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz umfasst, und Bereitstellen mindestens einer Cas-Nuklease und/oder einer Effektor-Domäne oder Bereitstellen eines oder mehrerer rekombinanten Konstrukts/Konstrukte, wobei das bzw. die rekombinante(n) Konstrukt(e) mindestens eine Cas-Nuklease oder eine für eine Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder mindestens eine Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz, und optional mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz umfasst, wobei die gRNA dazu in der Lage ist, sowohl an einen Abschnitt der Nukleinsäure-Zielregion zu hybridisieren als auch mit der Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne zu interagieren; wobei wenn die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz durch ein oder mehrere rekombinante(s) Kontrukt(e) bereitgestellt werden, die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz auf oder in dem gleichen, oder auf oder in unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten lokalisiert sein kann; optional: wobei die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und/oder die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz auf die Anwendung in einer pflanzlichen Zelle hin angepasst sind; (iii) optional: Bereitstellen mindestens eines Vektors zur Einbringung des bzw. der rekombinanten Konstrukts/Konstrukte; (iv) optional: Bereitstellen mindestens eines weiteren rekombinanten Konstrukts umfassend einen rekombinanten Nukleinsäure-Abschnitt zur gezielten Homologie-gerichteten Reparatur der Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur oder Insertion in die Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur bevorzugt umfassend mindestens eine regulatorische Sequenz und optional mindestens eines weiteren Vektors zur Einbringung des mindestens einen weiteren rekombinanten Konstrukts; (v) Einbringen der gRNA, der Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne und/oder des bzw. der rekombinanten Konstrukts/Konstrukte in die pflanzliche Zielstruktur; (vi) Kultivieren der pflanzlichen Zielstruktur unter Bedingungen, welche die Aktivierung der eingeführten gRNA, Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne und/oder des bzw. der eingeführten rekombinanten Konstrukts/Konstrukte und dadurch eine gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur gestatten, um eine pflanzliche Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, die die gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion umfasst, zu erhalten; (vii) Gewinnen einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle aus der gezielt veränderten mindestens einen meristematischen Zelle, (viii) wobei die Pflanze, das Pflanzenmaterial oder die pflanzliche Zelle direkt durch Zellteilung und Differenzierung und optional einer Fremdbefruchtung oder Selbstung aus der gezielt veränderten mindestens einen meristematischen Zelle gewonnen wird, und wobei die gewonnene Pflanze, das Pflanzenmaterial oder die pflanzliche Zelle die gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion umfasst, wobei das bzw. die rekombinante(n) Konstrukt(e), welche mindestens eine gRNA oder eine für eine gRNA kodierende Sequenz, und/oder mindestens eine Cas-Nuklease oder eine für eine Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder mindestens eine Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz umfassen, vorzugsweise nicht chromosomal oder extrachromosomal integriert werden/sind.
  • Meristematische Zellen gehören einem Gewebetyp innerhalb einer Pflanze an, welcher als Meristem oder auch Bildungsgewebe bezeichnet wird. Wie auch Stammzellen in tierischen Organismen besitzen pflanzliche meristematische Zellen als undifferenzierte Zellen die Fähigkeit, sich je nach Umwelteinfluss zu jeglichem spezialisierten Zelltyp zu differenzieren. Meristeme sind bei pflanzlichen Organismen nicht nur während der Embryonalentwicklung, sondern während des gesamten Lebenszyklus vorhanden, sodass eine gezielte Veränderung von meristematischen Zellen und Geweben gemäß der vorliegenden Offenbarung nicht auf pflanzliche Embryonen oder Keimlinge beschränkt ist, sondern auch in größeren Keimlingen und ausgereiften Pflanzen beispielsweise in Meristemen, aus welchen generative Pflanzenorgane (z. B. in Mais die Fahne oder der Kolben) hervorgehen, durchgeführt werden kann.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist die meristematische Zelle eine reife oder unreife pflanzliche Zelle eines pflanzlichen Embryos oder eines Keimlings oder einer Pflanze, umfassend mindestens eine meristematische Zelle oder meristematisches Gewebe.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist die meristematische Zelle eine Zelle einer monokotyledonen oder einer dikotyledonen Pflanze.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein spezielles Verfahren bereitgestellt, welches gezielt die geringe Population an meristematischen Zellen in einer Pflanze in all ihren Entwicklungsstadien als pflanzliche Zielstruktur entweder direkt oder indirekt ansteuern kann. Die mindestens eine meristematische Zielzelle kann direkt oder indirekt angesteuert. werden, d. h. mindestens ein rekombinantes Konstrukt gemäß der vorliegenden Offenbarung kann direkt in die mindestens eine meristematische Zielzelle eingebracht werden bzw. das mindestens eine rekombinante Konstrukt kann mit Hilfe eines geeigneten Vektors in eine beliebige pflanzliche Zelle oder ein beliebiges pflanzliches Gewebe eingebracht werden, wobei das mindestens eine rekombinante Konstrukt im Anschluss zu der pflanzlichen Zielstruktur transportiert werden kann. Dies erfolgt etwa durch die systemische Ausbreitung von mindestens einem durch einen Vektor in eine pflanzliche Zelle oder in ein pflanzliches Gewebe eingeführten rekombinanten Konstrukt.
  • Eine pflanzliche Zielstruktur, wie hierin verwendet, umfasst mindestens eine pflanzliche meristematische Zelle, welche als Gewebe, Pflanzenmaterial, als ganze Pflanze oder als isolierte Zelle vorliegen kann, wobei die pflanzliche meristematische Zelle zudem mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion enthält. Die in der pflanzlichen Zielstruktur enthaltene mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion umfasst DNA- und RNA-Sequenzen und kann innerhalb der Zielstruktur chromosomal oder extrachromosomal vorliegen.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung, welcher sich auf die Einführung einer gezielten Nukleinsäure-Veränderung in eine nicht chromosomale Zielstruktur bezieht, umfasst der Begriff pflanzliche Zielstruktur, wie hierin verwendet, mindestens eine pflanzliche Zelle, welche als Gewebe, Pflanzenmaterial, als ganze Pflanze oder als isolierte Zelle vorliegen kann, wobei die pflanzliche Zelle zudem mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion, umfassend DNA und RNA, enthält.
  • Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen meristematischen Zelle als Zielstruktur durch transient eingeführte CRISPR/Cas-Werkzeuge und/oder gegebenenfalls weitere Effektor-Domänen verändert. Da die so veränderte mindestens eine meristematische Zelle die gezielte Veränderung in der Nukleinsäure-Zielregion durch die anschließende Zellteilung und Differenzierung unmittelbar und direkt an ihre Nachkommen weitergeben kann bedarf das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung keiner weiteren Kreuzungs- und Selektionsschritte, um eine Pflanze, Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle mit der erwünschten gezielten Veränderung bereitzustellen. Vielmehr können aus den embryonalen oder ebenso aus sekundären Meristemen, wie z. B. Pollen oder Ovarien, optional unter Durchführung einer Selbstung oder einer Fremdbefruchtung, pflanzliche Organismen oder pflanzliche Zielstrukturen gewonnen werden, welche die gezielt eingeführte Veränderung tragen.
  • In einer Ausführungsform bietet das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den weiteren Vorteil, dass die CRISPR/Cas-Werkzeuge und/oder gegebenenfalls weitere Effektor-Domänen nur transient in die pflanzliche Zielstruktur, bevorzugt eine meristematische Zelle oder ein meristematisches Gewebe, eingebracht werden, sodass keine stabile Integration der CRISPR/Cas Werkzeuge wie Cas-Nuklease und gRNA und ggf. regulatorischen Sequenzen sowie ggf. weiterer Effektor-Domänen in die endogenen chromosomalen oder endogenen extrachromosomalen Nukleinsäuren der pflanzlichen Zielstruktur erfolgt.
  • Gemäß der vorliegenden Offenbarung wurde gefunden, dass durch die Ausnutzung des Wirkmechanismus der RNA-dirigierten DNA-Modifikation der CRISPR-Cas Werkzeuge auch weitere Effektor-Domänen, gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren, eingesetzt werden können, wodurch sich das Spektrum der gezielten Genom Editierung verbreitern lässt. Es können entweder die Cas-Nuklease Variante oder die gRNA oder beide davon mit einer Effektor-Domäne verknüpft werden.
  • Eine Effektor-Domäne wie hierin verwendet umfasst DNA- bzw. RNA-modifizierende oder DNA- bzw. RNA-bindende Polypeptide oder Nukleinsäuren, umfassend alle Arten von monomeren, dimeren oder multimeren Nukleasen, wie z. B. TALE Nukleasen, Meganukleasen, Zink-Finger-Nukleasen, Ribonuklease, Desoxyribonukleasen, Exonukleasen, Endonukleasen und Restriktionsendonukleasen vom Typ I, II, III oder IV und dergleichen und umfassend Nickasen, Aktivatoren und Repressoren der Transkription, Phosphatasen, Glykosylasen, oder Enzyme, welche epigenetische Veränderungen bewirken können, wie beispielsweise Acetylasen, Methylasen, Methyltransferasen, Proteine, welche methylierte DNA binden können, oder Histon-Deacetylasen, Aptamere, umfassend einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenzen sowie Peptide, fluoreszierende Proteine, Markernukleinsäure- oder Markeraminosäuresequenzen, und dergleichen, und Kombinationen davon. Im Bezug auf Enzyme oder Polypeptide allgemein, umfasst der Begriff „Effektor-Domäne” auch eine katalytische Domäne oder Kern-Domäne des jeweiligen Enzyms oder Polypeptides, z. B. einem Bindeprotein, wobei die katalytische Domäne bzw. Kern-Domäne nach wie vor dazu in der Lage ist, die enzymatische oder die Bindefunktion des jeweiligen nativen Enzyms oder Polypetids zu erfüllen. Der Entwurf derartiger trunkierter Domänen und deren Anpassung auf die gewünschte Funktion hin ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • Hierin werden Verfahren und Konstrukte bereitgestellt, bei welchen gRNA und/oder Cas-Nuklease bereits verknüpft mit einer weiteren Effektor-Domäne als oder auf einem rekombinanten Konstrukt bereitgestellt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, bei welchem die mindestens eine gRNA sowie die mindestens eine Cas-Nuklease und/oder mindestens ein weitere Effektor-Domäne separat auf unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten bereitgestellt werden. Gemäß dieses Verfahrens kann die gRNA Komponente als DNA oder RNA bereitgestellt werden, die Cas-Nuklease oder Variante davon kann als DNA oder RNA oder als Polypeptidsequenz bereitgestellt werden, und die Effektor-Domäne kann als DNA oder RNA oder als Polypeptidsequenz bereitgestellt werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche die simultane Einbringung mindestens einer gRNA sowie mindestens einer Cas-Nuklease Variante zusammen mit mindestens einer Effektor-Domäne umfasst, kann die Effektor-Domäne mit der gRNA bzw. der Cas-Nuklease Variante durch einen Nukleinsäure- oder Aminosäure-Linker verknüpft sein, um eine ideale Anordnung der Domänen zueinander und dadurch deren Funktionalität durch adäquate Flexibilität der Domänen zueinander zu gewährleisten.
  • Aktivatoren und Repressoren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen können, umfassen vorzugsweise SEQ ID NOs: 1–4 sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie die Sequenzen mit den entsprechenden SEQ ID NOs.
  • Verfahren zur Anzucht und Kultivierung der Mikroorganismen und Viren, welche gemäß der vorliegenden Offenbarung als Vektoren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • In einer Ausführungsform wird das rekombinante Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung mit Hilfe mindestens eines Vektors oder eines Vektorsystems in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht.
  • In einer anderen Ausführungsform wird das rekombinante Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung direkt ohne einen zusätzlichen Vektor in die Zielzelle eingebracht, vorzugsweise durch mechanische Verfahren, durch Transfektion oder durch Ausnutzung von Endozytose.
  • Ebenfalls vorgesehen, gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist die Einbringung von mindestens einem rekombinanten Konstrukt in eine pflanzliche Zielstruktur.
  • Vektoren und Vektorsysteme der vorliegenden Erfindung umfassen solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie der/das jeweils nicht modifizierte Vektor oder Vektorsystemmit der entsprechenden SEQ ID NO. Die genannten Vektoren und Vektorsysteme können etwa Codon-optimierte oder trunkierte rekombinante Konstrukte umfassen, oder sie können gezielte Punktmutationen enthalten, um ihre Aktivität in unterschiedlichen Zielzellen zu gewährleisten. Die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 31 ist eine Hybridsequenz, bei der der Bereich zwischen den BclI und der BssHII-Schnittstellen des Fescue Segments RNA3 des Brom-Mosaik-Virus (s. NCBI: DQ530425) durch den korrespondierenden Abschnitt des R_BMV_RNA3_S113'A/G (Hema & Kao 2004, Journal of Virology) Fragmentes ersetzt wurde. Ferner wird gemäß der vorliegenden Offenbarung auch ein Agrobacterium spp. als Vektor angesehen und kann alleine oder in Kombination mit weiteren Einbringungsmitteln bzw. Vektoren verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform werden die o. g. Vektoren und Vektorsysteme gemäß SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38 oder Sequenzen mit o. g. Sequenzhomologie hierzu als Gerüststruktur verwendet, um die erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte, umfassend mindestens eine gRNA sowie mindestens eine Cas-Nuklease und/oder mindestens eine Effektor-Domäne in eine pflanzliche Zielstruktur einzubringen. Die hierfür erforderlichen molekularbiologischen Methoden und Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • Rekombinante Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 23 und 24 sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie das jeweils nicht modifizierte rekombinante Konstrukt mit der entsprechenden SEQ ID NO. Die genannten rekombinanten Konstrukte können etwa Codon-optimierte oder trunkierte Sequenzen umfassen, oder sie können gezielte Punktmutationen enthalten, um ihre Aktivität oder Bindungseigenschaften in unterschiedlichen Zielzellen zu gewährleisten oder zu modifizieren. In SEQ ID NO: 23 entsprechen die Positionen 16239–16258 der Position für die jeweilige gRNA von Interesse, welche je nach Ziel-Nukleinsäuresequenz modifiziert werden kann und muss. In SEQ ID NO: 24 entsprechen die Positionen 16645–16664 der Position für die jeweilige gRNA von Interesse, welche je nach Ziel-Nukleinsäuresequenz modifiziert werden kann und muss.
  • In einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle, wobei das rekombinante Konstrukt ausgewählt ist aus SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen.
  • In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Pflanze, ein Pflanzenmaterial oder eine pflanzliche Zelle, erhältlich oder erhalten durch ein Verfahren umfassend das Einbringen eines rekombinanten Konstrukts gemäß SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, in eine pflanzliche Zielstruktur, welche mindestens eine meristematische Zelle umfasst.
  • In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von mindestens einem rekombinanten Konstrukt gemäß SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, zur gezielten Veränderung mindestens einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zelle.
  • Zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung eignen sich alle Cas-Polypeptidsequenzen sowie Cas-kodierende Nukleinsäuresequenzen, welche speziell auf den Einsatz in einer pflanzlichen Zelle hin optimiert wurden bzw. deren kodierende Konstrukte geeignete regulatorische Sequenzen tragen, welche die adäquate Transkription und/oder Translation in einer pflanzlichen Zelle im dafür vorgesehenen zellulären Kompartiment, umfassend den Zellkern, das Zytosol, ein Mitochondrium, ein Plastid, umfassend einen Chloroplasten, bewirken können. Ferner müssen die jeweiligen Cas-Nukleasen in einer Ausführungsform über ihre intrinsische Nukleasefunktion verfügen.
  • Alternativ können gemäß eines Aspekts der vorliegenden Offenbarung auch Cas-Nickasen zum Einsatz kommen, d. h. Cas-Polypeptide, die dahingehende verändert wurden, dass sie nur noch einen DNA-Strang spalten und nicht wie eine native Cas-Nuklease einen DNA-Doppelstrangbruch erzeugen. Dies bietet zum einen die Möglichkeit einer erhöhten Spezifität, da zur Erzielung eines Doppelstrangbruchs zwei rekombinante Konstrukte umfassend eine Cas-Nickase zum Einsatz kommen müssen. Zum anderen bietet sich die Möglichkeit, einen gezielt versetzten Doppelstrangbruch anstelle eines „Blunt” Schnittes einzuführen.
  • Schließlich können gemäß eines Aspekts der vorliegenden Offenbarung auch Cas-null Nukleasen, d. h. Varianten, welche über keine Nukleaseaktivität mehr verfügen, zum Einsatz kommen. Hiermit eröffnet sich die Möglichkeit, die Cas-Nuklease zusammen mit einer weiteren Effektor-Domäne gemäß der vorliegenden Offenbarung, z. B. einem weiteren DNA- bzw. RNA-modifizierenden oder DNA- bzw. RNA-bindenden Polypeptid oder Nukleinsäuren, gemäß der vorliegenden Offenbarung zu verwenden, wodurch sich das Spektrum der Einführung gezielter Veränderungen in einer pflanzlichen Zielstruktur erweitert.
  • Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, gezielte Mutationen in die katalytische Domäne einer Cas-Nuklease von Interesse einzuführen, um diese zu einer Nickase oder zu einer Cas-null Nuklease „umzuprogrammieren”.
  • Beispielhafte Cas-Nukleasen oder Cas-Nuklease kodierende Sequenzen zur Anwendung in der vorliegenden Offenbarung sind in SEQ ID NOs 16–22 und als UniProtKB/Swiss-Prot Datenbankzugang Q99ZW2.1 (SEQ ID NO: 39) offenbart und umfassen auch solche Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie die jeweils nicht modifizierten Sequenzen mit der entsprechenden SEQ ID NO bzw. zugänglich unter der genannten Datenbankhinterlegungsnummer.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung nutzt den dem CRISPR/Cas System zu Grunde liegenden Wirkmechanismus der RNA-gesteuerten DNA-Modifikation dahingehend, dass eine Effektor-Domäne anstelle von oder zusammen mit der Cas-Nuklease durch eine gezielt angepasste gRNA an die gewünschte Position einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zielstruktur dirigiert wird, sodass die Effektor-Domäne gezielt platziert werden kann, um die gewünschte Nukleinsäure Editierung zu bewirken.
  • In einer Ausführungsform dieses Aspekts ist die Nukleinsäure-Zielregion eine genomische DNA.
  • In einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts ist die Nukleinsäure-Zielregion eine mitochondriale oder plastidäre DNA, wobei das rekombinante Konstrukt eine Lokalisationssequenz umfasst, welche die Lokalisation des rekombinanten Konstrukts im entsprechenden Zielkompartiment, z. B. einem Mitochondrium oder einem Chloroplasten, umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die die Effektor-Domäne kodierende Sequenz zusätzlich eine Sequenz ausgewählt aus einer Kernlokalisationssequenz, einer Plastidenlokalisationssequenz, vorzugsweise einer Mitochondrienlokalisationssequenz und einer Chloroplastenlokalisationssequenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz zusätzlich eine Sequenz ausgewählt aus einer Kernlokalisationssequenz, einer Plastidenlokalisationssequenz, vorzugsweise einer Mitochondrienlokalisationssequenz und einer Chloroplastenlokalisationssequenz.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts ist die Nukleinsäure-Zielregion eine Ribonukleinsäure (RNA) in einem beliebigen pflanzlichen Kompartiment, z. B. dem Zytosol. Gemäß dieser Ausführungsform kann eine gezielt modifizierte gRNA bereitgestellt werden, welche dazu in der Lage ist, mit einer RNA-Zielstruktur zu interagieren. Die gRNA kann zudem eine weitere Effektor-Domäne, z. B. ein Aptamer, umfassen.
  • Dem Fachmann auf dem Gebiet ist bekannt, dass das Design der entsprechenden mindestens einen gRNA, welche zusammen mit mindestens einer Cas-Nuklease und/oder mit mindestens einer Effektor-Domäne verwendet wird, von der Spezifität und speziell den Bindungs- und Erkennungseigenschaften der jeweils verwendeten Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne sowie der Nukleinsäure-Zielregion, welche gezielt verändert werden soll, abhängt.
  • Wildtyp Cas-Nukleasen, speziell vom Typ Cas9, erzeugen einen „blunt” Doppelstrangbruch in der Ziel-DNA-Sequenz, d. h. ohne Einzelstrang-DNA-Überhang. Hierdurch wird der zelleigene DNA-Reparaturmechanismus der Zielzelle aktiviert über den sog. Nicht-homologe Reparatur (non-homologous end joining oder NHEJ) induziert. Dieser Mechanismus ist jedoch fehleranfällig, es kann also zur Etablierung unerwünschter Mutationen an den Orten der Wiederzusammenführung der einzelnen DNA-Stränge kommen. Mittels NHEJ können etwa einfache oder mehrfache Gen-Knock-Outs mediiert werden, wobei die DNA-Stränge nach dem gezielten DNA-Bruch durch zelleigene Mechanismen wieder zusammengeführt werden. Ein weiterer Reparaturmechanismus ist die Homologie-gerichtete Reparatur (homology-directed repair (HDR) oder homologe Rekombination (HR)). Auch dieser Mechanismus dient der Wiederzusammenführung von DNA-Strängen bei DNA-Läsionen. Im Gegensatz zu NHEJ benötigt HDR jedoch die Anwesenheit einer Matrize, d. h. einem homologen DNA-Stück, welches die Legierung der einzelnen DNA-Stränge mediiert. Hierdurch können etwa Insertionen, Gen-Austausch oder die gezielte Zusammenführung der einzelnen Stränge ohne die Hinzufügung von unerwünschten, nicht-steuerbaren Mutationen erreicht werden. Beide Reparaturmechanismen, NHEJ und HDR/HR stellen natürlich vorkommende Mechanismen zur DNA-Reparatur dar, welche in jeder hierin offenbarten Zelle als natürliche Reparaturmechanismen vorkommen.
  • Entscheidend für die ortsgerichtete Einführung der Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion ist gemäß dem oben dargelegten Mechanismus des Typ-II CRISPR/Cas Systems die gezielte Auswahl und das gezielte Design der gRNA-Sequenzen, um die Spaltung von Off-Target Regionen anders als der Zielregion zu vermeiden. Die Identifikation geeigneter PAM-Motive in Abhängigkeit der verwendeten CRISPR/Cas Werkzeuge und optional weiterer Effektor-Domänen und die Verwendung dieser Information zum Design geeigneter rekombinanter Konstrukte ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung wird das Genom oder die extrachromosomale Nukleinsäure-Zielregion einer Zelle daher zunächst nach geeigneten PAM-Sequenzen hin durchsucht, um so gezielt eine passende gRNA entwerfen zu können.
  • Der Begriff guide RNA oder gRNA wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, welches aus natürlicher oder synthetischer RNA und/oder aus natürlicher oder synthetischer DNA bestehen kann und über die Funktion verfügt, einen Komplex mit einer Cas-Nuklease bilden zu können, wodurch die Cas-Nuklease erst in die Lage versetzt wird, eine Nukleinsäure-Zielregion zu erkennen. Zudem verfügte eine gRNA neben der Cas-Nuklease-Interaktionsdomäne über die Funktion einer Erkennungsdomäne, zur gezielten Hybridisierung an ein komplementäres Ziel-Nukleinsäuremolekül von Interesse. Folglich können gRNAs eine intrinsische Hairpin-Region durch komplementäre Basenpaarung bilden, wodurch die natürliche tracrRNA/crRNA Hairpin-Struktur nachgeahmt wird (siehe Jinek et al., 2012 oben) und zudem je nach erwünschter Zielsequenz eine geeignete Erkennungsdomäne umfassen.
  • Gemäß der vorliegenden Offenbarung können gRNAs verwendet werden, welche speziell auf den Einsatz in einer pflanzlichen Zelle hin angepasst wurden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde zudem erarbeitet, dass eine beliebige gRNA wie hierin beschrieben zusätzlich an mindestens eine Effektor-Domäne, wie z. B. ein Aptamer, gekoppelt oder zusammen mit der Effektor-Domäne eingebracht werden kann, um so die Funktionalität der gRNA zu erweitern. Das rekombinante Konstrukt umfassend eine gRNA und mindestens eine Effektor-Domäne kann als DNA- oder RNA-Konstrukt in die pflanzliche Zielstruktur unter Einsatz eines geeigneten rekombinanten Konstrukts und/oder Vektors eingebracht werden. Die Effektor-Domäne kann zudem nicht nur aus einer Nukleinsäure bestehen, sondern auch als Polypeptid, oder eine dafür kodierende Sequenz, vorliegen.
  • In einer Ausführungsform wird die gRNA gekoppelt an die Cas-Nuklease und/oder die Effektor-Domäne, z. B. das/die DNA- bzw. RNA-modifizierende oder das/die DNA- bzw. RNA-bindende Polypeptid oder Nukleinsäure, in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die gRNA als separates rekombinantes Konstrukt unabhängig von der Cas-Nuklease und/oder die Effektor-Domäne, z. B. das DNA- bzw. RNA-modifizierende oder DNA- bzw. RNA-bindende Polypeptid oder Nukleinsäure, in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht.
  • Die gRNA kann als DNA- oder als RNA-Molekül in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht werden. So können die gRNAs gemäß einer Ausführungsform direkt in Form einer synthetischen Nukleinsäure, z. B. als RNA, wahlweise auch im Komplex mit einer Cas-Nuklease, oder in einer anderen Ausführungsform in Form eines aktivierbaren und transkribierbaren rekombinanten DNA-Konstrukts in die Zielzelle eingebracht werden. Ferner kann gemäß der vorliegenden Offenbarung eine einzelne gRNA eingesetzt werden, oder es können duale oder multiple gRNAs in einem oder mehreren rekombinanten Konstrukt(en) gleichzeitig in eine Zelle eingeführt werden, wobei die gRNAs über die selbe oder individuelle regulatorische Sequenz(en) verfügt/verfügen. Da die Interaktionsdomäne einer klassischen CRISPR/Cas gRNA stets mit der gleichen Cas-Nuklease interagieren wird, kann durch den Einsatz individueller gRNAs, welche als weitere Komponente eine unterschiedliche Erkennungssequenz tragen, in einem Ansatz ein Multiplexing, d. h. die gezielte Veränderung mehrerer Zielregionen in einem Ansatz erreicht werden. Erforderlich kann hierbei stets sein, dass sich anliegend an die oder innerhalb der Zielregion eine PAM-Sequenz befindet. Das Design einer geeigneten gRNA kann vom Fachmann auf dem Gebiet in Kenntnis der verwendeten Cas-Nuklease, der Nukleinsäure-Zielregion, der Art der erwünschten Nukleinsäure-Veränderung, ausgewählt aus Mutation, Insertion oder Deletion, sowie der erwünschten Zielzelle in silico bestimmt werden. Die Wirksamkeit dieser gRNAs in vivo sowie mögliche Off-Target Effekte müssen jedoch für jede gRNA separat evaluiert werden. Zudem gilt es für nicht-etablierte Systeme, wie bei der transienten Transformation von pflanzlichen Meristemzellen, geeignete Vektoren und Verfahren zur Einbringung mindestens einer gRNA zusammen mit mindestens einer geeigneten Cas-Nuklease und/oder mindestens einer Effektor-Domäne, z. B. eines/einer DNA- bzw. RNA-modifizierenden oder eines/einer DNA- bzw. RNA-bindenden Polypeptids oder Nukleinsäure, zu etablieren, um die konzertierte Aktivität beider Moleküle in der Zielzelle zu gewährleisten.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruhen die erfindungsgemäßen Verfahren und dadurch die hiermit erzeugten Pflanzen, Pflanzenmaterialien oder Zellen auf dem natürlich vorkommenden DNA-Reparaturmechanismus der Zielzelle.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung wird die Reparatur eines Einzelstrang- oder Doppelstrang-DNA-Bruchs, welcher zuvor durch eine Cas-Nuklease und/oder eine weitere Effektor-Domäne mediiert wurde, durch eine oder mehrere HDR Matrize(n) geheilt, welche nicht natürlich vorkommt/vorkommen, sondern in die Zielzelle eingeführt wurde(n).
  • Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung wird daher in einer Ausführungsform eine HDR-Matrize offenbart, welche optional zusammen mit oder zeitversetzt zu den CRISPR/Cas Konstrukten und/oder einer weiteren mindestens einen Effektor-Domäne in eine Zielzelle eingebracht werden kann, um gezielt einen HDR-Mechanismus zu induzieren und dadurch gezielte Nukleinsäuresequenzen als Insertion an die Stelle des Doppelstrangbruchs einzufügen. Hierdurch können sowohl gezielte Knock-Ins, als auch die gezielte Reparatur der DNA-Läsion zur Verhinderung einer unerwünschten Mutation am Ort des DNA-Bruchs bewirkt werden. Ein Knock-In kann hierbei das gezielte Einfügen von mindestens einem Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 500 Nukleotide oder mindestens 1000 Nukleotide in die Ziel-Nukleinsäure in der pflanzlichen Zelle bedeuten. Ein Knock-In kann hierbei auch der gezielte Austausch von mindestens einem Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid bedeuten. Ferner kann ein Knock-In auch durch zwei, drei, vier oder mehr Austausche oder eine Kombination von Einfügen und Austauschen erzielt werden. Insertionen meinen das gezielte Einfügen von mindestens einem Nukleotid, mindestens 2 Nukleotide, mindestens 3 Nukleotide, mindestens 4 Nukleotide, mindestens 5 Nukleotide, mindestens 6 Nukleotide, mindestens 7 Nukleotide, mindestens 8 Nukleotide, mindestens 9 Nukleotide, mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide, mindestens 200 Nukleotide, mindestens 500 Nukleotide, mindestens 1000 Nukleotide, mindestens 2000 Nukleotide, mindestens 5000 Nukleotide, mindestens 10000 Nukleotide oder mindestens 15000 Nukleotide in die Ziel-Nukleinsäure in der pflanzlichen Zelle bedeuten. Eine Nukleinsäuresequenzen als Insertion kann eine Sequenz einer Transkriptionsfaktorbindestelle, eine regulatorische Sequenz, eine Polypeptid-kodierende Sequenz, eine Intronsequenz, eine Sequenz kodierend für eine nicht-kodierende RNA (z. B. IncRNA), eine Expressionskassette oder ein RNAi-Konstrukt. Ferner kann ein Knock-In hierbei auch herbeigeführt werden durch die Deletion von Sequenzabschnitten, welche die Funktionalität eines Gens stören (beispielsweise die Deletion von Transposoninsertionen). Die HDR-Matrize kann als einzelsträngige oder als doppelsträngige Nukleinsäure in die pflanzliche Zielstruktur von Interesse eingebracht werden.
  • In einer Ausführungsform wird eine Ziel-Nukleinsäure in einer pflanzlichen Zelle gezielt ausgeschaltet (Knock-Out), d. h. die Transkription und ggf. Translation der Nukleinsäure wird verhindert. Dies kann durch die gezielte Mutation oder Deletion einer regulatorischen Sequenz wie Promotor- oder Terminatorsequenz einer Ziel-Nukleinsäure erfolgen oder durch die gezielte Mutation oder Deletion der Ziel-Nukleinsäure selbst oder Teile davon. Weiterhin kann auch durch gezielte Mutation oder Deletion, welche den Leseraster einer Ziel-Nukleinsäure verändern, oder durch gezielte Mutation oder Deletion von potentiellen Spleißsignalen ein Knock-Out erzielt werden. In einer Ausführungsform erfolgt dieser Knock-Out ohne Einsatz einer HDR Matrize, in einer anderen Ausführungsform wird hierfür zusätzlich zu den CRISPR/Cas Konstrukten und/oder einer weiteren Effektor-Domäne eine HDR Matrize in die Zielzelle eingebracht. Eine gezielte Mutation ist beispielsweise ein Austausch von mindestens einem Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid, vorzugsweise mit der Folge, dass das betroffene Codon dann für eine andere Aminosäure kodiert. Eine gezielt ausgeschaltete Ziel-Nukleinsäure in einer pflanzlichen Zelle weist mindestens eine gezielte Mutation oder Deletion, kann aber auch zwei, drei, vier oder mehr gezielte Mutationen und/oder Deletionen aufweisen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform kann zusätzlich zu der Einführung einer gezielten Veränderung eine Ziel-Nukleinsäuresequenz der natürliche NHEJ Mechanismus einer Pflanzenzelle bewusst durch Zugabe eines entsprechenden Inhibitors unterdrückt werden, wodurch der NHEJ Mechanismus der Zelle reprimiert wird. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei welcher die pflanzliche Zielstruktur eine isolierte meristematische Zelle eines Keimlings/Pflanze oder eines pflanzlichen Embryos oder freigelegte meristemastische Zelle einer Pflanze in einem späteren Entwicklungsstadium ist, werden die die meristematischen Zellen umfassenden pflanzlichen Zielstrukturen vor, während und nach der Einbringung des mindestens einen rekombinanten Konstrukts gemäß der vorliegenden Offenbarung derart kultiviert, dass einer Oxidation der isolierten Strukturen vorgebeugt wird. In einer Ausführungsform umfasst dies die Zugabe eines Antioxidans.
  • Die nachfolgende Tabelle 1 führt geeignete Medien zur Kultivierung unterschiedlicher pflanzlicher Zielstrukturen auf, welche meistematische Zellen umfassen. Weitere geeignete Reaktionsbedingungen wie Puffer, Zusätze, Temperatur- und pH-Bedingungen sowie ggf. weitere notwendige Zusätze können vom Fachmann auf dem Gebiet in Kenntnis eines hierin offenbarten Verfahren und Konstrukte, gemäß eines beliebigen Aspekts der vorliegenden Offenbarung leicht bestimmt werden. Tabelle 1: Medienzusammensetzungen zur Kultivierung unterschiedlicher pflanzlicher Zielstrukturen mit meristematischen Zellen (MS Medium = Murashige Skoog Medium; MS Salze = Murashige Skoog Salze (Toshio Murashige, Folke Skoog: A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. In: Physiologia Plantarum, Jg. 15 (1962), Heft 3, S. 473–497, ISSN 0031-9317, doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x).
    Embryo Embryo Embryo-Bombardment Embryo-Bombardment Agro-Embryo Agro-Embryo Planzen-Meristem Exposition
    MM1(MM = Maturation Medium)-Reifungsmedium 1 MM2-Reifungsmedium 2 MM1OSM (Osmotikum) MM1MOD (MOD = modifiziert MM1Tim (Tim = Timentin) MM1ACE Meristem Peeling-Antioxidans
    MS Salze MS Medium MS Salze MS Salze MS Salze MS Salze MS Salze
    30,8 g/l 3,4 g/l 30,8 g/l 30,8 g/l 30,8 g/l 30,8 g/l 95 mg/L
    Saccharose Saccharose Saccharose Saccharose Saccharose Saccharose Cystein
    36,4 g/l Sorbitol 95 mg/l L-Cystein 150 mg/l Timetin 19.62 g/l ACE 100 mg/L Ascorbinsäure
    36,4 g/l Mannitol 4,25 mg/l Silbernitrat
    95 mg L-Cystein
    4,25 mg/l L-Silbernitrat
  • Die transiente Einführung der hierin offenbarten Konstrukte in meristematische Zellen oder Gewebe bietet den Vorteil, dass sich aus diesen Reproduktionsgewebe entwickeln, über welche die gezielte Veränderung dann stabil an die nächste Generation weitergegeben werden kann, wobei die Folgegeneration frei von den zuvor eingeführten Konstrukten ist. Die hierin offenbarten Verfahren und Konstrukte erlauben ferner, an der derart veränderten Pflanze direkt Saatgut zu ernten, welches die stabile DNA-Veränderung trägt, ohne als Zwischenschritt über eine Zellkultur in Form von Kallusproduktion und -regeneration zu gehen, womit auch auf die hierfür notwendigen Selektions- und Regenrationsschritte sowie die hierfür erforderlichen Medien und Zusätze umgangen werden können.
  • Die hierin offenbarten Verfahren eigenen sich zur Erzeugung von gezielten DNA-Veränderungen sowohl in monokotylen wie auch dikotylen Pflanzen. Beispiele für Monokotyledonen sind Gräser und Getreide wie Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Secale cereale, Triticale, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italic, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Traticum durum, Hordeum bulbosum, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii. Beispiele für Dikotyledonen sind Malus domestica, Beta vulgaris, Helianthus annuus, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis arenosa, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capselia bursa-pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica juncacea, Brassica nigra, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Glycine max, Gossypium ssp. oder Populus trichocarpa.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure-Sequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt wird mindestens eine oder mehrere regulatorische Sequenzen.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäure-Sequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt als regulatorische Sequenz mindestens einen oder mehrere Promotor(n), optional einen pflanzen- und gewebespezifischen, einen phänotypischen, einen konstitutiven oder induzierbaren Promotor, welcher geeignet zur Induktion der Transkription in einer gewünschten Zielzelle ist. Ein Promotor ist eine Nukleinsäureregion, welche an der Erkennung sowie der Bindung von RNA-Polymerasen sowie anderen Proteinen beteiligt ist, um die Transkription zu steuern. Geeignete Promotoren für entweder die gRNA oder die Cas-Nuklease sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt. Die Induktion eines induzierbaren Promotors kann durch Stimuli wie Temperatur, Chemikalien, pH, Licht, endogene Pflanzensignale, z. B. ausgeschüttet nach Verwundung der Pflanze, und dergleichen erfolgen. Beispielhafte Promotoren sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nos: 5–11, und umfassen auch solche Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, welche trotz Modifikation noch die gleiche Funktion erfüllen wie das jeweils nicht modifizierte Sequenz mit der entsprechenden SEQ ID NO. Weitere vorteilhafte Promotoren sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Promotoren der Wall-Associated Kinasen (WAKs) 1 und 2 (siehe z. B. Wagner TA, Kohorn BD. Wall-Associated Kinases Are Expressed throughout Plant Development and Are Required for Cell Expansion. The Plant Cell. 2001; 13(2): 303–318 sowie z. B. NCBI Eintrag: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), einem Promotor des SCARECROW1 (scr1) Gens (siehe z. B. Tissue Specificity and Evolution of Meristematic WOX3 Function; Rena Shimizu, Jiabing Ji, Eric Kelsey, Kazuhiro Ohtsu, Patrick S. Schnable and Michael J. Scanlon Plant Physiology February 2009 vol. 149 no. 2 841–850 und sowie z. B. NCBI Eintrag: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), einem Promotor der FAF2- und FAF4-Gene (siehe z. B. The FANTASTIC FOUR Proteins influence shoot meristem size in Arabidopsis thaliana Vanessa Wahl, Luise H Brand, Va-Long Guo, Markus Schmid Wahl et al. BMC Plant Biology 2010, 10: 285 http://www.biomedcentral.com/1471-2229/10/285 sowie z. B. NCBI Eintrag: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), einem Promotor des OSH1-Gens (siehe z. B. Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122 sowie z. B. Genbank Eintrag: GenBank: CP002688.1 oder GenBank: AP008209.2) oder ein Promotor eines Metalloprotein-Gens, z. B. aus Reis (z. B. GenBank: BAD87835.1). Die Promotoren der vorliegenden Erfindung können natürlich vorkommende, synthetische oder chimäre Promotoren, oder eine Kombination davon, sein. Ein bevorzugter Promotor gemäß der vorliegenden Offenbarung ist ein in einer pflanzlichen Meristemzelle aktiver Promotor oder ein in Plastiden einer pflanzlichen Zelle aktiver Promotor. In einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure-Sequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt wird, zudem als regulatorische Sequenz mindestens einen Terminator.
  • In einer Ausführungsform umfasst die die Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt wird, umfassend eine gRNA und eine Cas-Nuklease, oder eine dafür kodierende Sequenz, mindestens eine oder mehrere Kernlokalisationssequenz(en) (KLS), welche die Kernlokalisation der zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion verwendeten Nukleinsäuren und Polylpeptiden bewirken.
  • In einer Ausführungsform umfasst das rekombinante Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, welche zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion eingesetzt wird, eine gRNA und eine Cas-Nuklease, oder eine dafür kodierende Sequenz, eine oder mehrere Plastidenlokalisationssequenz(en) (PLS), zum Beispiel eine Mitochondrien- oder Chloroplastenlokalisationssequenz(en) (MLS oder CLS), welche die Lokalisation der zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion verwendeten Nukleinsäuren und Polypeptiden in den entsprechenden pflanzlichen Plastiden bewirkt.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure-Sequenz, welche für eine hierin offenbarte Cas-Nuklease kodiert, oder eine hierin offenbarte Cas-Nuklease zudem eine tag-Sequenz. Eine tag-Sequenz ist ein Nukleinsäure- oder Proteinabschnitt, welcher der Cas-Nuklease oder der gRNA, oder der die Cas-Nuklease oder die gRNA kodierenden Nukleinsäure-Sequenz vorangestellt und/oder nachgestellt und/oder innerhalb der Sequenz lokalisiert sein kann, um optional unter anderem deren Lokalisation, Visualisierung innerhalb einer Zielzelle zu ermöglichen. Besonders bevorzugt sind tag-Sequenzen ausgewählt aus der folgenden Liste: Polyhistidin(His)-Tag, Glutathione-S-transferase(GST)-tag, Thioredoxin-Tag, FLAG-tag, einem Tag mit Fluoreszenz-Eigenschaften, ausgewählt aus einem Grünfluoreszierenden Protein(GFP)-tag, einem DsRed-tag, einem mCherry-tag und dergleichen, einem Streptavidin oder strep-Tag, Maltose-Bindeprotein(MBP)-Tag, Chloroplastentransitpeptid, Mitochondrientransitpeptid, ein Snap-Tag und/oder ein Sekretionstag.
  • In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle zudem eine Screeningschritt. In diesem Schritt wird durch Verfahren zur Analyse der Nukleinsäuresequenz einer Zielregion, z. B. durch Polymerase-Kettenreaktion oder durch Sonden, überprüft, ob die Einbringung, Aktivierung und anschließende Reaktion des mindestens einen rekombinanten Konstrukts gemäß der vorliegenden Offenbarung zur erwünschten gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion. Verfahren, um dieses Screening durchzuführen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet für jegliche pflanzliche Zielstruktur sowie Nukleinsäure-Zielregion, bekannt.
  • Gemäß der vorliegenden Offenbarung können die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte zur gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zelle durch mechanische Verfahren, unter anderem Partikel-Beschuss, Mikroinjektion und Elektroporation, oder durch induzierte Endozytose, geeignete Vektoren, direkte Transfektion, und dergleichen eingebracht werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Partikelbeschuss in die Zielzelle oder pflanzliche Zielstruktur eingebracht. Hierbei werden die Vektoren zunächst z. B. auf Gold- oder Wolframpartikel präzipitiert und die Zielzelle/pflanzliche Zielstruktur wird dann mit den so erhaltenen ggf. weiter prozessierten Partikeln durch eine geeignete Apparatur bombardiert. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Mikroinjektion in die Zielzelle oder pflanzliche Zielstruktur direkt oder indirekt eingebracht. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Besprühen mit anschließender Aufnahme, z. B. im Zuge einer viralen Infektion, oder Infiltration in die Zielzelle oder pflanzliche Zielstruktur eingebracht.
  • Gemäß einer Ausführungsform werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Partikel-Beschuss in eine meristematische Zelle eingebracht. Diese Methode eignet sich sowohl zur Einbringung von rekombinanten Konstrukten umfassend doppelsträngige Plasmid-DNA, lineare einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, einzelsträngige oder doppelsträngige RNA, und von Polypeptiden sowie von Kombinationen davon bei allen Arten von pflanzlichen Meristemen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien einer Pflanze. Als Trägermaterial für die rekombinanten Konstrukte können unter anderem Gold und Wolfram verwendet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgt die Einbringung der erfindungsgemäßen Vektoren und/oder der rekombinanten Konstrukte durch Mikroinjektion direkt in die Zielzelle oder das gewünschte Kompartiment einer Zielzelle.
  • Gemäß dieser weiteren Ausführungsform werden die Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch Mikroinjektion in eine meristematische Zelle eingebracht. Diese Art der Einbringung eignet sich für alle Arten von Meristemen (s. Beispiel 2 unten). Zudem eignet sich die Einbringung gemäß dieser Ausführungsform sowohl zur Einbringung von rekombinanten Konstrukten, umfassend doppelsträngige Plasmid-DNA, lineare einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, einzelsträngige oder doppelsträngige RNA, und von Polypeptiden sowie von Kombinationen davon.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgt die Einbringung der erfindungsgemäßen Vektoren durch Elektroporation durch Hochspannungspulse.
  • In noch einer anderen Ausführungsform gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgt die Einbringung der erfindungsgemäßen Vektoren durch Endozytose, d. h. einen zelleigenen Mechanismus, durch welchen zellfremdes Material in die Zelle aufgenommen werden kann.
  • In einer Ausführungsform ist der Vektor ein viraler Vektor, welcher das mindestens eine rekombinante Konstrukt umfasst. Die Einbringung durch einen viralen Vektor bietet die Möglichkeit der Ausbreitung des Vektors und des umfassten mindestens einen rekombinanten Konstrukts. Geeignete virale Vektoren, welche zur Anwendung gemäß der vorliegenden Offenbarung eingesetzt oder modifiziert werden können, sind ausgewählt aus der Gruppe, umfassend, aber nicht beschränkt auf SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38 und umfassen auch solche Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen. Es ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, dass die Sequenz eine natürlich vorkommenden Virus, welcher als viraler Vektor eingesetzt werden soll, entsprechend an das gewünschte einzubringende rekombinante Konstrukt sowie die pflanzliche Zielstruktur von Interesse angepasst werden muss.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die rekombinanten Konstrukte durch Agrobacterium spp. -vermittelter Transformation, insbesondere Agrobacterium tumefaciens- oder Agrobacterium rhizogenes-vermittelter Transformation, in eine pflanzliche Zielstruktur eingebracht. Diese Art der Einbringung ist dem Fachmann auf dem Gebiet für unterschiedliche Zielpflanzen sowie unterschiedliche pflanzliche Zielstrukturen davon wohlbekannt.
  • Der Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass die Wahl der Einbringungsart u. a. von der entsprechenden pflanzlichen Zielzelle sowie dem einzubringenden Konstrukt abhängen kann, weshalb je nach Zielzelle eine andere Einbringungsart erforderlich sein kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgt die Einbringung der erfindungsgemäßen Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukte durch eine Kombination der oben genannten Einbringungsmethoden. So kann beispielsweise ein viraler Vektor, welcher das mindestens eine rekombinante Konstrukt von Interesse enthält, durch Agrobacterium tumefaciens als weiteren Vektor, oder etwa durch Partikel-Beschuss oder Mikroinjektion, in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht werden.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden spezielle Verfahren zur Einbringung von Vektoren und/oder rekombinanten Konstrukten gemäß der vorliegenden Erfindung in meristematische Pflanzenzellen und -gewebe offenbart. Für die Transformation oder Transfektion meristematischer Zellen und Gewebe ist deren Zugänglichkeit ein entscheidender Faktor, wobei sich die Zugänglichkeit der unterschiedlichen pflanzlichen Meristemtypen in den verschiedenen Entwicklungsstadien einer Pflanze erheblich unterscheiden.
  • In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Bereitstellung einer pflanzlichen Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, offenbart, wobei in die pflanzliche Zielstruktur mindestens ein rekombinantes Konstrukt gemäß der vorliegenden Offenbarung eingebracht werden kann. Das Verfahren gemäß dieser Ausführungsform umfasst als entscheidenden Schritt das Zugänglichmachen einer meristematischen Struktur von Interesse, welche noch nicht ausdifferenzierte meristematische Zellen umfasst. Handelt es sich bei der pflanzlichen Zielstruktur um Meristeme im Embryo, ist es wesentlich, einen pflanzlichen Embryo der richtigen Größe zu wählen und die tieferen, d. h. im Inneren liegenden, meristematischen Zellen als Ziel einer Transformation oder Transfektion mit mindestens einem rekombinanten Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung anzusteuern, da die in den äußeren Schichten befindlichen meristematischen Zellen bereits einen gewissen Grad der Differenzierung erreicht haben können und somit nicht mehr gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Vorzugsweise sind die pflanzlichen Embryonen hinsichtlich ihrer Größe so auszuwählen, dass sie mit einem exponierteren Meristem ausgestattet sind. Für Maisembryonen bedeutet das, dass Embryonen von weniger als 1,5 mm maximalen Durchmesser, bevorzugt von weniger als 1 mm maximalen Durchmesser, besonders bevorzugt von weniger als 0,7 mm maximalen Durchmesser und ganz besonders bevorzugt von weniger als 0,5 maximalen Durchmesser in vorteilhafter Weise erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Eine meristematische Zelle im Sinne der vorliegenden Erfindung ist somit eine meristematische Zelle, deren Differenzierungsgrad es noch gestattet, dass aus der Zelle nach er gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Region von Interesse noch alle gewünschten Typen von Pflanzenzellen, insbesondere solche Typen, aus welchen direkt oder indirekt eine fertile Pflanze regeneriert werden kann, entstehen können.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Bereitstellung einer pflanzlichen Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, in die mindestens ein rekombinantes Konstrukt gemäß der vorliegenden Offenbarung eingebracht werden kann, offenbart, wobei es sich bei der meristematischen Zelle um eine Zelle eines Keimlings oder einer älteren Pflanze handelt.
  • Gemäß dieser Ausführungsform muss das Meristem vollständig oder nahezu vollständig freipräpariert werden. Zudem muss beachtet werden, dass die tiefer liegenden, d. h. im Inneren liegenden, meristematischen Zellen als Ziel einer Transformation oder Transfektion mit mindestens einem rekombinanten Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung angesteuert werden, da die in den äußeren Schichten befindlichen meristematischen Zellen bereits einen gewissen Grad der Differenzierung erreicht haben können und somit nicht mehr gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Gemäß dieser Ausführungsform sind die freigelegten Meristeme einer Oxidation ausgesetzt. Um eine Schädigung der meristematischen Zellen zu verhindern, werden daher vorzugsweise geeignete antioxidative Schutzmaßnahmen angewendet, wie z. B. der Einsatz eines Anti-Oxidationsmittels oder weiterer schützender Maßnahmen, um eine weitere Entwicklung der pflanzlichen Zielstruktur umfassend mindestens eine meristematische Zelle, zu gewährleisten.
  • Sequenzprotokoll – freier Text
  • Die folgenden Angaben geben die deutsche Übersetzung der im Sequenzprotokoll als freier Text (Numerische Kennzahl <223>) enthaltenen Angaben, jeweils aufgeführt für die entsprechende Sequenzkennzahl, wieder.
  • Figure DE102015006335A1_0002
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden, nicht als limitierend anzusehenden, Beispiele erläutert.
  • Beispiel 1: Herstellung von CRISPR/Cas-Konstrukten
  • Die Erstellung der Konstrukte erfolgt auf Grundlage der Publikation von Mali et al. 2003. Die Promotoren wurdengezielt gegen spezifische pflanzliche Promotoren ersetzt und die gRNA den jeweiligen Zielgenen angepasst.
  • Konstrukte für monolotyledone Pflanzen:
  • Als Promotoren wurden unter anderem der Mais-Ubi-Intron Promotor (SEQ ID NO: 7), der Mais U3 Promotor (SEQ ID NO: 10), der Weizen U6 Promotor (SEQ ID NO: 8), der Reis U3 Promotor (SEQ ID NO: 9) und der Brachipodium EF1 Promotor (SEQ ID NO: 40) verwendet. Ein beispielhaftes verwendetes Konstrukt hat die SEQ ID NO: 23 (Vektor1_TaU6 standard).
  • Konstrukte für dicotyledone Pflanzen:
  • Hier wurden als Promotoren ein Parsley-Ubi4 (SEQ ID NO: 5) und ein Arabidopsis U6 Promotor (SEQ ID NO: 6) verwendet. Ein beispielhaftes verwendetes Konstrukt hat die SEQ ID NO: 24 (Vektor1_ZmU3 standard).
  • Die unterschiedlichen gRNAs wurden für die jeweiligen Zielgene spezifisch erstellt und in die entsprechende Position in den oben angegebenen Vektoren kloniert. Die Position der gRNA Sequenz entspricht den als „n” gekennzeichneten Nukleotiden in SEQ ID NOs: 23 und 24.
  • Beispiel 2: Einbringung von CRISPR/Cas-Konstrukten
  • Die oben in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukte wurden mittels unterschiedlicher Methoden in die Meristeme eingebracht. Grundlage dafür ist die Zugänglichkeit der Meristeme, die abhängig von dem verwendeten Material durch unterschiedliche Methoden gewährleistet wurde (siehe Beispiel 4)
  • Folgende Methoden wurden verwendet:
  • – Partikel-Beschuss:
  • Partikel-Beschuss kann bei allen verwendeten Meristemen angewendet werden. Es wird mit dsPlasmid-DNA, linearer dsDNA, RNA und Protein beschossen. Als Trägermaterial können Gold und Wolfram verwendet werden. Als Test wurden Beschösse von Embryo-Meristemen ( ) und „Tassel”-Meristemen ( ) gemacht, Mit Hilfe des rot fluoreszierenden Proteins konnte nachgewiesen werden, dass es möglich ist, DNA durch Partikel-Beschuss in diese Zellen einzubringen.
  • – Mikroinjektion:
  • Die Mikroinjektion kann bei allen Meristemen stattfinden, vorzugsweise unter Verwendung eines Mikroskops mit Mikromanipulator. Auf Grund der Größe bestimmter Meristemstrukturen wie präparierten „Tassel”- und „Ear”-Meristemen kann diedie Mikroinjektion aber auch unter mikroskopischer Kontrolle durchgeführt werden. Die Injektion kann über unterschiedliche Methoden stattfinden und wie schon beim Partikel-Beschuss (Beispiel 1) angegeben mit unterschiedlichen Molekülen. Zum einen werden dsPlasmid-DNA, linearer dsDNA, RNA und Protein in flüssiger Lösung durch eine Mikro- oder Nano-Kanüle in die meristematischen Zellen injiziert, zum anderen werden dsPlasmid-DNA, linearer dsDNA, RNA und Protein auf Mikro- oder Nano-Nadeln aufgebracht und durch anstechen der meristematischen Zellen mit den Nadeln übertragen.
  • Beispiel 3: Transiente meristematische Transformation von Maiskeimlingen und/oder Embryonen/erfindungsgemäße Behandlung der meristematischen Gewebe
  • Die Zugänglichkeit der Meristeme in den einzelnen Stadien unterscheidet sich erheblich. So sind im Embryo (1 und 2) die Meristeme relativ gut zugänglich, vorausgesetzt man verwendet Embryonen der richtigen Größe. Wichtig ist es, die tiefer gelegenen Zellen der Meristeme zu transformieren, da die oberen Zellen bereits eine gewisse Differenzierung durchlaufen haben und nicht mehr geeignet sind.
  • Meristeme in Keimlingen und älteren Pflanzen müssen vollständig frei präpariert werden, da sie schon von so vielen Schichten Gewebe umgeben sind, dass sie nicht für einen Beschuss oder eine Mikroinjektion zugänglich sind. 3 und 4 zeigen die präparierten Meristeme, die für die Transformation verwendet werden können. Auch hier gilt wie bei den Embryo-Meristemen, dass die oberen Zellen bereits eine gewisse Differenzierung durchlaufen haben und nicht mehr geeignet sind. Es müssen also die Zellen weiter innen in den Meristemen transformiert werden. Da die isolierten Meristeme frei liegen und dadurch einer starken Oxidation und eines daraus resultierenden Absterben ausgesetzt sind, wurden sie mit einem Anti-Oxidationsmittel, um eine weitere Entwicklung des Keimlings zur Pflanze zu ermöglichen.
  • Um die „Tassel”-Meristeme zugänglich zu machen, haben wir eine Methode entwickelt um die Pflanze und die Meristeme möglichst wenig zu schädigen. Dazu wird auf der Höhe der „Tassel”-Meristeme eine Art Fenster durch die Blätter hindurch geschnitten (6). Dies gewährleistet, dass die Blätter nicht absterben und sich die Pflanze ganz normal weiterentwickelt und, dass das Meristem von den restlichen Blättern geschützt bleit.
  • Zusätzlich schiebt das Meristem sehr zügig (innerhalb weniger Stunden/Tage) weiter nach oben, so dass es dann wieder vollständig geschützt ist. Dies reduziert die Wahrscheinlichkeit eines Oxidierens und damit eines Absterben des Meristems.
    • – Die Transfektion findet dann mittels der oben angegebenen Methoden (s. Beispiel 2) statt. Die Embryonen keimen aus und Pflanzen werden kultiviert bis zur Selbstung und Ernte. Vergleichbar bei den Keimlingen und den adulten Pflanzen, nur ohne Keimung.
  • Beispiel 4: Nachweis der erfolgten gezielten gentechnischen Veränderung
  • Der Nachweis ist über unterschiedliche Verfahren und zu unterschiedlichen Zeitpunkten möglich:
    Die Anwesenheit der gewünschten gezielten Veränderung einer Nukleinsäure-Zielregion kann in frühen Phasen des Keimlings, der sich entwickelnden Pflanzen und der Pollen analysiert werden, so dass man bereits Hinweise auf die erfolgten Mutationen erhält. Ein eindeutiges Ergebnis erhält man aber nur, wenn man die Nachkommen der Selbstung analysiert, da dies den Nachweis für eine vererbte Mutation erbringt.
  • – Enrichment PCR:
  • Diese Methode kommt zur Anwendung, wenn durch die gezielte Mutation eine Restiktionsenzymschnittstelle zerstört wird. Man verdaut dann isolierte genomische oder extrachromosomale DNA mit dem Enzym, welches an dieser Stelle schneidet, so dass Wildtyp-DNA geschnitten wird. Anschließend folgt eine PCR mit Primern die genomisch upstream und downstream der Restiktionsenzymschnittstelle liegen. Man bekommt im Idealfall also nur ein Produkt, wenn eine Mutation stattgefunden hat und die DNA an der Stelle nicht geschnitten wurde. Da der Verdau der genomischen oder der extrachromosomalen DNA in der Regel nicht 100% ist, wird das erhaltene PCR-Amplifikat erneut mit dem Enzym verdaut um sicher zustellen, dass eine Mutation stattgefunden hat und die Restiktionsenzymschnittstelle mutiert ist. Die unverdauten Fragmente werden anschließen kloniert und sequenziert, um eine genaue Analyse der Mutation durchzuführen. Sollte die Nukleinsäure-Zielregion eine RNA sein, kann diese zunächst durch dem Fachmann bekannte Verfahren in DNA umgeschrieben werden, bevor eine Enrichment PCR erfolgt.
  • – Sequenzierung:
  • Sollte eine Enrichment PCR nicht möglich sein, wird über einen Next Generation Sequencing(NGS)-Ansatz die spezifische Region sequenziert und die erhaltenen Sequenzen hinsichtlich ihrer Mutationen untersucht.
  • – Sequenzierung ganzer Genome (WGS) zur Identifikation von Off-Target Effekten:
  • Um auszuschließen, dass es zu unerwünschten Mutationen gekommen ist, wird von den Kandidaten mit den gewünschten Mutationen eine WGS durchgeführt.
  • Zusätzliche Analysen sind der Abwesenheits-Nachweis von den verwendeten Konstrukten und Viren mittels spezifischer PCR- und qPCR-Systeme.
  • Beispiel 5: Virale Vektoren
  • Viren bieten den Vorteil, dass sie als fertige Viruspartikel, aber auch als DNA oder RNA in eine pflanzliche Zielstruktur eingebracht werden können. Zusätzlich bieten sie die Möglichkeit der Ausbreitung in den Zellen, falls diese Funktion durch die Modifikation ihrer RNA/DNA-Sequenz nicht zerstört wurde. Dies hat den Vorteil, dass man zum einen nicht direkt das Meristem infizieren muss, oder es ausreichen kann, nur wenige Zellen zu infizieren und es trotzdem zur Ausbreitung in mehrere Zellen- oder Gewebetypen kommt. Zusätzlich bieten DNA-Viren den Vorteil, eine große Menge an DNA-Templates für die HR zur Verfügung zu stellen.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 8697359 B1 [0009]
    • WO 2015/026885 A1 [0010]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
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    • Mali et al. 2003 [0126]

Claims (15)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle, umfassend die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen einer pflanzlichen Zielstruktur, welche mindestens eine meristematische Zelle umfasst, wobei die mindestens eine meristematische Zelle mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion umfasst; (ii) Bereitstellen mindestens einer gRNA oder Bereitstellen eines oder mehrerer rekombinanten Konstrukts/Konstrukte, wobei das bzw. die rekombinante(n) Konstrukt(e) (a) mindestens eine gRNA oder eine für eine gRNA kodierende Sequenz, und (b) optional mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz umfasst, und Bereitstellen mindestens einer Cas-Nuklease und/oder einer Effektor-Domäne oder Bereitstellen eines oder mehrerer rekombinanten Konstrukts/Konstrukte, wobei das bzw. die rekombinanten) Konstrukt(e) (a) mindestens eine Cas-Nuklease oder eine für eine Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder mindestens eine Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz, und (b) optional mindestens eine regulatorische Sequenz und/oder eine Lokalisationssequenz umfasst, wobei die gRNA dazu in der Lage ist, sowohl an einen Abschnitt der Nukleinsäure-Zielregion zu hybridisieren als auch mit der Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne zu interagieren; wobei wenn die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz durch ein oder mehrere rekombinante Konstrukts/Konstrukte bereitgestellt werden, die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder die für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz auf oder in dem gleichen, oder auf oder in unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten lokalisiert sind; (iii) Einbringen der gRNA, der Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne oder des bzw. der rekombinanten Konstrukts/Konstrukte in die pflanzliche Zielstruktur; (iv) Kultivieren der pflanzlichen Zielstruktur unter Bedingungen, welche die Aktivierung der eingeführten gRNA, Cas-Nuklease und/oder der Effektor-Domäne oder des bzw. der eingeführten rekombinanten Konstrukts/Konstrukte und dadurch eine gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur gestatten, um eine pflanzliche Zielstruktur, umfassend mindestens eine meristematische Zelle, die die gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion umfasst, zu erhalten; (v) Gewinnen einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder einer pflanzlichen Zelle aus der gezielt veränderten mindestens einen meristematischen Zelle, wobei die Pflanze, das Pflanzenmaterial oder die pflanzliche Zelle direkt durch Zellteilung und Differenzierung und optional einer Fremdbefruchtung oder Selbstung aus der gezielt veränderten mindestens einen meristematischen Zelle gewonnen wird, und wobei die gewonnene Pflanze, das Pflanzenmaterial oder die pflanzliche Zelle die gezielte Veränderung der Nukleinsäure-Zielregion umfasst.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in der Pflanze, dem Pflanzenmaterial oder der pflanzlichen Zelle aus Schritt (v) das bzw. die rekombinanten) Konstrukt(e), welche (a) mindestens eine gRNA oder eine für eine gRNA kodierende Sequenz, oder (b) mindestens eine Cas-Nuklease oder eine für eine Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder mindestens eine Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz umfassen, nicht chromosomal oder extrachromosomal integriert werden/sind.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt (ii) die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz und/oder die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz und/oder die Effektor-Domäne oder eine für eine Effektor-Domäne kodierende Sequenz auf die Anwendung in einer pflanzlichen Zelle hin angepasst sind.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zwischen Schritt (ii) und (iii) das Bereitstellen mindestens eines Vektors zur Einbringung des bzw. der rekombinanten Konstrukts/Konstrukte erfolgt.
  5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zwischen Schritt (ii) und (iii) das Bereitstellen mindestens eines weiteren rekombinanten Konstrukts umfassend einen rekombinanten Nukleinsäure-Abschnitt zur gezielten Homologie-gerichteten Reparatur der Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur oder Insertion in die Nukleinsäure-Zielregion in der pflanzlichen Zielstruktur und optional mindestens eines weiteren Vektors zur Einbringung des mindestens einen weiteren rekombinanten Konstrukts erfolgt.
  6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die meristematische Zelle eine reife oder unreife pflanzliche Zelle eines pflanzlichen Embryos oder eines Keimlings oder einer Pflanze, umfassend mindestens eine meristematische Zelle oder meristematisches Gewebe, ist.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die meristematische Zelle eine Zelle einer monokotyledonen oder einer dikotyledonen Pflanze ist.
  8. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Agrobacterium spp., einem Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen, oder einem Agens, das zur Transfektion einer Peptid- oder Polypeptidsequenz oder von Nukleinsäuresequenzen geeignet ist, oder einer Kombination davon.
  9. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die gRNA direkt als natürliche oder synthetische Nukleinsäure und/oder die Cas-Nuklease direkt als Polypeptid und/oder die Effektor-Domäne direkt als Nukleinsäure oder Polypeptid in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht wird.
  10. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die gRNA oder die die gRNA kodierende Sequenz oder die Cas-Nuklease oder die die Cas-Nuklease kodierende Sequenz oder die Effektor-Domäne oder die die Effektor-Domäne kodierende Sequenz zusätzlich eine Lokalisationssequenz umfasst, ausgewählt aus einer Kernlokalisationssequenz, einer Plastidenlokalisationssequenz, vorzugsweise einer Mitochondrienlokalisationssequenz und einer Chloroplastenlokalisationssequenz.
  11. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zusätzlich ein Inhibitor des endogen non-homologous end joining (NHEJ) Reperaturmechanismus in die pflanzliche Zielstruktur eingebracht wird.
  12. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Konstrukt ausgewählt ist aus SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen.
  13. Pflanze, Pflanzenmaterial oder pflanzliche Zelle, erhältlich oder erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.
  14. Rekombinantes Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus SEQ ID NOs: 23 und 24, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu den vorgenannten Sequenzen.
  15. Verwendung mindestens eines rekombinanten Konstrukts gemäß Anspruch 14 oder eines Vektors, umfassend eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 12–15 und 25–38, sowie Sequenzen mit mindestens 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzhomologie zu diesen Sequenzen zur gezielten Veränderung mindestens einer Nukleinsäure-Zielregion in einer pflanzlichen Zielstruktur, welche mindestens eine meristematische Zelle umfasst, wobei die mindestens eine meristematische Zelle mindestens eine Nukleinsäure-Zielregion umfasst.
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