DE102015004187A1 - Male sterile plant of the genus Triticum - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum, deren sämtliche Allele des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens inaktiviert sind, und Teile, Samen und Nachkommen davon, sowie Nukleinsäuren, Vektoren und transgene Pflanzen, Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, Verfahren zur Restauration einer Fertilität und Verfahren zum Nachweis.The present invention relates to a male sterile plant of the genus Triticum, whose alleles of the gene coding for tapetal development and function (TDF) are inactivated, and parts, seeds and progeny thereof, as well as nucleic acids, vectors and transgenic plants, processes for the production of plants , Method of Restoring Fertility and Method of Detection.

Description

Die Erfindung betrifft eine männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum, in der sämtliche Allele des für das Protein tapetal development and function (TDF) codierenden Gens inaktiviert sind. Desweiteren betrifft die Erfindung Nachkommen dieser Pflanze sowie Teile und Samen dieser Nachkommen, die ein inaktiviertes TDF-Gen enthalten.The invention relates to a male-sterile plant of the genus Triticum in which all the alleles of the gene encoding the protein tapetal development and function (TDF) are inactivated. Furthermore, the invention relates to progeny of this plant and parts and seeds of these progeny, which contain an inactivated TDF gene.

Hybriden zeigen in der Regel deutlich höhere Erträge als Liniensorten, so dass bei zahlreichen Kulturpflanzen die Hybridzüchtung für die Sortenentwicklung genutzt wird. Die kommerzielle Nutzung von Hybridweizen/Hybriden der Gattung Triticum (Weizen) ist sehr begrenzt, da alle zur Zeit zur Verfügung stehenden Systeme mit erheblichen, technischen Problemen zu kämpfen haben.Hybrids generally show significantly higher yields than line varieties, so that in many crops hybrid breeding is used for variety development. The commercial use of hybrid wheat / hybrids of the genus Triticum (wheat) is very limited as all currently available systems are struggling with significant technical problems.

Voraussetzung für die Entwicklung von Hybridsorten ist die Verfügbarkeit von männlich sterilen Linien, um die Befruchtung gezielt steuern zu können.The prerequisite for the development of hybrid varieties is the availability of male sterile lines to be able to control fertilization in a targeted manner.

Häufig werden hierzu sogenannte CMS-Linien verwendet, die eine Mutation im mitochondrialen Genom aufweisen, was zu einer cytoplasmatisch bedingten, männlichen Sterilität (CMS) führt. Da diese Linien keinen Pollen mehr produzieren, können sie gezielt mit Pollen einer anderen Linien bestäubt werden, so dass auf den CMS-Linien das Hybridsaatgut geerntet werden kann.Frequently used for this purpose are so-called CMS lines which have a mutation in the mitochondrial genome, which leads to a cytoplasmic male sterility (CMS). Since these lines no longer produce pollen, they can be pollinated with pollen from other lines, so that the hybrid seeds can be harvested on the CMS lines.

Ein Problem stellt die Erhaltung und Vermehrung der CMS-Linien dar, da diese nicht durch Selbstbestäubung vermehrt werden können. Für die Erhaltung dieser Linien benötigt man daher sogenannte Maintainer-Linien. Diese Linien sind im Kerngenom genetisch identisch mit der männlich sterilen Linie, jedoch tragen sie nicht die mitochondriale Mutation, so dass diese Linien fertil sind. Durch Nutzung dieser Maintainer-Linie als Vater und der CMS-Linie als Mutter kann auf den Mutterpflanzen Saatgut erhalten werden, welches weiterhin steril ist, da der Sterilitätsphänotyp ausschließlich maternal vererbt wird.One problem is the preservation and propagation of the CMS lines, since these can not be increased by self-pollination. For the maintenance of these lines you need so-called maintainer lines. These lines are genetically identical to the male sterile line in the nuclear genome, but they do not carry the mitochondrial mutation, so these lines are fertile. By using this maintainer line as father and the CMS line as mother, seed can be obtained on the mother plants, which is still sterile, as the sterility phenotype is only inherited maternally.

Diese maternale Vererbung bedingt aber auch, dass das Hybridsaatgut von CMS-Linien immer im Sterilitätsplasma vorliegt und somit männlich sterile Pflanzen hervorbringt. Bei Kulturpflanzen, in denen das Ernteprodukt ein vegetatives Organ ist, z. B. Zuckerrübe ist dies kein Problem. Bei Kulturarten, bei denen Saatgut das Ernteprodukt ist, muss durch Einfügen eines sogenannten Restorergens die Fertilität der Hybride wiederhergestellt werden. Das Restorergen ist kerncodiert und ist in der Lage die durch die Mutation im Mitochondrium hervorgerufenen Defekte in der Entwicklung der männlichen Blütenorgane zu kompensieren, und somit die Fertilität wiederherzustellen. Häufig ist es schwer, gut wirksame Restorergene zu identifizieren und für die Züchtung zu nutzen.However, this maternal inheritance also requires that the hybrid seed of CMS lines always be present in the sterility plasma and thus produce male sterile plants. In crops in which the harvested product is a vegetative organ, e.g. For example, sugar beet is not a problem. For crops where seed is the harvest product, the incorporation of a so-called restorer gene must restore the fertility of the hybrids. The restorer gene is nuclear-encoded and is able to compensate for the defects in the development of the male flower organs caused by the mutation in the mitochondrion, and thus to restore fertility. Often it is difficult to identify and use efficient restorer genes for breeding.

Die bekannten, CMS-basierten Systeme sind in Weizen aufgrund der schwierigen Saatgutproduktionen (CMS-Linie; Maintainer-Linie; Restorerlinie) zu kostenintensiv, so dass eine kommerzielle Anwendung der Systeme in der Vergangenheit gescheitert ist.The known, CMS-based systems are too expensive in wheat due to the difficult seed productions (CMS line, maintainer line), so that a commercial application of the systems has failed in the past.

In geringem Maßstab werden alternativ Gametozide kommerziell genutzt: Durch Applikation einer chemischen Substanz wird die Entwicklung der männlichen Blütenorgane gestört, so dass es zu einer männlichen Sterilität kommt. Das Problem hierbei ist jedoch das enge Ausbringungsfenster des Gametozids im Feld. Durch ungeeignete Wetterbedingungen kann die Applikation des Gametozids verhindert werden, was somit zu einem Totalausfall der Hybridsaatgutproduktion führt ( Whitford et al., 2013 ).Gametocides are alternatively used commercially on a small scale: the application of a chemical substance disturbs the development of the male flower organs, resulting in male sterility. The problem here, however, is the narrow application window of the gametocide in the field. Due to unsuitable weather conditions the application of the gametocide can be prevented, which leads to a total loss of hybrid seed production ( Whitford et al., 2013 ).

Neben den CMS-basierten, männlich sterilen Phänotypen sind ferner Systeme bekannt, die auf Mutationen im Kerngenom basieren und eine sogenannte Genetic Male Sterility (GMS) hervorrufen. Solche Mutationen sind meist rezessiv, so dass der männlich sterile Phänotyp nur im homozygot, rezessiven Zustand ausgebildet wird. Dadurch ist eine einfache Restoration der Fertilität gegeben, da durch Einbringen eines nicht mutierten Allels des GMS-Gens (z. B. durch die Vaterpflanze bei der Hybridsaatgutproduktion) die männliche Sterilität wieder aufgehoben werden kann, und die Hybriden somit voll fertil sind.In addition to the CMS-based, male-sterile phenotypes, systems are also known that are based on mutations in the nuclear genome and cause genetic male sterility (GMS). Such mutations are usually recessive, so that the male sterile phenotype is formed only in the homozygous, recessive state. This provides a simple restoration of fertility, since male sterility can be reversed by introducing an unmutated allele of the GMS gene (eg, by the parent plant in hybrid seed production) and the hybrids are thus fully fertile.

Das Problem liegt allerdings auch hier in der Erhaltung und Vermehrung der männlich sterilen Linien ( Kempe und Gils, 2011 ). Durch Kreuzung der sterilen GMS-Linien mit Pollen einer heterozygoten Mutante werden in der Nachkommenschaft immer nur maximal 50% der Nachkommen steril sein. Der sterile Phänotyp ist allerdings erst zum Zeitpunkt der Blüte festzustellen. Somit können GMS-Linien normalerweise nicht für die großflächige Produktion von Hybriden eingesetzt werden.However, the problem here is the preservation and propagation of male sterile lines ( Kempe and Gils, 2011 ). By crossing the sterile GMS lines with pollen from a heterozygous mutant, only a maximum of 50% of the offspring will be sterile in offspring. However, the sterile phenotype can only be determined at the time of flowering. Thus, GMS lines can not normally be used for the large-scale production of hybrids.

Die Nutzung von GMS-Linien ist nur dann möglich, wenn zu einem sehr frühen Zeitpunkt in der Entwicklung der Pflanzen eine Unterscheidung zwischen homozygot sterilen und heterozygot-fertilen Pflanzen möglich ist. Im Idealfall ist diese Unterscheidung bereits am Samen erkennbar. Um genetische Analysen in einem frühen Stadium der Pflanzenentwicklung, also vor Beginn der Blütenentwicklung, durchführen zu können, ist es jedoch zwingend notwendig, die Position der Mutation im Kerngenom der männlich sterilen Linie sowie die Sequenz des mutierten Gens zu kennen, um entsprechende DNA-Marker darauf anwenden zu können. Mit Hilfe dieser Marker ist es dann möglich sein, bereits an sehr jungen Sämlingen oder in einem noch früheren Stadium Untersuchungen durchzuführen, auf deren Grundlage die fertilen Pflanzen verworfen und die sterilen Pflanzen für die Hybridsaatgutproduktion genutzt werden könnten. The use of GMS lines is only possible if a distinction between homozygous sterile and heterozygous fertile plants is possible at a very early stage in the development of the plants. Ideally, this distinction is already evident in the seed. However, in order to be able to carry out genetic analyzes at an early stage of plant development, ie before the start of flower development, it is absolutely necessary to know the position of the mutation in the nuclear genome of the male sterile line as well as the sequence of the mutated gene in order to obtain corresponding DNA markers to apply to it. With the help of these markers, it will then be possible to carry out investigations already on very young seedlings or at an even earlier stage, on the basis of which the fertile plants could be discarded and the sterile plants used for hybrid seed production.

US 2006288440 A1 offenbart ein System zur Nutzung von kerncodierter, männlicher Sterilität für Mais. Das System mit dem Namen SEED PRODUCTION TECHNOLOGY (SPT) basiert darauf, dass eine sterile Maismutante, deren Sterilität durch eine Mutation in einem bekannten, kerncodierten Gen verursacht wird, durch Einfügen eines Transgens restauriert werden kann. Das Transgen enthält dabei das nicht mutierte Allel des Sterilitäts- bzw. Fertilitätsgens, so dass das Transgen als Wildtyp-Allel fungiert. Das Fertilität restaurierende Transgen ist genetisch gekoppelt mit einem weiteren Transgen, welches die Weitergabe des Transgens über den Pollen verhindert (Pollenkiller). Dadurch entsteht bei Selbstbefruchtungen der transgenen Linie nur Saatgut, das hemizygot für das die Fertilität wiederherstellende Transgen ist. Für das Transgen homozygotes Saatgut kann nicht gebildet werden. Dies ist sehr wichtig für die Effizienz des Systems, da der Maintainer nur im hemizygoten Zustand sowohl fertiles, transgenes Saatgut als auch steriles, nicht transgenes Saatgut nach Selbstbefruchtung erzeugen kann. Liegt das Transgen hingegen im homozygoten Zustand vor, würden alle Nachkommen wieder fertil sein. Das Transgen enthält des Weiteren eine Expressionskassette, die zur Rotfluoreszenz der Samen führt. Somit lassen sich transgene von nicht transgenen Samen einfach unterscheiden. Da die transgenen Samen fertil sind, kann auf Basis der Fluoreszenz auch eine Separierung in fertile und sterile Pflanzen stattfinden. Durch Aussaat der nicht transgenen Samen erhält man somit die für die Hybridproduktion notwendigen Mutterpflanzen, die transgenen Samen können zum einen als Vaterlinie für die weitere Vermehrung der Mutterlinie verwendet werden (Maintainerlinie) und auch durch einfache Selbstung vermehrt werden ( Whitford et al., 2013 ). US 2006288440 A1 discloses a system for using nuclear-encoded male sterility for corn. The system, named SEED PRODUCTION TECHNOLOGY (SPT), is based on the idea that a sterile corn mutant whose sterility is caused by a mutation in a known nuclear-encoded gene can be restored by inserting a transgene. The transgene contains the non-mutated allele of the sterility or fertility gene, so that the transgene acts as a wild-type allele. The fertility-restoring transgene is genetically linked to another transgene that prevents transmission of the transgene via the pollen (pollen killer). This results in self-fertilization of the transgenic line only seed which is hemizygous for the fertility-restoring transgene. For the transgene homozygous seed can not be formed. This is very important for the efficiency of the system, as the maintainer can produce only fertile, transgenic seeds as well as sterile, non-transgenic seeds after self-fertilization only in the hemizygous state. On the other hand, if the transgene is homozygous, all offspring will be fertile again. The transgene further contains an expression cassette which leads to red fluorescence of the seeds. Thus, transgenic can be easily distinguished from non-transgenic seeds. Since the transgenic seeds are fertile, it is also possible to separate them into fertile and sterile plants on the basis of fluorescence. By sowing the non-transgenic seeds, one thus obtains the mother plants necessary for the hybrid production, the transgenic seeds can be used as a paternal line for the further propagation of the maternal line (maintainer line) and also be propagated by simple selfing ( Whitford et al., 2013 ).

Das SPT System kann theoretisch in allen Pflanzenarten angewandt werden. Voraussetzung ist jedoch das Vorhandensein einer GMS-Linie sowie die Kenntnis über die Struktur desjenigen Gens, welches infolge einer Mutation die männliche Sterilität verursacht und somit für den GMS-Phänotyp verantwortlich ist.The SPT system can theoretically be applied in all plant species. The prerequisite, however, is the presence of a GMS line and the knowledge about the structure of the gene which causes male sterility as a result of a mutation and is therefore responsible for the GMS phenotype.

Für Weizen sind kerncodierte Sterilitätssysteme auf Basis des Genlocus MS1 (Cornerstone) entwickelt worden ( Zhou et al., 2006 ). Die Restaurierung der Fertilität erfolgt hier durch ein Extra-Chromosom, welches aus Agropyron elongatum stammt. Gleichzeitig vererbt das Extra-Chromosom einen Genlocus, der zur Blaufärbung des Aleurons führt, so dass hier eine frühzeitige Unterscheidung von sterilen und fertilen Pflanzen anhand der Samenfärbung möglich ist ( Whitford et al., 2013 ). Obwohl verstanden ist, dass der männlich sterile Phänotyp in der Cornerstone-Mutante durch eine Deletion im kurzen Arm des Chromosoms 4B zustande kommt, konnte das verantwortliche Gen bislang noch nicht identifiziert und kloniert werden. Es ist nicht auszuschließen, dass nicht nur ein Gen innerhalb der Deletion für die Ausprägung des männlich sterilen Phänotyps verantwortlich ist, sondern dass die Kombination der Entfernung mehrerer Gene zu der männlichen Sterilität führt. Inwieweit ein derartiger Locus dann für die Anwendung in einem SPT-ähnlichen System angewendet werden kann, muss erst noch experimentell gezeigt werden.For wheat, nuclear-encoded sterility systems based on the gene locus MS1 (Cornerstone) have been developed ( Zhou et al., 2006 ). Restoration of fertility is achieved by an extra chromosome derived from Agropyron elongatum. At the same time, the extra chromosome passes on a gene locus that causes the blue stain of the aleurone, so that an early differentiation of sterile and fertile plants based on seed colouration is possible ( Whitford et al., 2013 ). Although it is understood that the male sterile phenotype in the Cornerstone mutant is due to a deletion in the short arm of chromosome 4B, the responsible gene has not yet been identified and cloned. It can not be ruled out that not only one gene within the deletion is responsible for the expression of the male sterile phenotype, but that the combination of the removal of several genes leads to male sterility. The extent to which such a locus can then be applied for use in a SPT-like system has yet to be demonstrated experimentally.

Neben dem MS1-Locus sind weitere genomische Loci im Weizen bekannt, die zu männlicher Sterilität führen ( Whitford et al., 2013 ). Bisher konnte jedoch noch in keinem Fall das für die Sterilität verantwortliche Gen identifiziert und kloniert werden.In addition to the MS1 locus, other genomic loci are known in wheat that lead to male sterility ( Whitford et al., 2013 ). So far, however, the gene responsible for sterility has never been identified and cloned.

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum zur Verfügung zu stellen, deren Sterilität kerncodiert ist.It is therefore the object of the present invention to provide a male sterile plant of the genus Triticum, whose sterility is nuclear-encoded.

Die Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.The object is solved by the subject of the claims.

Die vorliegende Erfindung stellt erstmals ein kloniertes Weizengen (TaTDF) zur Verfügung, dessen Inaktivierung zu einem männlich sterilen Phänotyp im Weizen führt. Die durch die Inaktivierung des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens erzeugte Mutante kann für die Entwicklung eines Hybridweizensystems genutzt werden.The present invention provides for the first time a cloned wheat gene (TaTDF) whose inactivation results in a male sterile phenotype in wheat. The mutant produced by the inactivation of the gene coding for tapetal development and function (TDF) can be used for the development of a hybrid wheat system.

Die bekannte, männlich sterile Arabidopsis-Mutante TDF1 (tapetal development and function 1), weist eine Mutation im AtMYB35-Gen auf. Ein bekanntes potentielles Homolog einer monocotyledonen Pflanze ist das Reis-Gen Os03g18480. Mutationen in LOC_Os03g18480, die im Reis zu einer männlichen Sterilität führen, sind jedoch nicht bekannt. The well-known, male sterile Arabidopsis mutant TDF1 (tapetal development and function 1) has a mutation in the AtMYB35 gene. A known potential homologue of a monocotyledonous plant is the rice gene Os03g18480. However, mutations in LOC_Os03g18480 that lead to male sterility in rice are not known.

Das TDF-Gen aus Weizen (TaTDF) zeigt zwar eine hohe Sequenzübereinstimmung mit dem Protein LOC_Os03g18480 aus Reis, welches wiederum die höchste Homologie zu AtMYB35 zeigt. Vergleicht man jedoch die Aminosäuresequenzen der drei Proteine, so fällt auf, dass die Homologie zwischen dem von AtMYB35 und von Os03g18480 codierten Protein überwiegend auf dem N-Terminus beschränkt ist, wohingegen der C-Terminus des Proteins kaum signifikante Homologien zeigt.Although the TDF gene from wheat (TaTDF) shows a high sequence identity with the protein LOC_Os03g18480 from rice, which in turn shows the highest homology to AtMYB35. However, comparing the amino acid sequences of the three proteins reveals that the homology between the protein encoded by AtMYB35 and Os03g18480 is predominantly confined to the N-terminus, whereas the C-terminus of the protein shows little significant homology.

Durch das von der vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellte Wissen über das für die Sterilität verantwortliche Gen in Weizen können sehr spezifische DNA-Marker entwickelt werden, die eine Unterscheidung von männlich sterilen und fertilen Pflanzen in einem sehr frühen Stadium ermöglichen. Dies ist insbesondere für den Züchtungsprozess für die Entwicklung von männlich sterilen Linien von Vorteil.The knowledge provided by the present invention of the sterility-responsive gene in wheat allows very specific DNA markers to be developed that allow discrimination of male sterile and fertile plants at a very early stage. This is particularly advantageous for the breeding process for the development of male sterile lines.

Gleichzeitig kann das Wissen über das Sterilitätsgen aber auch Anwendung finden bei der Unterscheidung von Samen, die sterile oder fertile Pflanzen hervorbringen. Dazu wird eine Gewebeprobe des Samens mittels Seed clipping Technologie abgenommen und mittels DNA Markern untersucht. Dadurch können die Samen sortiert werden in solche, die fertile bzw. solche, die sterile Pflanzen hervorbringen.At the same time, however, knowledge of the sterility gene may also find application in distinguishing seeds producing sterile or fertile plants. For this purpose, a tissue sample of the seed is removed by seed clipping technology and examined by DNA markers. This allows the seeds to be sorted into those producing fertile or those producing sterile plants.

Außerdem kann das klonierte Gen in einem SPT-ähnlichen Systems verwendet werden. Dieses System ermöglicht eine großflächige und damit kostengünstige Vermehrung der sterilen Linie und damit auch eine kostengünstige Hybridsaatgutproduktion. Die Etablierung des SPT-Systems in Weizen scheiterte bisher an der Verfügbarkeit eines klonierten Sterilitätsgens.In addition, the cloned gene can be used in a SPT-like system. This system allows a large-scale and therefore cost-effective increase in the sterile line and thus also a cost-effective hybrid seed production. The establishment of the SPT system in wheat has so far failed due to the availability of a cloned sterility gene.

Die vorliegende Erfindung betrifft folglich eine männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum, in der sämtliche Allele des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens (sämtliche TDF-Allele) inaktiviert sind.The present invention thus relates to a male sterile plant of the genus Triticum in which all alleles of the gene coding for tapetal development and function (TDF) (all TDF alleles) are inactivated.

Eine „Pflanze der Gattung Triticum” ist beispielsweise eine Pflanze ausgewählt aus einer der Spezies: Triticum aestivum, Triticum aethiopicum, Triticum antiquorum, Triticum baeoticum, Triticum carthlicum, Triticum compactum, Triticum dicoccoides, Triticum dicoccon, Triticum durum, Triticum ispahanicum, Triticum macha, Triticum monococcum, Triticum parvicoccum, Triticum × petropavlovskyi, Triticum polonicum, Triticum sinskajae, Triticum spelta, Triticum sphaerococcum, Triticum tetraurartu, Triticum timopheevii, Triticum turanicum, Triticum turgidum, Triticum urartu, Triticum vavilovii oder Triticum × zhukovskyi.For example, a "plant of the genus Triticum" is a plant selected from one of the species: Triticum aestivum, Triticum aethiopicum, Triticum antiquorum, Triticum baeoticum, Triticum carthlicum, Triticum compactum, Triticum dicoccoides, Triticum dicoccone, Triticum durum, Triticum ispahanicum, Triticum macha. Triticum monococcum, Triticum parvicoccum, Triticum × petropavlovskyi, Triticum polonicum, Triticum sinskajae, Triticum spelta, Triticum sphaerococcum, Triticum tetraurartu, Triticum timopheevii, Triticum turanicum, Triticum turgidum, Triticum urartu, Triticum vavilovii or Triticum × zhukovskyi.

Die Begriffe „männliche Sterilität”, „männlich steriler Phänotyp”, „männlich steril” oder vergleichbare Termini bezeichnen die Eigenschaft einer Pflanze, nur noch weniger als 20%, vorzugsweise weniger als 15% oder 10%, besonders bevorzugt weniger als 5% und ganz besonders bevorzugt keine (0%) fertilen Nachkommen durch Kreuzung mit einer fertilen Pflanze derselben Gattung im Vergleich mit einer normal fertilen Pflanze zu erzeugen, wobei die männlich sterile Pflanze in der Kreuzung als Vater eingesetzt wird und die normal fertile Pflanze, welche als Mutter in der Kreuzung eingesetzt wird, eine Pflanze desselben Genotyps wie die männlich sterile Pflanze ist, welche jedoch die genetische Modifikation wie beispielsweise Geninaktivierung oder Mutation, die die männliche Sterilität verursacht, nicht aufweist.The terms "male sterility", "male sterile phenotype", "male sterile" or comparable terms refer to the property of a plant, still less than 20%, preferably less than 15% or 10%, more preferably less than 5% and all particularly preferred to produce no (0%) fertile progeny by crossing with a fertile plant of the same genus in comparison with a normally fertile plant, the male sterile plant being used as a parent in the cross and the normally fertile plant being used as a mother in the Crossbred is a plant of the same genotype as the male sterile plant, but which does not have the genetic modification such as gene inactivation or mutation causing male sterility.

„Sämtliche Allele” bedeutet, dass alle Allele des TDF-Gens in allen Subgenomen des Weizens inaktiviert sind. Da Weizen über drei Subgenome verfügt (Subgenome A, B und D), sind insgesamt sechs Allele des TDF-Gens im Weizen vorhanden. Alle sechs Allele sind gemäß der Erfindung inaktiviert."All alleles" means that all alleles of the TDF gene are inactivated in all subgenomes of the wheat. Since wheat has three subgenomes (subgenomes A, B and D), a total of six alleles of the TDF gene are present in the wheat. All six alleles are inactivated according to the invention.

Die Begriffe „für tapetal development and function codierendes Gen”/„für TDF codierendes Gen” und „TDF-Gen” werden hierin synonym verwendet. Gemeint ist ein funktionelles TDF-Gen bzw. ein Allel davon. Letzteres kann auch als „aktives TDF-Gen” bzw. „aktives TDF-Allel” bezeichnet werden, in Abgrenzung zum „inaktivierten TDF-Gen” oder „inaktivierten TDF-Allel”.The terms "gene coding for tapetal development and function" / "gene coding for TDF" and "TDF gene" are used interchangeably herein. This refers to a functional TDF gene or an allele thereof. The latter can also be referred to as "active TDF gene" or "active TDF allele", in contrast to the "inactivated TDF gene" or "inactivated TDF allele".

Exemplarische genomische Sequenzen des Wildtyp Weizen-TDF-Locus aus einem Genotyp der Sorte Taifun sind in SEQ ID NOs: 1–3 gezeigt. SEQ ID NO: 1 stammt aus dem Subgenom A, SEQ ID NO: 2 stammt aus dem Subgenom B, und SEQ ID NO: 3 stammt aus dem Subgenom D. SEQ ID NOs: 4, 5 und 6 zeigen die entsprechenden Promotorsequenzen. In SEQ ID NOs: 7, 8 und 9 ist die cDNA-Sequenz der TDF-Gene aus den Weizen-Subgenomen A, B bzw. D gezeigt. Die Aminosäuresequenz des codierten TDF-Proteins ist in SEQ ID NO: 10 (Subgenom A), SEQ ID NO: 11 (Subgenom B) und SEQ ID NO: 12 (Subgenom D) wiedergegeben.Exemplary genomic sequences of the wild-type wheat TDF locus from a genotype of the typhoon variety are shown in SEQ ID NOs: 1-3. SEQ ID NO: 1 is from subgenome A, SEQ ID NO: 2 is from subgenome B, and SEQ ID NO: 3 is from subgenome D. SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 show the corresponding promoter sequences. In SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, the cDNA sequence of the TDF genes is off the wheat subgenomes A, B and D, respectively. The amino acid sequence of the encoded TDF protein is shown in SEQ ID NO: 10 (subgenome A), SEQ ID NO: 11 (subgenome B) and SEQ ID NO: 12 (subgenome D).

„Inaktiviertes TDF-Gen” oder „inaktiviertes TDF-Allel” bedeutet, dass die Funktion des TDF-Gens bzw. -Allels und/oder des TDF-Proteins inaktiviert ist (d. h. ausgeschaltet oder nicht mehr vorhanden) oder signifikant reduziert ist. Vorzugsweise ist die Funktion des TDF-Gens bzw. TDF-Allels und/oder des TDF-Proteins um mindestens 80%, oder mindestens 85% im Vergleich zum aktiven Gen/Allel/Protein reduziert. Besonders bevorzugt ist eine Reduzierung der Funktion um mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100% im Vergleich zum aktiven Gen/Allel/Protein. Die Funktion des TDF-Gens bzw. -Allels ist zum Beispiel signifikant reduziert, wenn die Expression des Gens nur 20% oder weniger, 15% oder weniger, 10% oder weniger, oder 5% oder weniger als die Expression eines aktiven Gens/Alles beträgt. Die Funktion des TDF-Proteins ist zum Beispiel signifikant reduziert, wenn das Proteins nur 20% oder weniger, 15% oder weniger, 10% oder weniger, oder 5% oder weniger der biologischen Aktivität eines aktiven Gens/Allels aufweist."Inactivated TDF gene" or "inactivated TDF allele" means that the function of the TDF gene and / or the TDF protein is inactivated (i.e., off or absent) or significantly reduced. Preferably, the function of the TDF gene or TDF allele and / or the TDF protein is reduced by at least 80%, or at least 85%, compared to the active gene / allele / protein. Particularly preferred is a reduction of the function by at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99% or 100% compared to the active gene / allele / protein. For example, the function of the TDF gene is significantly reduced if the expression of the gene is only 20% or less, 15% or less, 10% or less, or 5% or less than the expression of an active gene / all is. For example, the function of the TDF protein is significantly reduced if the protein has only 20% or less, 15% or less, 10% or less, or 5% or less of the biological activity of an active gene / allele.

Die Inaktivierung des TDF-Gens/-Allels bzw. TDF-Proteins hat zur Folge, dass die Pflanze, in der sämtliche Allele des für das TDF-Protein codierenden Gens inaktiviert vorliegen, männlich steril ist. Die männliche Sterilität lässt sich durch bekannte Verfahren überprüfen, beispielsweise durch den Anbau der Pflanze und morphologische Untersuchung der gebildeten Antheren auf makro- und mikroskopischer Ebene. Weiterhin können auch bekannte molekulare Analyseverfahren herangezogen werden, mit deren Hilfe für den Fall, dass die Inaktivierung aufgrund einer Mutation auf DNA-Ebene erfolgt, die molekulare Struktur dieser Mutation festgestellt werden kann. Führt die Mutation, beispielsweise eine Deletion oder Insertion von Nukleotiden, zu einer Leserasterverschiebung, kann der Fachmann Vorhersagen darüber treffen, ob eine männliche Sterilität in der Pflanze vorliegen wird. Im Fall einer Inaktivierung durch Inhibition des TDF-Gens/-Allels oder der TDF-Gene/-Allele über ein RNAi-vermitteltes Gene-Silencing oder einer Mutation/Deletion/Insertion im Genpromotor (zum Beispiel im Bereich des Minimalpromoters oder Transkriptionsstarts), sollte dies zu einer reduzierten Transkriptmenge führen. Hierbei sollten die Transkriptuntersuchungen dann vorzugsweise im von der Pflanze gebildeten Antherengewebe erfolgen, um verlässliche Vorhersagen über das Auftreten der männlichen Sterilität zu machen.Inactivation of the TDF gene / TDF protein results in that the plant in which all the alleles of the gene coding for the TDF protein are inactivated is male sterile. The male sterility can be checked by known methods, for example, by the cultivation of the plant and morphological examination of the anthers formed at the macro- and microscopic level. Furthermore, it is also possible to use known molecular analysis methods with the aid of which the molecular structure of this mutation can be ascertained in the event that the inactivation takes place due to a mutation on the DNA level. If the mutation, for example a deletion or insertion of nucleotides, results in frameshift, the skilled artisan can make predictions as to whether male sterility will be present in the plant. In the case of inactivation by inhibition of the TDF gene / allele or the TDF genes / alleles via RNAi-mediated gene silencing or mutation / deletion / insertion in the gene promoter (for example in the area of the minimal promoter or transcription start), should this lead to a reduced amount of transcript. In this case, the transcript examinations should then preferably take place in anther tissue produced by the plant in order to make reliable predictions about the occurrence of male sterility.

Desweiteren kann der Fachmann auch bei der Einfügung von Deletionen oder Insertionen in die Nukleotidsequenz des TaTDF Gens, die nicht zur Leserasterverschiebung führen aber zu einer Deletion und/oder Insertion von Aminosäuren in das TaTDF-Protein eine Vorhersage treffen, ob dies zu einer Inaktivierung des funktionalen Proteins und damit zur Ausbildung einer männlichen Sterilität führt. Eine derartige Vorhersage kann z. B. durch eine Proteinstrukturvorhersage mittels geeigneter Software getroffen werden.Furthermore, one skilled in the art can also predict the insertion of deletions or insertions into the nucleotide sequence of the TaTDF gene which will not result in frameshifting but deletion and / or insertion of amino acids into the TaTDF protein, if this results in inactivation of the functional Protein and thus leads to the development of a male sterility. Such a prediction may e.g. By protein structure prediction using appropriate software.

Das „aktive Gen/Allel” kann ein TDF-Wildtyp-Gen/-Allel meinen, wie es zum Beispiel in einer männlich fertilen Pflanze vorliegt. Vorzugsweise umfasst der Locus des „TDF-Wildtyp-Gens/-Allels” ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder eine Nukleotidsequenz, die zur SEQ ID NO: 1, 2, oder 3 homolog ist. Die cDNA des TDF-Wildtyp-Gen/-Allel entspricht vorzugsweise einem Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 7, 8 oder 9 oder eine Nukleotidsequenz, die zur SEQ ID NO: 7, 8 oder 9 homolog ist. Das „aktive Protein” ist ein TDF-Wildtyp-Protein. Das „TDF-Wildtyp-Protein” umfasst vorzugsweise die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 10, 11 oder 12 oder eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt zu mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist zu einer der SEQ ID NOs: 10, 11 oder 12.The "active gene / allele" may mean a wild type TDF gene / allele, such as is present in a male fertile plant. Preferably, the "TDF wild-type gene / allele" locus comprises a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or a nucleotide sequence homologous to SEQ ID NO: 1, 2, or 3. The cDNA of the TDF wild-type gene / allele preferably corresponds to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 7, 8 or 9 or a nucleotide sequence which is homologous to SEQ ID NO: 7, 8 or 9. The "active protein" is a wild type TDF protein. The "TDF wild type protein" preferably comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 11 or 12 or an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85% or at least 90%, more preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% is identical to one of SEQ ID NOs: 10, 11 or 12.

Die Inaktivierung des TDF-Gens bzw. TDF-Allels kann z. B. durch die Veränderung von codierenden oder regulatorischen (z. B. Promotor) TDF-Sequenzen erfolgen, wobei die Veränderung die Funktion (Expression) des TDF-Gens verhindert oder signifikant reduziert. Es können auch gezielt eine oder mehrere Mutationen in die codierenden TDF-Sequenzen (Exons) oder die Spleißsignale eingefügt werden, die das Entstehen eines funktionellen TDF-Proteins verhindern, d. h. dass die Translation einer auf diese Art mutierten TDF-Sequenz zur Synthese eines nicht-funktionellen TDF-Proteins oder eines TDF-Proteins mit einer signifikant reduzierten Funktion führt.The inactivation of the TDF gene or TDF allele can z. By altering coding or regulatory (eg, promoter) TDF sequences, which alteration prevents or significantly reduces the function (expression) of the TDF gene. It is also possible to selectively insert one or more mutations into the coding TDF sequences (exons) or the splice signals which prevent the emergence of a functional TDF protein, i. H. translation of a TDF sequence mutated in this way results in the synthesis of a non-functional TDF protein or a TDF protein with a significantly reduced function.

Eine geeignete Mutation in einer codierenden Sequenz des TDF-Gens oder einem Spleißsignal umfasst zum Beispiel die Addition oder Deletion von einer oder mehreren Teilnukleotidsequenzen mit einer Länge von mindestens einem Nukleotid der genomischen TDF-Sequenz, vorausgesetzt diese Addition oder Deletion führt dazu, dass keine Funktion oder nur eine signifikant reduzierte Funktion des synthetisierten TDF-Proteins gegeben ist, d. h. dass eine Inaktivierung des TDF-Gens/-Allels bzw. TDF-Proteins vorliegt. Eine solche Addition oder Deletion ist dann eine besonders geeignete Mutation, wenn die Addition zur Insertion von mindestens einem Nukleotid in einem Exon führt und/oder zum Zerstören eines Spleißsignals führt, oder die Deletion zum Verlust eines Teils eines Exons und/oder zum Verlust eines Spleißsignals führt. Im Falle einer Addition mit Insertion in einem Exon oder einer Deletion mit Verlust eines Teils des Exons, ist vorzugsweise die Anzahl der addierten bzw. deletierten Nukleotide nicht durch drei teilbar, so dass die Addition bzw. Deletion zu einer Leserasterverschiebung führt. Eine Addition oder Deletion kann weiterhin im Zuge der Translation auch die Synthese zusätzlicher Aminosäuren bzw. weniger Aminosäuren zur Folge haben, was die Funktion des TDF-Proteins stören oder vollends zerstören kann, indem es Auswirkungen auf die sekundäre und tertiäre Proteinstruktur hat. Geeignete Mittel zur Mutation sind neben den bekannten Mutagenese-Techniken insbesondere die Technologien des „Genome Editing”, wie beispielsweise Meganukleasen, TALENs, Zinkfingernukleasen oder ein CRISPR/Cas-System, welche Doppelstrangbrüche in der DNA induzieren können und dann das Hinzufügen oder den Verlust von Nukleotiden beispielsweise während eines Rekombinationsereignisses begünstigen.For example, a suitable mutation in a coding sequence of the TDF gene or a splice signal comprises the addition or deletion of one or more partial nucleotide sequences of at least one nucleotide in length of the TDF genomic sequence, provided that this addition or deletion results in no function or only a significantly reduced function of the synthesized TDF protein is given, ie that there is an inactivation of the TDF gene / allele or TDF protein. Such an addition or deletion is a particularly suitable mutation when the addition to the insertion of at least results in a nucleotide in an exon and / or leads to the destruction of a splice signal, or the deletion leads to the loss of part of an exon and / or the loss of a splice signal. In the case of an addition with insertion in an exon or a deletion with loss of part of the exon, preferably the number of added or deleted nucleotides is not divisible by three, so that the addition or deletion leads to a frame shift. An addition or deletion may also result in the translation of the synthesis of additional amino acids or fewer amino acids, which may interfere with the function of the TDF protein or destroy completely by it has an impact on the secondary and tertiary protein structure. Suitable means of mutation, in addition to the known mutagenesis techniques, are in particular the technologies of "genome editing", such as meganucleases, TALENs, zinc finger nucleases or a CRISPR / Cas system, which can induce double-strand breaks in the DNA and then the addition or loss of For example, nucleotides during a recombination event favor.

Ferner können auch eine oder mehrere Punktmutationen in die codierende Sequenz eingefügt werden, zum Beispiel zum Einbringen von Stopp-Codons oder zur Substitution von Nukleotiden zwecks Veränderung der Aminosäuresequenz des codierten TDF-Proteins, beispielsweise durch Strahlung oder chemische Mutagenzien oder durch gerichtete Mutagenese, beispielsweise mittels TILLING. Teilweise können Punktmutationen auch durch Gene-Repair-OligoNucleotide(GRON)-Technik oder auch CRISPR/Cas erfolgen. Weiterhin können Insertionen, die zur Inaktivierung führen, auch durch Transposon-Mutagenese eingebracht werden. Die oben genannten Techniken des Genome Editings wie auch die Mutagenisierungs-Technologien sind auch geeignet, vorhandene Spleißsignale zu zerstören oder neue einzufügen.Furthermore, one or more point mutations may also be inserted into the coding sequence, for example for introducing stop codons or for substituting nucleotides to alter the amino acid sequence of the encoded TDF protein, for example by radiation or chemical mutagens or by directed mutagenesis, for example by TILLING. Partial point mutations can also be made by Gene Repair OligoNucleotide (GRON) technique or CRISPR / Cas. Furthermore, insertions that lead to inactivation can also be introduced by transposon mutagenesis. The above techniques of genome editing as well as the mutagenization technologies are also capable of destroying existing splice signals or inserting new ones.

Die Inaktivierung des TDF-Gens bzw. TDF-Allels kann durch eine oder mehrere der oben und auch weiter unten beschriebenen Techniken herbeigeführt werden; dem Fachmann sind jedoch noch weitere Verfahren zur Inaktivierung bekannt, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Somit sollen die genannten Techniken der Inaktivierung nicht als abschließend oder den Umfang der Erfindung beschränkend verstanden werden.Inactivation of the TDF gene or TDF allele may be accomplished by one or more of the techniques described above and also below; however, those skilled in the art are aware of other methods of inactivation which can be used according to the invention. Thus, the foregoing inactivation techniques are not intended to be exhaustive or to limit the scope of the invention.

Die Entstehung von funktionellem TDF-Protein kann ferner posttranskriptionell verhindert oder signifikant reduziert werden, z. B. durch RNA-Inhibierung.The emergence of functional TDF protein may also be prevented or significantly reduced post-translationally, e.g. By RNA inhibition.

Ein weiterer Weg zur Inaktivierung des TDF-Gens bzw. TDF-Allels ist, inaktive Genversionen in natürlichen Quellen mittels EcoTILLING zu identifizieren und diese dann durch sexuelle Kreuzung, Protoplastenfusion oder ähnliche Verfahren und gleichzeitige Marker-gestützte Selektion in das Kerngenom von anderen Linien, vorzugweise Elite-Linien, zu überführen.Another way to inactivate the TDF gene or TDF allele is to identify inactive gene versions in natural sources by EcoTILLING, and then by sexual crossing, protoplast fusion or similar methods and simultaneous marker-based selection into the nuclear genome of other lines, preferably Elite lines, convict.

Folglich kann das TDF-Gen der männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum gemäß der Erfindung eine oder mehrere Mutation(en) enthalten. Vorzugsweise enthält die männlich sterile Pflanze gemäß der Erfindung eine oder mehrere Mutation(en), die entweder die Expression des TDF-Gens reduziert (reduzieren) oder verhindert (verhindern), oder zur Synthese eines nichtfunktionellen TDF-Proteins oder eines TDF-Proteins mit reduzierter Funktionalität/Aktivität führt (führen).Thus, the TDF gene of the male sterile plant of the genus Triticum according to the invention may contain one or more mutations. Preferably, the male sterile plant according to the invention contains one or more mutations that either reduce (reduce) or prevent (prevent) the expression of the TDF gene, or to synthesize a non-functional TDF protein or reduced TDF protein Functionality / Activity leads (lead).

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt (liegen) diese Mutation(en) in einem oder mehreren Exon(s) vor, besonders bevorzugt in demselben Exon des TDF-Gens bzw. der TDF-Allele der Subgenome, vorzugsweise in Exon 2. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform liegt (liegen) die Mutation(en) im Exon 2 in einer Region korrespondierend zu einem Sequenzabschnitt zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 286 der SEQ ID NO: 3, beispielsweise (a) zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 285 der SEQ ID NO: 3, (b) zwischen den Nukleotidpositionen 258 und 285 der SEQ ID NO: 3, (c) zwischen den Nukleotidpositionen 281 und 286 der SEQ ID NO: 3, oder (d) zwischen den Nukleotidpositionen 281 und 283 der SEQ ID NO: 3; oder (e) an der Nukleotidposition 282 der SEQ ID NO: 3. Besonders bevorzugt entsprechen die Mutationen mindestens einer der Mutationen in einer der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NOs: 19 bis 25, welche mit Referenz zu SEQ ID NO: 3 wiedergegeben sind. Vorstehende Angaben zu Nukleotidpositionen bzw. Mutationenbeziehen sich auf SEQ ID NO: 3 aus dem Subgenom D (die „Referenzsequenz”). In den TDF-Genen/-Allelen der anderen Subgenome können die Nukleotidpositionen aufgrund der Divergenz zwischen den Allelen unterschiedlich sein. Die für die Mutation(en) gemäß der Erfindung bevorzugten Regionen im TDF-Gen/-Allel sind nicht beschränkt auf die für die Referenzsequenz angegebenen Nukleotidpositionen, vielmehr können die Mutation(en) auch an den entsprechenden Positionen der Nukleotidsequenz anderer Allele liegen.In a preferred embodiment, this mutation (s) is present in one or more exons, more preferably in the same exon of the TDF gene or TDF alleles of the subgenomes, preferably in exon 2. In a very particular In a preferred embodiment, the mutation (s) in exon 2 are in a region corresponding to a sequence segment between nucleotide positions 256 and 286 of SEQ ID NO: 3, for example (a) between nucleotide positions 256 and 285 of SEQ ID NO: 3 (b) between nucleotide positions 258 and 285 of SEQ ID NO: 3, (c) between nucleotide positions 281 and 286 of SEQ ID NO: 3, or (d) between nucleotide positions 281 and 283 of SEQ ID NO: 3; or (e) at nucleotide position 282 of SEQ ID NO: 3. Most preferably, the mutations correspond to at least one of the mutations in one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 19 to 25, which are reproduced with reference to SEQ ID NO: 3. The above information on nucleotide positions or mutations refer to SEQ ID NO: 3 from subgenome D (the "reference sequence"). In the TDF genes / alleles of the other subgenomes, the nucleotide positions may be different due to the divergence between the alleles. The preferred regions for the mutation (s) according to the invention in the TDF gene / allele are not limited to the nucleotide positions indicated for the reference sequence, but rather the mutation (s) may also be at the corresponding positions of the nucleotide sequence of other alleles.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der(den) Mutation(en) um Deletion(en), vorzugsweise um Deletion(en) von 1 bis 28 Nukleotiden. Besonders bevorzugt treten diese Deletion(en) im Exon 2 in der Region korrespondierend einem Sequenzabschnitt zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 286 der SEQ ID NO: 3 (Referenzsequenz) auf.In a preferred embodiment, the mutation (s) are deletion (s), preferably deletion (s) from 1 to 28 nucleotides. Most preferably, these deletion (s) occur in the exon 2 in the region corresponding to a sequence section between nucleotide positions 256 and 286 of SEQ ID NO: 3 (reference sequence).

Die Mutation(en) in der männlich sterilen Pflanze gemäß der Erfindung, die zur Inaktivierung des TDF-Gens führt (führen), kann (können) transgen oder nicht-transgen erzeugt werden.The mutation (s) in the male sterile plant according to the invention which results in the inactivation of the TDF gene can be generated transgenically or non-transgenically.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Teile und Samen einer männlich sterilen Pflanze gemäß der Erfindung, in der sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind.Furthermore, the present invention relates to parts and seeds of a male sterile plant according to the invention in which all the alleles of the gene coding for TDF are inactivated.

Ein „Teil” einer Pflanze meint im Sinne der vorliegenden Erfindung ein pflanzliches Organ wie beispielsweise Blatt, Sprossachse, Stamm, Wurzel, vegetative Knospe, Meristem, Embryo, Anthere, Ovula oder Frucht; oder bezeichnet einen Zusammenschluss mehrerer Organe, z. B. eine Blüte oder ein Samen, oder einen Teil eines Organs, z. B. einen Querschnitt aus der Sprossachse; oder bezeichnet ein pflanzliches Gewebe wie Kallusgewebe, Speichergewebe, meristematisches Gewebe, Blattgewebe, Sprossgewebe, Wurzelgewebe, Pflanzentumorgewebe oder reproduktives Gewebe.For the purposes of the present invention, a "part" of a plant means a plant organ such as, for example, leaf, shoot axis, stem, root, vegetative bud, meristem, embryo, anther, ovule or fruit; or denotes a merger of several organs, eg. B. a flower or a seed, or a part of an organ, for. B. a cross section of the stem axis; or denotes a plant tissue such as callus tissue, storage tissue, meristematic tissue, leaf tissue, shoot tissue, root tissue, plant tumor tissue or reproductive tissue.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind. Vorzugsweise stammt die Pflanzenzelle aus einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum.In particular, the present invention also relates to a plant cell, characterized in that all the alleles of the gene coding for TDF are inactivated. Preferably, the plant cell is derived from a male sterile plant of the genus Triticum.

Unter einer „Pflanzenzelle” ist im Sinne der vorliegenden Erfindung beispielsweise eine isolierte Zelle mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen.For the purposes of the present invention, a "plant cell" is understood as meaning, for example, an isolated cell with a cell wall or aggregates thereof or protoplasts.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nachkommen der erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum und Teile oder Samen davon, enthaltend mindestens ein inaktiviertes TDF-Gen/-Allel. Für beispielsweise hexaploide Pflanzen der Gattung Triticum wie Triticum aestivum können auch zwei, drei, vier oder fünf inaktivierte TDF-Gene/-Allele enthalten sein; für beispielsweise tetraploide Pflanzen der Gattung Triticum wie Triticum durum können auch zwei oder drei inaktivierte TDF-Gene/-Allele enthalten sein. Die Nachkommen der Pflanzen sind beispielsweise herstellbar durch Kreuzung einer erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum mit einer fertilen Pflanze derselben Gattung, wobei die männlich sterile Pflanze in der Kreuzung als Vater eingesetzt wird und die normal fertile Pflanze als Mutter in der Kreuzung eingesetzt wird. Die Nachkommenpflanzen oder ein Teil oder Samen davon können eine Hybridpflanze der Gattung Triticum bzw. ein Teil oder Samen davon sein. Vorzugsweise meint „Hybridpflanze” eine Pflanze der F1 Generation einer Kreuzung aus zwei nicht identischen Elternlinien.The present invention also relates to progeny of the male sterile plant of the genus Triticum according to the invention and parts or seeds thereof containing at least one inactivated TDF gene / allele. For example, hexaploid plants of the genus Triticum such as Triticum aestivum may also contain two, three, four or five inactivated TDF genes / alleles; for example, tetraploid plants of the genus Triticum such as Triticum durum may also contain two or three inactivated TDF genes / alleles. The progeny of the plants can be produced, for example, by crossing a male sterile plant according to the invention of the genus Triticum with a fertile plant of the same genus, the male sterile plant being used as the parent in the cross and the normally fertile plant being used as the mother in the cross. The progeny plants or a part or seeds thereof may be a hybrid plant of the genus Triticum or a part or seeds thereof. Preferably, "hybrid plant" means an F1 generation plant of a cross from two non-identical parental lines.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Herstellen einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, umfassend das Inaktivieren von sämtlichen Allelen des für TDF codierenden Gens in der Pflanze. Geeignete Verfahren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik hinreichend bekannt. Die oben aufgeführten Verfahren zum Herstellen einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum stellen keine abschließende oder beschränkende Aufzählung dar.The invention further relates to a method for producing a male sterile plant of the genus Triticum comprising inactivating all alleles of the TDF coding gene in the plant. Suitable methods are well known to those skilled in the art. The above-listed methods for producing a male sterile plant of the genus Triticum are not exhaustive or restrictive.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus den folgenden: (a) einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder SEQ ID NO: 7, 8 oder 9; (b) einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein enthaltend eine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 11 oder 12 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Identität von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 96%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 11 oder 12 aufweist, codiert; (c) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu (a) oder (b); (d) einer Nukleotidsequenz, die homolog ist zu (a) oder (b) oder eine Identität von mindestens 70% zu (a) oder (b) aufweist, wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein kodiert; (e) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; und (f) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (c) hybridisiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein kodiert. Ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Teilsequenz (Fragment) der in (a) bis (f) genannten Nukleotidsequenzen ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Das Fragment hat eine Länge von mindestens 17, 18, 19, 20, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400 oder 500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden. Die Teilnukleotidsequenz liegt vorzugsweise in sense Orientierung, anti-sense (invers komplementäre) Orientierung oder komplementärer Orientierung zu derjenigen Nukleotidsequenz vor, aus welcher die Teilsequenz/das Fragment stammt. Fragmente können als Primer, Sonden, oder inhibitorische Sequenzen (zum Beispiel für einen RNAi-Ansatz) verwendet werden.Furthermore, the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the following: (a) a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or SEQ ID NO: 7, 8 or 9; (b) a nucleotide sequence coding for a protein containing one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 10, 11 or 12 or an amino acid sequence having an identity of at least 80%, preferably at least 85%, at least 90% or at least 95%, especially preferably at least 96%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% to one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 10, 11 or 12 encoded; (c) a nucleotide sequence complementary to (a) or (b); (d) a nucleotide sequence homologous to (a) or (b) or having an identity of at least 70% to (a) or (b), wherein the nucleotide sequence encodes a TDF protein; (e) a nucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions with (a) or (b); and (f) a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to (c), wherein the nucleotide sequence encodes a TDF protein. A nucleic acid molecule comprising a partial sequence (fragment) of the nucleotide sequences mentioned in (a) to (f) is likewise provided by the present invention. The fragment has a length of at least 17, 18, 19, 20, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400 or 500 consecutive nucleotides. The partial nucleotide sequence is preferably in sense orientation, anti-sense (inverse complementary) orientation or complementary orientation to the nucleotide sequence from which the partial sequence / fragment is derived. Fragments can be used as primers, probes or inhibitory sequences (for example for an RNAi approach).

Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter „homologen Sequenzen” oder „Homologe” oder vergleichbaren Termini Nukleinsäuremoleküle verstanden, welche den gleichen phylogenetischen Ursprung haben. Vorzugsweise üben Proteine, die durch diese Nukleinsäuremoleküle codiert werden, die gleiche Funktion aus. Homologe Nukleinsäuremoleküle weisen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität auf. For the purposes of the present invention, "homologous sequences" or "homologues" or comparable terms mean nucleic acid molecules which have the same phylogenetic origin. Preferably, proteins encoded by these nucleic acid molecules perform the same function. Homologous nucleic acid molecules have at least 70%, preferably at least 75%, at least 80%, at least 85% or at least 90%, more preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% sequence identity.

Unter „Hybridisieren” oder „Hybridisierung” wird ein Vorgang verstanden, bei dem sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül an einen weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang anlagert, d. h. Basenpaarungen eingeht. Standardverfahren zur Hybridisierung sind beispielsweise in Sambrook et al. 2001 beschrieben. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 60%, weiter bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen des Nukleinsäuremoleküls eine Basenpaarung mit dem weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Der Begriff „Stringenz” bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. Ionenstärke und der Temperatur ab. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen” sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen stattfindet. Der Begriff „Hybridisierungsbedingungen” bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf die bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85% oder mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität aufweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 × SSC bei 65°C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C für insgesamt etwa 1 Stunde. Der hier verwendete Begriff ”stringente Hybridisierungsbedingungen” kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68°C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA und 1% BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 × SSC und 0,1% SDS bei 68°C. Bevorzugt findet eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen statt.By "hybridization" or "hybridization" is meant a process in which a single-stranded nucleic acid molecule attaches to a largely complementary nucleic acid strand, d. H. Base pairings are received. Standard methods for hybridization are described, for example, in Sambrook et al. 2001 described. Preferably, it is understood that at least 60%, more preferably at least 65%, 70%, 75%, 80% or 85%, more preferably 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% or 99% of the bases of the nucleic acid molecule base pair with the largely complementary nucleic acid strand. The possibility of such attachment depends on the stringency of the hybridization conditions. The term "stringency" refers to the hybridization conditions. High stringency is given when base pairing is difficult, low stringency when base pairing is facilitated. The stringency of the hybridization conditions depends, for example, on the salt concentration or ionic strength and the temperature. In general, the stringency can be increased by increasing the temperature and / or lowering the salt content. By "stringent hybridization conditions" are meant those conditions in which a hybridization takes place predominantly only between homologous nucleic acid molecules. The term "hybridization conditions" does not only refer to the conditions prevailing in the actual attachment of the nucleic acids, but also to the conditions prevailing during the subsequent washing steps. Stringent hybridization conditions are, for example, conditions under which predominantly only those nucleic acid molecules which at least 70%, preferably at least 75%, at least 80%, at least 85% or at least 90%, particularly preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, hybridize, at least 98% or at least 99% sequence identity. Stringent hybridization conditions are, for example: hybridization in 4 x SSC at 65 ° C followed by multiple washes in 0.1 x SSC at 65 ° C for a total of about 1 hour. The term "stringent hybridization conditions" as used herein can also mean hybridization at 68 ° C in 0.25 M sodium phosphate, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA and 1% BSA for 16 hours and then washing twice at 2x SSC and 0.1% SDS at 68 ° C. Preferably, hybridization takes place under stringent conditions.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einem Vektor enthalten sein. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid, ein Cosmid, einen Phagen oder einen Expressionsvektor, einen Transformationsvektor, Shuttle-Vektor oder Klonierungsvektor handeln. Der Vektor kann doppel- oder einzelsträngig, linear oder zirkulär sein und kann einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder durch Integration in dessen Genom oder extrachromosomal transformieren. Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem Vektor mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenz(en), welche die Transkription und optional die Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle erlauben, operativ verknüpft. Eine regulatorische Sequenz, vorzugsweise DNA, kann homolog oder heterolog zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäure sein. Beispielsweise steht die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder eines Terminators. Geeignete Promotoren können Promotoren sein, welche konstitutiv induziert werden (Bsp.: 35S-Promoter aus dem „Cauliflower mosaic virus” ( Odell et al., 1985 ). Besonders geeignet sind solche Promotoren, welche gewebespezifisch sind (zum Beispiel pollenspezifische Promotoren ( Chen et al., 2010 ; Zhao et al., 2006 ; oder Twell et al., 1991 )), oder entwicklungsspezifisch sind (zum Beispiel blühspezifische Promotoren). Geeignete Promotoren können auch synthetische bzw. chimäre Promotoren sein, welche in der Natur nicht vorkommen, aus mehreren Elementen zusammengesetzt sind und einen Minimalpromotor beinhalten sowie stromaufwärts des Minimalpromotors mindestens ein cis-regulatorisches Element aufweisen, welches als Bindungsstelle für spezielle Transkriptionsfaktoren dient. Chimäre Promotoren können den gewünschten Spezifitäten nach konzipiert und durch unterschiedliche Faktoren induziert oder reprimiert werden. Beispiele für solche Promotoren finden sich in Gurr & Rushton, 2005 oder Venter, 2007 . Ein geeigneter Terminator ist beispielsweise der nos-Terminator ( Depicker et al., 1982 ).The nucleic acids according to the invention can be contained in a vector. The vector may be a plasmid, a cosmid, a phage or an expression vector, a transformation vector, shuttle vector or cloning vector. The vector may be double- or single-stranded, linear or circular and may transform a prokaryotic or eukaryotic host either by integration into its genome or extrachromosomally. Preferably, the nucleic acid of the invention is operably linked in a vector having one or more regulatory sequences that permit transcription and optionally expression in a prokaryotic or eukaryotic host cell. A regulatory sequence, preferably DNA, may be homologous or heterologous to the nucleic acid of the invention. For example, the nucleic acid is under the control of a suitable promoter or terminator. Suitable promoters may be promoters which are constitutively induced (for example: 35S promoter from the cauliflower mosaic virus (US Pat. Odell et al., 1985 ). Particularly suitable are those promoters which are tissue-specific (for example pollen-specific promoters ( Chen et al., 2010 ; Zhao et al., 2006 ; or Twell et al., 1991 )), or are developmentally specific (for example, flower specific promoters). Suitable promoters may also be synthetic or chimeric promoters, which do not occur in nature, are composed of several elements and comprise a minimal promoter and, upstream of the minimal promoter, have at least one cis-regulatory element which serves as a binding site for specific transcription factors. Chimeric promoters can be designed to the desired specificities and induced or repressed by different factors. Examples of such promoters can be found in Gurr & Rushton, 2005 or Venter, 2007 , A suitable terminator is, for example, the nos terminator ( Depicker et al., 1982 ).

Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die folgenden Schritte: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor; und (ii) Regenerieren einer Pflanze aus dieser (diesen) transformierten Zelle(n). Von der Erfindung umfasst ist auch eine durch dieses Verfahren hergestellte Pflanze der Gattung Triticum.Accordingly, the present invention further relates to a method for producing a transgenic plant, comprising the following steps: (i) transforming at least one cell of a plant with a nucleic acid according to the invention or with a vector according to the invention; and (ii) regenerating a plant from said transformed cell (s). The invention also includes a plant of the genus Triticum produced by this process.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls zum Nachweis, dass ein Allel des für TDF codierenden Gens inaktiviert ist, wobei das Nukleinsäuremolekül eine Teilsequenz (Fragment) einer Nukleotidsequenz umfasst, wobei die Nukleotidsequenz vorzugsweise ausgewählt ist aus (a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9; (b) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9; oder (c) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert. Furthermore, the present invention relates to the use of a nucleic acid molecule for detecting that one allele of the gene coding for TDF is inactivated, wherein the nucleic acid molecule comprises a partial sequence (fragment) of a nucleotide sequence, wherein the nucleotide sequence is preferably selected from (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9; (B) a nucleotide sequence which is complementary to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9; or (c) a nucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions with (a) or (b).

Die Fertilität der männlich sterilen Pflanze gemäß der Erfindung kann durch Einführen eines Transgens, das ein aktives Allel des TDF-Gens umfasst, wieder hergestellt (restauriert) werden. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Restauration der Fertilität einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, umfassend die folgenden Schritte: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, in der sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind, mit einer Nukleinsäure oder mit einem Vektor enthaltend eine für TDF codierende Nukleotidsequenz; und (ii) Regenerieren einer fertilen Pflanze aus der mindestens einen transformierten Zelle aus (i).The fertility of the male sterile plant according to the invention can be restored (restored) by introducing a transgene comprising an active allele of the TDF gene. Accordingly, the present invention also relates to a method for restoring the fertility of a male-sterile plant of the genus Triticum, comprising the following steps: (i) transforming at least one cell of a male-sterile plant of the genus Triticum, in which all the alleles of the gene coding for TDF are inactivated with a nucleic acid or with a vector containing a TDF coding nucleotide sequence; and (ii) regenerating a fertile plant from the at least one transformed cell from (i).

Von der Erfindung umfasst ist auch eine durch dieses Verfahren hergestellte Pflanze der Gattung Triticum.The invention also includes a plant of the genus Triticum produced by this process.

Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, die die Einbringung eines Transgens zum Beispiel in Form einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors in eine pflanzliche Zelle oder prokaryotische Zelle (wie Agrobacterium) umfassen. Das Transgen kann beispielsweise durch Konjugation, Mobilisation, biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation, Transfektion, Transduktion, Vakuuminfiltration oder Elektroporation eingebracht werden. Solche Verfahren ebenso wie Verfahren zur Präparation von beschriebenen Vektoren sind dem Fachmann geläufig ( Sambrook et al. 2001 ).Thus, the present invention provides methods involving the incorporation of a transgene, for example, in the form of a nucleic acid of the invention or a vector of the invention into a plant cell or prokaryotic cell (such as Agrobacterium). The transgene can be introduced, for example, by conjugation, mobilization, biolistic transformation, Agrobacterium-mediated transformation, transfection, transduction, vacuum infiltration or electroporation. Such methods as well as methods for the preparation of described vectors are familiar to the person skilled in the art ( Sambrook et al. 2001 ).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Aufrechterhalten der männlichen Sterilität der erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, in der sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind, mit (a) einem aktiven Allel des für TDF codierenden Gens, (b) einem Pollen-spezifisch exprimierten Transgen, das für ein Nukleinsäuremolekül oder ein Protein codiert, das die Ausbildung von fertilen Pollen verhindert, und (c) einem Transgen, das in der Pflanze ein phänotypisches Merkmal verursacht, welches als Selektionsmarker verwendet werden kann; (ii) Regenerieren einer fertilen Pflanze aus der transformierten Zelle aus (i); (iii) Selbsten der Pflanzen aus (ii); und (iv) Selektieren von Nachkommenpflanzen aufgrund des Selektionsmarkers aus (i). Vorzugsweise werden die Transgene (a) bis (c) eng gekoppelt transformiert, d. h. zwei Transgene sind jeweils bevorzugt weniger als 5 cM, weniger als 4 cM, weniger als 3 cM, weniger als 2 cM, weniger als 1 cM, weniger als 0,5 cM, weniger als 0,2 cM, weniger als 0,1 cM oder weniger als 0,05 cM voneinander entfernt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befinden sich zwei der Transgene (a) bis (c) oder alle drei Transgene (a) bis (c) auf einem DNA-Konstrukt (z. B. einer Expressionskassette).The present invention also relates to a method for maintaining male sterility of the male sterile plant of the invention, the method comprising the steps of: (i) transforming at least one cell of a male sterile plant of the genus Triticum, in which all alleles of the TDF encoding (B) a pollen-specifically expressed transgene coding for a nucleic acid molecule or a protein preventing production of fertile pollen, and (c) a transgene causing a phenotypic trait in the plant which can be used as a selection marker; (ii) regenerating a fertile plant from the transformed cell of (i); (iii) the selves of the plants of (ii); and (iv) selecting progeny plants based on the selection marker of (i). Preferably, the transgenes (a) to (c) are tightly transformed, i. H. preferably two transgenes are less than 5 cM, less than 4 cM, less than 3 cM, less than 2 cM, less than 1 cM, less than 0.5 cM, less than 0.2 cM, less than 0.1 cM or less than 0.05 cM apart. In a particularly preferred embodiment, two of the transgenes (a) to (c) or all three transgenes (a) to (c) are located on a DNA construct (eg an expression cassette).

Die erfindungsgemäße männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum kann zur Herstellung von Hybridpflanzen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Herstellen einer Hybridpflanze der Gattung Triticum das Kreuzen einer erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze, in der sämtliche TDF-Allele inaktiviert sind, mit einer Pflanze, die mindestens ein aktives TDF-Allel in einem Subgenom aufweist. Weiterhin erfasst die Erfindung auch eine Pflanze der Gattung Triticum, vorzugsweise eine Hybridpflanze, enthaltend mindestens ein inaktiviertes Allel des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens, erhältlich durch Kreuzen der erfindungsgemäßen männlich sterilen Pflanze, in der sämtliche TDF-Allele inaktiviert sind, mit einer Pflanze, die mindestens ein aktives Allel des für TDF codierenden Gens in einem Subgenom aufweist.The male sterile plant of the genus Triticum according to the invention can be used for the production of hybrid plants. In a preferred embodiment, a method for producing a hybrid plant of the genus Triticum comprises crossing a male sterile plant according to the invention in which all TDF alleles are inactivated with a plant having at least one active TDF allele in a subgenome. Furthermore, the invention also encompasses a plant of the genus Triticum, preferably a hybrid plant containing at least one inactivated allele of the gene coding for tapetal development and function (TDF), obtainable by crossing the male sterile plant according to the invention in which all TDF alleles are inactivated, with a plant having at least one active allele of the TDF-encoding gene in a subgenome.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer männlichen Sterilität in einer Pflanze der Gattung Triticum oder in einem Samen davon, umfassend die folgenden Schritte: (i) Isolieren von DNA aus der Pflanze, einem Teil davon oder dem Samen; (ii) Analysieren der DNA mit Hilfe eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Teilsequenz einer Nukleotidsequenz aufweist, ausgewählt aus (a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9, (b) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9, oder (c) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; und (iii) Identifizieren einer Pflanze, in welcher sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind.The invention further relates to a method for detecting male sterility in a plant of the genus Triticum or in a seed thereof, comprising the following steps: (i) isolating DNA from the plant, a part thereof or the seed; (ii) analyzing the DNA with the aid of a nucleic acid molecule having a partial sequence of a nucleotide sequence selected from (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9, ( b) a nucleotide sequence which is complementary to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9, or (c) a nucleotide sequence which under stringent conditions with (a) or (b) hybridizes; and (iii) identifying a plant in which all alleles of the TDF coding gene are inactivated.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert.The invention is illustrated by the following figures.

1: Oben: Vorhergesagte Genstruktur des Gens TaTDF; unten: ein Ausschnitt des Gens aus Subgenom A („4AS”; SEQ ID NO: 1, beginnend mit Nukleotidposition 236), Subgenom B („46L”; SEQ ID NO: 2, beginnend mit Nukleotidposition 236) und Subgenom D („4DL”; SEQ ID NO: 3, beginnend mit Nukleotidposition 235) und Sequenz eines Teils des zweiten Exons („Exon2”) exemplarisch aus Subgenom A. Dargestellt sind außerdem die Bindungsstellen der beiden generierten TALEN-Arme („TAL-2” bzw. „TaTDF-TAL2” und „TAL-1” bzw. „TaTDF-TAL1”), sowie die für die späteren Analysen verwendete Rsal-Schnittstelle. 1 : Above: Predicted gene structure of the gene TaTDF; below: a section of the gene from subgenome A ("4AS", SEQ ID NO: 1, starting at nucleotide position 236), subgenome B ("46L", SEQ ID NO: 2, beginning at nucleotide position 236) and subgenome D ("4DL SEQ ID NO: 3, beginning at nucleotide position 235) and sequence of a portion of the second exon ("Exon2") exemplarily from subgenom A. Also shown are the binding sites of the two generated TALEN arms ("TAL-2" or " TaTDF-TAL2 "and" TAL-1 "or" TaTDF-TAL1 ") as well as the Rsal interface used for the later analyzes.

2A und B: Vektoren umfassend die TALEN-Konstrukte für die Transformation von Weizen zur gezielten Mutation der TaTDF Allele. Für die Transformation des TALEN-2 wurde das Konstrukt A, für die Transformation des TALEN-1 wurde das Konstrukt B verwendet. Vektorbestandteile: ColE1 ori: Replikationsursprung für die Amplifikation des Plasmids in E. coli; pVS1-REP: Replikationsursprung für die Amplifikation des Plasmids in Agrobacterium tumefaciens; Spec-R: Spectinomycinresistenzgen zur bakteriellen Selektion; LB: Left border site der T-DNA; Ubiquitinpromotor: Promotor des Ubiquitin 1 Gens aus Zea mays inklusive des 1. Introns; Intron1: 1. Intron des Ubiquitin 1 Gens aus Zea mays; HPT: Hygromycinphosphotransferase Gen zur Selektion transgener Pflanzen auf Hygromycin; pat: Phosphinotricin-acetyltransferase Gen zur Selektion transgener Pflanzen auf Phosphinotricin; 35S Terminator: Terminationssequenz des 35S-Gens aus dem Blumenkohlmosaikvirus; nosT: Terminationssequenz des Nopalinsythasegens aus Agrobacterium tumefaciens; Fokl: Nukleasedomäne des Restriktionsenzyms Fokl aus Flavobacterium okeanokoites; TAL C terminus: C-Terminus des Transcription activation like effector (TALE) Proteins aus Xanthomonas campestris; TaTDF-TAL2 repeats: Aminosäuresequenz innerhalb des artifiziellen TALEN verantwortlich für die sequenzspezifische Bindung und die TAL-1 Sequenz (vergleiche 1); TaTDF-TAL1 repeats: Aminosäuresequenz innerhalb des artifiziellen TALEN verantwortlich für die sequenzspezifische Bindung an die TAL-1 Sequenz (vergleiche 1); TAL N terminus: N-Terminus des Transcription activation like effector (TALE) Proteins aus Xanthomonas campestris; d35S-Promotor: Promotor des 35S-Gens aus dem Blumenkohlmosaikvirus mit duplizierten Enhancerelement; RB: Right border site der T-DNA. 2A and B: vectors comprising the TALEN constructs for the transformation of wheat to the targeted mutation of TaTDF alleles. For the transformation of TALEN-2 the construct A was used, for the transformation of TALEN-1 the construct B was used. Vector components: ColE1 ori: origin of replication for the amplification of the plasmid in E. coli; pVS1-REP: origin of replication for the amplification of the plasmid in Agrobacterium tumefaciens; Spec-R: spectinomycin resistance gene for bacterial selection; LB: Left border site of T-DNA; Ubiquitin promoter: promoter of the ubiquitin 1 gene from Zea mays including the first intron; Intron1: 1. intron of the ubiquitin 1 gene from Zea mays; HPT: hygromycin phosphotransferase gene for selecting transgenic plants for hygromycin; pat: phosphinotricin acetyltransferase gene for selecting transgenic plants for phosphinotricin; 35S terminator: termination sequence of the cauliflower mosaic virus 35S gene; nosT: termination sequence of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens; Fokl: Nuclease domain of the restriction enzyme Fokl from Flavobacterium okeanokoites; TAL C terminus: C-terminus of the transcription activation-like effector (TALE) protein from Xanthomonas campestris; TaTDF-TAL2 repeats: Amino acid sequence within the artificial TALEN responsible for the sequence-specific binding and the TAL-1 sequence (cf. 1 ); TaTDF-TAL1 repeats: Amino acid sequence within the artificial TALEN responsible for the sequence-specific binding to the TAL-1 sequence (cf. 1 ); TAL N terminus: N-terminus of the transcription activation-like effector (TALE) protein from Xanthomonas campestris; d35S promoter: Promoter of cauliflower mosaic virus 35S gene with duplicated enhancer element; RB: Right border site of T-DNA.

3A und 3B: Sequenzanalyse von amplifizierten, genomischen DNA-Fragmenten von transgenen Pflanzen der Transformationsexperimente WA499 und WA500 (Zeilen 1 bis 22; codogener Strang). Genomische DNA der Pflanzen wurde mit RsaI verdaut, eine PCR-Amplifikation des dargestellten Bereichs durchgeführt und die PCR-Fragmente wurden erneut mit RsaI verdaut. Unverdaute Fragmente wurden kloniert und sequenziert. Im Bereich der Bindungsstellen der beiden TALEN-Arme sind Deletionen zu erkennen, die zu einem Verlust der RsaI-Schnittstelle führen. Entsprechende Deletionen sind beispielhaft in Referenzsequenz SEQ ID NO: 3 übersetzt und in den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NOs: 19–25 dargestellt. 3A and 3B : Sequence analysis of amplified genomic DNA fragments from transgenic plants of the transformation experiments WA499 and WA500 (lines 1 to 22, codogenic strand). Genomic DNA of the plants was digested with RsaI, a PCR amplification of the region shown was performed and the PCR fragments were digested again with RsaI. Undigested fragments were cloned and sequenced. In the region of the binding sites of the two TALEN arms, deletions can be recognized that lead to a loss of the RsaI site. Corresponding deletions are for example translated into reference sequence SEQ ID NO: 3 and shown in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 19-25.

4: Analyse von Einzelpflanzennachkommen der Linie WA500-T-003 mittels PCR Assay. Von allen Pflanzen wurde eine PCR-Amplifikation des TaTDF-Locus durchgeführt und das PCR Produkt anschließend mit RsaI verdaut. Unverdaute DNA zeigt die Präsenz von Mutationen an. 4 : Analysis of single plant progeny of line WA500-T-003 by PCR assay. All plants were subjected to PCR amplification of the TaTDF locus and the PCR product was subsequently digested with RsaI. Undigested DNA indicates the presence of mutations.

5A–J: Sequenzvergleich von amplifizierten und klonierten PCR-Fragmenten des Weizen TaTDF-Gens aus der Sorte Taifun. Sequenzübereinstimmungen sind durch Unterstreichung kenntlich gemacht; Bereiche, in denen sich die Sequenzen unterscheiden, weisen keine Unterstreichung auf. Die dargestellten Sequenzunterschiede lassen eine Zuordnung der jeweiligen Sequenz zu den einzelnen Weizensubgenomen zu. Dazu wurde die in den öffentlich verfügbaren Datenbanken vorhandenen Sequenzen aus dem A-, B- oder D-Subgenom des Weizens mit den amplifizierten Sequenzen verglichen (letzten drei Zeilen 4B (= Sugenom B), 4A (= Sugenom A) und 4D (= Sugenom D)). Zwischen den Sequenzen der Subgenome gibt es signifikante Unterschiede, die auch in den amplifizierten Sequenzen aus Taifun gefunden werden konnten. Wie aus dem Vergleich in 5 zu sehen, sind die Fragmente 4 und 8 anhand der gefundenen Polymorphismen eindeutig als PCR Produkte aus dem Subgenom A anzusehen, wohingegen die übrigen Fragmente dem Subgenom D zuzuordnen sind. Aus dem Subgenom B wurde in dieser PCR somit kein Amplifikat erhalten. Die spezifischen Sequenzunterschiede zwischen den Subgenomen wurden dann für die Generierung von Subgenom-spezifischen Primern verwendet. 5A -J: Sequence comparison of amplified and cloned PCR fragments of the Typhoon wheat TaTDF gene. Sequence matches are indicated by underlining; Areas where the sequences differ have no underline. The sequence differences shown allow an assignment of the respective sequence to the individual wheat subgenomes. To this end, the sequences from the A, B or D subgenome of the wheat present in the publicly available databases were compared with the amplified sequences (last three lines 4B (= sugenome B), 4A (= sugenome A) and 4D (= sugenom D)). There are significant differences between the sequences of the subgenomes, which could also be found in the amplified sequences from typhoon. As from the comparison in 5 can be seen, the fragments 4 and 8 are clearly based on the found polymorphisms to be regarded as PCR products from the subgenom A, whereas the remaining fragments are attributable to the subgenom D. Thus, no amplicon was obtained from subgenome B in this PCR. The specific sequence differences between the subgenomes were then used for the generation of subgenome-specific primers.

6–8: Sterile Weizenpflanze WA500-T-003-03-25. 6: isolierte Ovarien mit Antheren der sterilen Linie WA500-T-003-03-25 im Vergleich zur Wildtyppflanze Taifun; 7: Ähre der Pflanze WA500-T-003-03-25. Es sind keine aus den Spelzen hervortretende Antheren zu sehen, die für das dargestellte Stadium typisch wären; 8: Vergleich der Blüten der sterilen Weizenpflanze WA500-T-003-03-25 und der Wildtypflanze Taifun. (Pfeile zeigen Antheren). 6 - 8th : Sterile wheat plant WA500-T-003-03-25. 6 : isolated ovaries with anthers of the sterile line WA500-T-003-03-25 in comparison to the wild-type plant typhoon; 7 : Ear of the plant WA500-T-003-03-25. No anthers appearing from the husks are typical of the stage shown; 8th : Comparison of the flowers of the sterile wheat plant WA500-T-003-03-25 and the wild-type plant typhoon. (Arrows show anthers).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, schränken die Erfindung jedoch in keiner Weise ein.The following examples illustrate the invention, but do not limit the invention in any way.

Beispiel 1: Identifizieren von Kandidatengenen in Weizen (Triticum aestivum) Example 1 Identification of Candidate Genes in Wheat (Triticum aestivum)

Zur Identifizierung geeigneter Kandidaten-Gene wurden folgende Auswahlkriterien angelegt:

• 1) Gene codieren für Transkriptionsfaktoren, da diese eine Vielzahl von anderen Genen steuern, sollte eine Mutation bzw. Inaktivierung dieser Gene zu stärkeren Effekten führen, als die Mutation bzw. Inaktivierung eines Strukturgens;
• 2) Gene werden in anderen monocotyledonen Pflanzen wie beispielsweise Reis ausschließlich Antheren-spezifisch exprimiert

To identify suitable candidate genes, the following selection criteria were created:

• 1) genes coding for transcription factors, since these control a variety of other genes, a mutation or inactivation of these genes should lead to stronger effects than the mutation or inactivation of a structural gene;
• 2) Genes are expressed exclusively anther-specific in other monocotyledonous plants such as rice

Anhand der Liste möglicher Kandidatengene wurden, sofern möglich, die jeweiligen Weizenhomologe identifiziert. Anschließend wurden die verfügbaren Expressionsdaten der Gene analysiert. Es wurde nun eine weitere Einschränkung vorgenommen auf solche Weizengene, die eine möglichst spezifische Expression in den Antheren hatten.Where possible, the respective wheat homologues were identified on the basis of the list of possible candidate genes. Subsequently, the available expression data of the genes were analyzed. A further restriction has now been made to those wheat genes which had the most specific possible expression in the anthers.

Beispiel 2: Identifizieren von geeigneten Bereichen innerhalb der GeneExample 2: Identification of Appropriate Regions Within the Genes

Auf Basis der vorhandenen Genomdaten des Weizens wurden nun Genvorhersagemodelle für die identifizierten Gene erstellt. Ziel war es, Exonbereiche für eine gezielte Mutagenese zu nutzen, um eine Veränderung der Proteinstruktur oder einen vorzeitigen Abbruch der Translation zu erreichen. Die Mutagenese sollte dann die männliche Sterilität zur Folge haben. Erfolgreich gelang dies nur im Fall eines Kandidatengens, nämlich dem TaTDF-Gen, weshalb sich die nachfolgende Ausführungen ausschließlich auf die Arbeiten an und mit dem TaTDF-Gen beschränken.Based on the existing genome data of the wheat, gene prediction models for the identified genes were created. The aim was to use exon areas for targeted mutagenesis to achieve a change in protein structure or a premature termination of translation. Mutagenesis should then result in male sterility. This was successful only in the case of a candidate gene, namely the TaTDF gene, which is why the following explanations are limited exclusively to the work on and with the TaTDF gene.

Nach Vorlage der Exon/Intronstruktur konnten Bereiche in den Exons des TaTDF-Gens identifiziert werden, die in allen drei Subgenomen des Weizens identisch oder sehr ähnlich waren. Diese Bereiche wurden dann für die Entwicklung von TALENS genutzt (1).Upon presentation of the exon / intron structure, regions in the exons of the TaTDF gene could be identified that were identical or very similar in all three subgenomes of wheat. These areas were then used for the development of TALENS ( 1 ).

Beispiel 3: Erzeugen von TALENs-Konstrukten und deren Verwendung zur Transformation von WeizenExample 3: Generation of TALENs constructs and their use for transformation of wheat

Es wurden zweimal 19 bp bzw. 25 bp des genomischen Bereichs als Bindungsstelle für eine TAL-Nuklease ausgewählt, mit einem Abstand von 12–18 bp zwischen den beiden Bindungsstellen. 1 zeigt die Exon/Intron Struktur des Gens TaTDF aus Weizen sowie die Bindungsstellen für die beiden TALEN-Arme TaTDF-TAL1 und TaTDF-TAL2, die mit einem Abstand von 14 bp auf dem codogenen bzw. dem nicht codogenen DNA-Strang binden.Twelve 19 bp and 25 bp of the genomic region, respectively, were selected as the binding site for a TAL nuclease, with a distance of 12-18 bp between the two binding sites. 1 shows the exon / intron structure of the TaTDF gene from wheat and the binding sites for the two TALEN arms TaTDF-TAL1 and TaTDF-TAL2, which bind at a distance of 14 bp on the codogenic and non-codogenic DNA strand, respectively.

Nach Erstellung der TALENs wurden diese mit dem starken, konstitutiven Promotor 70Subiintron fusioniert und entweder in den Binärvektor p7U oder p6U kloniert (2). Die Transformation der beiden TALEN-Arme in die Weizensorte Taifun erfolgte dann als Co-Transformation durch Mischen der beiden Agrobakterienstämme zu gleichen Teilen. Selektiert wurden die transgenen Pflanzen dann im Versuch WA499 mittels Hygromycin, so dass alle generierten transgenen Pflanzen das Konstrukt p6U70SubintronTaTDF-TAL2 enthielten, ein Teil der Pflanzen aber auch noch zusätzlich das Konstrukt p7U70SubiintronTaTDF-TAL1. Im ersten Transformationsversuch (WA499) konnten 9 transgene Weizenlinien identifiziert werden, in denen beide TALEN-Arme integriert waren. Im zweiten Transformationsversuch (WA500) wurde dann ebenfalls eine Co-Transformation durchgeführt. Hier wurde jedoch durch Zusatz von Phosphinotricin in das Regenerationsmedium auf Anwesenheit des bar-Gens selektiert. In diesem Versuch konnten 13 transgene Sprosse identifiziert werden, die beide TALEN-Arme enthielten.After generating the TALENs, they were fused to the strong, constitutive promoter 70ubintron and cloned into either the p7U or p6U binary vector ( 2 ). The transformation of the two TALEN arms into the wheat variety Typhoon was then carried out as a co-transformation by mixing the two Agrobacterium strains in equal parts. The transgenic plants were then selected in the experiment WA499 by means of hygromycin, so that all generated transgenic plants contained the construct p6U70 SubintronTaTDF-TAL2, a part of the plants but also additionally the construct p7U70SubiintronTaTDF-TAL1. In the first transformation trial (WA499), 9 transgenic wheat lines were identified in which both TALEN arms were integrated. In the second transformation attempt (WA500) a co-transformation was carried out. Here, however, the presence of the bar gene was selected by addition of phosphinotricin in the regeneration medium. In this experiment, 13 transgenic shoots were identified that contained both TALEN arms.

Beispiel 4: Identifizieren von Deletionen in den transgenen WeizenpflanzenExample 4: Identification of deletions in the transgenic wheat plants

Die transgenen Ausgangstransformanten aus Beispiel 3 wurden auf Deletionen im Bereich des Spacers zwischen den beiden TALEN-Armen untersucht.The transgenic starting transformants from Example 3 were examined for deletions in the region of the spacer between the two TALEN arms.

Dazu wurde die Methode der Enrichment PCR angewandt ( Curtin et al., 2011 ). Bei dieser Methode wird sich zu Nutze gemacht, dass durch die Wirkung der TALENS entweder Deletionen oder Insertionen im Bereich der Schnittstelle, also im Bereich des Spacers zwischen den Bindungsstellen der beiden TALEN-Arme, entstehen. Dies kann dazu führen, dass eine vorhandene Restriktionsschnittstelle im Bereich des Spacers mutagenisiert wird, und somit das Restriktionsenzym nicht mehr schneiden kann.For this purpose, the Enrichment PCR method was used ( Curtin et al., 2011 ). This method makes use of the fact that the action of the TALENS results in either deletions or insertions in the region of the interface, ie in the region of the spacer between the binding sites of the two TALEN arms. This can result in an existing restriction site being mutagenized in the region of the spacer, and thus can no longer cut the restriction enzyme.

Für die Bindungsstelle des TALENs für das TaTDF-Gen wurde das Restriktionsenzym RsaI identifiziert, welches im Bereich des Spacers innerhalb der genomischen Weizen-DNA schneiden sollte (1).For the binding site of TALEN for the TaTDF gene, the restriction enzyme RsaI was identified, which was to cut in the region of the spacer within the genomic wheat DNA ( 1 ).

Für die Enrichment-PCR wurde nun isolierte, genomische DNA der transgenen Weizenlinien mit dem Enzym RsaI verdaut. Mutagenisierte DNA sollte nun nicht verdaut werden, so dass bei einer anschließenden PCR über den zu mutagenisierenden Bereich des Gens nur solche DNA amplifiziert werden sollte, die nicht verdaut wurde, also durch die Wirkung des TALEN mutagenisiert wurde. Da ein Restriktionsverdau auf genomische DNA niemals vollständig ist, wird es jedoch auch immer zur Amplifikation der nicht mutagenisierten DNA kommen. In einem zweiten Schritt wurde daher das amplifizierte PCR-Produkt noch einmal mit dem Enzym RsaI verdaut. Sollten hier unverdaute Fragmente entstehen, liegt die Vermutung nahe, dass der amplifizierte Genlocus tatsächlich durch die Wirkung des TALEN mutagenisiert wurde. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurden die generierten, unverdauten PCR-Produkte in den Klonierungsvektor pGEM-T kloniert und sequenziert. For the Enrichment-PCR isolated, genomic DNA of the transgenic wheat lines was digested with the enzyme RsaI. Mutagenized DNA should now not be digested, so that in a subsequent PCR on the gene to be mutagenized only that DNA should be amplified that was not digested, that was mutagenized by the action of TALEN. However, since restriction digestion on genomic DNA is never complete, amplification of the non-mutagenized DNA will always occur. In a second step, therefore, the amplified PCR product was digested once more with the enzyme RsaI. If undigested fragments are formed here, it is likely that the amplified gene locus was indeed mutagenized by the action of TALEN. To confirm this assumption, the generated undigested PCR products were cloned into the cloning vector pGEM-T and sequenced.

Tatsächlich konnten in den generierten, transgenen Weizenlinien der Transformationen WA499 und WA500 zahlreiche Deletionen im Bereich der TALEN-Bindungsstelle detektiert werden. Diese reichten von einer Deletion von nur 1 bp bis zu 28 bp (3).Indeed, in the generated, transgenic wheat lines of the transformations WA499 and WA500, numerous deletions in the region of the TALEN binding site could be detected. These ranged from a deletion of only 1 bp up to 28 bp ( 3 ).

Des Weiteren ist zu beachten, dass für die Extraktion der DNA für die Enrichment PCR Blattmaterial verwendet wurde. Die TALENs sollten in allen Zellen aktiv sein. Somit könnte es sein, dass die detektierten Mutationen nur in dem analysierten Blattgewebe vorliegen, in anderen Teilen der Pflanze jedoch nicht. Dieser chimäre Charakter der Pflanze erfordert es, dass die transgenen Pflanzen in die nächste Generation überführt werden. Dann sollte die chimäre Natur der Pflanzen eliminiert sein, und die Mutation sollte in allen Zellen der Pflanze vorliegen und dadurch gemäß den Mendelschen Regeln vererbt werden.Furthermore, it should be noted that leaf material was used for the extraction of the DNA for Enrichment PCR. The TALENs should be active in all cells. Thus, the detected mutations may be present only in the analyzed leaf tissue but not in other parts of the plant. This chimeric character of the plant requires that the transgenic plants be transferred to the next generation. Then the chimeric nature of the plants should be eliminated, and the mutation should be present in all cells of the plant and thereby be inherited according to the Mendelian rules.

Beispiel 5: Erzeugen und Analyse von Pflanzen der T1-GenerationExample 5: Generation and analysis of plants of the T1 generation

Die transgenen Ausgangs-Weizenlinien, für die Mutationen im Bereich des TaTDF-Gens nachgewiesen werden konnten, wurden daher durch Selbstung in die nächste Generation überführt. Die aus den Körnern der T0-Pflanzen hervorgegangenen Pflanzen (T1-Generation) wurden erneut mittels PCR auf Vorhandensein der Mutation getestet. Dabei wurde zunächst eine PCR auf die einzelnen Weizenpflanzen gemacht, um dann die PCR Produkte anschließend mittels RsaI-Verdau auf Mutagenese des TaTDF-Gens zu testen. Ein vorheriger Verdau der genomischen Weizen-DNA vor der PCR Reaktion war nun nicht mehr nötig, da davon ausgegangen werden konnte, dass eine evtl. vorhandene Mutation nun in allen Zellen der Pflanze vorliegt.The transgenic parent wheat lines, for which mutations in the region of the TaTDF gene could be detected, were therefore transferred to the next generation by selfing. The plants originating from the grains of the T0 plants (T1 generation) were again tested by PCR for the presence of the mutation. Initially, a PCR was performed on the individual wheat plants to then test the PCR products by RsaI digestion for mutagenesis of the TaTDF gene. Previous digestion of the genomic wheat DNA prior to the PCR reaction was no longer necessary because it could be assumed that any existing mutation is now present in all cells of the plant.

Es stellte sich mittels des PCR Assays heraus, dass nicht alle Pflanzen die in der T0-Generation gefundene Mutation weitervererbten.It was found by the PCR assay that not all plants passed on the mutation found in the T0 generation.

Besonderes Interesse weckte die Linie WA500-T-003, da hier in der T0-Pflanze in der Enrichment PCR nahezu die gesamte amplifizierte DNA nicht durch RsaI geschnitten werden konnte. In dem PCR-Assay auf die Selbstungsnachkommenschaft dieser Linie wurde daher erwartet, auch solche Pflanzen zu identifizieren, die nach Verdau der amplifizierten DNA nur unverdautes PCR Produkt nach Gelanalyse zeigen würden. Diese Pflanzen wären dann homozygot für die Mutation. Erstaunlicherweise war dies jedoch nicht der Fall, sondern es wurde in allen Pflanzen sowohl unverdaute als auch verdaute DNA Fragmente identifiziert (4). Überraschend war allerdings, dass das Verhältnis zwischen verdauten und unverdauten PCR Fragmenten unterschiedlich war. Dies ließ den Schluss zu, dass in der Linie WA500-T-003 zwar eine Mutation im TaTDF-Gen stattgefunden hatte, aber möglicherweise nicht auf allen Chromosomen bzw. nicht auf allen Chromosomen der drei Weizen(sub)genome.Of particular interest was the WA500-T-003 line, since in the T0 plant in Enrichment PCR almost all of the amplified DNA could not be cut by RsaI. In the self-progeny progeny PCR assay, therefore, it was also expected to identify those plants which, after digestion of the amplified DNA, would show only undigested PCR product after gel analysis. These plants would then be homozygous for the mutation. Surprisingly, this was not the case, but both undigested and digested DNA fragments were identified in all plants ( 4 ). However, it was surprising that the ratio between digested and undigested PCR fragments was different. This suggested that there was a mutation in the TaTDF gene in the WA500-T-003 line, but might not be on all chromosomes or all chromosomes of the three wheat (sub) genomes.

Beispiel 6: Subgenom-spezifische Analyse der Pflanzen der T1-GenerationExample 6: Subgenom-specific analysis of plants of the T1 generation

Durch Amplifikation von ca. 1 kb langen Fragmenten aus dem Genom der Weizensorte „Taifun” im Bereich des TaTDF-Gens und anschließender Sequenzierung von 8 klonierten PCR-Fragmenten, konnten die Sequenzen des TaTDF-Locus in den einzelnen Subgenomen identifiziert werden (5). Dementsprechend konnten Primersysteme entwickelt werden, die spezifisch den TaTDF-Locus nur eines Subgenoms amplifizieren (Tabelle 1). Nachweis Subgenom Primer SEQ ID NO: Sequence Fragmentgröße A TDF-4AS-1 13 ATCGAGAAAGTAACCGATGGATGA 406 bp TDF1-1 14 TGCTGCGACAAGGCCAACGT B TDF-4BL-1 15 GTGTGTTGCGTCATGGATGG 190 bp TDF-4DL-1 16 ATGCATGTACTACACAGAGAGAC D TDF-4DL-1 17 ATGCATGTACTACACAGAGAGAC 190 bp TDF-4DL-2 18 GTGTGTTGCATCATGGATGC Tabelle 1: Primersysteme für die subgenomspezifische Amplifikation des Weizen TaTDF-Gens. By amplification of approximately 1 kb fragments from the genome of the wheat variety "Taifun" in the region of the TaTDF gene and subsequent sequencing of 8 cloned PCR fragments, the sequences of the TaTDF locus in the individual subgenomes could be identified ( 5 ). Accordingly, primer systems could be developed that specifically amplify the TaTDF locus of only one subgenome (Table 1). Proof Subgenomes primer SEQ ID NO: Sequence fragment size A TDF-4AS-1 13 ATCGAGAAAGTAACCGATGGATGA 406 bp TDF1-1 14 TGCTGCGACAAGGCCAACGT B TDF 4BL-1 15 GTGTGTTGCGTCATGGATGG 190 bp TDF-4DL-1 16 ATGCATGTACTACACAGAGAGAC D TDF-4DL-1 17 ATGCATGTACTACACAGAGAGAC 190 bp TDF-4DL-2 18 GTGTGTTGCATCATGGATGC Table 1: Primer systems for the subgenome-specific amplification of the wheat TaTDF gene.

Die entwickelten Primer wurden dann wieder für das PCR Assay eingesetzt, bei dem das amplifizierte Fragment des TaTDF-Gens anschließend mit RsaI verdaut wurde.The primers developed were then used again for the PCR assay, in which the amplified fragment of the TaTDF gene was subsequently digested with RsaI.

Dabei konnten für die Nachkommen der Linie WA500-T-003 Mutationen in allen drei Subgenomen festgestellt werden (Tabelle 2). A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom Name hetero homo hetero homo hetero homo WA500-T-003-002 – + – + – – WA500-T-003-003 – + + – – + WA500-T-003-008 – + + – – – WA500-T-003-009 – + + – + – WA500-T-003-010 – + – – – + WA500-T-003-012 – + – + + – WA500-T-003-014 – + + – – – WA500-T-003-015 – + + – + – WA500-T-003-020 – + + – + – WA500-T-003-021 – + – + + – WA500-T-003-024 – + – – – + WA500-T-003-025 – + – + + – WA500-T-003-026 – + + – + – WA500-T-003-035 – + – + – – WA500-T-003-038 – + + – – – WA500-T-003-039 – + + – + – Tabelle 2: Analyse der Mutationen im TaTDF-Locus von Nachkommen der Linie WA500-T-003 mittels Subgenom-spezifischer PCR. Unterstrichen markiert sind Pflanzen, die Mutationen in allen drei Subgenomen des TaTDF-Locus tragen (WA500-T-003-003, WA500-T-003-009, WA500-T-003-012, WA500-T-003-015, WA500-T-003-020, WA500-T-003-021, WA500-T-003-025, WA500-T-003-026 und WA500-T-003-039). Mutations in all three subgenomes could be detected for offspring of the WA500-T-003 line (Table 2). A subgenomic D subgenomic B subgenomic Surname hetero homo hetero homo hetero homo WA500 T-003-002 - + - + - - WA500 T-003-003 - + + - - + WA500 T-003-008 - + + - - - WA500 T-003-009 - + + - + - WA500 T-003-010 - + - - - + WA500 T-003-012 - + - + + - WA500 T-003-014 - + + - - - WA500 T-003-015 - + + - + - WA500 T-003-020 - + + - + - WA500 T-003-021 - + - + + - WA500 T-003-024 - + - - - + WA500 T-003-025 - + - + + - WA500 T-003-026 - + + - + - WA500 T-003-035 - + - + - - WA500 T-003-038 - + + - - - WA500 T-003-039 - + + - + - Table 2: Analysis of the mutations in the TaTDF locus of progeny line WA500-T-003 by subgenom-specific PCR. Underlined are plants bearing mutations in all three subgenomes of the TaTDF locus (WA500-T-003-003, WA500-T-003-009, WA500-T-003-012, WA500-T-003-015, WA500 -T-003-020, WA500-T-003-021, WA500-T-003-025, WA500-T-003-026 and WA500-T-003-039).

PCR-Produkte des TaTDF-Locus spezifisch für das A-, B- oder D-Subgenom wurden generiert und anschließend mit RsaI verdaut. Bei Vorliegen von ausschließlich unverdauter DNA wurde davon ausgegangen, dass die Mutation homozygot vorliegt, bei Vorliegen von unverdauter und verdauter DNA wurde davon ausgegangen, dass die Mutation im heterozygoten Zustand vorliegt.PCR products of the TaTDF locus specific for the A, B or D subgenome were generated and subsequently digested with RsaI. In the presence of exclusively undigested DNA, it was assumed that the mutation was homozygous; in the presence of undigested and digested DNA it was assumed that the mutation was in the heterozygous state.

Erstaunlicherweise konnten dabei innerhalb der Nachkommenschaft der Linie WA500-T-003 Einzelpflanzen identifiziert werden, die in allen drei Genloci des TaTDF-Gens eine Mutation aufwiesen. Die Mutation im A-Subgenom lag bereits homozygot vor, so dass davon ausgegangen werden muss, dass bereits in der T0-Pflanzen beide Genloci des TaTDF-Gens auf dem A-Subgenom durch die Wirkung des TALEN mutagenisiert wurden.Surprisingly, it was possible to identify individual plants within the progeny of the WA500-T-003 line, which had a mutation in all three gene loci of the TaTDF gene. The mutation in the A subgenome was already homozygous, so that it must be assumed that already in the T0 plant both gene loci of the TaTDF gene on the A subgenome were mutagenized by the action of TALEN.

Um in zukünftigen Analysen den Arbeitsaufwand zu reduzieren, wurden basierend auf den Primersystemen Markersysteme für die Kapillarelektrophorese entwickelt. Diese Markersysteme konnten eindeutig die Mutationen auf dem A-, B- und D-Subgenom nachweisen, sowie zwischen homozygoten und heterozygoten Pflanzen unterscheiden (Tabelle 3). Name A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom WA500-T-003-002 403 190 189 WA500-T-003-003 403 187 186/189 WA500-T-003-008 403 190 186/189 WA500-T-003-009 403 187/190 186/189 WA500-T-003-010 403 187 189 WA500-T-003-012 403 187/190 186 WA500-T-003-014 403 190 186/189 WA500-T-003-015 403 187/190 186/189 WA500-T-003-020 403 187/190 186/189 WA500-T-003-021 403 187/190 186 WA500-T-003-024 403 187 189 WA500-T-003-025 403 187/190 186 WA500-T-003-026 403 187/190 186/189 WA500-T-003-035 403 190 186 WA500-T-003-038 403 190 186/189 WA500-T-003-039 403 187/190 186/189 Avalon 405 190 189 Cadenza 405 190 189 Chinese Spring 405 190 189 Opus 405 190 189 Claire 405 190 189 Julius 405 190 189 Tabelle 3: Subgenom-spezifische Untersuchung des TaTDF-Locus mittels Kapillarelektrophorese. DNA der Nachkommen der Linie WA500-T-003 wurde für eine PCR des TaTDF-Locus mit fluoreszenzmarkierten, Subgenom-spezifischen Primern eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden dann in der Kapillarelektrophorese aufgetrennt, um so Größenunterschiede von ≥ 1 bp zu detektieren. Als Kontrolle wurden DNAs von verschiedenen kommerziell erhältlichen fertilen Weizensorten eingesetzt (letzte 7 Zeilen). Im A-Subgenom konnte in den WA500-T-003-Nachkommen eine 2 bp Deletion festgestellt werden, die als 403 bp Fragment anstelle eines 405 bp Fragmentes in der Kapillarelektrophorese zu erkennen ist. Tritt nur das 403 bp Fragment auf, so liegt die Mutation homozygot vor; können sowohl das 403 bp als auch das 405 bp Fragment detektiert werden, so liegt die Mutation heterozygot vor; kann nur das 405 bp Fragment detektiert werden, so liegt die wt-Sequenz homozygot vor. Im D-Subgenom liegt eine Deletion von 3 bp vor, ebenso im B-Subgenom. Beim D-Subgenom wird im wt ein PCR Fragment von 190 bp in der Kapillarelektrophorese detektiert. Tritt die Mutation homozygot auf, so wird nur ein 187 bp Fragment detektiert, im heterozygoten Zustand wird sowohl ein 187 bp als auch ein 190 bp Fragment detektiert. Ähnlich verhält es sich für das B-Subgenom, nur das hier ein 189 bp Fragment im wt detektiert wird, wohingegen in homozygoten Mutanten ein 186 bp Fragment und in heterozygoten Mutanten ein 186 bp und ein 189 bp Fragment detektiert wird. Der Assay ließ ebenfalls eine Aussage darüber zu, ob die Deletion homozygot (einfach unterstrichen) oder heterozygot (doppelt unterstrichen) vorliegt. In order to reduce the workload in future analyzes, marker systems for capillary electrophoresis were developed based on the primer systems. These marker systems were clearly the Identify mutations on the A, B and D subgenomes as well as distinguish between homozygous and heterozygous plants (Table 3). Surname A subgenomic D subgenomic B subgenomic WA500 T-003-002 403 190 189 WA500 T-003-003 403 187 186/189 WA500 T-003-008 403 190 186/189 WA500 T-003-009 403 187/190 186/189 WA500 T-003-010 403 187 189 WA500 T-003-012 403 187/190 186 WA500 T-003-014 403 190 186/189 WA500 T-003-015 403 187/190 186/189 WA500 T-003-020 403 187/190 186/189 WA500 T-003-021 403 187/190 186 WA500 T-003-024 403 187 189 WA500 T-003-025 403 187/190 186 WA500 T-003-026 403 187/190 186/189 WA500 T-003-035 403 190 186 WA500 T-003-038 403 190 186/189 WA500 T-003-039 403 187/190 186/189 Avalon 405 190 189 Cadenza 405 190 189 Chinese Spring 405 190 189 opus 405 190 189 Claire 405 190 189 Julius 405 190 189 Table 3: Subgenom-specific examination of the TaTDF locus by capillary electrophoresis. Descendants of the WA500-T-003 line were used for PCR of the TaTDF locus with fluorescently labeled, subgenom-specific primers. The PCR products were then separated by capillary electrophoresis to detect size differences of ≥ 1 bp. As a control, DNAs from various commercially available fertile wheat cultivars were used (last 7 lines). In the A sub-genome, a 2 bp deletion could be detected in the WA500-T-003 offspring, which can be recognized as a 403 bp fragment instead of a 405 bp fragment in capillary electrophoresis. If only the 403 bp fragment occurs, the mutation is homozygous; if both the 403 bp and the 405 bp fragment can be detected, then the mutation is heterozygous; if only the 405 bp fragment can be detected, the wt sequence is homozygous. There is a deletion of 3 bp in the D subgenome, as well as in the B subgenome. In the D-subgenome, a PCR fragment of 190 bp is detected in the wt in capillary electrophoresis. If the mutation occurs homozygously, only a 187 bp fragment is detected; in the heterozygous state, both a 187 bp and a 190 bp fragment are detected. The situation is similar for the B subgenome, except that here a 189 bp fragment is detected in the wt, whereas in homozygous mutants a 186 bp fragment and in heterozygous mutants a 186 bp and a 189 bp fragment is detected. The assay also suggested whether the deletion was homozygous (single underlined) or heterozygous (double underlined).

Beispiel 7: Erzeugen und Analyse von Pflanzen, welche die Mutation homozygot tragenExample 7: Generation and analysis of plants homozygous for the mutation

Auf Grundlage der Nachkommenschaftsanalyse der Linie WA500-T-003 wurden zwei Einzelpflanzen ausgewählt, WA500-T-003-003 bzw. WA500-T-003-021. WA500-T-003-003 war homozygot für das A- und D-Subgenom, und heterozygot für das B-Subgenom. WA500-T-003-021 hingegen war homozygot für das A-Subgenom und das B-Subgenom, aber nur heterozygot für das D-Subgenom.Based on progeny analysis of line WA500-T-003, two single plants were selected, WA500-T-003-003 and WA500-T-003-021, respectively. WA500-T-003-003 was homozygous for the A and D Subgenom, and heterozygous for the B subgenome. WA500-T-003-021, on the other hand, was homozygous for the A subgenome and the B subgenome, but only heterozygous for the D subgenome.

Beide Linien wurden im Gewächshaus geselbstet, und die Nachkommen wurden mit Hilfe des Markersystems auf Anwesenheit der Mutationen in den einzelnen Subgenomen getestet.Both lines were selfed in the greenhouse, and the progeny were tested for the presence of mutations in the individual subgenomes using the marker system.

Dabei konnten bei beiden Nachkommenschaften Pflanzen identifiziert werden, die für alle drei Subgenome die Mutationen im TaTDF-Genlocus homozygot tragen (Tabelle 4). Diese Pflanzen wurden im Gewächshaus zur Blüte gebracht. Dabei zeigte sich, dass keine der Pflanzen in der Lage war, funktionale Antheren zu bilden, die Pflanzen also männlich steril sind (6–8). Name A-Subgenom D-Subgenom B-Subgenom Taifun 405 190 189 WA500-T-003-003-01 403 187 189 WA500-T-003-003-02 403 187 186/189 WA500-T-003-003-03 403 187 189 WA500-T-003-003-04 403 187 186 WA500-T-003-003-05 403 187 186 WA500-T-003-003-06 403 187 189 WA500-T-003-003-08 403 187 186/189 WA500-T-003-003-09 403 187 186/189 WA500-T-003-003-10 403 187 186/189 WA500-T-003-003-11 403 187 186 WA500-T-003-003-13 403 187 186/189 WA500-T-003-003-14 403 187 186 WA500-T-003-003-15 403 187 189 WA500-T-003-003-16 403 187 186/189 WA500-T-003-003-17 403 187 186/189 WA500-T-003-003-18 403 187 186 WA500-T-003-003-19 403 187 186 WA500-T-003-003-20 403 187 186 WA500-T-003-003-21 403 187 186 WA500-T-003-003-23 403 187 186/189 WA500-T-003-003-24 403 187 186 WA500-T-003-003-25 403 187 186 WA500-T-003-021-01 403 187 186 WA500-T-003-021-02 403 187 186 WA500-T-003-021-03 403 187/190 186 WA500-T-003-021-04 403 187/190 186 WA500-T-003-021-05 403 187/190 186 WA500-T-003-021-06 403 190 186 WA500-T-003-021-07 403 187/190 186 WA500-T-003-021-08 403 187 186 WA500-T-003-021-09 403 190 186 WA500-T-003-021-10 403 190 186 WA500-T-003-021-11 403 187 186 WA500-T-003-021-12 403 190 186 WA500-T-003-021-13 403 187/190 186 WA500-T-003-021-14 403 187/190 186 WA500-T-003-021-15 403 187/190 186 WA500-T-003-021-17 403 187/190 186 WA500-T-003-021-18 403 187/190 186 WA500-T-003-021-19 403 187/190 186 WA500-T-003-021-20 403 187/190 186 WA500-T-003-021-21 403 187 186 WA500-T-003-021-22 403 190 186 WA500-T-003-021-23 403 187 186 WA500-T-003-021-24 403 187/190 186 WA500-T-003-021-25 403 187 186 Tabelle 4: Subgenomspezifischer Nachweis von Deletionen im TaTDF-Locus von Nachkommen der Linien WA500-T-003-03 und WA500-T-003-21 mittels Kapillarelektrophoresemarker. Die Unterstreichung makiert Linien, welche für alle drei Deletionen homozygot sind. Both progeny plants were identified as homozygous for all three subgenomes of the mutations in the TaTDF gene locus (Table 4). These plants were brought to flower in the greenhouse. It was found that none of the plants was able to form functional anthers, so the plants are male sterile ( 6 - 8th ). Surname A subgenomic D subgenomic B subgenomic typhoon 405 190 189 WA500 T-003-003-01 403 187 189 WA500 T-003-003-02 403 187 186/189 WA500 T-003-003-03 403 187 189 WA500 T-003-003-04 403 187 186 WA500 T-003-003-05 403 187 186 WA500 T-003-003-06 403 187 189 WA500 T-003-003-08 403 187 186/189 WA500 T-003-003-09 403 187 186/189 WA500 T-003-003-10 403 187 186/189 WA500 T-003-003-11 403 187 186 WA500 T-003-003-13 403 187 186/189 WA500 T-003-003-14 403 187 186 WA500 T-003-003-15 403 187 189 WA500 T-003-003-16 403 187 186/189 WA500 T-003-003-17 403 187 186/189 WA500 T-003-003-18 403 187 186 WA500 T-003-003-19 403 187 186 WA500 T-003-003-20 403 187 186 WA500 T-003-003-21 403 187 186 WA500 T-003-003-23 403 187 186/189 WA500 T-003-003-24 403 187 186 WA500 T-003-003-25 403 187 186 WA500 T-003-021-01 403 187 186 WA500 T-003-021-02 403 187 186 WA500 T-003-021-03 403 187/190 186 WA500 T-003-021-04 403 187/190 186 WA500 T-003-021-05 403 187/190 186 WA500 T-003-021-06 403 190 186 WA500 T-003-021-07 403 187/190 186 WA500 T-003-021-08 403 187 186 WA500 T-003-021-09 403 190 186 WA500 T-003-021-10 403 190 186 WA500 T-003-021-11 403 187 186 WA500 T-003-021-12 403 190 186 WA500 T-003-021-13 403 187/190 186 WA500 T-003-021-14 403 187/190 186 WA500 T-003-021-15 403 187/190 186 WA500 T-003-021-17 403 187/190 186 WA500 T-003-021-18 403 187/190 186 WA500 T-003-021-19 403 187/190 186 WA500 T-003-021-20 403 187/190 186 WA500 T-003-021-21 403 187 186 WA500 T-003-021-22 403 190 186 WA500 T-003-021-23 403 187 186 WA500 T-003-021-24 403 187/190 186 WA500 T-003-021-25 403 187 186 Table 4: Subgenome-specific detection of deletions in the TaTDF locus of progeny lines WA500-T-003-03 and WA500-T-003-21 using capillary electrophoresis markers. The underline marks lines that are homozygous for all three deletions.

Die Ähren dieser Pflanzen (der Nachkommen von WA500-T-003-003 und WA500-T-003-021) wurden dann mit einer Tüte isoliert, um zu prüfen ob doch noch eine Selbstbefruchtung möglich war. In keiner der isolierten Weizenähren konnten Samen gefunden werden. Somit konnte eine 100%-ige männlichen Sterilität etabliert werden.The ears of these plants (the progeny of WA500-T-003-003 and WA500-T-003-021) were then isolated with a bag to check if self-fertilization was still possible. Seeds could not be found in any of the isolated wheat ears. Thus, a 100% male sterility could be established.

Die weiblichen Blütenorgane der Pflanzen hingegen sind vollkommen normal ausgebildet, was auf keine Störung der weiblichen Fertilität hindeutet. Auch sonst können an den Pflanzen keine anormalen Phänotypen beobachtet werden.In contrast, the female flower organs of the plants are perfectly normal, which does not indicate a disturbance of female fertility. Even otherwise no abnormal phenotypes can be observed on the plants.

Um die weibliche Fertilität zu überprüfen, wurden Kreuzungen mit Pollen einer Winterweizensorte durchgeführt. In den Kreuzungsähren wurden Körner in normaler Anzahl gebildet, so dass eine 100%-ige weibliche Fertilität der Ähren nachgewiesen ist.To check female fertility, crosses were made with pollen from a winter wheat variety. In the crossbreeds grains were formed in normal numbers, so that a 100% female fertility of the ears is detected.

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Claims (20)

Männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche Allele des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens inaktiviert sind.Male sterile plant of the genus Triticum, characterized in that all the alleles of the gene encoding tapetal development and function (TDF) are inactivated. Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das für tapetal development and function (TDF) codierende Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus den folgenden: (a) Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder SEQ ID NO: 7, 8 oder 9; (b) Nukleotidsequenz, die für ein Protein enthaltend eine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 11 oder 12 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Identität von mindestens 80% zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 11 oder 12 aufweist, codiert; (c) Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu (a) oder (b); (d) Nukleotidsequenz, die homolog ist zu (a) oder (b), wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein codiert; (e) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; und (f) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (c) hybridisiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein codiert.Plant according to claim 1, characterized in that the gene encoding tapetal development and function (TDF) comprises a nucleotide sequence selected from the following: (a) nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or SEQ ID NO: 7, 8 or 9; (b) a nucleotide sequence which is for a protein comprising one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 10, 11 or 12 or an amino acid sequence which has an identity of at least 80% to one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 10, 11 or 12, coded; (c) nucleotide sequence complementary to (a) or (b); (d) a nucleotide sequence homologous to (a) or (b), wherein the nucleotide sequence encodes a TDF protein; (e) nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with (a) or (b); and (f) a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to (c), wherein the nucleotide sequence encodes a TDF protein. Pflanze nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das inaktivierte TDF-Gen eine oder mehrere Mutation(en) enthält.Plant according to claim 1 or 2, characterized in that the inactivated TDF gene contains one or more mutation (s). Pflanze nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation(en) in den Allelen in demselben Exon des TDF-Gens liegt (liegen), vorzugsweise in Exon 2.Plant according to claim 3, characterized in that the mutation (s) in the alleles are located in the same exon of the TDF gene, preferably in exon 2. Pflanze nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation(en) im Exon 2 in einer Region zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 286 der SEQ ID NO: 3 (Referenzsequenz) liegt (liegen), bevorzugt: (a) zwischen den Nukleotidpositionen 256 und 285 der SEQ ID NO: 3, (b) zwischen den Nukleotidpositionen 258 und 285 der SEQ ID NO: 3, (c) zwischen den Nukleotidpositionen 281 und 286 der SEQ ID NO: 3, (d) zwischen den Nukleotidpositionen 281 und 283 der SEQ ID NO: 3; oder (e) an der Nukleotidposition 282 der SEQ ID NO: 3.Plant according to claim 4, characterized in that the mutation (s) in exon 2 lie in a region between nucleotide positions 256 and 286 of SEQ ID NO: 3 (reference sequence), preferably: (a) between nucleotide positions 256 and 285 of SEQ ID NO: 3, (b) between nucleotide positions 258 and 285 of SEQ ID NO: 3, (c) between nucleotide positions 281 and 286 of SEQ ID NO: 3, (d) between nucleotide positions 281 and 283 of FIG SEQ ID NO: 3; or (e) at nucleotide position 282 of SEQ ID NO: 3. Pflanze nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation(en) Deletionen sind, vorzugsweise Deletionen von 1 bis 28 Nukleotiden.Plant according to one of claims 3 to 5, characterized in that the mutation (s) are deletions, preferably deletions of 1 to 28 nucleotides. Pflanze nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation(en) transgen oder nicht-transgen erzeugt wurde(n).Plant according to any one of Claims 3 to 6, characterized in that the mutation (s) are transgenic or non-transgenic (n). Teil und Samen der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7.Part and seeds of the plant according to one of claims 1 to 7. Nachkommen der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7, oder ein Teil oder Samen davon, enthaltend mindestens ein inaktiviertes Allel des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens.Progeny of the plant according to any one of claims 1 to 7, or a part or seed thereof containing at least one inactivated allele of the gene coding for tapetal development and function (TDF). Nachkommenpflanze gemäß Anspruch 9, oder ein Teil oder Samen davon, wobei die Nachkommenpflanze eine Hybridpflanze der Gattung Triticum ist.A progeny plant according to claim 9, or a part or seed thereof, wherein the progeny plant is a hybrid plant of the genus Triticum. Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus den folgenden: (a) Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder SEQ ID NO: 7, 8 oder 9; (b) Nukleotidsequenz, die für ein Protein enthaltend eine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 11 oder 12 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Identität von mindestens 80% zu einer der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 10, 11 oder 12 aufweist, codiert; (c) Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu (a) oder (b); (d) Nukleotidsequenz, die homolog ist zu (a) oder (b), wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein codiert; (e) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; (f) Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (c) hybridisiert, wobei die Nukleotidsequenz für ein TDF-Protein codiert; (g) Nukleotidsequenz, die eine Teilsequenz der in (a) bis (f) genannten Nukleotidsequenzen mit mindestens 17 aufeinanderfolgende Nukleotiden in sense, anti-sense oder komplementärer Orientierung ist.A nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the following: (a) nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or SEQ ID NO: 7, 8 or 9; (b) a nucleotide sequence which is for a protein comprising one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 10, 11 or 12 or an amino acid sequence which has an identity of at least 80% to one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 10, 11 or 12, coded; (c) nucleotide sequence complementary to (a) or (b); (d) a nucleotide sequence homologous to (a) or (b), wherein the nucleotide sequence encodes a TDF protein; (e) nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with (a) or (b); (f) a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to (c), wherein the nucleotide sequence codes for a TDF protein; (g) A nucleotide sequence which is a partial sequence of the nucleotide sequences mentioned in (a) to (f) with at least 17 consecutive nucleotides in sense, anti-sense or complementary orientation. Vektor umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 11.Vector comprising the nucleic acid according to claim 11. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die folgenden Schritte: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze mit der Nukleinsäure nach Anspruch 11 oder mit dem Vektor nach Anspruch 12; und (ii) Regenerieren einer Pflanze aus der mindestens einen transformierten Zelle aus (i). A method of producing a transgenic plant comprising the steps of: (i) transforming at least one cell of a plant with the nucleic acid of claim 11 or the vector of claim 12; and (ii) regenerating a plant from the at least one transformed cell from (i). Verfahren zur Restauration der Fertilität einer männlich sterilen Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die folgenden Schritte: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit der Nukleinsäure nach Anspruch 11 oder mit dem Vektor nach Anspruch 12, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz codierend für ein TDF-Gen umfasst; und (ii) Regenerieren einer fertilen Pflanze aus der mindestens einen transformierten Zelle aus (i).A method of restoring fertility of a male sterile plant according to any one of claims 1 to 7, comprising the following steps: (i) transforming at least one cell of the plant according to any one of claims 1 to 7 with the nucleic acid according to claim 11 or with the vector according to claim 12, wherein the nucleic acid comprises a nucleotide sequence coding for a TDF gene; and (ii) regenerating a fertile plant from the at least one transformed cell from (i). Pflanze der Gattung Triticum, hergestellt durch das Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, oder umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 11 oder den Vektor nach Anspruch 12.Plant of the genus Triticum, produced by the method according to claim 13 or 14, or comprising the nucleic acid according to claim 11 or the vector according to claim 12. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls umfassend eine Teilsequenz einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus (a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9; (b) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9; oder (c) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert zum Nachweis, dass ein Allel des für TDF codierenden Gens inaktiviert ist.Use of a nucleic acid molecule comprising a partial sequence of a nucleotide sequence selected from (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9; (B) a nucleotide sequence which is complementary to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9; or (c) a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with (a) or (b) to demonstrate that one allele of the TDF coding gene is inactivated. Verfahren zum Aufrechterhalten der männlichen Sterilität einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die folgenden Schritte: (i) Transformieren von mindestens einer Zelle einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einem DNA-Konstrukt umfassend (a) ein aktives Allel des für TDF codierenden Gens, (b) ein Pollen-spezifisch exprimiertes Transgen, welches für ein Nukleinsäuremolekül oder ein Protein codiert, das die Ausbildung von fertilen Pollen verhindert, und (c) ein Transgen, das in der Pflanze ein phänotypisches Merkmal verursacht, welches als Selektionsmarker verwendet werden kann; (ii) Regenerieren einer fertilen Pflanze aus der transformierten Zelle aus (i), (iii) Selbsten der Pflanzen aus (ii), und (iv) Selektieren von Nachkommenpflanzen aufgrund des Selektionsmarkers.A method of maintaining male sterility of a plant according to any one of claims 1 to 7, comprising the following steps: (i) transforming at least one cell of a plant according to any one of claims 1 to 7 with a DNA construct comprising (a) an active allele of the TDF coding gene, (b) a pollen-specifically expressed transgene that encodes a nucleic acid molecule or protein that prevents the formation of fertile pollen, and (c) a transgene that causes a phenotypic trait in the plant that can be used as a selection marker; (ii) regenerating a fertile plant from the transformed cell of (i), (iii) the selves of the plants of (ii), and (iv) Selecting progeny plants based on the selection marker. Verfahren zum Herstellen einer männlich sterilen Pflanze der Gattung Triticum, umfassend das Inaktivieren von sämtlichen Allelen des für TDF codierenden Gens in der Pflanze.A method of producing a male sterile plant of the genus Triticum comprising inactivating all alleles of the TDF coding gene in the plant. Pflanze der Gattung Triticum enthaltend mindestens ein inaktiviertes Allel des für tapetal development and function (TDF) codierenden Gens, erhältlich durch Kreuzen der Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einer Pflanze, die mindestens ein aktives Allel des für TDF codierenden Gens in einem Subgenom aufweist.Plant of the genus Triticum containing at least one inactivated allele of the gene coding for tapetal development and function (TDF), obtainable by crossing the plant according to any one of claims 1 to 7 with a plant containing at least one active allele of the TDF coding gene in a subgenome having. Verfahren zum Nachweis einer männlichen Sterilität in einer Pflanze der Gattung Triticum oder in Samen davon, umfassend die folgenden Schritte: (i) Isolieren von DNA aus der Pflanze oder dem Samen, (ii) Analysieren der DNA mit Hilfe eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Teilsequenz einer Nukleotidsequenz aufweist, ausgewählt aus (a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9, (b) einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, oder 9, oder (c) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit (a) oder (b) hybridisiert; und (iii) Identifizieren einer Pflanze, in welcher sämtliche Allele des für TDF codierenden Gens inaktiviert sind.A method for detecting male sterility in a plant of the genus Triticum or in seeds thereof, comprising the following steps: (i) isolating DNA from the plant or seed, (ii) analyzing the DNA using a nucleic acid molecule having a partial sequence of a nucleotide sequence selected from (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9, (B) a nucleotide sequence which is complementary to a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9, or (c) a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with (a) or (b); and (iii) identifying a plant in which all alleles of the TDF coding gene are inactivated.

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