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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe, umfassend die Schritte (a) Erhalten einer biologischen Probe von einem Säugetier, (b) Gewinnen von mindestens zwei extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukten aus der biologischen Probe, (c) Nachweis der mindestens zwei extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukte aus dem Extrakt, (d) Bestimmung eines Musters anhand der Anwesenheit oder des Massenverhältnisses der mindestens zwei extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukte, (e) Vergleichen des Musters mit dem Muster einer Rückstellprobe. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung dient bevorzugt der eindeutigen Rückführbarkeit von Körpermaterialien und/oder Ausscheidungen auf ein Individuum, beispielsweise bei einem Drogentest im Urin. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Durchführung des beschriebenen Verfahrens.
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Hintergrund der Erfindung
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Um festzustellen, ob Arznei- oder Suchtstoffe in einem Individuum im Körper vorhanden sind, können im Labor Analysen in verschiedenen Körpermaterialien durchgeführt werden. Eine Laboranalyse wird in der Regel benötigt, wenn der Verdacht auf einen Missbrauch besteht. Dies spielt eine Rolle in der Suchtmedizin, wie bei Drogen- oder Arzneimittelmissbrauch oder der Kontrolle eines Entzugs, bei der Überwachung der Drogenfreiheit am Arbeitsplatz oder bei forensischen Fragestellungen. Wenn Köpermaterialien (z. B. Blut, Urin, Speichel, Sekrete, Punktate, Gewebsbiopsien) in ein analytisches Labor eingesendet werden, ist nicht immer gesichert, dass die eingesendete Probe eindeutig auf das Individuum zurückgeführt werden kann, von dem sie eigentlich stammt. Es kann zu zufälligen oder absichtlichen Probenvertauschungen oder Verfälschungen kommen. Diese Gefahr ist besonders bei Urinproben gegeben, die für die Drogenanalytik besonders geeignet sind, da ihre Gewinnung nicht-invasiv ist und die im Urin ausgeschiedenen Arzneimittel- und Drogen und deren Metabolite in höherer Konzentration als im Blut vorliegen und lange nachgewiesen werden können. Über das Profil der Metaboliten sind außerdem zusätzliche Aussagen zur Verstoffwechselung im Körper möglich.
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Während bei der Entnahme von Blut, Speichel, Punktionen und Biopsien der Untersucher direkt am Probanden tätig werden muss und damit zumindest bei der Probenentnahme eine Sichtkontrolle besteht, ist dies bei der Urinsammlung oder dem Absetzen von Fäkalien nicht immer gegeben. Obwohl bei Fragestellungen zum Arzneimittel- und Drogenmissbrauch gefordert wird, dass das üblicherweise für die Analytik verwendete Körpermaterial Urin unter Sicht abgegeben werden soll, ist dies nicht immer zu gewährleisten. Es müssen die baulichen Gegebenheiten vorhanden sein und die Intimsphäre der Probanden gewahrt werden. Bei mangelnder Aufsicht ist aber gerade bei Urin die Gefahr der Manipulation und vor allem die Abgabe eines Urins von einem anderen Individuum also einer falschen Probe besonders groß.
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Um den Austausch des Materials aufzudecken, wurden Vorgehensweisen etabliert, bei denen die Individuen Markierungssubstanzen oral zu sich nehmen müssen, die über den Urin als Muttersubstanzen oder als Metabolite im Urin ausgeschieden werden. Sind die Markierungssubstanzen oder deren Stoffwechselprodukte im untersuchten Urin nicht nachweisbar, besteht der Verdacht auf die Abgabe einer Probe von einem anderen Individuum.
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Das
europäische Patent Nr. 1 410 014 B1 beschreibt ein Verfahren, durch welches eine Probe, die von einer Ausscheidung, von einer Körperflüssigkeit eines Säugetiers oder als Gewebeprobe entnommen wurde, in Bezug auf die Herkunft der Probe identifiziert und so dem Donor der Probe eindeutig zugeordnet werden kann. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) orales Verabreichen einer Kombination von mindestens zwei Markersubstanzen an ein Säugetier, (b) Abwarten über einen Zeitraum, welcher ausreichend ist, dass die Kombination der mindestens zwei Markersubstanzen an den Ort der Probenentnahme gelangt, (c) Entnahme einer biologischen Probe von dem Säugetier, (d) Untersuchen der biologischen Probe auf die Anwesenheit und/oder Menge der Kombination der mindestens zwei Markersubstanzen oder Derivaten davon und (e), wenn die Kombination der mindestens zwei Markersubstanzen oder der Derivate davon in der biologischen Probe nachweisbar ist, Untersuchen der biologischen Probe auf einen Analyten. Hierbei handelt es sich bei der biologischen Probe, die von dem Säugetier entnommen wird, um Urin, der in einem Sammelgefäß aufgefangen wird. Gemäß
EP 1 410 014 B1 zeichnet sich das Verfahren dadurch aus, dass mindestens zwei Markersubstanzen ausgewählt werden aus Isoprenoiden, Lipiden, Sacchariden, Polyolen, Polyethylenglykolen oder Derivaten davon. Ein derartiges Verfahren ist kommerziell unter dem Markennamen Ruma
® im Handel.
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Nachteilig für das in
EP 1 410 014 B1 beschriebenen Verfahren ist die Tatsache, dass nach oraler Einnahme der Markersubstanzen eine geraume Zeit vergeht bis die Substanzen bzw. deren Metabolite im Urin nachweisbar werden. Wenn der Proband/Patient die Markersubstanzen unter Sicht in einer Einrichtung einnehmen muss, ist es erforderlich, dass mehrere Stunden abgewartet werden müssen, bevor der Urin gewonnen und untersucht werden kann.
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Es wurde daher ein Verfahren sowie ein Kit für ein Identifikationssystem beim Deutschen Patent- und Markenamt angemeldet (
DE 10 2008 061 174 ), bei dem die im Verfahren gemäß
EP 1 410 014 B1 notwendige Wartezeit entfällt.
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Das Verfahren der
DE 10 2008 061 174 zur Identifikation von biologischen Proben umfasst die Schritte (a) Gewinnen einer DNA-Probe des Spenders, (b) Bestimmen von DNA-Sequenzen nicht-kodierender Bereiche aus der DNA-Probe des Spenders, (c) Gewinnen einer biologischen Probe des Spenders, (d) Isolieren von DNA-haltigen Zellen aus der biologischen Probe des Spenders, (e) Bestimmen von DNA-Sequenzen nicht-kodierender Bereiche aus den DNA-haltigen Zellen aus der biologischen Probe des Spenders; und (f) Vergleichen der DNA-Sequenzen nicht-kodierender Bereiche aus der DNA-Probe des Spenders mit DNA-Sequenzen nicht-kodierender Bereiche aus den DNA-haltigen Zellen aus der biologischen Probe des Spenders.
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Nachteilig für das in
DE 10 2008 061 174 angemeldete Verfahren ist, dass es sich um eine genetische Untersuchung handelt, die in Deutschland dem Gesetz über genetische Untersuchungen beim Menschen (Gendiagnostikgesetz) unterliegt. Der Spender der Probe muss seine schriftliche Einverständniserklärung zur Untersuchung abgeben. Darüber hinaus muss er nach medizinischen, physischen und sozialen Aspekten von einem Arzt beraten werden. Es ist zu erwarten, dass ähnliche gesetzliche Regelungen in Europa und in den USA in Kraft treten werden (
Directorate-General for Research, European Commission: Genetic Testing: Patients' Rights, Insurance and Employment: A Survey of Regulation in the EU. Dictus Publishing 2011, ISBN/EAN:978-3-8433-3294-1). Darüber hinaus handelt es sich um humangenetische Leistungen, die in Deutschland von einem Labor, das die Analyse der Arzneimittel und Drogen sowie deren Stoffwechselprodukte durchführt, in der Regel nicht erbracht werden können. Weiterhin ist das Verfahren sehr arbeitsintensiv, teuer in der Durchführung und auf das Vorhandensein spezieller Instrumente wie z. B. PCR-Geräte und DNA-Sequenzierungsautomaten angewiesen. Erschwerend kommt hinzu, dass für den Identitätsnachweis ein zusätzliches Körpermaterial entnommen werden muss, z. B. ein Wangenabstrich.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung eines Verfahrens, durch welches die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Verfahren behoben werden können. Insbesondere ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens, bei dem eine biologische Probe ohne Wartezeit einem Individuum zugeordnet werden kann, in dem die biologische Probe nicht-invasiv genommen werden kann und welches ferner nur wenig Arbeitsaufwand erfordert, günstig in der Durchführung ist und für das keine zusätzlichen Instrumente notwendig sind, die auch für den Drogennachweis zum Einsatz kommen. Das Verfahren soll darüber hinaus den nationalen Datenschutzbestimmungen genügen, die Intimsphäre des Individuums wahren und ohne vorherige ärztliche Beratung erfolgen können. Das Verfahren soll ferner auch nach längerer Lagerung der Proben zu eindeutigen Ergebnissen führen.
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Abbildungen
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zeigt ein Steroidprofil von Individuum 1
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zeigt ein Steroidprofil von Individuum 2
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zeigt ein Steroidprofil von Individuum 3
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zeigt ein Steroidprofil von Individuum 4
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zeigt das Steroidprofil von Individuum 5
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zeigt das Steroidprofil von Individuum 6
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Beschreibung der vorliegenden Erfindung
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Die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgaben werden in überraschender Weise durch das im Anspruch 1 beschriebene Verfahren gelöst. Besondere Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen beschrieben.
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Die vorliegende Erfindung löst sowohl die Probleme des im europäischen Patent
EP 1 410 014 B1 beschriebenen Verfahrens als auch die des beim Deutschen Patentamt unter
DE 10 2008 061 174 angemeldeten Verfahrens.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe, welches zur Rückführbarkeit der biologischen Probe auf ein Individuum eingesetzt werden kann. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
- (a) Erhalten einer biologischen Probe von einem Säugetier,
- (b) Gewinnen von mindestens zwei extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukten aus der biologischen Probe,
- (c) Nachweis der mindestens zwei extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukte aus dem Extrakt,
- (d) Bestimmung eines Musters anhand der Anwesenheit oder des Massenverhältnisses der mindestens zwei extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukte,
- (e) Vergleichen des Musters mit dem Muster einer Rückstellprobe.
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Als biologische Probe können Körpermaterialien oder Ausscheidungen wie Blut, Urin, Sekrete, beispielsweise Speichel, oder andere Körperflüssigkeiten sowie Gewebebiopsien und Haare verwendet werden. Vorzugsweise ist die biologische Probe eine Urinprobe, eine Speichelprobe, eine Stuhlprobe oder ein Schleimhautabstrich. Für Fragestellungen im Zusammenhang mit dem Konsum illegaler Drogen oder Arzneimittel oder bei Dopingtests wird vorzugsweise Urin verwendet.
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Das Säugetier ist vorzugsweise ein Mensch. Es kann sich hierbei um Patienten einer Arztpraxis oder eines Krankenhauses, einen Drogenabhängigen, einen Strafgefangenen, Sportler, einen Arbeitnehmer am Arbeitsplatz (Work Place Testing) oder einen Führerscheinwiederbewerber handeln.
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Das Verfahren ist ferner zur Zuordnung biologischer Proben bei Tieren geeignet, beispielsweise bei Haustieren oder Tieren aus landwirtschaftlicher Nutzung bzw. Massentierhaltung oder Sporttieren. Bei der biologischen Probe kann es sich daher um tierisches Körpermaterial im Zusammenhang mit z. B. tiermedizinischen Fragestellungen aus der Massentierhaltung oder um tierisches Körpermaterial bzw. Ausscheidungen im Zusammenhang mit Tieren im Hochleistungssport, wie z. B. Rennpferde, Rennkamele oder Windhunde, handeln.
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Die biologische Probe kann von Mensch und Tier beiderlei Geschlechts stammen. Ein klassisches Körpermaterial von einem Menschen ist z. B. eine Urinprobe von einem Drogenabhängigen, der an einer Substitutionstherapie mit beispielsweise Methadon, Buprenorphin, L-Polamidon oder Diamorphin teilnimmt. Bei Personen, die an einem Substitutionsprogramm teilnehmen, muss regelmäßig nachgewiesen werden, dass diese keine anderen (illegalen) Drogen konsumieren und dass das Substitutionsmittel eingenommen wird. Dies geschieht durch eine Analyse des Urins auf Drogen und/oder deren Metabolite sowie des Substitutionsmittels und/oder seiner Metabolite in geeigneten Intervallen.
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Laboruntersuchungen bei Drogen-, Alkohol- bzw. Medikamentenauffälligkeiten sind fester Bestandteil der Begutachtung bei Personen, die ihre Fahrerlaubnis wegen Führens eines Kraftfahrzeugs unter Drogeneinfluss verloren haben. Vor der Wiederausstellung der Fahrerlaubnis muss in der Regel regelmäßig nachgewiesen werden, dass sie über einen längeren Zeitraum (z. B. mehrere Monate) keine Drogen oder Arzneimittel konsumiert wurden. Dies geschieht überwiegend durch die Untersuchung von Urin- oder Haarproben. Auch im Strafvollzug und im Hochleistungssport werden bei Mensch und Tier wegen der möglichen Einnahme oder Verabreichung illegaler Substanzen häufig Urinproben untersucht.
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Das Erhalten der biologischen Probe kann auf vielerlei Arten geschehen (Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens). Vorzugsweise wird die biologische Probe nicht-invasiv erhalten, so dass bei der Probennahme kein ärztliches Personal anwesend sein bzw. die Probennahme vornehmen muss. Bei der biologischen Probe kann es sich um Ausscheidungen wie beispielsweise Urin handeln, die gesammelt werden. Es kann sich ferner um Material handeln, das durch eine Punktion oder eine Biopsie gewonnen wurde, wie beispielsweise Blut- oder Gewebeproben. Ferner kann das biologische Material durch einen Wangenabstrich oder eine Haarprobe erhalten werden. Vorzugsweise ist die biologische Probe Urin.
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Das extrazelluläre endogene Stoffwechselprodukt umfasst alle Produkte, die in einem lebenden oder toten Individuum als Stoffwechselleistung biochemisch, im Unterschied zu exogen zugeführten Substanzen, selbst hergestellt werden oder wurden. Chemisch kann es sich um Lipide, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, extrazelluläre Nukleinsäuren und vor allem Steroide handeln. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen Steroide auch alle Derivate von Steroiden oder Derivate des Sterans, vorzugsweise Cyclopentanoperhydrophenanthren sowie dessen Isomere.
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Bevorzugt sind die endogenen Stoffwechselprodukte ausgewählt aus Androsteron, Etiocholanolon, 5a-Androstan-3a,17b-diol, 5b-Androstan-3a,17b-diol, Testosteron und Epitestosteron. Besonders bevorzugt wird das Verhältnis, beispielsweise das Massenverhältnis bzw. die Konzentration zweier oder mehrerer der Stoffwechselprodukte in der Probe, bestimmt. Diese Stoffwechselprodukte weisen den Vorteil auf, dass sie nicht durch sportliche Betätigung, Ausdauersport, Menstruationszyklus, zirkadiane und annuale Rhythmik beeinflusst werden. Eine Verfälschung oder Manipulation der Probe kann somit vermieden bzw. verhindert werden.
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Insbesondere wird das Massenverhältnis zweier Stoffwechselprodukte ausgewählt aus Androsteron/Etiocholanolon, 5a-Androstan-3a,17b-diol/5b-Androstan-3a,17b-diol, Testosteron/Epitestosteron, Androsteron/Testosteron und Androsteron/Epitestosteron bestimmt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Massenverhältnis von mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, ferner bevorzugt mindestens vier, besonders bevorzugt von fünf Massenverhältnissen, ausgewählt aus Androsteron/Etiocholanolon, 5a-Androstan-3a,17b-diol/5b-Androstan-3a,17b-diol, Testosteron/Epitestosteron, Androsteron/Testosteron und Androsteron/Epitestosteron, bestimmt.
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Die Gewinnung des extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukts (Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens) erfolgt bevorzugt durch Extraktion, wobei jedoch auch andere im Stand der Technik bekannte Verfahren angewandt werden können. Der Nachweis, also beispielsweise die Bestimmung der Anwesenheit und/oder die Bestimmung der Konzentration und/oder die Bestimmung des Verhältnisses der extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukte, erfolgt üblicherweise chromatographisch (Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens). Chromatographische Verfahren umfassen unter anderem Gaschromatographie (GC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Massenspektrometrie (MS), Elektrophorese und Dünnschichtchromatographie (TLC), wobei auch Kombinationen von zwei oder mehrerern der genannten Verfahren zur Anwendung kommen können. Weitere Verfahren zum Nachweis der extrazellulären endogen Stoffwechselprodukte umfassen immunologische Verfahren wie beispielsweise das „Enzyme linked Immunisorbent technique”, enzymatische Verfahren wie beispielsweise ein enzymatischer optischer Test oder NMR Spektroskopie.
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Die Bestimmung des Musters der hierin beschriebenen Steroide und/oder Steroidderivate wie den Derivaten des Cyclopentanoperhydrophenanthrens (Steran) sowie deren Isomeren erfolgt bevorzugt durch ein gekoppeltes Gaschromatografie-Massenspektrometrie-Verfahren (GC-MS), HPLC-Massenspektrometrie-Verfahren (HPLC-MS), HPLC-Verfahren oder durch Gaschromatografie (GC).
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Aus dem nachgewiesenen extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukt(en) kann ein Muster erstellt werden, welches die Zuordnung der biologischen Probe, aus dem der Nachweis vorgenommen wurde, zu einem bestimmten Individuum erlaubt (Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens). Unter „Muster” ist insbesondere die typische Abfolge von extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukten wie den oben beschriebenen Steroiden, Steroidderivaten oder Derivaten des Cyclopentanoperhydrophenanthrens (Steran) sowie deren Verhältnis, vorzugsweise deren Massenverhältnis, zueinander zu verstehen wie beispielhaft von Thevis, M. et al. beschrieben (Anal Bioanal Chem 2007; 388: 1539–891). Insbesondere kann ein „Muster” auch durch die Bestimmung eines oder mehrerer Stoffwechselprodukte bzw. Verhältnisse von Stoffwechselprodukten über einen längeren Zeitraum, beispielsweise über mehrere Tage, Woche, Monate oder Jahre erfolgen.
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Die Untersuchung des Musters der extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukte erfolgt in der Rückstellprobe im selben Körpermaterial, bsp. Urin, in dem auch die Analyse in der biologischen Probe erfolgt ist.
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Das Muster von Stoffwechselprodukten, vor allem der hierin beschriebenen Steroide, ist in einem Körpermaterial individualspezifisch und erlaubt damit durch Vergleich der erhaltenen Muster die eindeutige Zuordnung eines Körpermaterials zu einem Individuum (Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens). Dies trifft besonders bei dem Erhalten von Urin als biologischer Probe zu. Hierzu ist es im Allgemeinen notwendig, dass die Anwesenheit und/oder die Konzentration der oben beschriebenen mindestens zwei extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukts in der biologischen Probe bestimmt wird. Das Muster kann sich in bevorzugter Weise auch aus dem Nachweis, d. h. der Bestimmung unter anderem der Anwesenheit und/oder Konzentration und/oder dem Verhältnis wie dem Massenverhältnis, von mehr als zwei, d. h. drei, vier oder weiteren Stoffwechselprodukten ergeben.
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Ergibt der Vergleich des Musters der extrazellulären endogenen Stoffwechselprodukt in der biologischen Probe, welche unter Aufsicht gewonnen wurde (Rückstellprobe), eine Übereinstimmung mit dem Muster in der biologischen Probe, kann davon ausgegangen werden, dass die biologische Probe eindeutig auf das Individuum zurückzuführen ist. Ergeben sich jedoch beim Abgleich Diskrepanzen, muss angenommen werden, dass das Material absichtlich oder unabsichtlich vertauscht oder verfälscht wurde. Bei Urinproben kann dies bedeuten, dass z. B. Fremdurin, abgegeben wurde oder verfälschende Substanzen in die Probe gegeben wurden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren hat somit den Vorteil, dass die Gewinnung der biologischen Probe, z. B. die Urinabgabe, nur einmal unter Aufsicht erfolgen muss, um das individuelle Muster extrazellulärer endogener Stoffwechselprodukte eindeutig zu etablieren. Jede weitere Gewinnung eines Körpermaterials muss dann nicht mehr unter Aufsicht erfolgen. Eine Wartezeit von mehreren Stunden, wie sie z. B. nach dem in dem
europäischen Patent Nr. 1 410 014 B1 beschriebenen Verfahren notwendig ist, entfällt. Ebenfalls entfällt die unter datenschutzrechtlichen und moralischen Aspekten bedenkliche und ferner aufwendige Bestimmung einer DNA-Sequenz, wie bei der
DE 10 2008 061 174 der Fall. Dies führt zu einer erheblichen Beschleunigung und zu einer höheren Akzeptanz des gesamten Verfahrens. Darüber hinaus entfallen die juristischen Regularien und die teure und aufwändige molekularbiologische Analytik. Für den Nachweis oder Ausschluss des Konsums von illegalen Drogen oder Arzneimitteln ist eine sichere Zuordnung von biologischen Proben wie Körpermaterialen zu einem Individuum unabdingbar, um die Richtigkeit von Analyseergebnissen zu gewährleisten und sowohl falsch negative als auch falsch positive Befunde auszuschließen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren hat somit folgende Vorteile gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren:
- 1) Möglichkeit der nicht-invasiven Probennahme
- 2) geringer Arbeitsaufwand
- 3) günstig in der Durchführung
- 4) keine speziellen Instrumente notwendig, die nicht in einem toxikologischen Labor vorgehalten werden
- 5) keine datenschutzrechtliche Problematik
- 6) Wahrung der Intimsphäre der Probanden
- 7) kann ohne ärztliche Anwesenheit/Beratung durchgeführt werden
- 8) führt zu eindeutigen Ergebnissen auch nach längerer Lagerung der Proben
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Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert und beschrieben.
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Beispiele
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Beispiel 1: Rückführbarkeit einer Urinprobe mit Drogenrückständen auf ein Individuum
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Das Ausführungsbeispiel betrifft die Sammlung einer Urinprobe, den Versand der Urinprobe, die Extraktion der Urinprobe, den Nachweis von Drogenrückständen und die Erhebung eines Steroidprofils mit Hilfe der Gaschromatografie-Massenspektrometrie (GC-MS).
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Urin von einem Individuum wird in einem handelsüblichen Kunstoff- oder Glasgefäß aufgefangen.
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Das Probengefäß wird mit einem maschinenlesbaren Strichcode eindeutig gekennzeichnet, der eine Auftragsnummer enthält, die auch auf dem elektronisch lesbaren Probenbegleitschein zu finden ist oder computergesteuert aus einem elektronischen Auftragserfassungssystem generiert wurde. Im Auftrag werden der Name des Individuums und die angeforderte Analyse kodiert. Die Probe wir in das Labor geschickt, wo der Auftrag elektronisch aktiviert wird. Mit der Anforderung für den Nachweis eines Arzneimittels oder einer illegalen Droge wird automatisch auch die Erhebung eines sogenannten Steroidprofils (Steroide, Steroidderivate, andere Derivate des Cyclopentanoperhydrophenanthrens ausgelöst.
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Im Labor wird ein Teil der Urinprobe für die GC-MS-Analyse mit internen Standards versetzt, bei saurem pH hydrolysiert und mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Probe wird hierzu mit 0,1 M Essigsäure auf pH 5 eingestellt und mit Glucuronidase versetzt.
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Danach erfolgt die Zugabe von internen Standards (z. B. deuterierte Standards für die massenspektrometrische Analyse), von Carbonatpuffer und von n-Pentan. Die Probe wird gemischt und für 90 min auf 60°C erwärmt. Nach Abkühlung und Zentrifugation werden 4 ml von der oberen organischen Phase eingedampft. Zum eingetrockneten Extrakt werden 100 μl Derivatisierungreagenz (bsp. Trimethylsilyl (TMS)) gegeben, auf dem Vortexmischer gemischt, das Röhrchen mit einem Deckel verschlossen und für 30 min bei 60°C in den Heizblock gestellt. Nach Abkühlen des Extrakts wird dieser der Analytik zugeführt, bsp. durch Injektion in ein GC-MS-System. Die Auswertung des Musters von Steroiden, Steroidderivaten oder anderen Derivaten des Cyclopentanoperhydrophenanthrens (Steran) sowie deren Isomere erfolgt im Computer des Analysensystems.
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In einem zweiten Teil der Urinprobe wird der Nachweis eines Arzneimittels, einer illegalen Droge oder deren Metabolite mit allgemein anerkannten Methoden geführt, zu denen auch die Gaschromatografie-Massenspektrometrie gehört.
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Handelt es sich um die erste Probe eines Individuums wird das Muster von Steroiden, Steroidderivaten oder anderen Derivaten des Cyclopentanoperhydrophenanthrens (Steran) sowie deren Isomere im Computer hinterlegt. Handelt es sich um eine Folgeprobe, wird das Muster mit dem bereits vorhandenen abgeglichen. Ein typisches Muster von Steroiden in Probanden (Steroidprofil) ist in den – dargestellt.
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Beispiel 2: Identifizierung von Urinproben anhand endogener Stoffwechselprodukte (Biomarker).
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Die Bestimmung der Stoffwechselprodukte erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
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Die Steroidhormone wurden mittels Massenspektrometrie analysiert und die Verhältnisse der Steroide Androsteron/Etiocholanolon, 5a-Androstan-3a,17b-diol/5b-Androstan-3a,17b-diol, Testosteron/Epitestosteron, Androsteron/Testosteron und Androsteron/Epitestosteron graphisch aufgetragen. Initial wurden die Urin-Steroidprofile von 10 bekannten Personen erstellt. Es erfolgte eine erneute Urinabnahme bei den gleichen Personen. Die Proben wurden anonymisiert und die Urin-Steroidprofile bestimmt, mit dem Ziel die anonymisierten Proben den 10 bekannten Personen zuzuordnen. Des Weiteren wurde die Methodik hinsichtlich der Probenidentitätsüberprüfung im Rahmen der Substitutionstherapie überprüft. Zudem wurden die Ergebnisse mit der parallelen Erstellung von DNA-Profilen (NGM Select Kit, Applied Biosystems) verglichen.
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Die 10 anonymisierten Proben des Initialexperiments ließen sich eindeutig den entsprechenden Personen zuordnen. 49 anhand von Steroidprofilen zugeordnete Urinproben wurden mittels DNA-Profilen verglichen (Patienteneinwilligung nach GenDG lag vor). Davon waren 13 Proben aufgrund zu geringer DNA-Konzentration nicht auswertbar, 35 Proben zeigten eine übereinstimmende Zuordnung, eine Probe wurde anhand des Steroidprofils falsch zugeordnet.
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Im weiteren Verlauf wurde über einen Zeitraum von zwei Jahren die Verwendung der Urin-Steroidprofile an 100 Substitutionspatienten angewendet. Die an mehreren Zeitpunkten bestimmten Steroidprofile einiger Beispielpatienten sind in den bis dargestellt. Es zeigte sich, das die Verwendung des untersuchten Steroidprofils sehr gut geeignet ist, eine abgegebene Urinprobe einer Rückstellprobe einer bestimmten Person zuzuordnen.
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Die Anwendung der urinären Steroidprofile in der Substitutionstherapie erlaubt somit, wie in den Beispielen gezeigt, die individuelle Zuordnung von Urinproben. Die Zuordnung mittels DNA-Profilen ist aufgrund der höheren interindividuellen Variabilität forensisch aussagekräftiger, zeigt aber eine sehr viel größere Ausfallhäufigkeit, da diese stark abhängig von der DNA-Konzentration ist. Die Verwendung des urinären Steroidprofils gibt dem Suchtmediziner dagegen ein zusätzliches Maß an Sicherheit in der Substitutionstherapie.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 1410014 B1 [0005, 0005, 0006, 0007, 0018, 0036]
- DE 102008061174 [0007, 0008, 0009, 0018, 0036]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Directorate-General for Research, European Commission: Genetic Testing: Patients' Rights, Insurance and Employment: A Survey of Regulation in the EU. Dictus Publishing 2011, ISBN/EAN:978-3-8433-3294-1 [0009]
- Thevis, M. et al. beschrieben (Anal Bioanal Chem 2007; 388: 1539–891) [0032]
