DE102014205531A1

DE102014205531A1 - A microfluidic device and method for analyzing a sample of biological material

Info

Publication number: DE102014205531A1
Application number: DE102014205531.8A
Authority: DE
Inventors: Jochen Hoffmann
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2015-10-01
Also published as: WO2015144345A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung (100) zum Analysieren einer Probe biologischen Materials. Dabei weist die mikrofluidische Vorrichtung (100) eine erste Reaktionskammer (110) auf, die ausgebildet ist, um eine erste Polymerase-Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen. Auch weist die mikrofluidische Vorrichtung (100) eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer (110) verbundene Mischkammer (130) auf, die ausgebildet ist, um das erste Reaktionsprodukt mit einem Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen. Ferner weist die mikrofluidische Vorrichtung (100) zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer (130) verbundene, zweite Reaktionskammer (150) auf, die ausgebildet ist, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase-Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch durchzuführen.The invention relates to a microfluidic device (100) for analyzing a sample of biological material. In this case, the microfluidic device (100) has a first reaction chamber (110), which is designed to perform a first polymerase chain reaction on the sample in order to produce a first reaction product. Also, the microfluidic device (100) has a mixing chamber (130) fluidly connected to the first reaction chamber (110) and configured to mix the first reaction product with a diluting medium to produce a dilute mixture. Further, the microfluidic device (100) comprises at least one second reaction chamber (150) fluidly connected to the mixing chamber (130) and configured to perform a second polymerase chain reaction on the dilute mixture to analyze the sample.

Description

Stand der TechnikState of the art

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, ferner auf ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, zudem auf eine Vorrichtung zum Ausführen der Schritte des Verfahrens sowie auf ein entsprechendes Computerprogramm.The present invention relates to a microfluidic device for analyzing a sample of biological material, to a method for analyzing a sample of biological material, to a device for carrying out the steps of the method and to a corresponding computer program.

Bei einem mikrofluidischen Diagnosesystem, wie einem sogenannten Chiplabor bzw. Lab-on-Chip (LoC) ist eine miniaturisierte und integrierte Durchführung komplexer fluidischer Arbeitsabläufe insbesondere für den spezifischen Nachweis verschiedenster Moleküle ermöglicht. Die US 2011/0070578 A1 offenbart eine DNA-Analyseeinrichtung, bei der eine Polymerase-Kettenreaktion und eine Verdünnung für eine nachfolgende elektrophoretische Separation durchgeführt werden.In a microfluidic diagnostic system, such as a so-called chip lab or lab-on-chip (LoC), a miniaturized and integrated implementation of complex fluidic workflows, in particular for the specific detection of a variety of molecules is possible. The US 2011/0070578 A1 discloses a DNA analyzer which performs a polymerase chain reaction and a dilution for subsequent electrophoretic separation.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Vor diesem Hintergrund werden mit dem hier vorgestellten Ansatz eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, weiterhin eine Vorrichtung, die dieses Verfahren verwendet, sowie schließlich ein entsprechendes Computerprogramm gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.Against this background, with the approach presented here, a microfluidic device for analyzing a sample of biological material, a method for analyzing a sample of biological material, furthermore a device using this method, and finally a corresponding computer program according to the main claims are presented. Advantageous embodiments emerge from the respective subclaims and the following description.

Gemäß Ausführungsformen der Erfindung kann insbesondere eine verschachtelte (engl. nested) Polymerase-Kettenreaktion bzw. PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) geschaffen werden, bei der eine Probe zwischen einer ersten und einer zweiten Polymerase-Kettenreaktion verdünnt wird (engl. diluted), was als eine „Diluted Nested PCR“ bezeichnet werden kann. Somit können gemäß Ausführungsformen der Erfindung mikrofluidische Strukturen und Prozessabläufe für eine Durchführung einer verschachtelten Polymerase-Kettenreaktion mit Verdünnung und unter Verwendung gleicher Primersequenzen bei der ersten und der zweiten Polymerase-Kettenreaktion bereitgestellt werden.In particular, according to embodiments of the invention, a nested polymerase chain reaction or PCR can be created, in which a sample is diluted between a first and a second polymerase chain reaction, what may be termed a "dilute nested PCR". Thus, in accordance with embodiments of the invention, microfluidic structures and processes may be provided for performing a nested polymerase chain reaction with dilution and using like primer sequences in the first and second polymerase chain reactions.

Vorteilhafterweise kann gemäß Ausführungsformen der Erfindung insbesondere eine Implementierung von PCR-Assays ohne Primer-Modifikation, wie beispielsweise herkömmlicherweise üblich durch Verwendung dUTP-haltiger (dUTP = Deoxyuridine Triphosphate) Primer, Primer mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen, „Abfangprimern“, die in der zweiten PCR eingesetzt werden, zu den Primern der ersten PCR komplementär sind und somit die Primer deaktivieren, oder dergleichen, ermöglicht werden. Somit braucht insbesondere nicht auf die Verwendung von dUTP-haltigen Primern bei der ersten PCR zurückgegriffen werden, wobei nach Überführung des PCR-Produkts in die singleplex-Reaktionskammern ein UNG-Verdau (UNG = Uracil-N-Glycosylase) durchgeführt würde, um die Primer der ersten Reaktion zu deaktivieren. Daher kann auf spezielle Nukleotide bei einer Primer-Synthese sowie auf ein zusätzliches Enzymsystem für den UNG-Verdau verzichtet werden. Ebenso braucht nicht auf die Verwendung von Primern mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen zurückgegriffen werden, wobei in der ersten multiplex-PCR beispielsweise Primer mit einer Schmelztemperatur zwischen 55 und 65°C, bei den zweiten singleplex-PCRs Primer mit einer Schmelztemperatur um 72 °C eingesetzt würden. Somit brauchen PCR-Primer für die erste und zweite PCR nicht in unterschiedlichen Längen für unterschiedliche Schmelztemperaturen ausgelegt werden.Advantageously, according to embodiments of the invention, in particular, an implementation of PCR assays without primer modification, such as conventionally conventional by using dUTP-containing (dUTP = deoxyuridine triphosphates) primers, primers with different melting temperatures, "capture primers" used in the second PCR are complementary to the primers of the first PCR and thus disable the primers, or the like. Thus, in particular, it is not necessary to resort to the use of dUTP-containing primers in the first PCR, wherein after transfer of the PCR product into the single-plex reaction chambers, a UNG digestion (UNG = uracil N-glycosylase) would be carried out to obtain the primers disable the first reaction. Therefore, it is possible to dispense with specific nucleotides in a primer synthesis as well as an additional enzyme system for UNG digestion. Likewise, it is not necessary to resort to the use of primers having different melting temperatures, primers having a melting point between 55 and 65 ° C. being used in the first multiplex PCR, and primers having a melting point of 72 ° C. for the second single-plex PCRs. Thus, PCR primers for the first and second PCR need not be designed in different lengths for different melting temperatures.

Daher können gemäß Ausführungsformen der Erfindung Kosten und Aufwand bei der verschachtelten Polymerase-Kettenreaktion eingespart werden. Auch kann dadurch eine Flexibilität eines LoC-Systems gesteigert werden, da viele verschiedene PCR-Assays bzw. Biocontents ohne Anpassung in einem LoC implementiert werden können. So gibt es beispielsweise deutlich mehr Assays, bei denen DNA-Moleküle direkt über eine singleplex- bis quadplex-PCR-Reaktion nachgewiesen werden als in einer Kombination aus multiplex-PCR plus anschließender Mikroarrayanalyse.Therefore, according to embodiments of the invention, cost and effort in the nested polymerase chain reaction can be saved. Also, this can increase flexibility of a LoC system because many different PCR assays or biocontents can be implemented without adaptation in a LoC. For example, there are significantly more assays in which DNA molecules are detected directly via a singleplex to quadplex PCR reaction than in a combination of multiplex PCR plus subsequent microarray analysis.

Vorteile einer Verschachtelung der Polymerase-Kettenreaktionen bestehen darin, dass durch eine Voramplifikation von in der Probe enthaltenen Nukleinsäuremolekülen in der ersten Polymerase-Kettenreaktion genügend Material für Einzelnachweisreaktionen in der zweiten Polymerase-Kettenreaktion erzeugt werden kann. Daher kann verhindert werden, dass beispielsweise ein zu untersuchendes Probenmaterial, das sehr wenige DNA-Moleküle enthält, direkt auf mehrere Reaktionskammern verteilt wird und somit die einzelnen Kammern zu wenig genetisches Ausgangsmaterial für eine PCR enthalten. Vielmehr kann durch eine Anhebung einer Menge an zu untersuchenden Nukleinsäuremolekülen in der ersten PCR in jeder Reaktionskammer der zweiten PCR beispielsweise jedes gewünschte der vorhandenen Nukleinsäuremoleküle nachgewiesen werden kann. Durch die Verschachtelung zweier Polymerase-Kettenreaktionen können in singleplex-Reaktionen sehr viele genetische Merkmale aus einer kleinen Probenmenge nachgewiesen werden.Advantages of interleaving the polymerase chain reactions are that sufficient material can be generated for single detection reactions in the second polymerase chain reaction by pre-amplifying nucleic acid molecules contained in the sample in the first polymerase chain reaction. Therefore, it can be prevented that, for example, a sample material to be examined, which contains very few DNA molecules, is distributed directly to a plurality of reaction chambers and thus the individual chambers contain too little genetic starting material for a PCR. Rather, by increasing an amount of nucleic acid molecules to be examined in the first PCR, for example, any desired nucleic acid molecules present in each reaction chamber of the second PCR can be detected. By interleaving two polymerase chain reactions, a large number of genetic characteristics can be detected from a small amount of sample in single-plex reactions.

Ferner braucht kein DNA-Mikroarray für einen Nachweis unterschiedlicher DNA-Moleküle eingesetzt zu werden. Dadurch können auch Anforderungen an eine optische Detektionseinheit in puncto Auflösung gesenkt werden und eine Prozesszeit verkürzt werden. Zudem kann gemäß Ausführungsformen der Erfindung eine Echtzeitfähigkeit bzw. Real-time-Fähigkeit vorgesehen sein. Reaktionen können beispielsweise in Triplikaten durchgeführt werden, wodurch eine Aussagekraft der Reaktionen erhöht werden kann.Furthermore, no DNA microarray for detection of different DNA molecules needs to be used. As a result, requirements for an optical detection unit in in terms of resolution can be reduced and a process time can be shortened. In addition, according to embodiments of the invention, a real-time capability can be provided. Reactions can be carried out, for example, in triplicates, whereby a significance of the reactions can be increased.

Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe biologischen Materials vorgestellt, wobei die mikrofluidische Vorrichtung folgende Merkmale aufweist:
eine erste Reaktionskammer, die ausgebildet ist, um eine erste Polymerase-Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen;
eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene oder verbindbare Mischkammer, die ausgebildet ist, um das erste Reaktionsprodukt mit einem Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und
zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene oder verbindbare, zweite Reaktionskammer, die ausgebildet ist, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase-Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch durchzuführen.A microfluidic device for analyzing a sample of biological material is presented, wherein the microfluidic device has the following features:
a first reaction chamber configured to perform a first polymerase chain reaction on the sample to produce a first reaction product;
a mixing chamber fluidically connected or connectable to the first reaction chamber and configured to mix the first reaction product with a diluting medium to produce a dilute mixture; and
at least one second reaction chamber fluidly connected or connectable to the mixing chamber and configured to perform a second polymerase chain reaction on the dilute mixture to analyze the sample.

Die mikrofluidische Vorrichtung kann beispielsweise in Verbindung mit analytischen Systemen, insbesondere für mikrofluidische Lab-on-Chip-Systeme zur Umweltanalytik oder medizinischen Diagnostik verwendet werden. Bei der mikrofluidischen Vorrichtung kann es sich um ein mikrofluidisches System bzw. eine analytische Vorrichtung handeln, insbesondere ein mikrofluidisches Lab-on-Chip bzw. Chiplabor zur medizinischen Diagnostik, mikrobiologischen Diagnostik oder Umweltanalytik. Als Probe kann eine zu analysierende Flüssigkeit, typischerweise eine flüssige oder verflüssigte Patientenprobe, z. B. Blut, Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ein ausgespülter Abstrich oder eine verflüssigte Gewebeprobe, oder eine Probe eines nichtmenschlichen Materials bezeichnet werden. In der Probe enthaltene Zellen können beispielsweise menschliche Zellen, z. B. Blutzellen oder dergleichen, tierische Zellen oder pathogene Zellen bzw. Pathogene, z. B. Viren oder Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Pilze, umfassen, die DNA und/oder RNA, d. h. Nukleinsäuremoleküle, aufweisen. Die Reaktionskammern können beispielsweise unter Verwendung von Ventilen mit der Mischkammer fluidisch verbunden sein.The microfluidic device can be used, for example, in connection with analytical systems, in particular for microfluidic lab-on-chip systems for environmental analysis or medical diagnostics. The microfluidic device may be a microfluidic system or an analytical device, in particular a microfluidic lab-on chip or chip laboratory for medical diagnostics, microbiological diagnostics or environmental analysis. As the sample, a liquid to be analyzed, typically a liquid or liquefied patient sample, e.g. Blood, urine, stool, sputum, cerebrospinal fluid, lavage, a flushed swab or liquefied tissue sample, or a sample of a non-human material. For example, cells contained in the sample may contain human cells, e.g. As blood cells or the like, animal cells or pathogenic cells or pathogens, eg. As viruses or microorganisms, such as. Bacteria or fungi comprising DNA and / or RNA, d. H. Nucleic acid molecules having. For example, the reaction chambers may be fluidly connected to the mixing chamber using valves.

Gemäß einer Ausführungsform kann in der ersten Reaktionskammer zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert sein. Hierbei kann in der Mischkammer das Verdünnungsmedium vorgelagert sein. Dabei kann in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer und zusätzlich oder alternativ in der Mischkammer zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert sein. Gemäß einer Ausführungsform kann die Vorrichtung zumindest zwei oder zumindest drei zweite Reaktionskammern aufweisen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders platzsparende Anordnung von Kammern in der mikrofluidischen Vorrichtung sowie eine Vereinfachung einer Anordnung von Kammern ermöglicht werden. Gemäß einer Ausführungsform kann der Reaktionsmix auch schon „ready-to-use“ in die Reaktionskammer eingeleitet werden.According to one embodiment, at least one substance may be preceded in the first reaction chamber for carrying out the first polymerase chain reaction. In this case, the dilution medium may be upstream in the mixing chamber. In this case, in the at least one second reaction chamber and additionally or alternatively in the mixing chamber, at least one substance for carrying out the second polymerase chain reaction may be upstream. According to one embodiment, the device may have at least two or at least three second reaction chambers. Such an embodiment offers the advantage that a particularly space-saving arrangement of chambers in the microfluidic device and a simplification of an arrangement of chambers are made possible. According to one embodiment, the reaction mixture can already be introduced "ready-to-use" into the reaction chamber.

Auch kann eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene oder verbindbare Speicherkammer zum Speichern von Verdünnungsmedium vorgesehen sein. Hierbei kann in der ersten Reaktionskammer zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert sein, wobei in der Speicherkammer das Verdünnungsmedium vorgelagert sein kann. Dabei kann in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer, in der Speicherkammer und zusätzlich oder alternativ in der Mischkammer zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass ein variables Mischungsverhältnis bzw. eine variable Verdünnung in der Mischkammer erzeugt werden kann. Gemäß einer Ausführungsform kann der Reaktionsmix auch schon „ready-to-use“ in die Reaktionskammer eingeleitet werden.Also, a storage chamber connected or connectable fluidically to the mixing chamber may be provided for storing dilution medium. In this case, at least one substance for carrying out the first polymerase chain reaction may be present in the first reaction chamber, it being possible for the dilution medium to be preceded in the storage chamber. In this case, in the at least one second reaction chamber, in the storage chamber and additionally or alternatively in the mixing chamber, at least one substance for carrying out the second polymerase chain reaction may be upstream. Such an embodiment offers the advantage that a variable mixing ratio or a variable dilution can be generated in the mixing chamber. According to one embodiment, the reaction mixture can already be introduced "ready-to-use" into the reaction chamber.

Insbesondere können ein Volumen der ersten Reaktionskammer und ein Volumen der Mischkammer ausgebildet sein, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion von der zweiten Polymerase-Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen. Durch die Verdünnung und der damit einhergehenden Verringerung der Konzentration von Primern aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion wird eine Beteiligung dieser Primer an der zweiten Polymerase-Kettenreaktion unterdrückt. Auch kann ein Volumen der Speicherkammer ausgebildet sein, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion für die zweite Polymerase-Kettenreaktion zumindest teilweise zu inaktivieren. Bei einer verschachtelten PCR können somit insbesondere PCR-Primer der ersten bzw. multiplex-Polymerase-Kettenreaktion von der nachfolgenden singleplex-Polymerase-Kettenreaktionen im Wesentlichen ausgeschlossen werden. Daher ist es möglich, ein spezifisches Zielmolekül nachzuweisen. Anders ausgedrückt kann das PCR-Produkt der ersten PCR soweit verdünnt werden, dass die ja ebenfalls verdünnten Primer der ersten PCR in der zweiten PCR im Wesentlichen dadurch zumindest teilweise effektiv inaktiviert sind. Der biochemische Hintergrund des beschriebenen Ansatzes besteht darin, dass die Konzentration der Primer der ersten PCR durch eine Verdünnung des Reaktionsvolumens (nach Vollendung der ersten PCR) soweit herabgesetzt oder verringert wird, dass diese Primer in der anschließenden zweiten PCR nicht mehr aktiv an der zweiten Reaktion teilnehmen können, weil die Konzentration dieser Primer dafür nicht ausreicht. Das Reaktionsvolumen der ersten PCR wird dann auf mehrere Kammern verteilt, in denen Primer für die zweite PCR vorgelagert sind, die sich beim Befüllen der Kammern mit dem verdünnten Mix der ersten PCR vermischen, sodass sich funktionsfähige Reaktionsmixe einstellen.In particular, a volume of the first reaction chamber and a volume of the mixing chamber may be configured to effect a mixing ratio in the dilute mixture suitable to at least partially exclude primers from the first polymerase chain reaction from the second polymerase chain reaction. Dilution and the concomitant reduction in the concentration of primers from the first polymerase chain reaction suppresses the involvement of these primers in the second polymerase chain reaction. Also, a volume of the storage chamber may be configured to effect a mixing ratio in the dilute mixture that is suitable to at least partially inactivate primers from the first polymerase chain reaction for the second polymerase chain reaction. In the case of a nested PCR, in particular PCR primers of the first or multiplex polymerase chain reaction can thus be essentially excluded from the subsequent single-plex polymerase chain reactions. Therefore, it is possible to detect a specific target molecule. In other words, the PCR product of the first PCR can be diluted to such an extent that the primers of the first PCR which are also diluted in the second PCR are essentially at least partially effectively inactivated thereby. The biochemical background of the described approach is that the Concentration of the primer of the first PCR by a dilution of the reaction volume (after completion of the first PCR) is reduced or reduced so far that these primers in the subsequent second PCR can not actively participate in the second reaction, because the concentration of these primers is not sufficient , The reaction volume of the first PCR is then distributed to several chambers, in which primers are upstream for the second PCR, which mix when filling the chambers with the diluted mix of the first PCR, so that establish functional reaction mixes.

Ferner kann eine Lüftungsöffnung vorgesehen sein, die in der Mischkammer als Ausgleichsöffnung relativ zu einem Umgebungsdruck ausgeformt ist. Hierbei kann die Lüftungsöffnung ausgebildet sein, um einen Druckausgleich zwischen der Mischkammer und einer Umgebung der mikrofluidischen Vorrichtung zu ermöglichen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass überschüssige Luft in der Mischkammer somit durch die Lüftungsöffnung entweichen kann und somit ein Mischvorgang in der Mischkammer erleichtert werden kann.Furthermore, a ventilation opening can be provided, which is formed in the mixing chamber as a compensation opening relative to an ambient pressure. In this case, the ventilation opening may be formed to allow a pressure equalization between the mixing chamber and an environment of the microfluidic device. Such an embodiment offers the advantage that excess air in the mixing chamber can thus escape through the ventilation opening and thus a mixing process in the mixing chamber can be facilitated.

Gemäß einer Ausführungsform können eine fluidisch zwischen die erste Reaktionskammer und die Mischkammer geschaltete Pumpkammer und eine Mehrzahl von Ventilen vorgesehen sein. Auch kann eine Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern vorgesehen sein. Dabei kann die erste Reaktionskammer zwischen einem ersten Paar von Ventilen angeordnet sein, kann die Pumpkammer zwischen einem zweiten Paar von Ventilen angeordnet sein und kann die Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern zwischen einer Mehrzahl von dritten Paaren von Ventilen angeordnet sein. Die Kammern der mikrofluidischen Vorrichtung können mittels Kanälen fluidisch verbunden sein, wobei die Ventile ausgebildet sein können, um einen Fluidfluss durch die Kanäle zu beeinflussen.According to one embodiment, a pumping chamber fluidically connected between the first reaction chamber and the mixing chamber and a plurality of valves may be provided. Also, a plurality of second reaction chambers may be provided. Here, the first reaction chamber may be disposed between a first pair of valves, the pumping chamber may be disposed between a second pair of valves, and the plurality of second reaction chambers may be disposed between a plurality of third pairs of valves. The chambers of the microfluidic device may be fluidly connected by means of channels, wherein the valves may be configured to influence a fluid flow through the channels.

Die Speicherkammer kann über einen Kanal und ein Ventil fluidisch mit der Mischkammer verbunden sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effiziente, platzsparende und konstruktionsunaufwendige mikrofluidische Vorrichtung bereitgestellt werden kann.The storage chamber may be fluidly connected to the mixing chamber via a channel and a valve. Such an embodiment offers the advantage that a particularly efficient, space-saving and design-free microfluidic device can be provided.

Es wird auch ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials vorgestellt, wobei das Verfahren unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar ist, die eine erste Reaktionskammer, eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene Mischkammer und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene, zweite Reaktionskammer aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
Ausführen einer ersten Polymerase-Kettenreaktion an der Probe in der ersten Reaktionskammer, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen;
Mischen des ersten Reaktionsprodukts mit einem Verdünnungsmedium in der Mischkammer, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und
Durchführen einer zweiten Polymerase-Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer, um die Probe zu analysieren.There is also provided a method of analyzing a sample of biological material, the method being practicable using a microfluidic device having a first reaction chamber, a mixing chamber fluidically connected to the first reaction chamber, and at least one second reaction chamber fluidically connected to the mixing chamber. the method comprising the steps of:
Performing a first polymerase chain reaction on the sample in the first reaction chamber to produce a first reaction product;
Mixing the first reaction product with a diluent medium in the mixing chamber to produce a dilute mixture; and
Performing a second polymerase chain reaction on the dilute mixture in the at least one second reaction chamber to analyze the sample.

Das Verfahren kann in Verbindung mit einer Ausführungsform der vorstehend genannten mikrofluidischen Vorrichtung vorteilhaft ausgeführt werden, um eine Probe biologischen Materials zu analysieren. Ferner kann das Verfahren zwischen dem Schritt des Ausführens und dem Schritt des Mischens einen ersten Schritt des Förderns des ersten Reaktionsprodukts von der ersten Reaktionskammer in die Mischkammer sowie zwischen dem Schritt des Mischens und dem Schritt des Durchführens einen zweiten Schritt des Förderns des verdünnten Gemischs von der Mischkammer in die zumindest eine zweite Reaktionskammer aufweisen. Die Schritte des Förderns können durch Ansteuern von zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung ausgeführt werden. Dabei können das zumindest eine Ventil und/oder die zumindest eine Fördereinrichtung Schnittstellen aufweisen, die ausgebildet sind, um Ansteuersignale zu empfangen.The method may be advantageously carried out in conjunction with an embodiment of the aforementioned microfluidic device to analyze a sample of biological material. Further, between the step of performing and the step of mixing, the method may include a first step of conveying the first reaction product from the first reaction chamber into the mixing chamber, and between the step of mixing and the step of performing a second step of conveying the diluted mixture of the Have mixing chamber in the at least one second reaction chamber. The steps of conveying can be carried out by controlling at least one valve and additionally or alternatively at least one conveyor. In this case, the at least one valve and / or the at least one conveyor may have interfaces which are designed to receive drive signals.

Gemäß einer Ausführungsform können im Schritt des Mischens Ansteuersignale zum Ansteuern zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung erzeugt werden, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion von der zweiten Polymerase-Kettenreaktion auszuschließen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass exakte Nachweise von Nukleinsäuresequenzen unter Vermeidung des Einsatzes spezieller oder unterschiedlicher Primer ermöglicht werden.According to one embodiment, in the mixing step, drive signals may be generated to drive at least one valve and additionally or alternatively at least one conveyor of the microfluidic device to effect a mixing ratio in the dilute mixture suitable for primers from the first polymerase chain reaction of to exclude the second polymerase chain reaction. Such an embodiment offers the advantage that exact detection of nucleic acid sequences while avoiding the use of special or different primers are made possible.

Bei einer verschachtelten PCR können zwei Polymerase-Kettenreaktionen nacheinander durchgeführt werden. Bei der ersten Polymerase-Kettenreaktion können mehrere Primerpärchen eingesetzt werden, wodurch im Sinne einer multiplex-PCR spezifisch mehrere Nukleinsäuresequenzen bzw. insbesondere DNA-Sequenzen in einer Reaktionskammer gleichzeitig amplifiziert werden können. Ein PCR-Produkt der ersten Reaktion kann dann auf mehrere räumlich getrennte Reaktionskammern verteilt werden, die jeweils ein Primerpaar enthalten können. Somit können amplifizierte Nukleinsäuremoleküle bzw. insbesondere DNA-Moleküle der ersten PCR als sogenannte „Template DNA“ in der zweiten PCR fungieren. Dadurch ist bei der zweiten PCR im Sinne einer singleplex-PCR in jeder Kammer ein Nukleinsäuremolekül nachweisbar. Zunächst kann eine zu untersuchende Probenlösung beispielsweise in eine erste Reaktionskammer eingebracht und mittels multiplex-PCR voramplifiziert werden. Bei dieser Reaktion können mehrere, beispielsweise zwischen 5 und 100, verschiedene Abschnitte einer Nukleinsäure vervielfältigt werden. Nach dem Mischen bzw. Verdünnen kann dieses PCR-Produkt beispielsweise auf viele zweite Reaktionskammern verteilt werden, in denen Substanzen wie Polymerase und ein Primerpaar vorgelagert sein können. Dadurch können in den Einzelkammern verschiedene Nukleinsäuremoleküle in Einzelreaktionen der singleplex-PCR insbesondere im Ablauf parallel bzw. hochparallel nachgewiesen werden.In a nested PCR, two polymerase chain reactions can be performed sequentially. In the first polymerase chain reaction several primer pairs can be used, whereby in the sense of a multiplex PCR specifically several nucleic acid sequences or in particular DNA sequences can be amplified simultaneously in a reaction chamber. A PCR product of the first reaction can then be distributed to several spatially separated reaction chambers, each of which can contain a primer pair. Thus, amplified nucleic acid molecules or in particular DNA molecules of the first PCR can act as so-called "template DNA" in the second PCR. This is in the sense of the second PCR a single-plex PCR in each chamber a nucleic acid molecule detectable. First, a sample solution to be examined can be introduced, for example, into a first reaction chamber and pre-amplified by means of multiplex PCR. In this reaction, several, for example between 5 and 100, different sections of a nucleic acid can be amplified. For example, after mixing or dilution, this PCR product can be distributed to many second reaction chambers in which substances such as polymerase and a primer pair can be preceded. As a result, in the individual chambers, different nucleic acid molecules can be detected in single reactions of the single-plex PCR, in particular parallel or highly parallel in the course.

Der hier vorgestellte Ansatz schafft ferner eine Vorrichtung, die ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen, anzusteuern bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden. The approach presented here also creates a device that is designed to perform the steps of a variant of a method presented here in appropriate facilities to drive or implement. Also by this embodiment of the invention in the form of a device, the object underlying the invention can be solved quickly and efficiently.

Unter einer Vorrichtung kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Die Vorrichtung kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen der Vorrichtung beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind.In the present case, a device can be understood as meaning an electrical device which processes sensor signals and outputs control and / or data signals in dependence thereon. The device may have an interface, which may be formed in hardware and / or software. In the case of a hardware-based embodiment, the interfaces can be part of a so-called system ASIC, for example, which contains a wide variety of functions of the device. However, it is also possible that the interfaces are their own integrated circuits or at least partially consist of discrete components. In a software training, the interfaces may be software modules that are present, for example, on a microcontroller in addition to other software modules.

Von Vorteil ist auch ein Computerprogrammprodukt mit Programmcode, der auf einem maschinenlesbaren Träger wie einem Halbleiterspeicher, einem Festplattenspeicher oder einem optischen Speicher gespeichert sein kann und zur Durchführung und/oder Ansteuerung der Schritte des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen verwendet wird, insbesondere wenn das Programmprodukt auf einem Computer oder einer Vorrichtung ausgeführt wird.Also of advantage is a computer program product with program code which can be stored on a machine-readable carrier such as a semiconductor memory, a hard disk memory or an optical memory and used for carrying out and / or controlling the steps of the method according to one of the embodiments described above, in particular if Program product is executed on a computer or a device.

Der hier vorgestellte Ansatz wird nachstehend anhand der beigefügten Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:The approach presented here will be explained in more detail below with reference to the accompanying drawings. Show it:

1 eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; 1 a schematic representation of a microfluidic device according to an embodiment of the present invention;

2 eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; 2 a schematic representation of a microfluidic device according to an embodiment of the present invention;

3 und 4 Vergleichsdarstellungen von Analyseergebnissen gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung; und 3 and 4 Comparative illustrations of analysis results according to embodiments of the present invention; and

5 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. 5 a flowchart of a method according to an embodiment of the present invention.

In der nachfolgenden Beschreibung günstiger Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.In the following description of favorable embodiments of the present invention, the same or similar reference numerals are used for the elements shown in the various figures and similar acting, with a repeated description of these elements is omitted.

1 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei ist die Mikrofluidische Vorrichtung 100 beispielsweise als ein mikrofluidischer Chip bzw. ein Westentaschenlabor bzw. LoC (engl. Lab on Chip) ausgeführt, insbesondere zur medizinischen Diagnostik, mikrobiologischen Diagnostik oder Umweltanalytik. Gezeigt sind von der mikrofluidischen Vorrichtung 100 in 1 hierbei eine erste Reaktionskammer 110, eine Pumpkammer 120, eine Mischkammer 130, eine Lüftungsöffnung 140, eine Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern 150, wobei in 1 lediglich beispielhaft vier zweite Reaktionskammern 150 gezeigt sind, sowie eine Mehrzahl von Ventilen 161, 162, 163, 164, 165 und 166. 1 shows a schematic representation of a microfluidic device 100 for analyzing a sample of biological material according to an embodiment of the present invention. Here is the microfluidic device 100 For example, as a microfluidic chip or a Westentaschenlabor or LoC (English Lab on Chip) executed, in particular for medical diagnostics, microbiological diagnostics or environmental analysis. Shown are the microfluidic device 100 in 1 in this case, a first reaction chamber 110 , a pumping chamber 120 , a mixing chamber 130 , a ventilation opening 140 , a plurality of second reaction chambers 150 , where in 1 merely by way of example four second reaction chambers 150 are shown, as well as a plurality of valves 161 . 162 . 163 . 164 . 165 and 166 ,

Die erste Reaktionskammer 110 ist zwischen einem ersten Ventil 161 und einem zweiten Ventil 162 angeordnet. Dabei ist das erste Ventil 161 in einem mikrofluidischen Zufuhrkanal angeordnet. Über den mikrofluidischen Zufuhrkanal ist die Probe in die erste Reaktionskammer 110 zuführbar. Die erste Reaktionskammer 110 ist ausgebildet, um eine erste Polymerase-Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen. Das zweite Ventil 162 ist in einem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die erste Reaktionskammer 110 ist mittels des ersten mikrofluidischen Verbindungskanals fluidisch mit der Pumpkammer 120 verbunden.The first reaction chamber 110 is between a first valve 161 and a second valve 162 arranged. Here is the first valve 161 arranged in a microfluidic feed channel. Via the microfluidic feed channel, the sample is in the first reaction chamber 110 fed. The first reaction chamber 110 is configured to perform a first polymerase chain reaction on the sample to produce a first reaction product. The second valve 162 is arranged in a first microfluidic connection channel. The first reaction chamber 110 is fluidic with the pumping chamber by means of the first microfluidic connection channel 120 connected.

Die Pumpkammer 120 ist zwischen einem dritten Ventil 163 und einem vierten Ventil 164 angeordnet. Dabei ist das dritte Ventil 163 dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Somit sind zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 in dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal das zweite Ventil 162 und das dritte Ventil 163 angeordnet. Die Pumpkammer 120 ist mittels eines zweiten mikrofluidischen Verbindungskanals fluidisch mit der Mischkammer 130 verbunden. Das vierte Ventil 164 ist in dem zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die Pumpkammer 120 ist fluidisch zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 angeordnet.The pumping chamber 120 is between a third valve 163 and a fourth valve 164 arranged. Here is the third valve 163 the first Microfluidic connection channel arranged. Thus, between the first reaction chamber 110 and the pumping chamber 120 in the first microfluidic connection channel, the second valve 162 and the third valve 163 arranged. The pumping chamber 120 is fluidic with the mixing chamber by means of a second microfluidic connection channel 130 connected. The fourth valve 164 is arranged in the second microfluidic connection channel. The pumping chamber 120 is fluid between the first reaction chamber 110 and the mixing chamber 130 arranged.

Die Mischkammer 130 ist über den zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch mit der Pumpkammer 120 verbunden. Das vierte Ventil 164 ist hierbei zwischen der Pumpkammer 120 und der Mischkammer 130 in dem zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Somit ist die Mischkammer 130 über den zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal, die Pumpkammer 120 und den ersten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch mit der ersten Reaktionskammer 110 verbunden. Das erste Reaktionsprodukt ist von der ersten Reaktionskammer 110 über die Pumpkammer 120 in die Mischkammer 130 zuführbar. In der Mischkammer 130 ist ein Verdünnungsmedium vorlagerbar bzw. vorgelagert. Die Mischkammer 130 ist ausgebildet, um das erste Reaktionsprodukt aus der ersten Reaktionskammer 110 mit dem Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen.The mixing chamber 130 is fluidic with the pumping chamber via the second microfluidic connection channel 120 connected. The fourth valve 164 is here between the pumping chamber 120 and the mixing chamber 130 arranged in the second microfluidic connection channel. Thus, the mixing chamber 130 via the second microfluidic connection channel, the pumping chamber 120 and the first microfluidic connection channel fluidly with the first reaction chamber 110 connected. The first reaction product is from the first reaction chamber 110 over the pumping chamber 120 into the mixing chamber 130 fed. In the mixing chamber 130 is a dilution medium vorlagerbar or upstream. The mixing chamber 130 is formed to the first reaction product from the first reaction chamber 110 to mix with the dilution medium to produce a diluted mixture.

Die Lüftungsöffnung 140 ist in der Mischkammer 130 ausgeformt. Auch wenn es in 1 darstellungsbedingt nicht explizit erkennbar ist, so ist die Lüftungsöffnung 140 als eine Durchgangsöffnung zwischen der Mischkammer 130 und einer Außenoberfläche der mikrofluidischen Vorrichtung 100 angeordnet. Dabei ist die Lüftungsöffnung 140 als eine Ausgleichsöffnung relativ zu einem Umgebungsdruck ausgeformt.The ventilation opening 140 is in the mixing chamber 130 formed. Even if it is in 1 is not explicitly recognizable due to the presentation, so is the ventilation opening 140 as a passage opening between the mixing chamber 130 and an outer surface of the microfluidic device 100 arranged. Here is the ventilation opening 140 formed as a compensation opening relative to an ambient pressure.

Zwischen dem zweiten Ventil 162 und dem dritten Ventil 163 ist gemäß dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung eine Verzweigungsstelle in dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 angeordnet. An der Verzweigungsstelle zweigt von dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal ein dritter mikrofluidischer Verbindungskanal ab. Der dritte mikrofluidische Verbindungskanal erstreckt sich zwischen der Verzweigungsstelle und den beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150. Dabei verzweigt sich der dritte mikrofluidische Verbindungskanal in vier Teilkanäle.Between the second valve 162 and the third valve 163 is according to the in 1 illustrated embodiment of the present invention, a branch point in the first microfluidic connection channel between the first reaction chamber 110 and the pumping chamber 120 arranged. At the branching point, a third microfluidic connection channel branches off from the first microfluidic connection channel. The third microfluidic connection channel extends between the branching point and the exemplary four second reaction chambers 150 , In this case, the third microfluidic connection channel branches into four subchannels.

Jede der beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150 ist zwischen einem fünften Ventil 165 und einem sechsten Ventil 166 angeordnet. Somit sind gemäß dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vier fünfte Ventile 165 und vier sechste Ventile 166 vorgesehen. Dabei ist jedes der fünften Ventile 165 in einem der Teilkanäle des dritten mikrofluidischen Verbindungskanals angeordnet. Die zweiten Reaktionskammern 150 sind über die mikrofluidischen Verbindungskanäle fluidisch mit der Mischkammer 130 verbunden. Über den dritten mikrofluidischen Verbindungskanal ist das verdünnte Gemisch aus der Mischkammer 130 in die zweiten Reaktionskammern 150 zuführbar. Die zweiten Reaktionskammern 150 sind ausgebildet, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase-Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch durchzuführen. Die beispielhaft vier sechsten Ventile 166 sind in vier Teilkanälen angeordnet, die sich in einem mikrofluidischen Abfuhrkanal vereinigen.Each of the exemplary four second reaction chambers 150 is between a fifth valve 165 and a sixth valve 166 arranged. Thus, according to the in 1 illustrated embodiment of the present invention four fifth valves 165 and four sixth valves 166 intended. In this case, each of the fifth valves 165 arranged in one of the sub-channels of the third microfluidic connection channel. The second reaction chambers 150 are fluidic with the mixing chamber via the microfluidic connection channels 130 connected. Via the third microfluidic connection channel is the dilute mixture from the mixing chamber 130 into the second reaction chambers 150 fed. The second reaction chambers 150 are configured to perform a second polymerase chain reaction on the dilute mixture to analyze the sample. The exemplary four sixth valves 166 are arranged in four sub-channels, which unite in a microfluidic discharge channel.

Auch wenn es in 1 nicht explizit erkennbar ist, so ist gemäß dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung in der ersten Reaktionskammer 110 zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert. Ferner ist in der Mischkammer 130 zumindest eine erste Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert. Schließlich ist in den zweiten Reaktionskammern 150 zumindest eine zweite Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert. Die mikrofluidische Vorrichtung 100 ist insbesondere ausgebildet, um ein verdünntes Gemisch mit einem Mischungsverhältnis zu erzeugen, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion von der zweiten Polymerase-Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen. Die Ventile 161, 162, 163, 164, 165 und 166 können Schnittstellen aufweisen, die ausgebildet sind, um Ansteuersignale zu empfangen.Even if it is in 1 is not explicitly recognizable, it is according to the in 1 illustrated embodiment of the present invention in the first reaction chamber 110 preceded by at least one substance for carrying out the first polymerase chain reaction. Further, in the mixing chamber 130 at least a first substance for performing the second polymerase chain reaction upstream. Finally, in the second reaction chambers 150 preceded by at least one second substance for carrying out the second polymerase chain reaction. The microfluidic device 100 is particularly adapted to produce a dilute mixture having a mixing ratio suitable for at least partially eliminating primers from the first polymerase chain reaction from the second polymerase chain reaction. The valves 161 . 162 . 163 . 164 . 165 and 166 may include interfaces configured to receive drive signals.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel sind ein Volumen der ersten Reaktionskammer 110 und ein Volumen der Mischkammer 130 ausgebildet, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion von der zweiten Polymerase-Kettenreaktion in den zweiten Reaktionskammern 150 zumindest teilweise auszuschließen.According to one embodiment, a volume of the first reaction chamber 110 and a volume of the mixing chamber 130 adapted to effect in the dilute mixture a mixing ratio which is suitable to primers from the first polymerase chain reaction of the second polymerase chain reaction in the second reaction chambers 150 at least partially excluded.

Anders ausgedrückt zeigt 1 eine schematische Aufsicht der mikrofluidischen Vorrichtung 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Die mikrofluidische Vorrichtung 100 ist beispielsweise als ein mikrofluidischer Chip ausgeführt und umfasst unter anderem die erste Reaktionskammer 110 für die Durchführung einer ersten Polymerase-Kettenreaktion bzw. PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) als eine multiplex-PCR, die Pumpkammer 120, die Mischkammer 130 und die zweiten Reaktionskammern 150 für die Durchführung der zweiten PCR als singleplex-Polymerase-Kettenreaktionen. Dabei sind Substanzen bzw. Reaktionskomponenten für die erste PCR, wie beispielsweise Polymerase, unterschiedliche Primerpärchen für eine gemultiplexte PCR, Nukleosidtriphosphate, insbesondere Desoxyribonukleosidtriphosphate bzw. dNTP, PCR-Puffer, Additive und dergleichen, in der ersten Reaktionskammer 110 vorgelagert. Substanzen bzw. Reaktionskomponenten für die zweite PCR, wie beispielsweise dNTP, PCR-Puffer und Additive, sind in dem Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 vorgelagert. Polymerase, Primerpärchen und beispielsweise real-time-Sonden bzw. Sonden für die Durchführung einer real-time-PCR, sind in den zweiten Reaktionskammern 150 vorgelagert.In other words, shows 1 a schematic plan view of the microfluidic device 100 according to an embodiment. The microfluidic device 100 is for example designed as a microfluidic chip and includes, inter alia, the first reaction chamber 110 for performing a first polymerase chain reaction (PCR) as a multiplex PCR, the pumping chamber 120 , the mixing chamber 130 and the second reaction chambers 150 for carrying out the second PCR as single-plex polymerase chain reactions. there are substances or reaction components for the first PCR, such as polymerase, different primer pairs for a multiplexed PCR, nucleoside triphosphates, in particular deoxyribonucleoside triphosphates or dNTP, PCR buffer, additives and the like, in the first reaction chamber 110 upstream. Substances or reaction components for the second PCR, such as dNTP, PCR buffer and additives, are in the diluent medium in the mixing chamber 130 upstream. Polymerase, primer pairs and, for example, real-time probes or probes for performing a real-time PCR, are in the second reaction chambers 150 upstream.

Im Betrieb der mikrofluidischen Vorrichtung 100 wird die Probe bzw. DNA-Probe in die erste Reaktionskammer 110 eingefüllt und mit den dort vorgelagerten Reaktionskomponenten vermischt. Wenn das erste Ventil 161 und das zweite Ventil 162 geschlossen sind, werden Reaktionsbedingungen für die erste PCR geschaffen. Anschließend wird mittels einer Fördereinrichtung, welche die Pumpkammer 120 und das dritte Ventil 163 sowie das vierte Ventil 164 als Pumpventile aufweist, das erste Reaktionsprodukt aus der ersten PCR bzw. das Flüssigkeitsvolumen der ersten Reaktionskammer 110 in die Mischkammer 130 überführt und mit dem darin befindlichen Verdünnungsmedium vermischt. Eine Verdrängung überschüssiger Luft der Mischkammer 130 erfolgt hierbei über die Lüftungsöffnung 140. Das verdünnte Gemisch wird mittels der Pumpkammer 120 bei geschlossenem zweiten Ventil 162 auf die zweiten Reaktionskammern 150 verteilt. Anschließend werden die fünften Ventile 165 und sechsten Ventile 166 geschlossen und Reaktionsbedingungen für die zweite PCR geschaffen. Ein Reaktionsverlauf kann entweder in Echtzeit (engl. real time) verfolgt werden, wobei quantitative Informationen über eine initiale Menge jeweiliger DNA-Moleküle gewonnen werden können, oder am Ende der zweiten Reaktion gemessen werden, wobei ja/nein-Aussagen möglich sind. Gemäß dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ist das Mischungsverhältnis bzw. eine Verdünnungsstufe durch eine Menge an vorgelagertem Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 bestimmt.During operation of the microfluidic device 100 the sample or DNA sample is added to the first reaction chamber 110 filled and mixed with the reaction components upstream there. If the first valve 161 and the second valve 162 are closed, reaction conditions are created for the first PCR. Subsequently, by means of a conveyor, which the pumping chamber 120 and the third valve 163 as well as the fourth valve 164 having as pump valves, the first reaction product from the first PCR or the liquid volume of the first reaction chamber 110 into the mixing chamber 130 transferred and mixed with the dilution medium therein. A displacement of excess air of the mixing chamber 130 takes place via the ventilation opening 140 , The diluted mixture is passed through the pumping chamber 120 with the second valve closed 162 to the second reaction chambers 150 distributed. Subsequently, the fifth valves 165 and sixth valves 166 closed and created reaction conditions for the second PCR. A course of the reaction can either be followed in real time, whereby quantitative information about an initial quantity of respective DNA molecules can be obtained, or measured at the end of the second reaction, with yes / no statements being possible. According to the in 1 In the embodiment of the present invention shown, the mixing ratio or dilution stage is an amount of precursor dilution medium in the mixing chamber 130 certainly.

Gemäß einem im Bezug zu dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel vereinfachten Ausführungsbeispiel einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 neben der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 noch zumindest eine zweite Reaktionskammer 150. Ein in die zweite Reaktionskammer 150 führender Kanal kann, wie in 1 gezeigt, von einem Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 abzweigen, oder alternativ von der Mischkammer 130 in die zweite Reaktionskammer 150 führen. Eine optionale Pumpkammer 120 kann an einer geeigneten Position eines die Kammern 110, 130, 150 verbindenden Verbindungskanalnetzes angeordnet sein.According to one in relation to the in 1 embodiment shown simplified embodiment of a microfluidic device 100 next to the first reaction chamber 110 and the mixing chamber 130 at least a second reaction chamber 150 , One in the second reaction chamber 150 leading channel can, as in 1 shown by a connecting channel between the first reaction chamber 110 and the mixing chamber 130 branch off, or alternatively from the mixing chamber 130 in the second reaction chamber 150 to lead. An optional pumping chamber 120 can be at a suitable position of the chambers 110 . 130 . 150 be arranged connecting connecting channel network.

2 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Hierbei entspricht die mikrofluidische Vorrichtung 100 der mikrofluidischen Vorrichtung aus 1 mit der Ausnahme, dass die mikrofluidische Vorrichtung 100 in 2 zusätzlich ein siebtes Ventil 267 und eine Speicherkammer 270 aufweist. Somit sind von der mikrofluidischen Vorrichtung 100 in 2 die erste Reaktionskammer 110, die Pumpkammer 120, die Mischkammer 130, die Lüftungsöffnung 140, die lediglich beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150, die Ventile 161, 162, 163, 164, 165, 166 sowie 267 und die Speicherkammer 270 gezeigt. 2 shows a schematic representation of a microfluidic device 100 for analyzing a sample of biological material according to an embodiment of the present invention. This corresponds to the microfluidic device 100 of the microfluidic device 1 with the exception that the microfluidic device 100 in 2 in addition a seventh valve 267 and a storage chamber 270 having. Thus, from the microfluidic device 100 in 2 the first reaction chamber 110 , the pumping chamber 120 , the mixing chamber 130 , the ventilation opening 140 , which by way of example only have four second reaction chambers 150 , the valves 161 . 162 . 163 . 164 . 165 . 166 such as 267 and the storage chamber 270 shown.

Die Speicherkammer 270 ist über einen vierten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch mit der Verzweigungsstelle in dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 verbunden. Das siebte Ventil 267 ist in dem vierten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die Speicherkammer 270 ist ausgebildet, um das Verdünnungsmedium zu speichern. Mit der Mischkammer 130 ist die Speicherkammer 270 fluidisch über den vierten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch verbunden. Somit ist das erste Reaktionsprodukt in der Mischkammer 130 mit dem Verdünnungsmedium aus der Speicherkammer 270 in einem einstellbaren Mischungsverhältnis verdünnbar.The storage chamber 270 is fluidly connected to the branch point in the first microfluidic connection channel between the first reaction chamber via a fourth microfluidic connection channel 110 and the pumping chamber 120 connected. The seventh valve 267 is arranged in the fourth microfluidic connection channel. The storage chamber 270 is designed to store the dilution medium. With the mixing chamber 130 is the storage chamber 270 fluidly connected fluidically via the fourth microfluidic connection channel. Thus, the first reaction product is in the mixing chamber 130 with the dilution medium from the storage chamber 270 dilutable in an adjustable mixing ratio.

Anders ausgedrückt zeigt 2 eine Struktur der mikrofluidischen Vorrichtung 100, bei der unterschiedliche Verdünnungsstufen des ersten Reaktionsprodukts für die zweite PCR einstellbar sind. Gemäß dem in 2 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das Verdünnungsmedium für die zweite PCR in der Speicherkammer 270 vorgelagert. Ein Reaktionsvolumen der ersten PCR bzw. das erste Reaktionsprodukt wird mittels der Pumpkammer 120 in die Mischkammer 130 transferiert. Mittels der Pumpkammer 120 wird eine definierte Menge des Verdünnungsmediums aus der Speicherkammer 270 ebenfalls der Mischkammer 130 zugeführt und dort mit dem ersten Reaktionsprodukt vermischt. Dieses verdünnte Gemisch wird nun, wie es in 1 beschrieben ist, auf die zweiten Reaktionskammern 150 verteilt, und dort bei der zweiten PCR temperaturzykliert. Somit sind hierbei ohne Designänderung verschiedene Verdünnungsstufen des ersten Reaktionsprodukts in dem verdünnten Gemisch einstellbar.In other words, shows 2 a structure of the microfluidic device 100 in which different dilution stages of the first reaction product can be set for the second PCR. According to the in 2 Illustrated embodiment of the present invention is the dilution medium for the second PCR in the storage chamber 270 upstream. A reaction volume of the first PCR or the first reaction product is by means of the pumping chamber 120 into the mixing chamber 130 transferred. By means of the pumping chamber 120 is a defined amount of the dilution medium from the storage chamber 270 also the mixing chamber 130 fed and mixed there with the first reaction product. This diluted mixture will now, as it is in 1 is described on the second reaction chambers 150 and temperature-cycled at the second PCR. Thus, without a change in the design, different dilution stages of the first reaction product in the diluted mixture can be set.

3 zeigt eine Vergleichsdarstellung von Analyseergebnissen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Analyseergebnisse sind dabei durch händisches Pipettieren unter Verwendung von Eppendorf-Tubes (= Reaktionsgefäße) entstanden: Die Ergebnisse zeigen, dass die Grundidee (Inaktivierung von Primern einer ersten PCR-Reaktion mittels Verdünnen) funktioniert. 3 FIG. 12 is a comparative illustration of analysis results according to an embodiment of the present invention. FIG. The Analysis results were obtained by manual pipetting using Eppendorf Tubes (= reaction vessels): The results show that the basic idea (inactivation of primers of a first PCR reaction by dilution) works.

Anders ausgedrückt zeigt 3 eine Vergleichsdarstellung einer Gelelektrophorese von Analyseergebnissen einer „Diluted Nested PCR“ gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung, durchgeführt in einem Labor-PCR-Gerät. Das erste Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt einer ersten PCR, einer multiplex-PCR, wurde um unterschiedliche Verdünnungsfaktoren verdünnt und als sogenannte Template-DNA für die zweite PCR, in Gestalt mehrerer singleplex-PCRs, verwendet. Dabei wurde ein Primerpaar für das PVL-Gen eingesetzt. Einige der Spalten A, B, C, D, E, F, G und H in 3 repräsentieren hierbei die Analyseergebnisse, die aufgrund unterschiedlicher Verdünnungsfaktoren erhalten wurden.In other words, shows 3 a comparative representation of a gel electrophoresis of analysis results of a "Diluted Nested PCR" according to embodiments of the present invention, carried out in a laboratory PCR apparatus. The first reaction product or a PCR product of a first PCR, a multiplex PCR, was diluted by different dilution factors and used as so-called template DNA for the second PCR, in the form of several singleplex PCRs. In this case, a primer pair for the PVL gene was used. Some of the columns A, B, C, D, E, F, G and H in 3 represent the analysis results obtained due to different dilution factors.

In Spalte A ist ein PCR-Produkt der ersten PCR bzw. ein erstes Reaktionsprodukt gezeigt. Spalte B zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte C ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte D zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 5000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte E ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte F zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte G ist eine Negativkontrolle dargestellt und Spalte H zeigt eine DNA-Leiter, lediglich beispielhaft vom Typ 50 bp plus.Column A shows a PCR product of the first PCR or a first reaction product. Column B shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 50 was used as template DNA. Column C shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product was diluted by a factor of 500 as template DNA. Column D shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 5000 was used as template DNA. Column E shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product was diluted by a factor of 50,000 and used as template DNA. Column F shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 500,000 was used as template DNA. In column G, a negative control is shown and column H shows a DNA ladder, merely exemplified by the type 50 bp plus.

4 zeigt eine Vergleichsdarstellung von Analyseergebnissen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Analyseergebnisse sind dabei durch händisches Pipettieren unter Verwendung von Eppendorf-Tubes (=Reaktionsgefäße) entstanden: Die Ergebnisse zeigen, dass die Grundidee (Inaktivierung von Primern einer ersten PCR-Reaktion mittels Verdünnen) funktioniert. 4 FIG. 12 is a comparative illustration of analysis results according to an embodiment of the present invention. FIG. The analysis results were obtained by manual pipetting using Eppendorf Tubes (= reaction vessels): The results show that the basic idea (inactivation of primers of a first PCR reaction by dilution) works.

Anders ausgedrückt zeigt 4 eine Vergleichsdarstellung einer Gelelektrophorese von Analyseergebnissen einer „Diluted Nested PCR“ gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung, durchgeführt in einem Labor-PCR-Gerät. Das erste Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt einer ersten PCR, einer multiplex-PCR, wurde um unterschiedliche Verdünnungsfaktoren verdünnt und als sogenannte Template-DNA für die zweite PCR, in Gestalt mehrerer singleplex-PCRs, verwendet. Dabei wurde ein Primerpaar für das SSC1-Gen eingesetzt. Einige der Spalten A, B, C, D, E, F, G und H in 4 repräsentieren hierbei die Analyseergebnisse, die aufgrund unterschiedlicher Verdünnungsfaktoren erhalten wurden.In other words, shows 4 a comparative representation of a gel electrophoresis of analysis results of a "Diluted Nested PCR" according to embodiments of the present invention, carried out in a laboratory PCR apparatus. The first reaction product or a PCR product of a first PCR, a multiplex PCR, was diluted by different dilution factors and used as so-called template DNA for the second PCR, in the form of several singleplex PCRs. A primer pair for the SSC1 gene was used. Some of the columns A, B, C, D, E, F, G and H in 4 represent the analysis results obtained due to different dilution factors.

In Spalte A ist ein PCR-Produkt der ersten PCR bzw. ein erstes Reaktionsprodukt gezeigt und Spalte B zeigt eine DNA-Leiter, lediglich beispielhaft vom Typ 50 bp plus. Spalte C zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte D ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte E zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 5000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte F ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte G zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte H ist eine Negativkontrolle dargestellt.Column A shows a PCR product of the first PCR and a first reaction product, respectively, and Column B shows a DNA ladder, by way of example only of type 50 bp plus. Column C shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 50 was used as template DNA. In column D, a second reaction product or a PCR product of the second PCR is shown, for which the first reaction product diluted by a factor of 500 was used as template DNA. Column E shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 5000 was used as template DNA. Column F shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR for which the first reaction product was diluted by a factor of 50,000 and used as template DNA. Column G shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 500,000 was used as template DNA. Column H shows a negative control.

5 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 500 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren 500 ist unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar, die eine erste Reaktionskammer, eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene Mischkammer und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene, zweite Reaktionskammer aufweist. Insbesondere ist das Verfahren 500 unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar, wie sie beispielsweise anhand der 1 bzw. 2 beschrieben ist. 5 shows a flowchart of a method 500 for analyzing a sample of biological material according to an embodiment of the present invention. The procedure 500 is executable using a microfluidic device having a first reaction chamber, a mixing chamber fluidly connected to the first reaction chamber, and at least one second reaction chamber fluidically connected to the mixing chamber. In particular, the method 500 executable using a microfluidic device, as for example with reference to the 1 respectively. 2 is described.

Das Verfahren 500 weist einen Schritt 510 des Ausführens einer ersten Polymerase-Kettenreaktion an der Probe in der ersten Reaktionskammer auf, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen. Auch weist das Verfahren 500 einen Schritt 520 des Mischens Des ersten Reaktionsprodukts mit einem Verdünnungsmedium in der Mischkammer auf, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen. Ferner weist das Verfahren 500 einen Schritt 530 des Durchführens einer zweiten Polymerase-Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer auf, um die Probe zu analysieren.The procedure 500 has a step 510 carrying out a first polymerase chain reaction on the sample in the first reaction chamber to produce a first reaction product. Also, the procedure assigns 500 one step 520 mixing the first reaction product with a diluent medium in the mixing chamber to produce a dilute mixture. Further, the method has 500 one step 530 performing a second polymerase chain reaction on the diluted mixture in the at least one second reaction chamber to analyze the sample.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden im Schritt 520 des Mischens Ansteuersignale zum Ansteuern zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung erzeugt, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion von der zweiten Polymerase-Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen.According to one embodiment, in step 520 mixing means for driving at least one valve and additionally or alternatively at least one conveyor of the microfluidic device is generated to effect in the dilute mixture a mixing ratio which is suitable to at least partially from the first polymerase chain reaction of the second polymerase chain reaction excluded.

Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die 1 bis 5 zusammenfassend und in anderen Worten erläutert.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to FIGS 1 to 5 in summary and in other words explained.

Die Vergleichsdarstellungen aus den 3 und 4 zeigen, dass bei Verdünnen des ersten Reaktionsprodukts bzw. des PCR-Produkts der ersten PCR, der multiplex-PCR, um den Faktor 500 mit Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 dann in der zumindest einen nachgeschalteten singleplex-PCR, der zweiten PCR, ein einziges, spezifisches PCR-Produkt generiert wird. Eine Verdünnung des ersten Reaktionsprodukts kann verhindern, dass die Primer der ersten PCR auch in der zweiten PCR noch aktiv sind. Somit kann in der zweiten PCR nur das gewünschte singleplex-PCR-Produkt generiert werden, und nicht auch alle anderen, von den multiplex-Primerpärchen adressierten, PCR-Produkte. So kann eine erhöhte Reaktionseffizienz bei sparsamerem Verbrauch von Reaktionskomponenten und Erhöhung einer Enzymaktivität erreicht werden, weshalb beispielsweise auch DNA-Sequenzen in kleinen Menge nachgewiesen werden können.The comparative representations of the 3 and 4 show that when diluting the first reaction product or the PCR product of the first PCR, the multiplex PCR, by a factor of 500 with dilution medium in the mixing chamber 130 then in the at least one downstream single-PCR, the second PCR, a single, specific PCR product is generated. A dilution of the first reaction product can prevent the primers of the first PCR are still active in the second PCR. Thus, only the desired single-plex PCR product can be generated in the second PCR, and not all other PCR products addressed by the multiplex primer pairs. Thus, an increased reaction efficiency can be achieved with more economical consumption of reaction components and an increase in enzyme activity, which is why, for example, DNA sequences can also be detected in small quantities.

Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird um einen Faktor 50 verdünnt. Hierbei kann eine teilweise Inaktivierung der Primerpärchen der ersten PCR erreicht werden, wie es in 3, Spalte B bzw. 4, Spalte C dargestellt ist. Die nötige Spezifität kann durch einen Einsatz von realtime-Sonden, die Signale nur bei Vorhandensein einer bestimmten DNA-Sequenz liefern, in der zweiten PCR erhalten werden. Wird dies beispielsweise unter Verwendung der mikrofluidischen Vorrichtung 100 aus 2 realisiert, so weist beispielsweise die erste Reaktionskammer 110 ein Volumen von 10 Mikroliter auf und weist die Speicherkammer 270, die das Verdünnungsmedium mit Reaktionskomponenten enthält, ein Volumen von 490 Mikroliter auf.According to one embodiment, it is diluted by a factor of 50. In this case, a partial inactivation of the primer pairs of the first PCR can be achieved, as described in US Pat 3 , Column B or 4 , Column C is shown. The required specificity can be obtained in the second PCR by using real-time probes that deliver signals only in the presence of a specific DNA sequence. This is done, for example, using the microfluidic device 100 out 2 realized, for example, has the first reaction chamber 110 a volume of 10 microliters and has the storage chamber 270 containing the diluent with reaction components has a volume of 490 microliters.

Gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung kann eine Dicke der mikrofluidischen Vorrichtung 100 beispielsweise 0,5 bis 5 Millimeter betragen, wobei Kanaldurchmesser von mikrofluidischen Kanälen 10 Mikrometer bis 3 Millimeter und Volumen von Kammern zwischen 1 Kubikmillimeter bis 1000 Kubikmillimeter betragen können.According to embodiments of the present invention, a thickness of the microfluidic device 100 For example, be 0.5 to 5 millimeters, wherein channel diameter of microfluidic channels can be 10 microns to 3 millimeters and volumes of chambers between 1 cubic millimeter to 1000 cubic millimeters.

Ein beispielhafter Prozessablauf umfasst für eine erste PCR einen Parameterraum mit einer Anzahl von 1 bis 20 Thermozyklen, wobei Temperaturzyklen mit 93 Grad Celsius bis 96 Grad Celsius zur Denaturierung, 72 Grad Celsius zur Verlängerung, 54 Grad Celsius bis 65 Grad Celsius zur Primeranbindung vorgesehen sind, wobei es auch möglich ist, den Schritt auf der Verlängerungstemperatur wegzulassen und somit eine zweischrittige PCR durchzuführen. Für eine zweite PCR umfasst ein Parameterraum eine Anzahl von 20 bis 60 Thermozyklen, wobei Temperaturzyklen mit 93 Grad Celsius bis 96 Grad Celsius zur Denaturierung, 72 Grad Celsius zur Verlängerung, 54 Grad Celsius bis 65 Grad Celsius zur Primeranbindung vorgesehen sind, wobei es auch möglich ist, den Schritt auf der Verlängerungstemperatur wegzulassen und somit eine zweischrittige PCR durchzuführen. Eine Anzahl an Polymerase-Kettenreaktionen liegt beispielsweise für die erste PCR zwischen 1 und 20 Reaktionen und für die zweite PCR zwischen 1 und 50 Reaktionen.An exemplary process sequence for a first PCR comprises a parameter space with a number of 1 to 20 thermocycles, wherein temperature cycles of 93 degrees Celsius to 96 degrees Celsius for denaturation, 72 degrees Celsius for extension, 54 degrees Celsius to 65 degrees Celsius for primer connection are provided whereby it is also possible to omit the step on the extension temperature and thus perform a two-step PCR. For a second PCR, a parameter space comprises a number of 20 to 60 thermocycles, with temperature cycles of 93 degrees Celsius to 96 degrees Celsius for denaturation, 72 degrees Celsius for extension, 54 degrees Celsius to 65 degrees Celsius for primer attachment, although possible is to omit the step on the extension temperature and thus perform a two-step PCR. For example, a number of polymerase chain reactions have between 1 and 20 reactions for the first PCR and between 1 and 50 reactions for the second PCR.

Eine Messung eines PCR-Reaktionserfolgs umfasst beispielsweise einen Einsatz von Hydrolysesonden, beispielsweise TaqMan-Sonden, LightCycler-Sonden, LoopTag-Sonden, Scorpion-Primer oder Molecular Beacons. Hierbei kann an einem ansteigenden Fluoreszenzsignal der Reaktionserfolg bestimmt werden. Auch denkbar sind eine elektrische Auslese mittels ISFETs, eine Impedanzmessung, eine Messung eines oberflächengebundenen PCR-Produkts mittels Interdigitalelektrodenstrukturen oder dergleichen.A measurement of a PCR reaction success includes, for example, a use of hydrolysis probes, for example TaqMan probes, LightCycler probes, LoopTag probes, Scorpion primers or molecular beacons. In this case, the reaction success can be determined by an increasing fluorescence signal. Also conceivable are electrical readout by means of ISFETs, an impedance measurement, a measurement of a surface-bound PCR product by means of interdigital electrode structures or the like.

Die beschriebenen und in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele sind nur beispielhaft gewählt. Unterschiedliche Ausführungsbeispiele können vollständig oder in Bezug auf einzelne Merkmale miteinander kombiniert werden. Auch kann ein Ausführungsbeispiel durch Merkmale eines weiteren Ausführungsbeispiels ergänzt werden. The embodiments described and shown in the figures are chosen only by way of example. Different embodiments may be combined together or in relation to individual features. Also, an embodiment can be supplemented by features of another embodiment.

Ferner können die hier vorgestellten Verfahrensschritte wiederholt sowie in einer anderen als in der beschriebenen Reihenfolge ausgeführt werden. Furthermore, the method steps presented here can be repeated as well as executed in a sequence other than that described.

Umfasst ein Ausführungsbeispiel eine „und/oder“ -Verknüpfung zwischen einem ersten Merkmal und einem zweiten Merkmal, so ist dies so zu lesen, dass das Ausführungsbeispiel gemäß einer Ausführungsform sowohl das erste Merkmal als auch das zweite Merkmal und gemäß einer weiteren Ausführungsform entweder nur das erste Merkmal oder nur das zweite Merkmal aufweist.If an exemplary embodiment comprises a "and / or" link between a first feature and a second feature, then this is to be read so that the embodiment according to one embodiment, both the first feature and the second feature and according to another embodiment either only first feature or only the second feature.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

US 2011/0070578 A1 [0002] US 2011/0070578 A1 [0002]

Claims

Mikrofluidische Vorrichtung (100) zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, wobei die mikrofluidische Vorrichtung (100) folgende Merkmale aufweist: eine erste Reaktionskammer (110), die ausgebildet ist, um eine erste Polymerase-Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen; eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer (110) verbundene oder verbindbare Mischkammer (130), die ausgebildet ist, um das erste Reaktionsprodukt mit einem Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer (130) verbundene oder verbindbare, zweite Reaktionskammer (150), die ausgebildet ist, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase-Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch durchzuführen.Microfluidic device ( 100 ) for analyzing a sample of biological material, wherein the microfluidic device ( 100 ) has the following features: a first reaction chamber ( 110 ) configured to perform a first polymerase chain reaction on the sample to produce a first reaction product; a fluidic with the first reaction chamber ( 110 ) connected or connectable mixing chamber ( 130 ) formed to mix the first reaction product with a dilution medium to produce a dilute mixture; and at least one fluidically with the mixing chamber ( 130 ) connected or connectable, second reaction chamber ( 150 ) configured to perform a second polymerase chain reaction on the dilute mixture to analyze the sample.

Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß Anspruch 1, bei der in der ersten Reaktionskammer (110) zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert ist oder sein kann, wobei in der Mischkammer (130) das Verdünnungsmedium vorgelagert ist, wobei in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer (150) und/oder in der Mischkammer (130) zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert ist.Microfluidic device ( 100 ) according to claim 1, wherein in the first reaction chamber ( 110 ) is or may be preceded by at least one substance for carrying out the first polymerase chain reaction, wherein in the mixing chamber ( 130 ) is preceded by the dilution medium, wherein in the at least one second reaction chamber ( 150 ) and / or in the mixing chamber ( 130 ) is preceded by at least one substance for carrying out the second polymerase chain reaction.

Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß Anspruch 1, mit einer fluidisch mit der Mischkammer (130) verbundenen oder verbindbaren Speicherkammer (270) zum Speichern von Verdünnungsmedium, wobei in der ersten Reaktionskammer (110) zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert ist oder sein kann, wobei in der Speicherkammer (270) das Verdünnungsmedium vorgelagert ist, wobei in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer (150), in der Speicherkammer (270) und/oder in der Mischkammer (130) zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert ist.Microfluidic device ( 100 ) according to claim 1, with a fluidic with the mixing chamber ( 130 ) connected or connectable storage chamber ( 270 ) for storing dilution medium, wherein in the first reaction chamber ( 110 ) is or may be preceded by at least one substance for carrying out the first polymerase chain reaction, wherein in the storage chamber ( 270 ) is preceded by the dilution medium, wherein in the at least one second reaction chamber ( 150 ), in the storage chamber ( 270 ) and / or in the mixing chamber ( 130 ) is preceded by at least one substance for carrying out the second polymerase chain reaction.

Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, bei der ein Volumen der ersten Reaktionskammer (110) und ein Volumen der Mischkammer (130) ausgebildet sind, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion von der zweiten Polymerase-Kettenreaktion auszuschließen.Microfluidic device ( 100 ) according to one of the preceding claims, in which a volume of the first reaction chamber ( 110 ) and a volume of the mixing chamber ( 130 ) are adapted to effect a mixing ratio in the dilute mixture suitable to exclude primers from the first polymerase chain reaction from the second polymerase chain reaction.

Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einer Lüftungsöffnung (140), die in der Mischkammer (130) als Ausgleichsöffnung relativ zu einem Umgebungsdruck ausgeformt ist.Microfluidic device ( 100 ) according to one of the preceding claims, with a ventilation opening ( 140 ) in the mixing chamber ( 130 ) is formed as a compensation opening relative to an ambient pressure.

Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einer fluidisch zwischen die erste Reaktionskammer (110) und die Mischkammer (130) geschalteten Pumpkammer (120) und einer Mehrzahl von Ventilen (161, 162, 163, 164, 165, 166, 267), wobei eine Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern (150) vorgesehen ist, wobei die erste Reaktionskammer (110) zwischen einem ersten Paar von Ventilen (161, 162) angeordnet ist, die Pumpkammer (120) zwischen einem zweiten Paar von Ventilen (163, 164) angeordnet ist und die Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern zwischen einer Mehrzahl von dritten Paaren von Ventilen (165, 166) angeordnet ist.Microfluidic device ( 100 ) according to one of the preceding claims, with a fluidically between the first reaction chamber ( 110 ) and the mixing chamber ( 130 ) connected pumping chamber ( 120 ) and a plurality of valves ( 161 . 162 . 163 . 164 . 165 . 166 . 267 ), wherein a plurality of second reaction chambers ( 150 ), the first reaction chamber ( 110 ) between a first pair of valves ( 161 . 162 ), the pumping chamber ( 120 ) between a second pair of valves ( 163 . 164 ) is arranged and the plurality of second reaction chambers between a plurality of third pairs of valves ( 165 . 166 ) is arranged.

Verfahren (500) zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, wobei das Verfahren unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung (100) ausführbar ist, die eine erste Reaktionskammer (110), eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer (110) verbundene Mischkammer (130) und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer (130) verbundene, zweite Reaktionskammer (150) aufweist, wobei das Verfahren (500) folgende Schritte aufweist: Ausführen (510) einer ersten Polymerase-Kettenreaktion an der Probe in der ersten Reaktionskammer (110), um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen; Mischen (520) des ersten Reaktionsprodukts mit einem Verdünnungsmedium in der Mischkammer (130), um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und Durchführen (530) einer zweiten Polymerase-Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer (150), um die Probe zu analysieren.Procedure ( 500 ) for analyzing a sample of biological material, the method using a microfluidic device ( 100 ), which is a first reaction chamber ( 110 ), one fluidically with the first reaction chamber ( 110 ) associated mixing chamber ( 130 ) and at least one fluidically with the mixing chamber ( 130 ), second reaction chamber ( 150 ), the method ( 500 ) has the following steps: Execute ( 510 ) a first polymerase chain reaction on the sample in the first reaction chamber ( 110 ) to produce a first reaction product; Mix ( 520 ) of the first reaction product with a dilution medium in the mixing chamber ( 130 ) to produce a diluted mixture; and performing ( 530 ) a second polymerase chain reaction on the dilute mixture in the at least one second reaction chamber ( 150 ) to analyze the sample.

Verfahren (500) gemäß Anspruch 7, bei dem im Schritt (520) des Mischens Ansteuersignale zum Ansteuern zumindest eines Ventils (161, 162, 163, 164, 165, 166, 267) und/oder zumindest einer Fördereinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung (100) erzeugt werden, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase-Kettenreaktion von der zweiten Polymerase-Kettenreaktion auszuschließen.Procedure ( 500 ) according to claim 7, wherein in step ( 520 ) of the mixing control signals for controlling at least one valve ( 161 . 162 . 163 . 164 . 165 . 166 . 267 ) and / or at least one conveying device of the microfluidic device ( 100 ) to cause in the dilute mixture a mixing ratio suitable to exclude primers from the first polymerase chain reaction from the second polymerase chain reaction.

Vorrichtung, die ausgebildet ist, um alle Schritte eines Verfahrens (500) gemäß einem der Ansprüche 7 bis 8 durchzuführen.Device designed to handle all the steps of a method ( 500 ) according to one of claims 7 to 8.

Computerprogramm, das dazu eingerichtet ist, alle Schritte eines Verfahrens (500) gemäß einem der Ansprüche 7 bis 8 durchzuführen.Computer program adapted to perform all steps of a procedure ( 500 ) according to one of claims 7 to 8.

Maschinenlesbares Speichermedium mit einem darauf gespeicherten Computerprogramm nach Anspruch 10. A machine-readable storage medium having a computer program stored thereon according to claim 10.