DE102014203747A1

DE102014203747A1 - Lasermikrodissektionssystem und Lasermikrodissektionsverfahren

Info

Publication number: DE102014203747A1
Application number: DE102014203747.6A
Authority: DE
Inventors: Falk Schlaudraff
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2015-09-03
Also published as: WO2015128447A1

Abstract

Lasermikrodissektionssystem (100) mit einem Mikroskop (10), das eine Aufnahmeeinrichtung (52) zur Aufnahme einer biologischen Probe (51) und eine Auflichteinrichtung (76) mit einer Laserablenkeinrichtung (73) aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit (70) bereitgestellten Laserstrahl (77) durch ein Mikroskopobjektiv (41) des Mikroskops (10) auf einen Probenbereich (510) der biologischen Probe (51) führt und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls (77) auf dem Probenbereich (510) verschiebt, wobei das Lasermikrodissektionssystem (100) mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73'') zum Führen mindestens eines weiteren Laserstrahls (77', 77'') auf den Probenbereich (510) oder auf mindestens einen anderen Probenbereich (530, 540) und zum Verschieben des Auftreffpunkts des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77'') auf dem jeweiligen Probenbereich aufweist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lasermikrodissektionssystem und ein Lasermikrodissektionsverfahren gemäß den jeweiligen Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche sowie verschiedene Verwendungen des beanspruchten Lasermikrodissektionssystems.
Stand der Technik
Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer biologischen Probe ("Objekt") isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt der Probe mit dem Laserstrahl, durch den diese kaum verändert wird. Die Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einer Probe mittels eines Infrarot- oder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer an der Probe anheftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten "Laser Capture Microdissection" wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben transportierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie kann dadurch erzeugt werden, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter Anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da sich die Probe im Gesichtsfeld bewegt und das Bild ohne weitere Kompensationsmaßnahmen verschwommen bzw. verschmiert erscheint.
Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der zu dissektierenden feststehenden Probe zu bewegen. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen sollen und dort besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Lasermikroskopsystem das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im Laserstrahlengang aufweist, ist beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 beschrieben.
In beiden Fällen, also in Systemen mit bewegter oder feststehender Probe, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreibung derartiger Löcher bzw. Vertiefungen, gegebenenfalls mit Überlappung.
Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen verwendet werden, die mit einem Laserstrahl vom umliegenden Gewebe separiert und anschließend beispielsweise unterschiedlichen diagnostischen Analyseverfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifisch Tumorzellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und auf spezifische Metaboliten oder Proteine zu untersuchen.
Weiterhin kann die Lasermikrodissektion auch zur Manipulation von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen eingesetzt werden. Hier ist beispielsweise an eine Fluoreszenzanregung zu denken oder an die Verwendung als optische Pinzette.
Ein Problem bei den Lasermikrodissektionstechniken ist die Geschwindigkeitsbegrenzung beim Ausschneiden eines Dissektats oder beim Manipulieren einer Zielregion auf einer Probe mit mehreren auszuschneidenden bzw. zu manipulierenden Probenabschnitten. Solche Probenabschnitte werden sequentiell abgearbeitet.
Bei diesem sogenannten Serial Section Cutting (SSC) werden verschiedene Serienschnitte, die aus ein und demselben Präparat stammen, parallel bearbeitet. Ein solches Verfahren ist beispielsweise aus der US 2012/0045790 A1 bekannt.
Gemäß dieser US 2012/0045790 A1 werden aus einem Präparat zwei insbesondere benachbarte Probenschnitte entnommen und jeweils auf einen Objektträger aufgebracht. Der erste Probenschnitt befindet sich auf einem Standardobjektträger (mit Deckglas), der zweite Probenschnitt befindet sich auf einem sogenannten Dissektions-Objektträger (ohne Deckglas). Ein Probenbereich auf dem Standardobjektträger wird mikroskopisch untersucht, wobei ein interessierender Probenabschnitt festgelegt wird. Das Bild des ersten Probenschnitts wird mit dem Bild des zweiten Probenschnitts überlagert, so dass der interessierende Probenbereich aus einem ersten Probenschnitt auf den entsprechenden Probenbereich im zweiten Probenschnitt projiziert wird. Dieser entsprechende Probenbereich kann nun mittels Lasermikrodissektion aus dem zweiten Probenschnitt herausgeschnitten und einer weiteren Analyse zugeführt werden. Auch bei diesem Lasermikrodissektionsverfahren können mehrere interessierende Probenbereiche nur sequentiell bearbeitet werden.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es daher, den Prozess der Lasermikrodissektion zu beschleunigen, wobei insbesondere gleichzeitig eine Flexibilisierung dieses Prozesses ermöglicht werden soll.
Offenbarung der Erfindung
Zur Lösung der genannten Aufgabe schlägt die vorliegende Erfindung ein Lasermikrodissektionssystem, Verwendungen dieses Systems sowie entsprechende Verfahren zur Lasermikrodissektion gemäß den unabhängigen Patentansprüchen vor. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Die vorliegende Erfindung geht aus von einem an sich bekannten Lasermikrodissektionssystem mit einem Mikroskop, das eine Aufnahmeeinrichtung zur Aufnahme einer biologischen Probe und eine Auflichteinrichtung mit einer Laserablenkeinrichtung aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf einen Probenbereich der biologischen Probe führt und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls auf dem Probenbereich verschiebt.
Ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem ist unten ausführlich unter Bezugnahme auf die 1 erläutert. Mittels der Auflichteinrichtung wird in einem solchen Lasermikrodissektionssystem der Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten der Probe verwendet wird, auf diese fokussiert. Somit verläuft, mit anderen Worten, der Strahlengang des Laserstrahls der Lasereinheit durch die Auflichteinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv und schneidet eine Objektebene des Mikroskopobjektivs an einem einstellbaren Schnittpunkt, der mittels Ansteuersignalen an die Laserablenkeinrichtung vorgegeben wird.
Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit Proben verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich und laserdissizierbar (also ohne Deckgläschen oder ähnliche Abdeckung, nicht jedoch flüssigkeitsüberzogen) vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Gewebe-Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt wurden, im vorliegenden Fall jedoch auch um dickere Schnitte aus einem entsprechenden Gewebeblock. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem dient daher nicht zur Gewinnung von Proben, sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auch mit Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, z.B. mit Ausstrichen, Mazeraten usw. Wie erwähnt, eignet sich die Erfindung jedoch auch zur Verarbeitung dickerer Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms vorbereitet wurden.
Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Proben eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, gegebenenfalls dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach probenabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen morphologischen Kriterien, eingerichtet sind. Im vorliegenden Fall dient das Lasermikrodissektionssystem insbesondere zum Heraustrennen von Probenpartikeln, die anschließend in einem Suspendierfluid aufgenommen werden. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen aufgrund der völlig unterschiedlichen Zielsetzung nicht auf derartige Lasermikrodissektionssysteme übertragen.
Zum Heraustrennen von Probenpartikel bzw. Probenbereichen, also zur Gewinnung von Dissektaten, wird ein Probenbereich entlang einer Schnittlinie vollständig durchtrennt und somit von der umgebenden Probe abgelöst. Es ist beispielsweise nicht möglich, Material unterschiedlicher, übereinander liegender Gewebeschichten getrennt voneinander zu isolieren. Ein mittels Lasermikrodissektion gewonnenes Dissektat stellt daher stets ein "Sammelprobenbereich" durch die gesamte Dicke der bearbeiteten Probe dar; eine Differenzierung in einzelne Gewebeschichten mittels Lasermikrodissektion ist nicht möglich bzw. kann nur indirekt über die Dicke des Probenbereichs geschehen.
Der Mikroskoptisch ist in Lasermikrodissektionssystemen mit einer Laserablenkeinrichtung, wie erfindungsgemäß eingesetzt, beim Bearbeiten der Probe gegenüber dem Mikroskopobjektiv bezüglich der x- und y-Richtung (also senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs) feststehend angeordnet.
Im Gegensatz zu Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch (Scanningtisch), der insbesondere bei stark vergrößernden Objektiven eine hohe Positioniergenauigkeit besitzen muss, um präzise Schnitte zu ermöglichen, erweisen sich Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserablenkeinrichtung als einfacher und kostengünstiger in der Herstellung und besitzen Präzisionsvorteile.
Die Laserablenkeinrichtung weist in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei dicke, gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um eine optische Achse drehbare gläserne Keilplatten („Glaskeile“) auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der gläsernen Keilplatten ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel. Am Ausgang der Laserablenkeinrichtung weist der Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der gläsernen Keilplatten einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs. Der Schnittpunkt des Laserstrahls mit der Objektebene ist damit einstellbar.
Eine derartige Laserablenkeinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserablenkeinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern, Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupillenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille trifft. Bei der Lasermikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV-taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Weitere Vorteile einer derartigen Laserablenkeinrichtung mit Keilplatten sind beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 genannt.
Vorteile der Erfindung
Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem besitzt ein Mikroskop, das eine Aufnahmeeinrichtung zur Aufnahme einer biologischen Probe und eine Auflichteinrichtung mit einer Laserablenkeinrichtung aufweist, die einen durch eine Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf einen Probenbereich dieser biologischen Probe führt und den Auftreffpunkt des Laserstrahls auf dem bzw. innerhalb des Probenbereichs verschiebt. Dieses Lasermikrodissektionssystem weist zusätzlich mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung auf, die derart eingerichtet ist, dass sie mindestens einen weiteren Laserstrahl auf den genannten Probenbereich führt oder auf mindestens einen anderen Probenbereich führt und den Auftreffpunkt dieses mindestens einen weiteren Laserstrahls dort verschiebt.
Die Erfindung setzt somit zur Manipulation oder zum Schneiden einer Probe einen weiteren Laserstrahl mit zugeordneter Laserablenkeinrichtung ein. Jedem weiteren Laserstrahl ist jeweils eine entsprechende Laserablenkeinrichtung zugeordnet. Unter "Probenbereich" soll ein interessierender Teilbereich der mikroskopisch betrachteten Probe verstanden werden, wobei dieser Probenbereich mittels der auftreffenden Laserstrahlung manipuliert oder mittels eines fokussierten Laserstrahls ausgeschnitten wird. In der Regel, jedoch nicht zwingend, wird der Laserstrahl beispielsweise durch ein Mikroskopobjektiv auf den Probenbereich fokussiert, insbesondere für das Laserschneiden.
Aufgrund des erfindungsgemäßen Einsatzes mehrerer (mindestens zwei) Laserstrahlen eröffnen sich drei verschiedene Möglichkeiten der Probenbearbeitung:
Erstens ist es möglich, einen einzigen Probenbereich auf einer Probe durch mehrere Laserstrahlen zu bearbeiten, beispielsweise einen Probenbereich mittels mehrerer fokussierter Laserstrahlen aus der Probe zu schneiden.
Zweitens können zwei oder mehr Probenbereiche einer mikroskopisch untersuchten biologischen Probe parallel und insbesondere gleichzeitig mit jeweils mindestens einem Laserstrahl bearbeitet werden. Auf diese Weise können beispielsweise mehrere interessierende Probenbereiche innerhalb einer Probe gleichzeitig aus der Probe dissektiert werden.
Schließlich können drittens mehrere Probenbereiche jeweils verschiedener Proben parallel und insbesondere gleichzeitig mit jeweils entsprechenden Laserstrahlen bearbeitet werden. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, in einer Reihe von Probenschnitten korrespondierende Probenbereiche parallel aus den jeweiligen Proben zu schneiden. In dem Folgenden soll dies als "Parallel Section Cutting" (PSC) bezeichnet werden.
Alle drei der genannten Alternativen sind auch untereinander kombinierbar. Beispielsweise kann die zweite Alternative mit der ersten Alternative kombiniert werden, so dass mehrere Probenbereiche auf einer Probe jeweils mit zwei oder mehr Laserstrahlen parallel bearbeitet werden. Bei Kombinationen der zweiten und dritten Alternative würden beispielsweise mehrere korrespondierende Probenbereiche auf mehreren Proben mittels jeweiliger zugeordneter Laserstrahlen parallel bearbeitet werden. Dem Fachmann erschließen sich die weiteren möglichen Kombinationen der ersten mit der dritten Alternative und die aller drei Alternativen.
Bevor auf die genannten Ausführungsformen näher eingegangen wird, sollen im Folgenden mögliche und bevorzugte Ausführungsformen für die Bereitstellung weiterer Laserablenkeinrichtungen mit zugeordneten Laserstrahlen erörtert werden. Allgemein kann der weitere Laserstrahl (oder die weiteren Laserstrahlen) durch zusätzliche Lasereinheiten und/oder durch einen oder mehrere Strahlteileranordnungen erzeugt werden, die einen vorhandenen Laserstrahl in zwei oder mehr Strahlen aufteilen.
Es kann vorteilhaft sein, wenn der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung eine weitere Lasereinheit zugeordnet ist, die einen des mindestens einen Laserstrahls bereitstellt. Somit ist mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung mit mindestens einer weiteren Lasereinheit vorhanden. Dies ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn für jeden Laserstrahl die volle Laserleistung beispielsweise beim Laserschneiden benötigt wird.
Es kann vorteilhaft sein, wenn der Lasereinheit eine Strahlteileranordnung nachgeordnet ist, die aus dem von der Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl den mindestens einen weiteren Laserstrahl durch Strahlteilung erzeugt. Es wäre somit prinzipiell ausreichend, wenn eine Lasereinheit vorhanden ist, aus der durch Strahlteilung mehrere Laserstrahlen erzeugt werden.
Selbstverständlich können auch Mischformen der beiden genannten Ausgestaltungen zweckmäßig sein. So kann einer weiteren Lasereinheit eine Strahlteileranordnung nachgeordnet sein, die aus dem von dieser weiteren Lasereinheit bereitgestellten weiteren Laserstrahl wiederum mindestens einen weiteren Laserstrahl durch Strahlteilung erzeugt.
Die genannten Laserablenkeinrichtungen können die jeweiligen Laserstrahlen auf verschiedene Weise auf eine Probe führen.
Zum einen ist es möglich, alle Laserstrahlen durch dasselbe Mikroskopobjektiv des Mikroskops der Lasermikrodissektionseinrichtung zu leiten. Selbstverständlich ist es auch möglich, nur einen Teil aller zur Verfügung stehenden Laserstrahlen durch dasselbe Mikroskopobjektiv zu leiten. Hierbei ist die vorhandene Laserablenkeinrichtung und mindestens eine der (mindestens einen) weiteren Laserablenkeinrichtungen derart eingerichtet, dass die von diesen Laserablenkeinrichtungen abgelenkten Laserstrahlen durch das Mikroskopobjektiv des Mikroskops des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems geführt werden.
Zum Anderen kann für einen, für mehrere oder für alle der weiteren Laserstrahlen jeweils eine Laserfokussierlinse vorgesehen sein, die den jeweiligen weiteren Laserstrahl auf dieselbe oder auf eine andere Probe führt. Hierzu ist eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung derart eingerichtet, dass sie den von ihr abgelenkten Laserstrahl durch eine Laserfokussierlinse auf den Probenbereich oder auf einen des mindestens einen anderen Probenbereichs führt. Bei dieser Ausgestaltung würde dem Mikroskop bzw. dem Mikroskopobjektiv des Lasermikrodissektionssystems mindestens eine weitere Laserfokussierlinse zugeschaltet sein. Dies ist insbesondere dann sinnvoll, wenn Probenbereiche zu bearbeiten sind, die nicht durch das selbe Mikroskopobjektiv bearbeitet werden können, wobei zur Bearbeitung aber nicht ein weiterer Mikroskopaufbau notwendig ist.
Schließlich kann es auch sinnvoll oder notwendig sein, wenn die genannte Laserfokussierlinse ein weiteres Mikroskopobjektiv eines weiteren Mikroskops darstellt. In diesem Fall umfasst das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem somit mehrere Mikroskope zur parallelen Bearbeitung von Probenbereichen, wie es insbesondere für das oben genannte Parallel Section Cutting von Vorteil sein kann.
Selbstverständlich sind auch die oben genannten drei Ausführungsformen wiederum beliebig miteinander kombinierbar, ohne dass es hierzu näherer Erläuterungen bedürfte.
Für das bereits erwähnte Parallel Section Cutting (dritte erfindungsgemäße Möglichkeit) ist die Laserablenkeinrichtung des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems derart eingerichtet, dass sie den ihr zugeordneten Laserstrahl auf den Probenbereich einer ersten biologischen Probe führt, wobei mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung vorgesehen ist, die derart eingerichtet ist, dass sie den ihr jeweils zugeordneten weiteren Laserstrahl auf jeweils einen anderen Probenbereich einer anderen Probe führt. Hierdurch ist das parallele Betreiben mehrerer Laserstrahlen zum parallelen Schneiden oder Manipulieren von Proben möglich. Beispielsweise sind hierzu mehrere (mindestens zwei) Laserachsen parallel mit gleicher Optik aufgebaut und auf Probenbereiche beispielsweise benachbarter Serienschnitte eines Präparats gerichtet. Beispielsweise kann einer der Serienschnitte gefärbt sein, damit der interessierende Probenbereich (in bekannter Weise) identifiziert werden kann. Die weiteren eingelegten Serienschnitte können ungefärbt sein. Mit Hilfe des gefärbten Schnittes kann ein oder mehrere Zielareale (Probenbereiche) identifiziert und markiert werden. Beispielsweise können geeignete Schnittlinien um die interessierenden Probenbereiche gelegt werden, die als Dissektate gewonnen werden sollen. Die Markierungen bzw. Schnittlinien werden dann entsprechend auf die weiteren Serienschnitte übertragen, so dass korrespondierende Probenbereiche auf unterschiedlichen Serienschnitten parallel manipuliert oder dissektiert und gesammelt werden können. Das Übertragen einer Markierung oder Schnittlinie erfolgt (in bekannter Weise) über Bildverarbeitung.
Das genannte Parallel Section Cutting, das neben der Dissektion auch die Manipulation von Probenbereichen umfassen soll, kann dadurch erfolgen, dass jeder der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung jeweils eine Laserfokussierlinse zum Führen des jeweiligen weiteren Laserstrahls auf den jeweiligen Probenbereich zugeordnet ist. In diesem Fall könnte für die weiteren Laserstrahlen auf jeweils ein weiteres Mikroskop mit Mikroskopobjektiv verzichtet werden. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn beispielsweise die Serienschnitte perfekt kalibriert sind, so dass eine erzeugte Schnittlinie in der Referenzprobe unmittelbar auf die parallelen Serienschnitte übertragbar ist. Wenn hingegen weitere Kalibrierungsschritte notwendig sind, ist es vorteilhaft, wenn die genannten Laserfokussierlinsen weitere Mikroskopobjektive entsprechender Mikroskope darstellen.
Für die Eingangs genannte erste erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Schneidens oder Manipulierens eines Probenbereichs auf einer Probe mit mindestens zwei Laserstrahlen ist die Laserablenkeinrichtung des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems derart eingerichtet, dass der Laserstrahl auf den Probenbereich der biologischen Probe geführt wird, und die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung ist derart eingerichtet, dass sie den mindestens einen weiteren Laserstrahl auf den selben Probenbereich dieser Probe führt. Der genannte Probenbereich kann somit durch mehrere Laserstrahlen manipuliert oder geschnitten werden. Das Bearbeiten erfolgt insbesondere auf demselben Sichtfeld, wie es durch das Mikroskopobjektiv gegeben ist. Aufgrund der vorhandenen mehreren Laserablenkeinrichtungen können die Laserstrahlen bzw. Laserfoki gleichzeitig und unabhängig voneinander derart gesteuert werden, dass mehrere Markierungen bzw. Schnittlinien gleichzeitig bearbeitet werden. Hierbei ist es auch denkbar, zumindest zum Teil außerhalb des Sichtfeldes zu arbeiten. Je nach Anzahl der Laserstrahlen können entsprechend viele Markierungen oder Schnittlinien manipuliert bzw. geschnitten werden. Es ist auch möglich, eine Schnittlinie mit zwei oder mehr Laserfoki zu schneiden.
Diese Ausführungsform führt zu einer enormen Beschleunigung bisheriger Lasermikrodissektionsverfahren.
Schließlich können gemäß der eingangs genannten zweiten erfindungsgemäßen Möglichkeit auch mehrere Probenbereiche auf einer Probe parallel bearbeitet werden. Hierzu weist das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem die Laserablenkeinrichtung auf, die derart eingerichtet ist, dass der Laserstrahl auf den Probenbereich der biologischen Probe geführt wird, sowie die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung, die derart eingerichtet ist, dass sie den mindestens einen weiteren Laserstrahl auf den mindestens einen anderen Probenbereich derselben biologischen Probe führt. Bezügliche Ausgestaltungen und Vorteile dieser Ausführungsform sei auf die gerade eben besprochene vorherige Ausführungsform verwiesen.
Bei den letztgenannten beiden Ausführungsformen (eingangs genannte erste und zweite erfindungsgemäße Möglichkeit) ist es möglich und vorteilhaft, die Laserstrahlen über das Mikroskopobjektiv des Mikroskops zu führen und mittels der jeweiligen Laserablenkeinrichtungen in den jeweiligen Probenbereichen zu verschieben. Selbstverständlich kann es auch wiederum zweckmäßig sein, neben dem vorhandenen Mikroskopobjektiv eine oder mehrere weitere Laserfokussierlinsen einzusetzen, wie bereits oben im Zusammenhang mit dem Parallel Section Cutting erläutert. Auch Mischformen sind denkbar. Insofern sei auf die obigen Erläuterungen verwiesen.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verwendungen entsprechend eingerichteter Lasermikrodissektionssysteme zum parallelen Schneiden oder Manipulieren eines Probenbereichs bzw. mehrerer Probenbereiche gemäß der oben geschilderten ersten, zweiten oder dritten erfindungsgemäßen Möglichkeit sowie entsprechende Lasermikrodissektionsverfahren. Zur Vermeidung von Wiederholungen seien die entsprechenden Verwendungen und Lasermikrodissektionsverfahren im Folgenden gemeinsam dargestellt. Nähere Details ergeben sich aus den Ausführungsbeispielen. Der Einfachheit halber soll nachfolgend Bezug auf die erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionsverfahren genommen werden, wobei die Ausführungen völlig analog auf die erfindungsgemäßen Verwendungen zu lesen sind.
Beim erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionsverfahren wird zunächst mindestens ein weiterer Laserstrahl bereitgestellt. In bekannter Weise wird ein Probenbereich einer biologischen Probe mittels eines (ersten) Laserstrahls bearbeitet. Durch parallelen Betrieb des mindestens einen weiteren Laserstrahls kann mindestens ein weiterer Probenbereich jeweils einer oder mehrerer anderer Proben parallel und insbesondere gleichzeitig bearbeitet werden. Unter "Bearbeiten" sei, wie bereits erwähnt, das Schneiden eines Probenbereichs mittels eines Laserstrahls oder das Manipulieren eines Probenbereichs mittels eines Laserstrahls verstanden.
Die (dritte) erfindungsgemäße Möglichkeit des Parallel Section Cutting wurde bereits oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystem behandelt. Bei dem vorliegenden entsprechenden Verfahren kann insbesondere ein Probenbereich einer Referenzprobe als Referenzprobenbereich ausgewählt und weitere Probenbereiche jeweils verschiedener Proben mittels jeweils zugeordneter Laserstrahlen bearbeitet werden. Diese Art der parallelen Manipulation oder des parallelen Schneidens von Probenbereichen ist insbesondere sinnvoll, wenn der Referenzprobenbereich und die weiteren Probenbereiche Bestandteile von Proben eines Serienschnitts desselben Präparats sind. Das Auswählen eines Referenzprobenbereichs erfolgt in an sich bekannter Weise beispielsweise durch Färbung oder andere Kontrastiermethoden. Die Koordinaten des Referenzprobenbereichs können auf entsprechende Probenbereiche der anderen Proben übertragen werden, wobei insbesondere bei einem Serienschnitt davon auszugehen ist, dass sich die Eigenschaften des Referenzprobenbereichs und der auf diese Weise bestimmten weiteren Probenbereiche nicht oder nicht wesentlich unterscheiden. Der Referenzprobenbereich wird folglich mittels eines Mikroskops bzw. mittels des Mikroskops des Lasermikrodissektionssystems mikroskopisch visualisiert und markiert und anschließend wird die Markierung auf die weiteren Probenbereiche übertragen. Das Markieren und das Übertragen der Markierung erfolgt in an sich bekannter Weise mittels Bildverarbeitung.
Das genannte Verfahren des Parallel Section Cutting ist insbesondere für das parallele Schneiden von einander entsprechenden Probenbereichen vorteilhaft, da das Schneiden in erheblich höherer Geschwindigkeit erfolgen kann als beim bisher bekannten Serial Section Cutting.
Ein Lasermikrodissektionsverfahren gemäß bereits erwähnter erster erfindungsgemäßer Möglichkeit des parallelen Schneidens oder Manipulierens betrifft die parallele Bearbeitung eines einzigen Probenbereichs mittels mehrerer Laserstrahlen. Wiederum kann das Bearbeiten mittels des Laserstrahls das Schneiden des Probenbereichs entlang einer vorgegebenen Schnittlinie umfassen. Verfahren zum Bestimmen geeigneter Schnittlinien sind aus dem Stand der Technik zahlreich bekannt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht nicht nur das parallele Schneiden mittels mehrerer Laserstrahlen entlang einer solchen Schnittlinie, sondern auch insbesondere das Schneiden von dicken Proben, wobei hierfür insbesondere zumindest ein Laserstrahl auf die Oberseite des Probenbereichs und zumindest ein anderer Laserstrahl auf die Unterseite des Probenbereichs geführt bzw. gelenkt wird. Die Laserablenkeinrichtungen der entsprechenden Laserstrahlen sind zu diesem Zweck entsprechend eingerichtet. Dazu können entsprechende Laserfokussierlinsen ober- und unterhalb des zu schneidenden Probenbereichs angeordnet sein. Alternativ können alle Laserfokussierlinsen auf einer Seite des Probenbereichs angeordnet sein, wobei mittels Umlenkeinrichtungen zumindest ein Laserstrahl auf die andere Seite des Probenbereichs gelenkt wird.
Schließlich ermöglicht das Lasermikrodissektionsverfahren gemäß oben erwähnter zweiter erfindungsgemäßer Möglichkeit des parallelen Schneidens oder Manipulierens das parallele Bearbeiten von mehreren Probenbereichen einer einzigen Probe mittels mehrerer parallel betriebener Laserstrahlen.
Figurenbeschreibung
1 zeigt ein Lasermikrodissektionssystem, das vorzugsweise den Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung darstellt, in schematischer Darstellung.
2 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit zum parallelen Bearbeiten von Probenbereichen auf verschiedenen Proben.
3 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Bearbeitens eines Probenbereichs auf einer Probe.
4 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Bearbeitens eines oder mehrerer Probenbereiche auf einer Probe.
5 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Bearbeitens eines oder mehrerer Probenbereiche auf einer Probe.
6 zeigt schematisch eine Möglichkeit der Bereitstellung weiterer Laserstrahlen durch weitere Lasereinheiten.
7 zeigt schematisch die Bereitstellung weiterer Laserstrahlen mittels einer Strahlteileranordnung, und
8 zeigt schematisch eine Kombinationsmöglichkeit aus den Beispielen der 5 und 6.
In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden nicht wiederholt erläutert.
In 1 ist ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Ein Koordinatensystem, anhand dessen die nachfolgend erwähnten Achsen bzw. Richtungen x, y und z veranschaulicht sind, ist in der 1 mit 200 bezeichnet.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem Mikroskopfuß 11 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Diese kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden. Zur Durchlichtbeleuchtung und zur Einstellung geeigneter Kontrast- bzw. Beobachtungsverfahren kann eine Kondensoreinheit 90 vorgesehen sein.
Das Mikroskop 10 kann als Konfokal-, insbesondere als Spinning-Disk-Mikroskop ausgebildet sein und verfügt in diesem Fall über entsprechende weitere oder alternative Mittel (in 1 nicht dargestellt).
Am Mikroskopfuß 11 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touchscreen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrachtungs- und/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann.
Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Eine Probe 51, beispielsweise eine in einer entsprechenden Aufnahmeeinrichtung bzw. Halterung 52 angebrachte Gewebeprobe, kann hierdurch in eine Objektebene eines Objektivs 41 gebracht werden. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein.
Von der Probe 51 ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang eines Beobachtungsstrahlengangs a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten Auskoppeleinrichtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des Beobachtungslichts, beispielsweise um 60°, ausgekoppelt und mittels eines Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des Beobachtungslichts kann in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 eingekoppelt und bildgebend erfasst werden. Der Bilderfassungseinheit 63 kann, vor Ort, in einer Steuereinheit 82 oder einem Steuerrechner 81 (siehe unten), oder in anderer räumlicher Anordnung, ein Bildauswertungsmodul 64 zugeordnet sein.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist eine Lasereinheit 70 mit einer Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl 77 mit Laserstrahlachse b wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Umlenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 auf die Probe 51 in dem Probenbereich 50 fokussiert.
Bei dem Lasermikrodissektionssystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl 77 auf die Probe 51 in der Objektebene, und damit auch in dem Probenbereich 50 auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Verstelleinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y-Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der Verstelleinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann.
Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere motorisierte Funktionen des Lasermikrodissektionssystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81, der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen. Die Steuereinheit 82 oder der Steuerrechner 81 kann auch beispielsweise mittels des Bildauswertungsmoduls 64 erhaltene Daten auswerten. Beispielsweise kann hierdurch eine Abfolge von Gewebeschichten oder anderer Strukturen der Probe 51 erkannt werden.
Für die Lasermikrodissektion kann insbesondere eine Laserablenkeinrichtung 73 vorgesehen sein. Mittels der Laserablenkeinrichtung 73 kann der Laserstrahl 77 gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel 71 und dem zweiten Umlenkspiegel 72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel 72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teiler ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf die Probe 51 in der Objektebene fokussiert. Eine Ablenkung mittels einer Laserablenkeinrichtung 73 ist im Detail in der EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass hier unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls 77 bzw. zur Positionierung der Probe 51 in der Objektebene gegenüber dem Laserstrahl 77 zum Einsatz kommen können. Die Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt.
Im dargestellten Beispiel weist die Laserablenkeinrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilplatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden. Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Aktoren 734 gedreht werden, die mit entsprechenden Ansteuersignalen beaufschlagt werden können und entsprechend die Zahnräder 733 antreiben. Die Rotationseinrichtungen können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur an dem rechten Aktor 734 gezeigt). Eine durch die Positonsgeber 735 erfasste Position kann an die Steuereinheit 82 übermittelt werden.
2 zeigt eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Bearbeitens von Probenbereichen auf verschiedenen Proben. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit sei im Folgenden von einem Schneiden der Probenbereiche mittels eines fokussierten Laserstrahls zur Erzeugung von Dissektaten ausgegangen. Das in 2 beschriebene Ausführungsbeispiel stellt eine Ausführungsform des in der Beschreibung diskutierten Parallel Section Cutting dar.
2 zeigt ein Objektiv 41, das einen Laserstrahl 77 auf eine Probe 51 fokussiert. Der Laserstrahl 77 wird mittels einer auf der optischen Achse c angeordneten Laserablenkeinrichtung 73 in x-y-Richtung innerhalb eines Probenbereichs 510 der Probe 51 verschoben. Zu näheren Erläuterungen dieses Systems sei vollumfänglich auf die Erläuterungen zur 1 verwiesen. Der Einfachheit halber ist in 2 das Lasermikrodissektionssystem 100 aus 1 nicht in Gänze dargestellt. Es sind lediglich die zum Verständnis der Erfindung notwendigen Komponenten dargestellt und im Folgenden beschrieben.
Die Probe 51 ist auf einer geeigneten Halterung 52 aufgebracht, die eine Laserdissektion erlaubt. Der Probenbereich, der mittels des fokussierten Laserstrahls 77 ausgeschnitten wird, ist mit 510 bezeichnet. Der Probenbereich 510 bildet einen Teilbereich der Probe 51, wobei der Probenbereich in an sich bekannter Weise als interessierender Probenbereich identifiziert wird. Dies geschieht üblicherweise anhand einer mikroskopischen Visualisierung der Probe 51 und des Probenbereichs 510, wobei durch eine Einfärbung der Probe 51 und mittels geeigneter (Fluoreszenz-)Untersuchung der Probe 51 der interessierende Probenbereich 510 ermittelt werden kann. In ebenfalls an sich bekannter Weise wird um diesen Probenbereich 510 eine beispielsweise individuelle Schnittlinie gelegt. Dieser Vorgang kann manuell oder bevorzugt mittels Bildverarbeitung erfolgen. Das Ergebnis kann beispielsweise am externen Steuerrechner 81 (vgl. 1) überprüft werden. Ergeht der Befehl zum Schneiden der Probe 51, steuert die Steuereinheit 82 die Laserablenkeinrichtung 73 derart an, dass der Laserstrahlfokus auf der Probe 51 die Schnittlinie beschreibt und auf diese Weise den Probenbereich 510 von der übrigen Probe trennt.
Bei dem dargestellten Parallel Section Cutting sind weitere Proben 53, 54 auf entsprechenden Halterungen aufgenommen, um parallel bearbeitet werden zu können. Hierzu sind weitere Laserstrahlen 77' und 77'' vorgesehen. Jedem dieser weiteren Laserstrahlen ist jeweils eine weitere Laserablenkeinrichtung 73', 73'' zugeordnet. Die optischen Achsen sind mit c' bzw. c'' bezeichnet. Bei den Proben 53 und 54 handelt es sich zweckmäßigerweise um insbesondere benachbarte Schnitte eines Serienschnitts aus einem Präparat. Die Proben 53 und 54 müssen nicht zwingend gefärbt sein. Es ist im Gegenteil günstig, mit ungefärbten Proben zu arbeiten, da Färbungen die Eigenschaften oder die biologischen Prozesse der Probe beeinflussen können.
Die um den Probenbereich 510 der Probe 51 festgelegte Schnittlinie wird auf die ungefärbten Probenbereiche 530 und 540 übertragen, so dass die Probenbereiche 530 und 540 dem Referenzprobenbereich 510 entsprechen. Unter "Übertragen der Schnittlinie" soll verstanden werden, dass Steuerbefehle an entsprechende Steuereinheiten der Laserablenkeinrichtungen 73', 73'' übertragen werden, um den Laserstrahl 77' bzw. 77'' entsprechend der festgelegten Schnittlinie auf der Probe 53 bzw. 54 zu führen.
Auf diese Weise ist es folglich möglich, entsprechend der einmal festgelegten Schnittlinie um den Referenzprobenbereich 510 parallel und insbesondere gleichzeitig mehrere entsprechende Probenbereiche 530, 540 aus weiteren Proben 53, 54 herauszuschneiden. Hierbei besteht die Option, auch den Laserstrahl 77 entsprechend abzulenken, so dass sein Fokus entlang der Schnittlinie verschoben wird, um den Referenzprobenbereich 510 zu dissektieren. Dies muss aber nicht zwangsläufig der Fall sein, wenn etwa der gefärbte Referenzprobenbereich als Dissektat für die weitere Analyse weniger brauchbar oder ganz unbrauchbar sein sollte. Aus diesem Grund ist der Laserstrahl 77 nur gestrichelt gezeichnet.
Das Ausführungsbeispiel gemäß 2 ist selbstverständlich nicht nur auf die dort dargestellte Anzahl von Proben beschränkt. Wie außerdem bereits erwähnt, können auch andere Markierungen als Schnittlinien für das Parallel Section Cutting eingesetzt werden. Beispielsweise können Zielareale als Probenbereiche identifiziert, markiert und anschließend manipuliert werden. Auf die Möglichkeiten zur Erzeugung von weiteren Laserstrahlen 77', 77'' wird weiter unten näher eingegangen werden. In 2 sind lediglich die entsprechenden Laserablenkeinrichtungen 73', 73'' dargestellt. Die Laserfokussierlinsen 41', 41'' sorgen in 2 für die Fokussierung der entsprechend zugeordneten Laserstrahlen 77', 77'' auf die jeweilige Probe 53, 54. Wenn diese Proben 53, 54 exakt kalibriert sind, kann es bei der Verwendung von Laserfokussierlinsen 41', 41'' bleiben. Sind jedoch Kalibrierungen notwendig, um sicherzustellen, dass einander korrespondierende Probenbereiche gleiche Koordinaten besitzen, ist es vorteilhaft, wenn die dargestellten Laserfokussierlinsen 41', 41'' Mikroskopobjektive weiterer Mikroskope (nicht dargestellt) darstellen. Solch weitere "Mikroskope" werden die wesentlichen Komponenten des in 1 dargestellten Systems beinhalten müssen, soweit durch diese Komponenten eine Kalibrierung und eine anschließende Dissektion ermöglicht wird, nämlich im Wesentlichen Lasereinheit, Laserablenkeinrichtung, Objektiv und Aufnahmeeinrichtung für die Probe.
3 zeigt schematisch eine Möglichkeit des parallelen Bearbeitens eines Probenbereichs auf einer Probe. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit soll hier wiederum von einem Schneiden der Probe ausgegangen werden. Wie anhand von 2 oben bereits erläutert, wird hierzu ein Laserstrahl 77 auf eine Probe 51 mittels eines Mikroskopobjektivs 41 fokussiert. Die Position des Fokus des Laserstrahls 77 auf der Probe 51 wird mit Hilfe einer Laserablenkeinrichtung 73 gesteuert.
Mittels eines weiteren Laserstrahls 77' mit zugeordneter weiterer Laserablenkeinrichtung 73' kann derselbe Probenbereich 510 der Probe 51 bearbeitet werden. Insbesondere können beide Laserstrahlen 77 und 77' parallel und insbesondere gleichzeitig den Probenbereich 510 entlang einer Schnittlinie schneiden. Auf diese Weise kann die Geschwindigkeit des Dissektierens erhöht werden. Die parallelen Laser 77, 77' können also entlang derselben Schnittlinie an unterschiedlichen Koordinaten gleichzeitig schneiden, aber prinzipiell auch an gleichen Koordinaten, etwa bei dicken Proben. Hierbei können die Foki der Laser 77, 77' in unterschiedlichen Probentiefen liegen, um dicke Proben schneller und effektiver zu schneiden.
Mittels entsprechender Umlenkspiegel 72, 72' können die Achsen b, b' der Laserstrahlen 77, 77' in die optische Achse c des Objektivs 41 eingekoppelt werden.
4 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit zum parallelen Bearbeiten eines oder mehrerer Probenbereiche auf einer Probe. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen wiederum gleiche Elemente wie in den vorangegangen Figuren.
Die Ausführungsform gemäß 4 kann als weitere Ausgestaltung des parallelen Bearbeitens eines Probenbereichs 510 auf einer Probe 51 (vgl. 3) verstanden werden. Im Gegensatz zu der Ausführungsform gemäß 3 sind in 4 aber zwei Fokussierlinsen 41, 41' bzw. ein Mikroskopobjektiv 41 und eine Fokussierlinse 41' bzw. zwei Mikroskopobjektive 41, 41' vorgesehen. Somit werden die beiden Laserstrahlen 77, 77' nicht durch eine einzige Fokussierlinse bzw. ein einziges Mikroskopobjektiv 41 geführt, sondern durch jeweils ein zugeordnetes Mikroskopobjektiv oder eine zugeordnete Fokussierlinse 41 bzw. 41'. Dies ermöglicht beispielsweise nicht nur innerhalb des Sichtfelds eines Mikroskopobjektivs, sondern auch außerhalb dieses Sichtfelds und schließlich innerhalb der Sichtfelder zweier Mikroskopobjektive zu arbeiten, je nachdem ob 41 und 41' eine Fokussierlinse und ein Mikroskopobjektiv oder zwei Mikroskopobjektive bezeichnet.
In einer anderen Ausführungsform des Beispiels gemäß 4 treffen die Laserstrahlen 77, 77' auf zwei voneinander unterschiedliche Probenbereiche (nicht gesondert bezeichnet). Auf diese Weise ist es möglich, verschiedene Probenbereiche einer Probe 51 parallel und insbesondere gleichzeitig zu schneiden oder zu manipulieren. Somit können etwa mehrere markierte interessierende Probenbereiche gleichzeitig aus einer Probe 51 geschnitten werden, was den Vorgang der Lasermikrodissektion enorm beschleunigt. Bzgl. weiterer Einzelheiten zu diesen Vorgängen sei auf die vorangehenden Ausführungsbeispiele verwiesen.
5 zeigt eine weitere Ausgestaltung der Anordnung gemäß 4. Hierbei ist ein zusätzlicher dritter Laserstrahl 77'' vorgesehen, der in der Darstellung gemäß 5 auf die Unterseite der Probe 51 gerichtet ist, während die beiden Laserstrahlen 77, 77' auf die Oberseite dieser Probe 51 gerichtet sind. Der auf die Unterseite der Probe 51 gerichtete Laserstrahl 77'' besitzt eine ihm zugeordnete Laserablenkeinrichtung 73''. Die in 5 dargestellte Vorrichtung eignet sich wiederum zum Schneiden (oder sonstigen Bearbeiten) eines einzigen Probenbereichs 510 auf der Probe 51 oder aber mehrerer Probenbereiche (nicht gesondert bezeichnet) auf der Probe 51. Hierzu sei auf die Erläuterungen im Zusammenhang mit 4 verwiesen.
Der auf die Unterseite gerichtete Laserstrahl 77'' gemäß 5 kann insbesondere zum Schneiden dicker Probenbereiche eingesetzt werden. Beispielsweise kann der Laserstrahl 77' von oben auf die Schnittlinie geführt werden, während der Laserstrahl 77'' von unten auf dieselbe Schnittlinie geführt wird, so dass die Schnittlinie von zwei Seiten geschnitten wird. Auf diese Weise kann ein dicker Probenbereich schonender geschnitten werden, als wenn mit einem einzigen Laserstrahl entsprechend hoher Energie nur von einer Seite aus geschnitten würde.
Bzgl. der 4 und 5 sei weiterhin betont, dass die dort dargestellte Schrägstellung der Laserachsen nicht unbedingt nur durch die dargestellte Schrägstellung der optischen Achsen der Mikroskopobjektive bzw. Laserfokussierlinsen erreicht werden kann. Ein entsprechender Auftreffwinkel des Laserstrahls auf die Probe kann, wie anhand der 1 und 3 erläutert, auch und vorzugsweise mit Objektiven bzw. Laserfokussierlinsen erzielt werden, deren optische Achsen senkrecht auf die Probe stehen, wobei die Schrägstellungen der Laserachsen dann allein durch die zugeordneten Laserablenkeinrichtungen bewirkt werden. Die Schrägstellungen der Achsen in den 4 und 5 dienen somit eher der leichteren Verständlichkeit.
6 zeigt schematisch eine Möglichkeit der Bereitstellung weiterer Laserstrahlen durch weitere Lasereinheiten. Hierbei sind zwei Lasereinheiten 70 und 70' in einem Lasermikrodissektionssystem 100 vorhanden (vgl. 1). Die Lasereinheiten 70, 70' erzeugen entsprechende Laserstrahlen 77, 77', die durch ihnen zugeordnete Laserablenkeinheiten 73, 73' auf einem Probenbereich geführt und dort verschoben werden.
7 zeigt schematisch die Bereitstellung weiterer Laserstrahlen mittels einer Strahlteileranordnung. Die Lasereinheit 70 erzeugt einen Laserstrahl, der eine Strahlteileranordnung 78 durchläuft. Hierbei wird der Laserstrahl in zwei Strahlen geteilt, wobei einer der beiden Strahlen mit 77 bezeichnet ist. Der andere der beiden geteilten Strahlen sei mit 77' bezeichnet. Auf diese Weise können zwei Laserstrahlen 77, 77' erzeugt werden, deren Intensität entsprechend geringer ist als die des ursprünglichen Laserstrahls 77. Beispielsweise kann der Laserstrahl 77' an einem Umlenkspiegel 74 reflektiert und einer ihm zugeordneten Laserablenkeinrichtung 73' zugeführt werden.
Während die Ausführungsform gemäß 6 insbesondere für Schneidprozesse sinnvoll ist, bei denen die volle Laserintensität benötigt wird, ist die Ausführungsform gemäß 7 für Prozesse wie Manipulationen vorteilhaft, für die ein Teil der ursprünglichen Laserleistung ausreichend ist.
Schließlich zeigt 8 eine Kombinationsmöglichkeit der Ausführungsformen von den 6 und 7. Hierbei wird der von der Lasereinheit 70 erzeugte Laserstrahl 77 einer Laserablenkeinrichtung 73 zugeführt. Ein weiterer Laserstrahl wird durch eine weitere Lasereinheit 70' erzeugt. Dieser weitere Laserstrahl wird in zwei Laserstrahlen aufgespalten, wobei wiederum einer der beiden aufgespaltenen Laserstrahlen mit 77', der andere hingegen mit 77'' bezeichnet werden soll. Die Aufspaltung erfolgt wiederum in einer Strahlteileranordnung 78'. Die auf diese Weise erzeugten Teilstrahlen 77' und 77'' werden dann jeweils entsprechenden Laserablenkeinrichtungen 73' und 73'' zugeführt, wobei für den Laserstrahl 77'' wiederum ein Umlenkspiegel 74 zum Einsatz kommen kann. Eine Anordnung, wie sie in 8 gezeigt ist, kann beispielsweise zum parallelen Schneiden von dicken Proben bzw. Probenbereichen (mit Laserstrahl 77) und dünnen Proben bzw. Probenbereichen (mit den Laserstrahlen 77' und 77'') verwendet werden. Dem Fachmann erschließen sich aus den 6 bis 8 weitere Kombinationsmöglichkeiten.
Bezugszeichenliste

10: Mikroskop
11: Mikroskopfuß
12: Beleuchtungseinrichtung
13: Benutzereingabe-/informationseinheit
14: Triebknopf
15: Schutzhaube
30: Mikroskoptisch
31: manuelle Verstelleinrichtung
40: Objektivrevolver
41: Objektiv
41', 41'': Laserfokussierlinse, Objektiv
42: Objektiv
51: Probe
52: Aufnahmeeinrichtung
53: Probe
54: Probe
510: Probenbereich, Referenzprobenbereich
530: Probenbereich
540: Probenbereich
60: Tubuseinheit
61: Auskoppeleinrichtungen
62: Okularpaar
63: Bilderfassungseinheit
64: Bildauswertungsmodul
70, 70': Lasereinheit
71: Umlenkspiegel
72, 72': Umlenkspiegel
73, 73', 73'': Laserablenkeinrichtung
74: Umlenkspiegel
75: Laserlichtquelle
76: Auflichteinheit
77, 77', 77'': Laserstrahl
78, 78': Strahlteileranordnung
731: Keilplatten
732: Kugellager
733: Zahnrad
734: Aktor
735: Positionsgeber
81: Steuerrechner
82: Steuereinheit
83: Verbindungen
90: Kondensoreinheit
100: Lasermikrodissektionssystem
a: Beobachtungsstrahlengang
b: Laserstrahlachse
c: optische Achse

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1276586 B1 [0005, 0022, 0061, 0070]
US 2012/0045790 A1 [0010, 0011]

Claims

Lasermikrodissektionssystem (100) mit einem Mikroskop (10), das eine Aufnahmeeinrichtung (52) zur Aufnahme einer biologischen Probe (51) und eine Auflichteinrichtung (76) mit einer Laserablenkeinrichtung (73) aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit (70) bereitgestellten Laserstrahl (77) durch ein Mikroskopobjektiv (41) des Mikroskops (10) auf einen Probenbereich (510) der biologischen Probe (51) führt und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls (77) auf dem Probenbereich (510) verschiebt, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73'') zum Führen mindestens eines weiteren Laserstrahls (77', 77'') auf den Probenbereich (510) oder auf mindestens einen anderen Probenbereich (530, 540) und zum Verschieben des Auftreffpunkts des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77'') auf dem jeweiligen Probenbereich aufweist.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73') eine weitere Lasereinheit (70') zugeordnet ist, die einen des mindestens einen Laserstrahls (77') bereitstellt.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Lasereinheit (70) eine Strahlteileranordnung (78) nachgeordnet ist, die aus dem von der Lasereinheit (70) bereitgestellten Laserstrahl (77) den mindestens einen weiteren Laserstrahl (77') durch Strahlteilung erzeugt.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der weiteren Lasereinheit (70') eine Strahlteileranordnung (78') nachgeordnet ist, die aus dem von der weiteren Lasereinheit (70') bereitgestellten weiteren Laserstrahl (77') mindestens einen weiteren Laserstrahl (77'') durch Strahlteilung erzeugt.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserablenkeinrichtung (73) und eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73') derart eingerichtet sind, dass die von diesen Laserablenkeinrichtungen abgelenkten Laserstrahlen (77, 77') durch das Mikroskopobjektiv (41) des Mikroskops (10) geführt werden.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73') derart eingerichtet ist, dass sie den von ihr abgelenkten Laserstrahl (77') durch eine Laserfokussierlinse (41') auf den Probenbereich (510) oder auf einen des mindestens einen anderen Probenbereichs (530, 540) führt.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserfokussierlinse ein weiteres Mikroskopobjektiv (41') eines weiteren Mikroskops darstellt.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der andere Probenbereich ein anderer Probenbereich der selben Probe (51) oder ein weiterer Probenbereich (530, 540) einer anderen Probe (53, 54) darstellt.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) die Laserablenkeinrichtung (73) zum Führen des Laserstrahls (77) auf den Probenbereich (510) einer ersten biologischen Probe (51) aufweist und die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73'') zum Führen des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77'') auf einen des mindestens einen anderen Probenbereichs (530, 540) einer anderen Probe (53, 54) oder – soweit auf Anspruch 8 zurückbezogen – der anderen Probe (53, 53) aufweist.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) die Laserablenkeinrichtung (73) zum Führen des Laserstrahls (77) auf den Probenbereich (510) der biologischen Probe (51) und die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73'') zum Führen des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77'') auf denselben Probenbereich (510) dieser biologischen Probe (51) aufweist.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) die Laserablenkeinrichtung (73) zum Führen des Laserstrahls (77) auf den Probenbereich (510) der biologischen Probe (51) aufweist und die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73'') zum Führen des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77'') auf den mindestens einen anderen Probenbereich der selben biologischen Probe (51) aufweist.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass jeder der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73', 73'') jeweils eine Laserfokussierlinse (41', 41'') zum Führen des jeweiligen weiteren Laserstrahls (77', 77'') auf den jeweiligen Probenbereich zugeordnet ist.
Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Laserfokussierlinsen ein weiteres Mikroskopobjektiv (41', 41'') eines weiteren Mikroskops darstellt.
Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems (100) nach Anspruch 9 zum parallelen Bearbeiten von Probenbereichen (510, 530, 540) jeweils verschiedener Proben (51, 53, 54) mittels jeweils zugeordneter Laserstrahlen (77, 77', 77'').
Verwendung nach Anspruch 14, wobei ein Probenbereich (510)einer Referenzprobe (51)als Referenzprobenbereich ausgewählt wird und weitere Probenbereiche (530, 540) jeweils verschiedener Proben (53, 54) mittels jeweils zugeordneter Laserstrahlen (77', 77'') bearbeitet werden.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Referenzprobenbereich (510) und die weiteren Probenbereiche (530, 540) Bestandteile von Proben (51, 53, 54) eines Serienschnitts desselben Präparats sind.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Referenzprobenbereich (540) mittels des Mikroskops (10) des Lasermikrodissektionssystems (100) mikroskopisch visualisiert und markiert wird und die Markierung auf die weiteren Probenbereiche (530, 540) übertragen wird.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Markierung eine Schnittlinie darstellt, die den Referenzprobenbereich (510) umgibt.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei nach Übertragung der Schnittlinie die weiteren Probenbereiche (530, 540) mittels der zugeordneten parallel betriebenen Laserstrahlen (77', 77'') aus den jeweiligen Proben (53, 54) geschnitten werden.
Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems nach Anspruch 10 zum parallelen Bearbeiten eines Probenbereichs (510) der Probe (51) mittels mehrerer Laserstrahlen.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Bearbeiten das Schneiden des Probenbereichs (510) entlang einer Schnittlinie umfasst.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei zumindest ein Laserstrahl (77') auf die Oberseite des Probenbereichs (510) und zumindest ein anderer Laserstrahl (77'') auf die Unterseite des Probenbereichs (510) geführt wird.
Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems nach Anspruch 11 zum parallelen Bearbeiten von mehreren Probenbereichen einer Probe (51) mittels den Probenbereichen jeweils zugeordneter Laserstrahlen (77', 77'').
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Bearbeiten das Schneiden der Probenbereiche entlang jeweiliger Schnittlinien umfasst.
Lasermikrodissektionsverfahren zum Bearbeiten eines Probenbereichs (510) einer biologischen Probe (51) mittels eines Laserstrahls (77), dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein weiterer Laserstrahl (77', 77'') bereitgestellt wird und mindestens ein weiterer Probenbereich (530, 540) jeweils verschiedener Proben (53, 54) sowie optional der Probenbereich (510) der Probe (51) mittels des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77'') bzw. optional des Laserstrahls (77) parallel bearbeitet werden.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei ein Probenbereich (510) einer Referenzprobe (51) als Referenzprobenbereich ausgewählt wird und weitere Probenbereiche (530, 540) jeweils verschiedener Proben (53, 54) mittels jeweils zugeordneter Laserstrahlen (77', 77'') bearbeitet werden.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Referenzprobenbereich (510) und die weiteren Probenbereiche (530, 540) Bestandteile von Proben (51, 53, 54) eines Serienschnitts des selben Präparats sind.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei der Referenzprobenbereich (510) mittels eines Mikroskops (10) mikroskopisch visualisiert und markiert wird und die Markierung auf die weiteren Probenbereiche (530, 540) übertragen wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Markierung eine Schnittlinie darstellt, die den Referenzprobenbereich (510) umgibt.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei nach Übertragung der Schnittlinie die weiteren Probenbereiche (530, 540) mittels der zugeordneten parallel betriebenen Laserstrahlen (77', 77'') aus den jeweiligen Proben (53, 54) geschnitten werden.
Lasermikrodissektionsverfahren zum Bearbeiten eines Probenbereichs (510) einer biologischen Probe (51) mittels eines Laserstrahls (77), dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein weiterer Laserstrahl (77') bereitgestellt wird und der Probenbereich (510) mittels des Laserstrahls (77) sowie des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77') parallel bearbeitet wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Bearbeiten das Schneiden des Probenbereichs (510) entlang einer Schnittlinie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei zumindest ein Laserstrahl (77') auf die Oberseite des Probenbereichs (510) und zumindest ein anderer Laserstrahl (77'') auf die Unterseite des Probenbereichs (510) geführt wird.
Lasermikrodissektionsverfahren zum Bearbeiten eines Probenbereichs (510) einer biologischen Probe (51) mittels eines Laserstrahls (77), dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein weiterer Laserstrahl (77') bereitgestellt wird und mindestens ein weiterer Probenbereich der Probe (51) mittels des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77') parallel bearbeitet wird.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Bearbeiten das Schneiden der Probenbereiche entlang jeweiliger Schnittlinien umfasst.