DE102014111892A1 - Prophylaxis and treatment of hantavirus infection - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Inhibitor zur Prophylaxe und Behandlung einer Infektion eines Lebewesens mit einem Hantavirus sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Inhibitor enthält.The present invention relates to an inhibitor for the prophylaxis and treatment of an infection of a living being with a hantavirus and a pharmaceutical composition containing the inhibitor.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Inhibitor zur Prophylaxe und Behandlung einer Infektion eines Lebewesens mit einem Hantavirus sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Inhibitor enthält.The present invention relates to an inhibitor for the prophylaxis and treatment of an infection of a living being with a hantavirus and a pharmaceutical composition containing the inhibitor.

Virusinfektionen stellen eine der größten Herausforderungen der modernen Medizin dar. Trotz intensiver Forschungen sind die derzeitigen Möglichkeiten von gezielten Therapien beschränkt. Viral infections represent one of the greatest challenges of modern medicine. Despite intensive research, the current possibilities of targeted therapies are limited.

In besonderem Fokus steht dabei u.a. das Influenzavirus, der Auslöser der echten Grippe. Im Stand der Technik werden verschiedene Influenzatherapien offenbart. So wird in der WO 2004/060360 die Verwendung von Acetylsalicylsäure und Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC) vorgeschlagen; vgl. auch Mazur et al. (2007), Acetylsalicylic acid (ASA) blocks influenza virus propagation via its NF-κB inhibiting activity, Cellular Microbiology 9(7), Seiten 1683–1694 . In der WO 2009/089822 wird die Verwendung von Lysin-Glycin-Acetylsalicylat zur Behandlung von Influenzainfektionen vorgeschlagen. Particular focus is placed on the influenza virus, the trigger of the true flu. Various influenza therapies are disclosed in the prior art. So will in the WO 2004/060360 proposed the use of acetylsalicylic acid and pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC); see. also Mazur et al. (2007), Acetylsalicylic acid (ASA) blocks influenza virus propagation via its NF-κB inhibiting activity, Cellular Microbiology 9 (7), pages 1683-1694 , In the WO 2009/089822 the use of lysine-glycine-acetylsalicylate for the treatment of influenza infections is proposed.

In letzter Zeit haben auch Infektionen mit Hantaviren an Bedeutung gewonnen. Hantaviren aus der Familie der Bunyaviridae umfassen u.a. die humanpathogenen Arten Hantaan-Virus, Puumala-Virus, Dobrava-Belgrad-Virus, Seoul-Virus, Korea-Fieber-Virus und Sin-Nombre-Virus. Diese behüllten Einzelstrang(-)-RNA-Viren [ss(-)RNA] verursachen je nach Virustyp verschiedene Erkrankungen. Dazu zählen schwere Lungenerkrankungen, akutes Nierenversagen oder hämorrhagische Fiebererkrankungen. Die Viren sind weltweit verbreitet und treten auch in Mitteleuropa auf. Sie werden durch den Kot oder Urin infizierter Nagetiere, der als Staub eingeatmet wird, auf den Menschen übertragen. Die infizierten Nagetiere selbst zeigen keine Krankheitssymptome. Die menschlichen Erkrankungen verlaufen unterschiedlich schwer. Während die in Mitteleuropa auftretenden Puumula- und Dobrava-Belgrad-Virusinfektionen in weniger als 1% der klinisch auffälligen Fälle tödlich verlaufen, beträgt die Letalität bei den in Ostasien auftretenden Infektionen mit dem Hantaan-Virus und dem auf dem Balkan zu findenden Dobrava-Belgrad-Virus bis 5% und bei den amerikanischen Hantaviren, wie dem Sin-Nombre-Virus und anderen, etwa 30 bis 40%.Recently, infections with hantavirus have gained in importance. Hantaviruses of the family Bunyaviridae include i.a. the human pathogenic species Hantaan virus, Puumala virus, Dobrava-Belgrade virus, Seoul virus, Korea fever virus and Sin-Nombre virus. These single-stranded (-) RNA viruses [ss (-) RNA] cause various diseases depending on the type of virus. These include severe lung disease, acute kidney failure or hemorrhagic fever. The viruses are distributed worldwide and also occur in Central Europe. They are transmitted to humans through the faeces or urine of infected rodents, which are inhaled as dust. The infected rodents themselves show no disease symptoms. The human diseases have different degrees of difficulty. While Puumula and Dobrava-Belgrade viral infections occur in less than 1% of clinically abnormal cases in Central Europe, lethality of Hantaan virus and Balkan Dobrava-Belgrade infections in East Asia Virus to 5% and in the American hantaviruses, such as the Sin-Nombre virus and others, about 30 to 40%.

Derzeit steht keine nachweislich wirksame antivirale Therapie gegen eine Infektion mit dem Hantavirus zur Verfügung. Ein Impfstoff befindet sich erst im Entwicklungsstadium.There is currently no proven effective antiviral therapy against hantavirus infection. A vaccine is only in the developmental stage.

Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Wirkstoff bereitzustellen, der für die Prophylaxe und/oder Behandlung einer Infektion eines Lebewesens mit einem Hantavirus geeignet ist.Against this background, it is an object of the present invention to provide an active ingredient which is suitable for the prophylaxis and / or treatment of an infection of a living being with a hantavirus.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Inhibitors des NF-κB-Signalübertragungsweges gelöst.This object is achieved by providing an inhibitor of the NF-κB signal transmission pathway.

Erfindungsgemäß wird unter einem Inhibitor ein Wirkstoff oder eine einen solchen Wirkstoff enthaltende Zusammensetzung verstanden, der spezifisch die Signalübertragung im NF-κB-Signalübertragungsweg bzw. eine Komponente hiervon in ihrer Aktivität vermindert bzw. hemmt, vorzugsweise blockiert. Der Wirkstoff kann erfindungsgemäß eine beliebige Ausgestaltung haben, bspw. in Form eines chemisch definierten Moleküls, eines Proteins, einer Nucleinsäure etc. vorliegen.According to the invention, an inhibitor is understood to mean an active ingredient or a composition containing such an active ingredient which specifically reduces or inhibits the signal transmission in the NF-κB signal transmission pathway or a component thereof, preferably blocks it. The active ingredient may according to the invention have any desired configuration, for example, in the form of a chemically defined molecule, a protein, a nucleic acid, etc.

Inhibitoren des NF-κB-Signalübertragungsweges sind im Stand der Technik umfassend beschrieben. Sie lassen sich ferner mittels eines einfachen Testsystems ohne weiteres identifizieren.Inhibitors of the NF-κB signal transduction pathway are fully described in the prior art. They can also easily be identified by means of a simple test system.

Bei dem NF-κB-Signalübertragungsweg handelt es sich um einen bedeutsamen Signalübertragungsweg in der Zelle. Zentraler Bestandteil dieses Übertragungsweges ist der heterodimäre NF-κB-Transkriptionsfaktor-Proteinkomplex. Der NF-κB-Transkriptionskomplex bestehet aus einer Gruppe von Homo- und Heterodimeren, die zur sogenannten Rel-Familie gehören. Die fünf bzw. sieben bei Säugetieren derzeit bekannten Untereinheiten von NF-κB sind: NF-κB1 (P50 bzw. P105), NF-κB2 (P52 bzw. P100), Rel A (P65), Rel B und C Rel. NF-κB kommt in praktisch allen Zelltypen und Geweben vor. Dimere dieser NF-κB-Untereinheiten binden an regulatorische Bereiche der DNA, die als κB Stellen bezeichnet werden. Dimere, die Rel A, Rel B oder Rel C enthalten, sind Transkriptionsaktivatoren, während Homodimeren von p50 und p52 eine Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlt. Sie fungieren als Repressoren. NF-κB ist von großer Bedeutung für die Regulation der Immunantwort, der Zellproliferation und des Zelltodes. Die Aktivierung von NF-κB gilt als kritisch für die Entstehung von Entzündungen. Schließlich erfüllt NF-κB wichtige Funktionen im Bereich der Entwicklung des Immunsystems und der lymphatischen Organe. The NF-κB signal transmission path is a significant signal transmission path in the cell. Central component of this transmission pathway is the heterodimeric NF-κB transcription factor-protein complex. The NF-κB transcription complex consists of a group of homo- and heterodimers belonging to the so-called Rel family. The five or seven subunits of NF-κB currently known in mammals are: NF-κB1 (P50 or P105), NF-κB2 (P52 and P100), Rel A (P65), Rel B and C Rel. NF- κB occurs in virtually all cell types and tissues. Dimers of these NF-κB subunits bind to regulatory regions of the DNA called κB sites. Dimers containing Rel A, Rel B or Rel C are transcriptional activators, while homodimers of p50 and p52 lack a transcriptional activation domain. They act as repressors. NF-κB is of great importance for the regulation of immune response, cell proliferation and cell death. The activation of NF-κB is considered critical for the development of inflammation. Finally, NF-κB fulfills important functions in the area of development of the immune system and the lymphatic organs.

Die Aktivierung von NF-κB erfolgt beispielsweise durch Wachstumsfaktoren, Cytokine, aber auch bakterielle und virale Antigene sowie chemisch-physikalische Noxen wie UV-Strahlung oder freie Radikale. Der meist an der Zellaußenseite einsetzende Stimulus wird über intrazellulär miteinander interagierende Proteine, die Knotenpunkte darstellen, im Sinne eines Signalweges bis zum NF-κB Transkriptionsfaktor weitergeleitet.The activation of NF-κB takes place for example by growth factors, cytokines, but also bacterial and viral antigens and chemical-physical Noxen such as UV radiation or free radicals. The stimulus usually beginning at the cell exterior is relayed to the NF-κB transcription factor in the sense of a signaling pathway via intracellularly interacting proteins that represent nodal points.

Der NF-κB-Signalübertragungsweg wird beispielsweise beschrieben in Hayden und Ghosh (2008), Shared principles in NF-κB signalling, cell 132(3), Seiten 344 bis 362 , oder in Verheist et al. (2011), Regulation of TNF-induced NF-κB activation by different cytoplasmic ubiquitination events, cytokine growth factor Rev. 22(5–6), Seiten 277 bis 286 . The NF-κB signal transmission path is described, for example, in Hayden and Ghosh (2008), Shared principles in NF-κB signaling, cell 132 (3), pages 344-362 , or in Verheist et al. (2011), Regulation of TNF-induced NF-κB activation by different cytoplasmic ubiquitination events, cytokine growth factor Rev. 22 (5-6), pages 277 to 286 ,

Erfindungsgemäß umfasst ein Lebewesen ein jedes Lebewesen, vorzugsweise ein Säugetier, einschließlich dem Menschen.According to the invention, a living being comprises every living being, preferably a mammal, including humans.

Die Erkenntnisse der Erfinder waren überraschend. So deutet der Stand der Technik sogar in die entgegengesetzte Richtung. The findings of the inventors were surprising. Thus, the state of the art even points in the opposite direction.

Taylor et al. (2009), Hantaan Virus Nucleocapsid protein binds to importin α proteins and inhibits tumor necrosis factor alpha-induced activation of nuclear factor kappa B, Journal of Virology 83(3), Seiten 1271–1279 , und Taylor et al. (2009), Inhibition of TNF-alpha-induced activation of NF-κB by hantavirus nucleocapsid proteins , beschreiben, dass das Hantavirus bzw. das virale N-Protein, den NF-κB-Signalübertragungsweg hemmt und dadurch das Virus dem Immunsystem des Wirtes entgehen kann. Die Hemmung des NF-κB-Signalübertragungsweg ist demnach nach Auffassung dieser Autoren einer der pathogenen Faktoren des Hantavirus. Ausgehend von diesen Erkenntnissen war deshalb anzunehmen, dass eine Hemmung des NF-κB-Signalübertragungsweges die Viruslast eher erhöhen wird. Demzufolge müsste die Behandlung einer Hantavirus-Infektion die Aktivierung des NF-κB-Signalübertragungsweges zum Ziel haben sollte. Taylor et al. (2009), Hantaan Virus Nucleocapsid protein binds to importin α proteins and inhibits tumor necrosis factor alpha-induced activation of nuclear factor kappa B, Journal of Virology 83 (3), pages 1271-1279 , and Taylor et al. (2009), Inhibition of TNF-alpha-induced activation of NF-κB by hantavirus nucleocapsid proteins , describe that the hantavirus or the viral N protein inhibits the NF-κB signal transduction pathway and thereby the virus can escape the immune system of the host. According to these authors, the inhibition of the NF-κB signal transmission pathway is therefore one of the pathogenic factors of the hantavirus. Based on these findings, it was therefore to be assumed that an inhibition of the NF-κB signal transmission path would rather increase the viral load. Consequently, the treatment of hantavirus infection should have the goal of activating the NF-κB signaling pathway.

Die Erkenntnisse der Erfinder belegen jedoch das Gegenteil. Die Erfinder haben erkannt, dass eine Hemmung des NF-κB-Signalübertragungsweges tatsächlich zu einer Reduzierung der Hantaviruslast führt.The findings of the inventors, however, prove the opposite. The inventors have recognized that inhibition of the NF-κB signal transduction pathway actually leads to a reduction in hantavirus burden.

Die Erfinder konnten im Zellkulturversuch am Beispiel von nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Substanzen, wie den Salicylaten, eindrucksvoll nachweisen, dass damit die Vermehrung von Hantaviren signifikant gehemmt werden kann. Sie konnten ferner zeigen, dass in Zellen, in denen durch retrovirale Transfektion der NF-κB-Signalübertragungs¬weg gehemmt ist, eine Vermehrung der Hantaviren nicht mehr stattfindet. Dieser Effekt ist hochspezifisch und wird bei der Hemmung anderer Signalübertragungswege, wie bspw. dem Raf/MEK/ERK-Signalweg, nicht beobachtet.Using the example of non-steroidal anti-inflammatory substances, such as salicylates, the inventors were able to demonstrate impressively that the proliferation of hantaviruses can be significantly inhibited in cell culture experiments. They were also able to show that in cells in which the NF-κB signaling pathway is inhibited by retroviral transfection, an increase in hantaviruses no longer takes place. This effect is highly specific and is not observed in the inhibition of other signal transduction pathways, such as the Raf / MEK / ERK signaling pathway.

Die Erfindung wird mit der Bereitstellung eines Inhibitors des NF-κB-Signalübertragungs¬weg vollkommen gelöst.The invention is completely solved by providing an inhibitor of the NF-κB signal transmission pathway.

Dabei ist es bevorzugt, wenn der Inhibitor eine Komponente des NF-κB-Signalübertragungsgweges hemmt. Dabei wird erfindungsgemäß unter einer Komponente ein Knotenpunkt im NF-κB-Signalübertragungsweg verstanden, wie ein Molekül oder vorzugsweise ein Protein, das in die Signalweiterleitung im NF-κB-Signalübertragungs¬weg involviert ist. Dabei ist die Komponente vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Tumor necrosis factor receptor associated factor (TRAF), NF-κB inducing kinase (NIK), Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MEKKK1), Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3 (MEKKK3), AKR mouse thymoma kinase (AKT), TGFβ activated kinase (TAK1), Inhibitor of NF-κB kinase alpha (IKKalpha)‚ Inhibitor of NF-κB kinase beta (IKKbeta), NEMO, Inhibitor von κB (I-κB), RELA (p65), C-REL, RELEB, NF-κB1 (p105), NF-κB2 (p100), p50, p52.It is preferred if the inhibitor inhibits a component of the NF-κB Signalübertragungsgweges. In this case, according to the invention, a component is understood to mean a node in the NF-κB signal transmission pathway, such as a molecule or preferably a protein which is involved in signal transmission in the NF-κB signal transmission pathway. The component is preferably selected from the group consisting of: tumor necrosis factor receptor associated factor (TRAF), NF-KB inducing kinase (NIK), mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MEKKK1), mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3 (MEKKK3), AKR mouse thymoma kinase (AKT), TGFβ activated kinase (TAK1), inhibitor of NF-κB kinase alpha (IKKalpha), inhibitor of NF-κB kinase beta (IKKbeta), NEMO, inhibitor of κB (I- κB), RELA (p65), C-REL, RELEB, NF-κB1 (p105), NF-κB2 (p100), p50, p52.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der erfindungsgemäße Inhibitor an wichtigen Knotenpunkten des NF-κB-Signalübertragungsweges ansetzt und diesen wirksam hemmt. Inhibitoren dieser Komponenten sind somit für die Realisierung der Erfindung besonders geeignet.This measure has the advantage that the inhibitor according to the invention attaches to important nodes of the NF-κB signal transmission pathway and effectively inhibits it. Inhibitors of these components are thus particularly suitable for the realization of the invention.

Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung ist der erfindungsgemäße Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nicht-steroidalen antiinflammatorischen Substanzen (NSAIDs), Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC), MG132, BAY11-7085 oder Derivaten hiervon. Unter einem Derivat wird eine chemisch verwandte und aus der Grundsubstanz erhaltene Verbindung verstanden, welche gleichermaßen zur spezifischen Inhibierung des NF-κB-Signalübertragungsweges in der Lage ist.According to a preferred development, the inhibitor according to the invention is selected from the group consisting of non-steroidal anti-inflammatory substances (NSAIDs), pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC), MG132, BAY11-7085 or derivatives thereof. By a derivative is meant a chemically related and derived from the parent compound which is equally capable of specifically inhibiting the NF-κB signaling pathway.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche erfindungsgemäße Inhibitoren bereitgestellt werden, die sich nach Erkenntnissen der Erfinder zur Realisierung der Erfindung besonders gut eignen und durch eine hohe therapeutische Sicherheit auszeichnen.This measure has the advantage that such inhibitors according to the invention are provided which, according to findings of the inventors, are particularly well suited to the realization of the invention and are distinguished by a high therapeutic safety.

Erfindungsgemäß umfassen nicht-steroidale anti-inflammatorische Substanzen nicht-selektive NSAR, wie Acetylsalicylderivate, beispielsweise Aspirin, und Arylpropionsäurederivate, beispielsweise Ibuprofen, sowie Arylessigsäurederivate, beispielsweise Diclofenac, etc. NSARs umfassen erfindungsgemäß ferner selektive COX-2-Inhibitoren, wie Parecoxib, Etoricoxib oder Celecoxib. According to the invention, non-steroidal anti-inflammatory substances comprise non-selective NSAIDs, such as acetylsalicyl derivatives, for example aspirin, and arylpropionic acid derivatives, for example ibuprofen, and arylacetic acid derivatives, for example diclofenac, etc. According to the invention, NSAIDs furthermore comprise selective COX-2 inhibitors, such as parecoxib, etoricoxib or celecoxib.

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn es sich bei dem Inhibitor des NF-κB-Signalübertragungsweges um ein Acetylsalicylat oder ein Derivat hiervon handelt.In this case, it is preferred according to the invention if the inhibitor of the NF-κB signal transmission path is an acetylsalicylate or a derivative thereof.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass derartige Substanzen zum Einsatz kommen, die sich durch besondere Wirksamkeit und Nebenwirkungsarmut ausgezeichnet haben. Als Acetylsalicylat kommen insbesondere die Salicylsäure, die Acetylsalicylsäure und durch Aminosäuren modifizierte Acetylsalicylate in Frage, wie LASAG. Unter einem Derivat wird eine chemisch verwandte und aus der Grundsubstanz erhaltene Verbindung verstanden, welche gleichermaßen zur Inhibierung des NF-κB-Signalübertragungsweges in der Lage ist.This measure has the advantage that such substances are used, which are have been distinguished by their special effectiveness and low side effects. Particularly suitable acetylsalicylate are salicylic acid, acetylsalicylic acid and acetylsalicylates modified by amino acids, such as LASAG. By a derivative is meant a chemically related compound obtained from the matrix which is equally capable of inhibiting the NF-κB signaling pathway.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn es sich bei dem Inhibitor des NF-κB-Signalübertragungsweges um, D,L-Lysinacetylsalicylat∙Glycin (LASAG) handelt.It is particularly preferred when the inhibitor of the NF-κB signal transduction pathway is D, L-lysine acetylsalicylate ∙ glycine (LASAG).

Wie die Erfinder zeigen konnten, weist LASAG eine besonders hohe Wirksamkeit gegen Hantaviren auf.As the inventors have shown, LASAG has a particularly high efficacy against hantaviruses.

Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist das Hantavirus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Hantaan-Virus, Dobrava-Virus, Seoul-Virus, Saaremaa-Virus, Amur-Virus, Puumala-Virus, Sin-Nombre-Virus, New-York-1-Virus, Monongahela-Virus, Bayou-Virus, Black-Creek Canal-Virus, Andes-Virus, Laguna-Negra-Virus, Araraquara-Virus, Choclo-Virus, Juquitiba-Virus, Castelo dos Sonhos, Bermejo-Virus und Lechiguanas-Virus.According to a preferred embodiment of the invention, the hantavirus is selected from the group consisting of: Hantaan virus, Dobrava virus, Seoul virus, Saaremaa virus, Amur virus, Puumala virus, Sin Nombre virus, New York 1 virus, Monongahela virus, Bayou virus, Black Creek Canal virus, Andes virus, Laguna Negra virus, Araraquara virus, Choclo virus, Juquitiba virus, Castelo dos Sonhos, Bermejo virus and Lechiguanas -Virus.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mittels des erfindungsgemäßen Inhibitors Infektionen durch solche Hantaviren behandelbar sind bzw. vorgebeugt werden kann, die eine besondere klinische Relevanz aufweisen.This measure has the advantage that, by means of the inhibitor according to the invention, infections by such hantaviruses can be treated or prevented, which have a particular clinical relevance.

Dabei ist es bevorzugt, wenn der Inhibitor des NF-κB-Signalübertragungsweges zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Krankheitsbildes vorgesehen ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: hämorrhagischem Fieber mit renalem Syndrom (HFRS), Hantavirus-induziertem kardiopulmonalem Syndrom (HCPS) und Nephropathia Epidemica (NE).It is preferred if the inhibitor of the NF-κB signal transmission path is provided for the prophylaxis and / or treatment of a disease selected from the group consisting of: hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), hantavirus-induced cardiopulmonary syndrome (HCPS ) and Nephropathia epidemica (NE).

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit der Erfindung gezielt durch Hantavirus-induzierte Krankheiten behandelbar sind. This measure has the advantage that can be treated with the invention targeted by hantavirus-induced diseases.

Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den erfindungsgemäßen Inhibitor aufweist.Against this background, another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the inhibitor of the invention.

Es versteht sich, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine pharmazeutisch akzeptable Formulierung aufweisen kann. Pharmazeutisch akzeptable Formulierungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Beispielhaft wird auf die Abhandlung von Kibbe A. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Auflage, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, verwiesen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner Zusätze enthalten. Diese umfassen jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für die erfindungsgemäße Verwendung vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel und weitere in Zusammenhang mit der Formulierung von Arzneimittel üblicherweise verwendete Stoffe fallen.It is understood that the pharmaceutical composition of the invention may have a pharmaceutically acceptable formulation. Pharmaceutically acceptable formulations are well known in the art. For example, reference is made to the paper by Kibbe A. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. The pharmaceutical composition of the invention may further contain additives. These include any compound or composition which is advantageous for use in the invention, including salts, binders, solvents, dispersants and other substances commonly used in the formulation of pharmaceuticals.

Es versteht sich ferner, dass in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung der Inhibitor als alleiniger Wirkstoff vorgesehen werden kann. Nach einer alternativen Ausgestaltung kann jedoch die pharmazeutische Zusammensetzung weitere Wirkstoffe enthalten.It is further understood that in the composition according to the invention the inhibitor can be provided as the sole active ingredient. However, according to an alternative embodiment, the pharmaceutical composition may contain other active ingredients.

Besonders bevorzugt ist es, wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Aerosol bzw. zur inhalativen, d.h. nasalen oder oralen bzw. bronchialen Verabreichung ausgestaltet ist. Unter einem Aerosol wird erfindungsgemäß ist ein Gemisch aus einem Feststoff oder einer Flüssigkeit und einem Gas verstanden. Die disperse Phase, auch als diskontinuierliche Phase bezeichnet, besteht aus multiplen festen oder flüssigen Partikeln. Im Allgemeinen liegt die Partikelgröße der dispersen Phasen bei kleiner 100 µm. Erfindungsgemäß können beide Grundtypen von Aerosolen, d.h. feste und flüssige Dispersionen in einer Gasphase, als pharmazeutische Aerosole verwendet werden. Beispiele von Aerosolen aus festen Partikeln in einer Gasphase sind solche, die von Trockenpulverinhalatoren (DPIs) emittiert werden. Hierzu im Gegensatz werden von fein dosierenden Inhalatoren ("metered-dose inhalers"), Soft-Mist-Inhalatoren oder Verneblern Aerosole generiert, deren disperse Phase flüssig ist. Die inhalative Verabreichung wird über die Verwendung einer geeigneten Inhalationsvorrichtung erreicht, die ein Aerosol generiert, das von dem Lebewesen bspw. über ein Mund- oder Nasenstück inhaliert wird.It is particularly preferred if the composition according to the invention is used as aerosol or for the inhalative, i. nasal or oral or bronchial administration is configured. An aerosol according to the invention is understood as meaning a mixture of a solid or a liquid and a gas. The disperse phase, also referred to as a discontinuous phase, consists of multiple solid or liquid particles. In general, the particle size of the disperse phases is less than 100 microns. According to the invention, both basic types of aerosols, i. solid and liquid dispersions in a gas phase, can be used as pharmaceutical aerosols. Examples of solid particle gas phase aerosols are those emitted by dry powder inhalers (DPIs). In contrast, metered-dose inhalers, soft-mist inhalers or nebulizers generate aerosols whose disperse phase is fluid. Inhalation administration is achieved through the use of a suitable inhalation device that generates an aerosol that is inhaled by the animal, for example via an oral or nasal piece.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung den Inhibitor in einer Konzentration von ca. 0,1 bis 4 mM aufweist. It is preferred if the pharmaceutical composition according to the invention comprises the inhibitor in a concentration of about 0.1 to 4 mM.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit solchen Mengen ausreichende Konzentrationen im Lebewesen, vorzugsweise im menschlichen Organismus, insbesondere in der Lunge, erreicht werden können, die eine wirksame Bekämpfung einer Hantavirus-Infektion oder eine Vorbeugung hiergegen sicherstellen.This measure has the advantage that with such amounts sufficient concentrations can be achieved in the animal, preferably in the human organism, in particular in the lungs, which ensure an effective control of a hantavirus infection or a prevention thereof.

Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Inhibitors und der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Infektion eines Lebewesens mit einem Hantavirus.Against this background, a further subject of the present invention relates to the use of the inhibitor according to the invention and the pharmaceutical according to the invention A composition for the prophylaxis and / or treatment of an infection of a living being with a hantavirus.

Die Eigenschaften, Merkmale, Vorteile und Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Inhibitors gelten für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung und erfindungsgemäße Verwendung gleichermaßen.The properties, features, advantages and developments of the inhibitor according to the invention apply equally to the pharmaceutical composition according to the invention and to the use according to the invention.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die Gesamtmenge des erfindungsgemäßen Inhibitors pro Verabreichungseinheit bei ca. 0,1 bis 70 mg liegt. It is preferred if the total amount of the inhibitor according to the invention per administration unit is about 0.1 to 70 mg.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Mengen von Inhibitor bereitgestellt werden, die ein Optimum an Therapieerfolgt gewährleisten. Bei einer inhalativen Applikation liegt die Gesamtdosis pro Tag beim Menschen zweckmäßigerweise im Bereich von 0,1 bis 30 mg, bei einer bronchialen Applikation bei 0,1 bis 70 mg. Je nach Anwendung kann die Untergrenze aber auch zwischen 0,1 und 20 mg bzw. 50 mg liegen. Je nach Anwendung kann aber auch die Obergrenze zwischen 1 mg bzw. 2 mg und den angegebenen Maximalwerten liegen. Eine Tagesdosis wird vorteilhafterweise in eins bis acht Gaben verabreicht, welche zweckmäßigerweise gleichmäßig über eine Wachdauer von 16 Stunden verteilt sind. Eine Behandlung erfolgt zweckmäßigerweise über einen Zeitraum von 1 bis 7 Tagen und länger. Die Erfindung umfasst insofern auch galenisch hergerichtete Gabeeinheiten, wobei die in einer Gabeeinheit vorliegende Menge des Inhibitors gemäß vorstehenden Bereichen eines Behandlungsplanes unschwer errechenbar ist.This measure has the advantage of providing such amounts of inhibitor that ensure optimum therapy. When administered by inhalation, the total dose per day in humans is expediently in the range of 0.1 to 30 mg, in the case of bronchial administration 0.1 to 70 mg. Depending on the application, however, the lower limit may also be between 0.1 and 20 mg or 50 mg. Depending on the application, however, the upper limit may be between 1 mg and 2 mg and the specified maximum values. A daily dose is advantageously administered in one to eight doses, which are desirably evenly distributed over a period of vigilance of 16 hours. A treatment is expediently carried out over a period of 1 to 7 days and longer. The invention thus also includes galenically prepared delivery units, wherein the amount of the inhibitor present in a delivery unit can be easily calculated in accordance with the above ranges of a treatment plan.

Vor diesem Hintergrund ist es bevorzugt, wenn die Tagesdosis des Inhibitors beim Menschen 70 mg nicht überschreitet.Against this background, it is preferred that the daily dose of the inhibitor in humans does not exceed 70 mg.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass Nebenwirkungen weitgehend vermieden oder zumindest deutlich reduziert werden.This measure has the advantage that side effects are largely avoided or at least significantly reduced.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft demnach auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Inhibitors bzw. der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines Krankheitsbildes, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus hämorrhagischem Fieber mit renalem Syndrom (HFRS) Hantavirus-induziertem cardiopulmonalem Syndrom (HCPS) und nephropatia epidemica (NE).Another object of the invention therefore also relates to the use of the inhibitor of the invention or the pharmaceutical composition of the invention for the treatment of a disease selected from the group consisting of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) hantavirus-induced cardiopulmonary syndrome (HCPS) and nephropathy epidemica (NE).

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the particular combination given, but also in other combinations or in isolation, without departing from the scope of the present invention.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind hierbei rein illustrativ und schränken die Reichweite der vorliegenden Erfindung nicht ein. Dabei Bezug genommen auf die beiliegenden Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:The present invention will now be explained in more detail with reference to exemplary embodiments, from which further properties, features and advantages of the invention result. The embodiments are here purely illustrative and do not limit the scope of the present invention. With reference to the attached figures, in which:

1 Ermittlung der EC50 von LASAG gegen Hantaviren (A) und der TC50 von LASAG für Vero-Zellen (B); 1 Determination of the LASAG EC 50 against hantaviruses (A) and the LASAG TC 50 for Vero cells (B);

2 Vergleich der antiviralen Wirkung von LASAG (A), ASA (B) und SA (C) gegen Hantaviren; 2 Comparison of the antiviral effects of LASAG (A), ASA (B) and SA (C) against hantaviruses;

3 MEK-Inhibitoren sind nicht in der Lage die Vermehrung von Hantaviren zu hemmen; 3 MEK inhibitors are unable to inhibit the proliferation of hantaviruses;

4 Hantaviren können sich nicht in Vero-Zellen vermehren, deren NF-κB-Signalweg gehemmt ist. 4 Hantaviruses can not replicate in Vero cells whose NF-κB signaling pathway is inhibited.

Ausführungsbeispieleembodiments

1. Effektive Konzentration von LASAG, die die Vermehrung von 50% der Hantaviren hemmt, und die für 50% der infizierten Vero-Zellen toxisch ist1. Effective concentration of LASAG, which inhibits the proliferation of 50% of hantaviruses, and which is toxic to 50% of infected Vero cells

In diesem Versuch sollen die EC50 und TC50 von LASAG ermittelt werden.In this experiment, the EC 50 and TC 50 are to be determined by LASAG.

Vero-Zellen werden in einer Konzentration von 8,0 × 104 Zellen/Vertiefung in 100 µl Wachstumsmedium (IMDM-10% FCS-Penicillin-Streptomycin-L-Glutamin) in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Es werden Dreifachansätze pro Substanzverdünnung gemacht. Anschließend wird die Platte über Nacht bei 37°C und 5% inkubiert. Hierbei kommt es zu einer Verdopplung der Zellzahl pro Vertiefung. Am nächsten Tag werden die ausgesäten Vero-Zellen mit IMDM ohne FCS gewaschen und anschließend mit dem Hantavirus Puumala Stamm Sotkamo mit einer MOI von 0,05 (8,5 × 310 ffu – 50 µl) für eine Stunde bei 37°C infiziert. Danach wird die Virusverdünnung aus der Platte mit 96 Vertiefungen entfernt und die jeweilige Testsubstanz in 200 µl zugegeben. Vero cells are seeded at a concentration of 8.0 x 10 4 cells / well in 100 μl of growth medium (IMDM-10% FCS-penicillin-streptomycin-L-glutamine) in a 96-well plate. There are three approaches per substance dilution made. Subsequently, the plate is incubated overnight at 37 ° C and 5%. This results in a doubling of the cell count per well. The next day, the seeded Vero cells are washed with IMDM without FCS and then infected with Hantavirus Puumala strain Sotkamo at an MOI of 0.05 (8.5 x 310 ffu - 50 μl) for one hour at 37 ° C. The virus dilution is then removed from the 96-well plate and the respective test substance is added in 200 μl.

LASAG (D,L-Lysinacetylsalicylat·Glycin; Fa. Bayer; Ch.B.BXNNEV1; MW: 363,50): Es wird eine 1M Stammlösung in IMDM/10% FCS hergestellt und mit 1N NaOH auf pH 7,4 eingestellt und anschließend auf 1 M bis 0,01 µM in 10er Schritten in IMDM/10% FCS verdünnt.LASAG (D, L-lysine acetylsalicylate · glycine; Bayer; Ch.B.BXNNEV1; MW: 363.50): Prepare a 1M stock in IMDM / 10% FCS and adjust to pH 7.4 with 1N NaOH and then diluted to 1 M to 0.01 μM in 10-step increments in IMDM / 10% FCS.

Die Viruswachstumskontrolle besteht aus IMDM/10% FCS. Die Platten werden bei 37°C und 5% CO2 für zehn Tage inkubiert. Danach werden die Überstände abgenommen und auf Vero-Zellen in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen titriert. Nach Verdünnung des zu testenden Überstandes wird die Gewebekulturplatte erneut für 10 Tage bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Danach werden die Zellen fixiert, permeabilisiert und es erfolgt eine immunzytologische Färbung mit einem Anti-Nukleokapsid-Protein-Primärantikörper (Anti-Puumala-NP, Firma Progen; 1:200 in PBS/10% FCS/0,1% Tween). Nach Inkubation mit einem Sekundärantikörper (Anti-Maus-POD-gekoppelter Antikörper, Fa. Dianova) erfolgt die Substratzugabe (TrueBlue; Fa. KPL/Medac). Virus-infizierte Zellen sind blau gefärbt. Die Platte wird getrocknet und danach werden die Virusfoci in jeder Verdünnung gezählt. Die Anzahl der focusbildenden Viruspartikel wird in ffU/ml (focus forming untis/ml) angegeben.The virus growth control consists of IMDM / 10% FCS. The plates are incubated at 37 ° C and 5% CO 2 for ten days. The supernatants are then removed and plated on Vero cells in a 96-well tissue culture plate titrated. After dilution of the supernatant to be tested, the tissue culture plate is re-incubated for 10 days at 37 ° C / 5% CO 2 . The cells are then fixed, permeabilized and subjected to immunocytological staining with an anti-nucleocapsid protein primary antibody (Anti-Puumala NP, Progen, 1: 200 in PBS / 10% FCS / 0.1% Tween). After incubation with a secondary antibody (anti-mouse POD-coupled antibody, Dianova), the substrate is added (TrueBlue, KPL / Medac). Virus-infected cells are stained blue. The plate is dried and then the virus foci are counted in each dilution. The number of focus-forming virus particles is given in ffU / ml (focus forming to / ml).

Für die Durchführung werden die Vero-Zellen in einer Konzentration von 8,0 × 104 Zellen/Vertiefung in 100 µl Wachstumsmedium (IMDM/10% FCS/Penicillin/ Streptomycin/L-Glutamin) in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Es werden Dreifachansätze pro Substanzverdünnung gemacht. Anschließend wird die Platte über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert, so dass am nächsten Tag ein dichter Zellrasen entstanden ist. Dann werden die ausgesäten Vero-Zellen mit IMDM ohne FCS gewaschen. Danach wird pro Vertiefung die bereits oben beschriebenen Verdünnungen der Testsubstanz in 200 µl Medium zugegeben. Die Kontrolle besteht aus Medium mit 1% DMSO. Die Platte wird für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Am nächsten Tag erfolgt die Messung der Viabilität mit Hilfe des WST-Assays (Firma Roche). Der Test wird gemäß Herstellerangaben durchgeführt. Hierfür werden pro Vertiefung 20 µl WST-q-1-Reagenz zugegeben (N-Verdünnung 1:10) und für vier Stunden bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Im Anschluss wird die Absorption der Proben bei einer Wellenlänge von 460 nm in einen ELISAreader gemessen. Mit den gemessenen Absorptionen wird mit dem Programm graphpad prism 5 die EC50 und TC50 berechnet. For carrying out the Vero cells are seeded in a concentration of 8.0 × 10 4 cells / well in 100 ul growth medium (IMDM / 10% FCS / penicillin / streptomycin / L-glutamine) in a 96-well tissue culture plate. There are three approaches per substance dilution made. Subsequently, the plate is incubated overnight at 37 ° C and 5% CO 2 , so that the next day a dense cell lawn is created. Then the seeded Vero cells are washed with IMDM without FCS. Thereafter, the already described above dilutions of the test substance in 200 ul medium is added per well. The control consists of medium with 1% DMSO. The plate is incubated for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 . The next day, the measurement of viability is carried out using the WST assay (Roche). The test is carried out according to the manufacturer's instructions. For this purpose, 20 μl of WST-q-1 reagent are added to each well (N dilution 1:10) and incubated for four hours at 37 ° C./5% CO 2 . The absorption of the samples at a wavelength of 460 nm is then measured in an ELISA reader. With the measured absorptions, the program graphpad prism 5 calculates the EC 50 and TC 50 .

Das Ergebnis ist in der 1 dargestellt. Dort ist der Virustiter in % (A) und die Viabilität in % (B) im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle dargstellt.The result is in the 1 shown. There, the virus titer in% (A) and the viability in% (B) in comparison to the respective control dargstellt.

Daraus ergibt sich, dass bei einer Konzentration von 0,62 µM LASAG die Vermehrung von 50% der Hantaviren gehemmt wird (EC50 = 0,62 µM) (A). Eine Konzentration von 13,33 mM LASAG von ist für 50% der infizierten Vero-Zellen toxisch (TC50 = 13,33 mM) (B). Hieraus ergibt sich ein Selektivitätsindex von 21.500, der den Unterschied zwischen Wirkung und Toxizität beschreibt.It follows that at a concentration of 0.62 μM LASAG, the proliferation of 50% of hantaviruses is inhibited (EC 50 = 0.62 μM) (A). A concentration of 13.33 mM LASAG from is toxic to 50% of the infected Vero cells (TC 50 = 13.33 mM) (B). This results in a selectivity index of 21,500, which describes the difference between effect and toxicity.

2. Vergleich der antiviralen Wirkung von LASAG, ASA und SA gegen Hantaviren2. Comparison of the antiviral effect of LASAG, ASA and SA against hantaviruses

Im nächsten Versuch sollen die antiviralen Wirkungen von LASAG, ASA und SA gegen Hantaviren miteinander verglichen werden.In the next experiment, the antiviral effects of LASAG, ASA and SA against hantaviruses will be compared.

LASAG: Wie oben in Beispiel 1 beschrieben, wird eine 1M Stammlösung von LASAG in IMDM/10% FCS hergestellt und mit 1N NaOH auf pH 7,4 eingestellt und anschließend auf 1 mM, 100 µM und 10 µM in IMDM/10% FCS verdünnt. LASAG: As described above in Example 1, a 1M stock solution of LASAG is prepared in IMDM / 10% FCS and adjusted to pH 7.4 with 1N NaOH and then diluted to 1 mM, 100 μM and 10 μM in IMDM / 10% FCS ,

ASA: (Acetylsalicylsäure; Firma Sigma; Lot# SLBD 9984V, MW: 180,16): Es wird eine 80 mM Stammlösung in IMDM/10% FCS hergestellt, mit 1N NaOH auf pH 7,4 eingestellt und anschließend auf 1 mM, 100 µM und 10 µM in IMDM/10% FCS verdünnt.ASA: (acetylsalicylic acid, Sigma; Lot # SLBD 9984V, MW: 180.16): Prepare an 80 mM stock in IMDM / 10% FCS, adjust to pH 7.4 with 1N NaOH and then to 1 mM, 100 μM and 10 μM in IMDM / 10% FCS.

SA: (Salicylsäure; Fa. Sigma, Lot# BCBJ2699V; MW: 160,10): Es wird eine 1M Stammlösung in IMDM/10% FCS hergestellt und auf 1 mM, 100 µM und 10 µM in IMDM/10% FCS verdünnt.SA: (salicylic acid, Sigma, Lot # BCBJ2699V; MW: 160.10): Prepare a 1 M stock in IMDM / 10% FCS and dilute to 1 mM, 100 μM and 10 μM in IMDM / 10% FCS.

Die Viruswachstumskontrolle besteht aus IMDM/10% FCS.The virus growth control consists of IMDM / 10% FCS.

Die Platten werden bei 37°C und 5% CO2 für 10 Tage inkubiert. Die weitere Behandlung erfolgt, wie weiter oben in Beispiel 1 beschrieben.The plates are incubated at 37 ° C and 5% CO 2 for 10 days. The further treatment is carried out as described above in Example 1.

Das Ergebnis ist in der 2 dargestellt. Der Virustiter ins in % im Vergleich zur Kontrolle dargestellt.The result is in the 2 shown. The virus titer is shown in% compared to the control.

Daraus ergibt sich, dass die antivirale Wirkung von LASAG (A), ASA (B) und SA (C) gegen Hantaviren vergleichbar gut ist, wobei LASAG die beste Wirkung zeigt. LASAG, ASA und SA führen in den Konzentrationen von 10,1 und 0,1 µM (graue Balken) zu einer Reduktion der Viruslast im Vergleich zur Kontrolle (schwarzer Balken).As a result, the anti-viral effect of LASAG (A), ASA (B) and SA (C) against Hantaviruses is comparably good, with LASAG showing the best effect. LASAG, ASA and SA lead to a reduction in viral load in the concentrations of 10.1 and 0.1 μM (gray bars) compared to the control (black bar).

3. MEK-Inhibitoren sind nicht in der Lage, die Vermehrung der Hantaviren zu hemmen3. MEK inhibitors are unable to inhibit the proliferation of hantaviruses

Im nächsten Experiment soll getestet werden, ob auch MEK/ERK-Inhibitoren in der Lage sind, die Vermehrung von Hantaviren zu hemmen. Dazu wurde der MEK-Inhibitor CI-1040 (Active Biochem; Cat. 1064 Lot#1; MW 478,67) eingesetzt. Für CI-1040 wurde eine Stammlösung mit 10 mM in 100% DMSO hergestellt und erneut auf 1 mM, 100 µM und 10 µM in DSMO verdünnt. Danach erfolgt die Verdünnung im Testmedium 1:100 (7 µl CI-1040 + 693µl Medium). Somit ist die DMSO-Konzentration im Testmedium 1% und die Konzentration von CI-1040 ist 10 µM, 1 µM und 0,1 µM. Die Viruswachstumskontrolle besteht aus Medium mit 1% DMSO. Die Platten werden bei 37°C und 5% CO2 für 10 Tage inkubiert.The next experiment is to test whether MEK / ERK inhibitors are able to inhibit the proliferation of hantaviruses. For this purpose, the MEK inhibitor CI-1040 (Active Biochem, Cat 1064 Lot # 1, MW 478.67) was used. For CI-1040, a stock solution of 10 mM in 100% DMSO was prepared and diluted again to 1 mM, 100 μM and 10 μM in DSMO. Thereafter, the dilution in the test medium 1: 100 (7 ul CI-1040 + 693μl medium). Thus, the DMSO concentration in the test medium is 1% and the concentration of CI-1040 is 10 μM, 1 μM and 0.1 μM. The virus growth control consists of medium with 1% DMSO. The plates are incubated at 37 ° C and 5% CO 2 for 10 days.

Die weitere Behandlung erfolgt wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Das Ergebnis ist in 3 dargestellt. Dort ist der Virustiter (log10 in ffu/ml; (A) und in % (B)) bei verschiedenen Konzentrationen des MEK-Inhibitors dargestellt. The further treatment is carried out as described above in Example 1. The result is in 3 shown. There the virus titer (log 10 in ffu / ml; (A) and in% (B)) is shown at different concentrations of the MEK inhibitor.

Danach führt der MEK-Inhibitor CI-1040 in den Konzentrationen 10,1 und 0,1 µM (graue Balken) zu keiner Reduktion der Viruslast im Vergleich zur Kontrolle (schwarzer Balken). Thereafter, the MEK inhibitor CI-1040 at concentrations of 10.1 and 0.1 μM (gray bars) leads to no reduction in the viral load in comparison to the control (black bar).

4. Hantaviren können sich nicht in Vero-Zellen vermehren, deren NF-κB-Signalweg gehemmt ist4. Hantaviruses can not multiply in Vero cells whose NF-κB signaling pathway is inhibited

In einem nächsten Experiment soll überprüft werden, ob sich Hantaviren in Vero-Zellen vermehren können, deren NF-κB-Signalweg gehemmt ist.In a next experiment, it will be investigated whether hantaviruses can multiply in Vero cells whose NF-κB signaling pathway is inhibited.

Dazu werden Vero-Zellen (Vero NL), Vero-Zellen mit durch retrovirale Transfektion blockiertem NF-κB-Signalweg (Vero KD; Zellen wurden mit einem replikationsdefizienten Retrovirus infiziert, das die jeweilige mutierte Kinase trägt und in das Wirtszellgenom integriert) und Vero-Zellen, die mit dem Vektor transfiziert wurden (Vero Vec), in einer Konzentration von 8,0 × 104 Zellen/Vertiefung in 100 µl Wachstumsmedium (IMDM/10% FCS/Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin) in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Es werden Dreifach-Ansätze pro Substanzverdünnung gemacht. Anschließend wird die Platte über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Hierbei kommt es zu einer Verdoppelung der Zellzahl pro Vertiefung.These include Vero cells (Vero NL), Vero cells with NF-κB signaling pathway blocked by retroviral transfection (Vero KD, cells were infected with a replication-deficient retrovirus carrying the respective mutant kinase and integrated into the host cell genome) and Vero KD. Cells transfected with the vector (Vero Vec) at a concentration of 8.0 x 10 4 cells / well in 100 μl growth medium (IMDM / 10% FCS / penicillin / streptomycin / L-glutamine) in a 96 well plate Seeded pits. There are three approaches per substance dilution made. Subsequently, the plate is incubated overnight at 37 ° C and 5% CO 2 . This results in a doubling of the cell count per well.

Am nächsten Tag werden die ausgesäten Vero-Zellen mit IMDM ohne FCS gewaschen und anschließend mit dem Hantavirus Puumala-Stamm Sotkamo mit einer MOI von 0,05 (8,5 × 103 ffu/50 µl) für eine Stunde bei 37°C infiziert.The next day, the seeded Vero cells are washed with IMDM without FCS and then infected with Hantavirus Puumala strain Sotkamo at an MOI of 0.05 (8.5 x 10 3 ffu / 50 μl) for one hour at 37 ° C ,

Täglich für sieben Tage werden die Überstände abgenommen und auf Vero-Zellen in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen titriert. Nach Verdünnung des zu testenden Überstandes wird die Gewebekulturplatte erneut für 10 Tage bei 37°C um 5% CO2 inkubiert. Danach werden die Zellen fixiert, permeabilisiert und es erfolgt eine immunzytologische Färbung mit einem Anti-NP-Primärantikörper (anti-Puumala-NP, Fa. Progen; 1:200 in PBS/10% FCS/0,1% Tween). Nach Inkubation mit einem Sekundärantikörper (Antimouse POD gekoppelter Antikörper, Fa. Dianova) erfolgt die Substanzzugabe (TruBlue); Fa. KPL/Medac). Virusinfizierte Zellen sind blau gefärbt. Die Platte wird getrocknet und danach werden die Virusfoci in jeder Verdünnung gezählt. Die Anzahl der focusbildenden Viruspartikel ist in ffU/ml (focus forming units/ml) angegeben.Supernatants are removed daily for seven days and titered on Vero cells in a 96-well tissue culture plate. After dilution of the supernatant to be tested, the tissue culture plate is re-incubated for 10 days at 37 ° C for 5% CO 2 . The cells are then fixed, permeabilized and subjected to immunocytological staining with an anti-NP primary antibody (anti-Puumala NP, Progen, 1: 200 in PBS / 10% FCS / 0.1% Tween). After incubation with a secondary antibody (Antimouse POD coupled antibody, Fa. Dianova), the substance is added (TruBlue); Fa. KPL / Medac). Virus infected cells are stained blue. The plate is dried and then the virus foci are counted in each dilution. The number of focus-forming virus particles is given in FFU / ml (focus-forming units / ml).

Das Ergebnis dieses Experimentes ist in der 4 dargestellt. Diese zeigt den Hantavirustiter (log10 in ffu/ml) im Verlauf von 7 Tagen in Vero-Zellen (Vero NL) und Vero-Zellen, bei denen durch retrovirale Transfektion der NF-κB-Signalweg gehemmt ist (Vero KD). Als Kontrolle dienen Vero-Zellen, die mit dem Vektor transfiziert wurden (Vero-Vec). The result of this experiment is in the 4 shown. This shows the hantavirus titer (log 10 in ffu / ml) over 7 days in Vero cells (Vero NL) and Vero cells in which the NF-κB signaling pathway is inhibited by retroviral transfection (Vero KD). Vero cells transfected with the vector serve as control (Vero-Vec).

Bereits vier Tage nach der Infektion waren bei Vero KD Zellen keine infektiösen Hantavirus-Partikel mehr nachweisbar. Der relativ hohe Titer am ersten Tag nach der Infektion resultiert durch Input-Virus.Just four days after the infection, no infectious hantavirus particles were detectable in Vero KD cells. The relatively high titer on the first day after infection results from input virus.

FazitConclusion

Die Erfinder konnten auf eindrucksvolle Art und Weise belegen, dass ein spezifischer Inhibitor des NF-κB-Signalübertragungsweges, wie beispielsweise LASAG, ASA und SA, zur Behandlung und Prophylaxe einer Infektion eines Lebewesens mit einem Hantavirus eingesetzt werden kann.The inventors have impressively demonstrated that a specific inhibitor of the NF-κB signaling pathway, such as LASAG, ASA and SA, can be used to treat and prevent infection of a living animal with a hantavirus.

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Claims (14)

Inhibitor des NF-κB-Signalübertragungsweges zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Infektion eines Lebewesens mit einem Hantavirus.Inhibitor of the NF-κB signal transduction pathway for the prophylaxis and / or treatment of an infection of a living being with a hantavirus. Inhibitor nach Anspruch 1, der eine Komponente des NF-κB-Signalübertragungsweges hemmt, die vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Tumor necrosis factor receptor associated factor (TRAF), NF-κB inducing kinase (NIK), Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MEKKK1), Mitogenactivated protein kinase kinase kinase 3 (MEKKK3), AKR mouse thymoma kinase (AKT), TGFβ activated kinase (TAK1), Inhibitor of NF-κB kinase alpha (IKKalpha)‚ Inhibitor of NF-κB kinase beta (IKKbeta), NEMO, Inhibitor von κB (I-κB), RELA (p65), C-REL, RELEB, NF-κB1 (p105), NF-κB2 (p100), p50, p52.The inhibitor of claim 1, which inhibits a component of the NF-κB signaling pathway, preferably selected from the group consisting of: tumor necrosis factor receptor associated factor (TRAF), NF-κB inducing kinase (NIK), mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MEKKK1), mitogen activated protein kinase kinase kinase 3 (MEKKK3), AKR mouse thymoma kinase (AKT), TGFβ activated kinase (TAK1), inhibitor of NF-kB kinase alpha (IKKalpha), inhibitor of NF-kB kinase beta ( IKKbeta), NEMO, inhibitor of κB (I-κB), RELA (p65), C-REL, RELEB, NF-κB1 (p105), NF-κB2 (p100), p50, p52. Inhibitor nach Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Nicht-steroidalen anti-inflammatorischen Substanzen (NSAIDs), Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC), MG132, BAY11-7085 oder Derivaten hiervon.An inhibitor according to claim 1 or 2, selected from the group consisting of: non-steroidal anti-inflammatory substances (NSAIDs), pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC), MG132, BAY11-7085 or derivatives thereof. Inhibitor nach Anspruch 3, bei dem es sich um ein Acetylsalicylat oder ein Derivat hiervon handelt.An inhibitor according to claim 3, which is an acetylsalicylate or a derivative thereof. Inhibitor nach Anspruch 4, bei dem es sich um D,L-Lysinacetylsalicylat·Glycin (LASAG) handelt.An inhibitor according to claim 4, which is D, L-lysine acetylsalicylate · glycine (LASAG). Inhibitor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Hantavirus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Hantaan-Virus, Dobrava-Virus, Seoul-Virus, Saaremaa-Virus, Amur-Virus, Puumala-Virus, Sin-Nombre-Virus, New-York-1-Virus, Monongahela-Virus, Bayou-Virus, Black-Creek Canal-Virus, Andes-Virus, Laguna-Negra-Virus, Araraquara-Virus, Choclo-Virus, Juquitiba-Virus, Castelo dos Sonhos, Bermejo-Virus und Lechiguanas-Virus. Inhibitor according to one of the preceding claims, characterized in that the hantavirus is selected from the group consisting of: Hantaan virus, Dobrava virus, Seoul virus, Saaremaa virus, Amur virus, Puumala virus, Sin Nombre virus , New York-1 virus, Monongahela virus, Bayou virus, Black Creek Canal virus, Andes virus, Laguna Negra virus, Araraquara virus, Choclo virus, Juquitiba virus, Castelo dos Sonhos, Bermejo virus and Lechiguanas virus. Inhibitor nach einem der vorherigen Ansprüche, zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Krankheitsbildes, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: hämorrhagischem Fieber mit renalem Syndrom (HFRS), Hantavirus-induziertem kardiopulmonalem Syndrom (HCPS) und Nephropathia Epidemica (NE).Inhibitor according to one of the preceding claims, for the prophylaxis and / or treatment of a disease selected from the group consisting of: hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), hantavirus-induced cardiopulmonary syndrome (HCPS) and Nephropathia epidemica (NE). Pharmazeutische Zusammensetzung aufweisend den Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 7.A pharmaceutical composition comprising the inhibitor according to any one of claims 1 to 7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die den Inhibitor in einer Konzentration von ca. 0,1 bis 4 mM aufweist.A pharmaceutical composition according to claim 8, which has the inhibitor in a concentration of about 0.1 to 4 mM. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, die für die nasale, bronchiale und/oder aerogene Verabreichung ausgebildet ist.A pharmaceutical composition according to claim 8 or 9, which is adapted for nasal, bronchial and / or aerogenic administration. Verwendung des Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Infektion eines Lebewesens mit einem Hantavirus.Use of the inhibitor according to any one of claims 1 to 7 and / or the pharmaceutical composition according to any one of claims 8 to 10 for the prophylaxis and / or treatment of an infection of a living being with a hantavirus. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge des Inhibitors pro Verabreichungseinheit bei ca. 0,1 bis 70 mg liegt.Use according to claim 11, characterized in that the total amount of inhibitor per administration unit is about 0.1 to 70 mg. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Tagesdosis des Inhibitors beim Menschen 70 mg nicht überschreitet.Use according to claim 11 or 12, characterized in that the daily dose of the inhibitor in humans does not exceed 70 mg. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Krankheitsbildes, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: hämorrhagischem Fieber mit renalem Syndrom (HFRS), Hantavirusinduziertem kardiopulmonalem Syndrom (HCPS) und Nephropathia Epidemica (NE).Use according to any one of claims 11 to 13, for the prophylaxis and / or treatment of a disease selected from the group consisting of: hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), hantavirus-induced cardiopulmonary syndrome (HCPS) and nephropathy epidemica (NE).
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