DE102014008098A1

DE102014008098A1 - Spektral flexible, schnell umschaltbare optische Filtervorrichtung

Info

Publication number: DE102014008098A1
Application number: DE102014008098.6A
Authority: DE
Inventors: Daniel Schwedt; Peter Westphal; Tiemo Anhut; Matthias Wald
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH; Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH; Carl Zeiss AG
Priority date: 2014-05-31
Filing date: 2014-05-31
Publication date: 2015-12-03

Abstract

Die Erfindung betrifft eine optische Filtervorrichtung (1) mit einem Filter (5), das Bereiche mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften aufweist. Die bekannten variablen Filtervorrichtungen weisen jedoch den Nachteil auf, dass die Umschaltung zwischen verschiedenen zu entfernenden spektralen Teilbereichen relativ lange dauert, da dazu der Verlaufsfilter verschoben und/oder geschwenkt werden muss. Die Erfindung soll auch bei hoher spektraler Trennschärfe und starker Unterdrückung eine schnelle Umschaltung ermöglichen. Dazu sind zwei variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtungen (6/7) vorgesehen, wobei ein auf die erste Strahlablenkvorrichtung einfallender Lichtstrahl mittels der ersten Strahlablenkvorrichtung auf unterschiedliche spektral selektive Bereiche des Filters ablenkbar ist und das Filter und die Strahlablenkvorrichtungen so angeordnet sind, dass der zum Filter abgelenkte und dort reflektierte oder transmittierte Lichtstrahl auf die zweite Strahlablenkvorrichtung trifft. Das ermöglicht eine flexiblere, schnellere Umschaltung zwischen unterschiedlichen Filterbereichen in weniger als 100 ms, da die Strahlablenkvorrichtungen beispielsweise im Falle der Ausgestaltung als drehbare Spiegel deutlich kleiner als das Filter und damit deutlich weniger träge sind, so dass sie schneller bewegt werden können. Fluoreszenzmikroskopie

Description

Die Erfindung betrifft eine optische Filtervorrichtung, die ein Filter, insbesondere mit dichroitischen Schichten, umfasst, das parallel zu einer seiner (vorzugsweise planen) Oberflächen angeordnete Bereiche („spektral selektive Bereiche”) mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften aufweist („Verlaufsfilter”). Das optische Transmissionsvermögen des Filters ist also zum einen wellenlängenabhängig (und in demselben Bereich für verschiedene Wellenlängen dem Betrage nach unterschiedlich) und für mindestens eine Wellenlänge in voneinander verschiedenen Bereichen des Filters unterschiedlich. Das Filter kann dabei einstückig sein, oder die unterschiedlichen Bereiche sind auf mehreren Stücken verteilt angeordnet. Mehrere Stücke sind dabei zweckmäßigerweise mechanisch miteinander verbunden, müssen dabei aber nicht unmittelbar miteinander in Kontakt sein.
Spektrale Filtervorrichtungen werden zur Entfernung eines spektralen Teilbereichs (der auch aus mehreren separaten Bändern bestehen kann) aus einem Lichtstrahl durch spektral selektive Reflexion, Transmission und/oder Absorption eingesetzt (Unterdrückung). Im Sinne der Erfindung umfasst der Begriff Licht jede mit optischen Mitteln manipulierbare elektromagnetische Strahlung, also insbesondere ultraviolette, sichtbare und infrarote Strahlung. Ein Lichtstrahl kann konvergent, divergent oder kollimiert sein.
Derartige Filtervorrichtungen können insbesondere bei der mikroskopischen Bildgebung von lumineszierenden (fluoreszierenden oder phosphoreszierenden) Proben eingesetzt werden. In der Fluoreszenzmikroskopie enthält das von der Probe kommende Licht („Probenlicht”) einerseits Fluoreszenzlicht, andererseits reflektiertes und gestreutes Beleuchtungslicht („Anregungslicht”). Anregungslicht und Fluoreszenzlicht weisen unterschiedliche Wellenlängen (Farben) auf, was ihre Trennung ermöglicht.
Im Stand der Technik sind dichroitische Spiegel als optische Filtervorrichtungen bekannt. Diese können beispielsweise wie in US 6,167,173 in einem Fluoreszenzmikroskop als Hauptfarbteiler zur optischen Kopplung des Beleuchtungsstrahlengangs mit dem Detektionsstrahlengang (auch als „Auffädeln” des Beleuchtungsstrahls auf den Fluoreszenzstrahl bezeichnet) eingesetzt werden. Dabei sind unterschiedliche Geometrien möglich, die sich auf den Unterdrückungsfaktor für das jeweils unerwünschte Licht auswirken. Dieser soll möglichst hoch sein.
Allgemein gilt, dass dichroitische Spiegel unter senkrechter Inzidenz (0°) eine maximale Trennschärfe und Unterdrückung aufweisen. In diesem Fall ist aber keine Kopplung mehrerer Strahlengänge möglich, so dass für Hauptfarbteiler ein von 0° abweichender, aber möglichst kleiner Einfallswinkel gewählt wird. Ursprünglich wurde wie in US 6,167,173 ein Einfallswinkel von 45° verwendet. Kleinere, aber von Null verschiedene Einfallswinkel gemäß US 2008/0062511 A1 erlauben demgegenüber eine stärkere Unterdrückung des zu entfernenden spektralen Teilbereichs in der Transmission.
Als Hauptfarbteiler (Hauptstrahlteiler) werden in der Regel solche dichroitischen Spiegel eingesetzt, die als Kerbfilter (engl. „notch filter”) ausgebildet sind. Langpässe oder breite Bandpässe finden dagegen Einsatz als Emissionsfilter im (reinen) Detektionsstrahlengang. Emissionsfilter können auch unter senkrechter Inzidenz angeordnet sein. Für alle Anwendungsfälle gilt, dass die spektrale Abhängigkeit von Transmission und Reflexion bei dichroitischen Spiegeln statisch ist. Das ist insbesondere in Verbindung mit spektral einstellbaren oder breitbandig emittierenden Lichtquellen, beispielsweise sogenannten Multilinien- oder Weißlichtlasern, problematisch. In spektral unterschiedlichen Anregungssituationen darf vor der Detektion nur das momentane Anregungslicht gefiltert werden, um das Messergebnis nicht zu verfälschen. Das gilt insbesondere für den Einsatz einer geeigneten optischen Filtervorrichtung als Hauptfarbteiler.
Notwendig sind optische Filtervorrichtungen, die hinsichtlich des zu entfernenden spektralen Teilbereichs variabel einstellbar sind. Sie können zur spektral flexiblen Beleuchtung und/oder zur flexiblen Trennung von Beleuchtungslicht und Probenlicht eingesetzt werden, indem der zu entfernende spektrale Teilbereich an das momentane Beleuchtungsband (oder die momentanen Beleuchtungsbänder) angepasst wird.
Ein Farbteiler, der eine Variabilität der Lichtquelle zulässt, ist beispielsweise in US 2010/188741 A1 beschrieben. Er umfasst mehrere spektral unterschiedliche Filter, die auf einem Rad angeordnet und dadurch selektiv in den Strahlengang schwenkbar sind. Dabei kann dem Farbteiler in Beleuchtungsrichtung ein drehbarer Spiegel zur Justierung des Einfallswinkels auf den Farbteiler vorgeordnet sein, um die Kollinearität mindestens eines Beleuchtungslasers zur optischen Achse einzustellen. Insbesondere kann es sich um einen durchstimmbaren Laser handeln.
Des weiteren wird in US 2002/0097485 A1 eine Filtervorrichtung beschrieben, die einen Strahlteiler und einen Spiegel umfasst, wobei der Strahlteiler als dichroitischer Spiegel mit einer Vielzahl von spektral selektiven Bereichen mit unterschiedlichen Filtereigenschaften ausgebildet ist. Das Verschieben des Strahlteilers quer zum Lichtstrahl ermöglicht die Anpassung der spektralen Charakteristika des Hauptstrahlteilers an das Beleuchtungslicht. Aufgrund des Einfallswinkels von 45° ist die Unterdrückung des zu entfernenden spektralen Teilbereichs relativ gering.
Eine stärkere Unterdrückung ermöglicht die in US 2008/062511 A1 beschriebene Filtervorrichtung aufgrund des dort geringeren Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes beziehungsweise des Probenlichtes von weniger als 45°, insbesondere weniger als 20°, auf die Oberfläche des Hauptfarbteilers oder eines im Detektionsstrahlengang angeordneten weiteren Strahlteilers. Dabei kann der weitere Strahlteiler als variabler Verlaufsfilter ausgebildet und entlang des Verlaufs verschiebbar angeordnet sein. Zusätzlich zur Verschiebung ist aus DE 20 2008 016 287 U1 auch eine Verschwenkung des Verlaufsfilters relativ zum Lichtstrahl bekannt, um die spektrale Lage der Filterkanten zu verschieben.
Die vorgenannten variablen Filtervorrichtungen weisen jedoch den Nachteil auf, dass die Umschaltung zwischen verschiedenen zu entfernenden spektralen Teilbereichen relativ lange dauert, da jeweils mindestens ein träges mechanisches Teil bewegt (Filter im Filterrad gedreht beziehungsweise Verlaufsfilter verschoben und/oder geschwenkt) werden muss.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine optische Filtervorrichtung der eingangs genannten Art zu verbessern, um auch bei hoher spektraler Trennschärfe und starker Unterdrückung des zu entfernenden spektralen Teilbereichs eine schnelle Umschaltung zwischen verschiedenen zu entfernenden spektralen Teilbereichen zu ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine optische Filtervorrichtung, welche die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß sind zwei variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtungen vorgesehen, wobei ein auf die erste Strahlablenkvorrichtung einfallender Lichtstrahl mittels der ersten Strahlablenkvorrichtung auf unterschiedliche spektral selektive Bereiche des Filters ablenkbar ist und das Filter und die Strahlablenkvorrichtungen so angeordnet sind, dass der zum Filter abgelenkte und dort reflektierte oder transmittierte Lichtstrahl (unabhängig von der Lage dieser Bereiche) auf die zweite Strahlablenkvorrichtung trifft. Variabel einstellbar bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Strahlablenkvorrichtung hinsichtlich der Ablenkrichtung (Winkeldifferenz zwischen eingehendem und ausgehendem Lichtstrahl) einstellbar ist.
Eine derartig ausgestaltete Filtervorrichtung ermöglicht eine flexiblere, schnellere Umschaltung zwischen unterschiedlichen Filterbereichen in weniger als 100 ms, vorzugsweise sogar in weniger als 10 ms, da die Strahlablenkvorrichtungen beispielsweise im Falle der Ausgestaltung als drehbare Spiegel deutlich kleiner als das Filter und damit deutlich weniger träge sind, so dass sie schneller bewegt werden können als das Filter selbst. Dabei können herkömmliche, mit geringem Aufwand kommerziell verfügbare Verlaufsfilter und Strahlablenkvorrichtungen verwendet werden. Die zweite Strahlablenkvorrichtung dient dabei zur Kompensation des Richtungsfehlers, der dem Lichtstrahl durch die Ablenkung auf unterschiedliche spektral selektive Bereiche des Filters durch die erste Strahlablenkvorrichtung aufgeprägt wird. Das Verlaufsfilter kann dabei so ausgebildet sein, dass die Filtervorrichtung eine kontinuierliche Anpassung der spektralen Strahlteilungseigenschaften auf den gewählten zu trennendenden Wellenlängenbereich erlauben, ohne Kompromisse hinsichtlich der Unterdrückung in Filterrichtung hinnehmen zu müssen. Die Transmission eines Fluoreszenzsignals wird durch die zusätzlichen Optiken im Vergleich zu herkömmlichen, rein dichroitischen Strahlteilerlösungen nur insignifikant reduziert.
Die Erfindung kann besonders vorteilhaft bei der bildweisen Mehrfachverfolgung (engl. „multi-tracking”) mehrerer unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffsorten verwendet werden, da hier in Verbindung mit einer schnellen Wellenlängenumschaltung seitens der Anregungslichtquelle nach für jeden Bildaufnahmedurchgang eine andere Wellenlänge eingestellt und so ein anderer Farbstoff angeregt werden kann. Dadurch wird einerseits ein Übersprechen (engl. „cross-talk”) im Anregungslicht unter den Farbstoffen minimiert und andererseits der Bildkontrast optimiert, da beispielsweise Kantenfilter bei einerseits hoher Unterdrückung im nicht transmittierten Spektralbereich andererseits einen steilen Übergang, typischerweise schmaler als 2 nm, zwischen Transmissions- und Sperrbereich aufweisen. Somit werden dem Fluoreszenzlicht nur geringe Filterverluste beigefügt.
Vorzugsweise sind das Filter und die Strahlablenkvorrichtungen so angeordnet, dass der am Filter reflektierte beziehungsweise durch das Filter transmittierte Lichtstrahl (für jeden der unterschiedlichen spektral selektiven Bereiche des Filters) von der zweiten Strahlablenkvorrichtung so ablenkbar ist, dass er parallel, insbesondere koaxial, zum einfallendem Lichtstrahl verläuft. Zweckmäßigerweise kann die Filtervorrichtung eine Steuereinheit umfassen, die zur Einstellung der Strahlablenkvorrichtungen mit diesen verbunden ist und dazu eingerichtet ist, die erste Strahlablenkvorrichtung in Abhängigkeit eines vorgebbaren oder vorgegebenen Parameters einzustellen und die zweite Strahlablenkvorrichtung zu einzustellen, dass sie den an dem Filter reflektierten beziehungsweise durch das Filter transmittierten Lichtstrahl so ablenkt, dass er parallel, insbesondere koaxial, zum einfallendem Lichtstrahl verläuft.
Vorzugsweise ist die erste und/oder die zweite Strahlablenkvorrichtung ein (jeweiliger) Spiegel, insbesondere basierend auf einem mikroelektromechanischen System (MEMS), oder ein (jeweiliges) akustooptisches Element, insbesondere ein akusto-optisch einstellbarer Deflektor (AOD). Damit ist die einstellbare Strahlablenkung mit geringem Aufwand und hoher Genauigkeit möglich. Der Einsatz eines akustooptischen Elements ermöglicht durch dessen zusätzliche spektral selektive Wirkung eine stärkere Unterdrückung des zu entfernenden spektralen Teilbereichs.
Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen mindestens eine der Strahlablenkvorrichtungen (insbesondere beide Strahlablenkvorrichtungen) um zwei verschiedene Achsen drehbar sind. Dadurch kann das Licht zweidimensional über das Filter bewegt werden, so dass eine größere Zahl von Schaltstellungen möglich ist. Dadurch, dass dann über zwei Achsen synchron abgelenkt werden kann, ist die neue Schaltstellung im Mittel zudem schneller erreichbar. Insbesondere können die Drehachsen in einer Ebene liegen, vorzugsweise mit zueinander orthogonalem Verlauf. Durch den so bereitgestellten ortsfesten Drehpunkt ist die Ablenkung mit geringerem Ortsfehler möglich. Zweckmäßigerweise kann der Drehpunkt in der Oberfläche der Strahlablenkvorrichtung liegen, um den Ortsfehler zu minimieren.
Eine größere Zahl von Filterkonfigurationen kann bereitgestellt werden, wenn die Bereiche mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften zweidimensional parallel zur Oberfläche des Filters verteilt angeordnet sind. Insbesondere ist eine Kombination mit einem Antrieb zur Verschiebung des Filters quer zu einer mittels der ersten Strahlablenkvorrichtung erreichbaren Ablenkrichtung möglich, beispielsweise, wenn die erste Strahlablenkvorrichtung nur um genau eine Achse drehbar ist.
Eine vereinfachte Bauweise ist dadurch möglich, dass die zweite Strahlablenkvorrichtung durch die erste Strahlablenkvorrichtung gebildet ist. Diese Mehrfachnutzung der ersten Strahlablenkvorrichtung ermöglicht eine kompaktere Bauweise und die Verwendung weniger komplexer optischer Komponenten. Das gelingt beispielsweise durch Anordnung eines Spiegels, insbesondere gebildet durch das Filter selbst, derart, dass er von der ersten Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenktes und daraufhin am Filter reflektiertes Licht echt parallel zu dem auf das Filter abgelenkten Licht zur ersten Strahlablenkvorrichtung reflektiert, und/oder durch Anordnung eines Retroreflektors derart, dass er von der ersten Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenktes und daraufhin durch das Filter transmittiertes Licht echt parallel zu dem auf das Filter abgelenkten Licht abseits des Filters oder durch einen farbneutralen Bereich des Filters zur ersten Strahlablenkvorrichtung reflektiert. Die zweite Strahlablenkvorrichtung ist dann virtuell, indem sie aus der Perspektive des Filters als versetztes Spiegelbild der ersten Strahlablenkvorrichtung (oder deren Rückseite) bereitgestellt wird.
Vorzugsweise kann die Filtervorrichtung eine dritte variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung umfassen, die so angeordnet ist, dass diejenigen spektralen Anteile des von der ersten Strahlablenkvorrichtung her auf das Filter treffenden Lichtstrahls, die vom Filter nicht zur zweiten Strahlablenkvorrichtung gelangen, auf die dritte Strahlablenkvorrichtung treffen. Analog zur zweiten Strahlablenkvorrichtung dient die dritte Strahlablenkvorrichtung zur Kompensation von Richtungsfehlern und daraus resultierenden Ortsfehlern, die dem zum Filter abgelenkten Lichtstrahl von der ersten Strahlablenkvorrichtung aufgeprägt werden. Im Falle des Einsatzes als Hauptfarbteiler ist die zweite Strahlablenkvorrichtung beispielsweise für den zur Lichtquelle zurückgeleiteten, dem Anregungslicht entsprechenden spektralen Anteil an dem vom Objektiv kommenden Probenlicht und die dritte Strahlablenkvorrichtung für den zum Detektor geleiteten spektralen Anteil des Probenlichts verantwortlich.
Die ausgangsseitige Strahllage kann mit höherer Genauigkeit konstant bleiben, wenn optisch zwischen der ersten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine (vorzugsweise um dieselbe Achse wie die erste Strahlablenkvorrichtung) variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine Kollimationsoptik angeordnet ist und/oder optisch zwischen der zweiten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine weitere (vorzugsweise um dieselbe Achse wie die zweite Strahlablenkvorrichtung) variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine zur Kollimationsoptik invers wirkende Dekollimationsoptik angeordnet ist und/oder optisch zwischen der dritten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine weitere variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine zur Kollimationsoptik invers wirkende Dekollimationsoptik angeordnet ist. Die Hilfsstrahlablenkvorrichtung dient zur Kompensation eines dem Lichtstrahl von der ersten Strahlablenkvorrichtung aufgeprägten Ortsfehlers. Entsprechend kann mittels der anderen Hilfsstrahlablenkvorrichtung ein dem Lichtstrahl von der zweiten Strahlablenkvorrichtung aufgeprägten Ortsfehlers kompensiert werden. Durch entsprechende Kollimations- und Dekollimationsoptiken kann ein solcher Ortsfehler von vornherein vermieden werden.
Vorteilhafterweise kann die Filtervorrichtung eine Sammeloptik zum Verringern des Strahlquerschnitts auf dem Filter umfassen. Dadurch können die spektral unterschiedlich selektiven Bereiche kleiner gestaltet werden, so dass die Filtergröße verringert oder bei gleicher Filtergröße eine größere Anzahl von Filterkonfigurationen bereitgestellt werden kann. Zudem verringert sich der Flächeninhalt, über den bei Verlaufsfiltern die Filterfunktion integriert wird. Dementsprechend erhöht sich die Trennschärfe der Anordnung bei Verwendung von Verlaufsfiltern. Dabei kann auf der entgegengesetzten Seite des Filters eine Optik zum Rückgängigmachen der fokussierenden Wirkung der Sammeloptik angeordnet sein. So kann eingangs- und ausgangsseitig der Filtervorrichtung eine identische Strahlgeometrie erreicht werden.
Die zuvor beschriebene Filtervorrichtung kann vorteilhafterweise in einem Mikroskop, insbesondere zur Detektion von Lumineszenz, eingesetzt werden, vorzugsweise als Hauptfarbteiler zur optischen Kopplung eines Beleuchtungsstrahlengangs, der eine Lichtquelle umfasst, und eines Detektionsstrahlengang, der einen optoelektronischen Detektor umfasst, wobei der vom Filter her auf die zweite Strahlablenkvorrichtung treffende Lichtstrahl mittels der zweiten Strahlablenkvorrichtung in ein Objektiv des Mikroskops, insbesondere durch eine Pupille des Objektivs, ablenkbar ist, oder als Anregungsfilter im Beleuchtungsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Detektionsstrahlenganges, oder als Nebenfarbteiler im Detektionsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges, oder als Emissionsfilter im Detektionsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges.
Vorteilhaft ist eine Ausführungsform des Mikroskops, in welcher das Filter in oder zumindest näherungsweise in einem Zwischenbild angeordnet sein, um eine erhöhte Trennschärfe bereitzustellen. Die Strahlablenkvorrichtungen sind dann vorzugsweise in oder zumindest näherungsweise in (zur Pupillenebene des Objektivs) konjugierten Pupillenebenen angeordnet. Alternativ kann es vorteilhaft sein, wenn das Filter in oder zumindest näherungsweise in einer konjugierten Pupilleebene und die (reflektierenden Oberflächen der) Strahlablenkvorrichtungen in Zwischenbildebenen angeordnet sind. Zwar ist die Trennschärfe in dieser Alternative geringer, die Aufpunkte sind aber konstant und Defekte somit korrigierbar.
Ein solches Mikroskop kann vorzugsweise einen durchstimmbaren Laser, der (unmittelbar oder mittelbar) auf die erste Strahlablenkvorrichtung der Filtervorrichtung (die als Hauptfarbteiler eingesetzt ist) gerichtet ist, umfassen. Dadurch werden unterschiedliche Messungen innerhalb einer großen spektralen Bandbreite mit kurzen Umschaltzeiten ermöglicht. Der Filter kann dabei als Kerbfilter (mit unterschiedlicher spektraler Lage der Kerbe in den verschiedenen spektral selektive Bereichen des Filters) ausgebildet sein. Das gilt auch für Multilinien-Laser und spektral breitbandig (nicht durchstimmbare) emittierende Laser.
Im Sinne der Erfinder liegt ein durchstimmbarer Laser dann vor, wenn durch ein internes Mittel des Lasers oder ein externes Mittel, beispielsweise einen spektral selektiven Modulator, ein Wellenlängenbereich exklusiv ausgewählt werden kann.
Zusätzlich kann das Mikroskop einen (statischen) Farbteiler und mindestens einen weiteren Laser umfassen, der (unmittelbar oder mittelbar) auf den diesen Farbteiler gerichtet ist, wobei der weitere Farbteiler so angeordnet ist, dass er Licht von dem weiteren Laser zur zweiten Strahlablenkvorrichtung reflektiert. Auf diese Weise kann Anregungslicht verschiedener Wellenlängen simultan eingesetzt werden. Dies ist beispielsweise bei der Lebendzellbildgebung besonders vorteilhaft, wenn schnell ablaufende Prozesse untersucht werden sollen, die beispielsweise bereits innerhalb einer Bildaufnahmedauer Änderungen verursachen, so dass die Bildinformationen zweier Multiverfolgungsaufnahmen einander nicht mehr überdecken. Des weiteren können zwei verschiedene, hocheffizient gefilterte und schnell umschaltbare Wellenlängen zur simultanen Anregung in speziellen mikroskopischen Verfahren wie „Stimulated Emission Depletion” (STED) oder auch „Coherent anti-Stokes-Raman Scattering” (CARS) bereitgestellt werden.
Alternativ oder zusätzlich kann das Mikroskop, wenn die erste und die zweite Strahlablenkvorrichtung in einem von der Oberfläche des Filters definierten ersten Halbraum angeordnet sind, eine zusätzliche variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung, die in einem (von dem ersten Halbraum verschiedenen) zweiten Halbraum angeordnet ist, einen weiteren durchstimmbaren Laser, der (unmittelbar oder mittelbar) auf die zusätzliche Strahlablenkvorrichtung gerichtet ist, oder einen Farbteiler, der einen spektralen Teilbereich des ersten durchstimmbaren Lasers separiert und (unmittelbar oder mittelbar) auf die zusätzliche Strahlablenkvorrichtung lenkt, und einen Spiegel, der einen von der zusätzlichen Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenkten und dort reflektierten Lichtstrahl in seiner Richtung umkehrt und durch das Filter auf die zweite Strahlablenkvorrichtung reflektiert, umfassen. Auch diese Ausführungsform ermöglicht die simultane Bereitstellung von zwei unterschiedlichen, schnell umschaltbaren Anregungswellenlängen bei hocheffizienter Filterung. Bei Kombination mit einem Farbteiler wie im voranstehenden Absatz können auch drei unterschiedliche Anregungswellenlängen simultan bereitgestellt werden.
Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen das Mikroskop als Lichtrastermikroskop mindestens eine weitere Strahlablenkvorrichtung zum Rastern des Lichtstrahls durch ein Sehfeld eines Objektivs des Lichtrastermikroskops umfasst, insbesondere mit Anordnung der weiteren Strahlablenkvorrichtung zwischen der Filtervorrichtung und dem Objektiv, insbesondere in einem gemeinsamen Abschnitt von Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, und/oder mit einer konfokalen Blende im Beleuchtungsstrahlengang und/oder mit einer konfokalen Blende im Detektionsstrahlengang. Der Lichtstrahl kann dabei im probenseitigen Fokus eine beliebige Querschnittsform, beispielsweise punktförmig oder linienförmig, aufweisen. Lichtrastermikroskope ermöglichen neben spektraler Bildgebung mit optischem Schneiden eine Vielzahl von korrelativen und manipulativen Untersuchungsmethoden, die beispielsweise bei Weitfeldmikroskopen nur begrenzt möglich sind. Zudem ist die Manipulation von Anregungs- und Detektionslicht im Lichtrastermikroskop deutlich einfacher möglich, weil in der Regel kein Bildfeld übertragen wird und sich diese Maßnahmen auf Strahlmanipulationen beschränken können.
Vorteilhaft ist es zudem, wenn das Mikroskop Mittel zum Erzeugen mehrerer disjunkter (fokussierter) Beleuchtungsflecken im Fokus des Objektivs, die mittels der weiteren Strahlablenkvorrichtung simultan durch das Sehfeld rasterbar sind, umfasst. Mittels einer solchen Mehrfleckabtastung (engl. „multi-spot scanning”) kann die Aufnahme beschleunigt oder die Belastung der Probe reduziert werden. Die Beleuchtungsflecken können beliebige (vorzugsweise identische) Formen, beispielsweise (quasi-)punktförmig oder linienförmig, und beliebige (vorzugsweise regelmäßige) relative Anordnungen zueinander, beispielsweise matrixförmig, aufweisen.
Das Verlaufsfilter kann als spektraler Langpass, Kurzpass, Bandpass, Bandsperre, Multi-Bandpass, Multi-Bandsperre oder als Kerbfilter ausgebildet sein. Diese Eigenschaften können in Transmission oder Reflexion vorliegen. Das Filter kann insbesondere mindestens einen Filterbereich aufweisen, der farbneutral und/oder polarisationsselektiv ist.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Betrieb eines Mikroskops, insbesondere wie oben beschrieben, mit einer Filtervorrichtung wie oben beschrieben und einem durchstimmbaren Laser, wobei eine Einstellung des durchstimmbaren Lasers und eine Einstellung der Strahlablenkvorrichtungen der Filtervorrichtung mittels einer Steuereinheit synchron, insbesondere simultan, durchgeführt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:
1 ein Lichtrastermikroskop mit einer ersten optischen Filtervorrichtung als flexiblem Hauptfarbteiler und einem einzelnen multispektralen Laser,
2 ein Lichtrastermikroskop mit einer zweiten optischen Filtervorrichtung als flexiblem Hauptfarbteiler und einem einzelnen multispektralen Laser,
3 ein Lichtrastermikroskop mit der zweiten optischen Filtervorrichtung als flexiblem Hauptfarbteiler und einem weiteren, statischen Hauptfarbteiler sowie einem durchstimmbaren Laser und mehreren statischen Lasern,
4 ein Lichtrastermikroskop mit einer dritten optischen Filtervorrichtung als flexiblem Hauptfarbteiler und zwei durchstimmbaren Lasern,
5 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente,
6 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente,
7 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente,
8 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente und
9 einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen eines weiteren Lichtrastermikroskops einschließlich abbildender Elemente.
In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.
1 zeigt in höchst schematischer Darstellung eine optische Filtervorrichtung 1 in einem Mikroskop 2 als Hauptfarbteiler HFT zur optischen Kopplung des Beleuchtungsstrahlengangs B, der einen durchstimmbaren Laser als Lichtquelle 3 umfasst, mit einem Detektionsstrahlengang D, der einen Detektor 4 umfasst. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind dabei keine abbildenden Elemente wie Linsen dargestellt. Die Filtervorrichtung 1 umfasst hier ein dichroitisches Verlaufsfilter 5 mit einer Vielzahl von spektral selektiven Bereichen mit beispielsweise unterschiedlichen Kurzpassfiltern, eine erste variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung 6 in Form eines Galvanometerspiegels und eine zweite variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung 7 in Form eines Galvanometerspiegels sowie nicht abgebildete Antriebe für die Strahlablenkvorrichtungen. Im Detektionsstrahlengang D sind außerdem eine konfokale Blende 8 und beispielsweise ein optionales Emissionsfilter 9 zur spektralen oder polarisationsoptischen Filterung angeordnet.
In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) können die Ablenkvorrichtungen 6 und 7 jeweils beispielsweise als einzelne MEMS-Spiegel oder als AOD ausgebildet sein. Im Falle eines MEMS-Spiegels lässt sich dieser vorzugsweise über zwei in derselben Ebene liegende, orthogonale Achsen kippen. Um die Möglichkeiten von 2-achsig kippbaren Ablenkvorrichtungen 6/7 auszunutzen, können die spektral unterschiedlich selektiven Bereiche des Verlaufsfilters 5 in mehreren Spalten und Zeilen angeordnet sein. Mit der einen Scan-Richtung wird die Spalte gewählt, mit der anderen die Zeile. Dadurch ist es möglich, die spektrale Auflösung zu erhöhen und/oder unterschiedliche spektrale Eigenschaften in mehreren „Etagen” auf einem Filtersubstrat unterzubringen. Im Falle eines AOD ist anstelle eines Antriebs eine Treiberschaltung vorzusehen. In diesem Fall kann die hohe Geschwindigkeit akusto-optischer Scanner bei gleichzeitiger verbesserter Unterdrückung durch Filter vorteilhaft eingesetzt werden.
Das Verlaufsfilter 5 kann grundsätzlich alle von Interferenzfiltern bekannten spektralen Eigenschaften aufweisen. Anstelle eines Kurzpasses (KP) kann es als Langpass (LP), Bandpass (BP), Bandsperre (BS, bei sehr schmalen BS auch Kerbfilter genannt), Multi-Bandpass (MBP) und Multibandsperre (MBS) ausgelegt sein.
Das Emissionsfilter 9 kann beispielsweise als motorisiert verschiebbares Verlaufsfilter oder als wählbares Filter in einem motorisierten Filterrad ausgebildet sein. Insbesondere kann es auch als Multi-Bandpass ausgelegt sein, der spektral auf N Stellungen des Strahlablenkvorrichtungs-Paares 6 und 7 abgestimmt ist. Alternativ kann Filter 9 in Kombination mit Detektor 4 auch als spektral auflösende Vorrichtung ausgeführt sein.
Der Laserstrahl, der zur Lumineszenzanregung in der Probe P dient, trifft zunächst auf den ersten Scan-Spiegel 6, welcher dazu in der Lage ist, die Schwerpunktrichtung des Laserstrahls nach der Reflexion innerhalb von wenigen Millisekunden gezielt zu verändern. Er dient dazu, den Laserstrahl gezielt an einer beliebigen Stelle eines Verlaufsfilters 5 auftreffen zu lassen. Der Verlaufsfilter 5 zeichnet sich dadurch aus, dass seine spektral selektive Eigenschaft räumlich variiert, was beispielsweise durch optische Interferenzschichten, deren Dicke sich kontinuierlich oder in kleinen Schritten ändert, erreicht wird. Idealer Weise verschieben sich bei Variation des Auftreffortes der zu filternden Strahlung nur die spektralen Filterkanten proportional oder zumindest monoton zum Ort. Das hier beispielhaft eingesetzte Verlaufsfilter 5 weist die von Interferenzfiltern bekannte Eigenschaft auf, dass die nicht transmittierte Strahlung nahezu vollständig reflektiert wird, so dass Absorption vernachlässigt werden kann.
Der Auftreffort des Laserstrahls auf dem Filter 5 wird mit Hilfe von Scanner 6 so eingestellt, dass die Laserstrahlwellenlänge knapp vor der spektralen Kante des Kurzpasses liegt, so dass der Laserstrahl weitgehend durch das Filter 5 transmittiert wird. Nachfolgend trifft der Laserstrahl auf den zweiten Scanner 7, welcher beispielsweise baugleich zu Scanner 6 ist. Scanner 7 dient dazu, die von Scanner 6 verursachte Richtungsänderung zu kompensieren, so dass der Laserstrahl nach der Reflexion an Scanner 7 stets die gleiche Ausbreitungsrichtung aufweist. Das Mikroskop 2 ist zur Ausbildung als Lichtrastermikroskop („LSM”) mit einer zusätzlichen variabel einstellbaren Strahlablenkvorrichtung 10 ausgerüstet, mittels derer der Anregungsfleck beispielsweise in zwei Dimensionen über die Probe P rasterbar ist. Danach wird der Laserstrahl zur Probe P geleitet.
Die von der Probe abgegebene Lumineszenzstrahlung, weist in der Regel eine größere Wellenlänge als die Laserstrahlung auf. Daher wird die Lumineszenzstrahlung nach der Umlenkung am LSM-Scanner 10 und am Scanner 7 vom Verlaufsfilter 5 reflektiert. Die konfokale Blende 8 dient zur Unterdrückung von außerfokaler Strahlung. Sie besteht beispielsweise aus einer Lochblende, kann aber (nicht abgebildet) auch aus einem Schlitz, einer Lochmatrix, einer Gitterblende oder einer noch komplexeren Transmissionsstruktur bestehen.
Hinter der Konfokalblende 8 trifft die Lumineszenzstrahlung auf den photoempfindlichen Detektor 4, der beispielsweise als Photovervielfacher (engl. „photomultiplier”; PMT) ausgebildet ist. In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann es sich um eine Photodiode (PD), eine Avalanche-Photodiode (APD) oder eine Kamera handeln.
Die Funktion von Scanner 7 kann alternativ (nicht abgebildet) auch dadurch erreicht werden, dass der Laserstrahl ein weiteres Mal über Scanner 6 geleitet wird, wobei die Vorder- oder Rückseite von Scanner 6 verwendet werden kann. Dadurch kann ein Scanner eingespart werden, wobei sich aber im Gegenzug die Komplexität des optischen Aufbaus erhöhen kann.
In 2 ist wiederum in höchst schematischer Darstellung eine Ausführungsform abgebildet, bei der ein LP-Verlaufsfilter 5 (statt KP wie in 1) eingesetzt wird. Wiederum lenkt der erste Scanner 6 den vom Laser 3 kommenden Laserstrahl zunächst auf das Verlaufsfilter 5. Der Auftreffort des Laserstrahls wird mittels Scanner 6 so gewählt, dass die Laserstrahlwellenlänge knapp unterhalb der spektralen Kante des LP-Verlaufsfilters 5 liegt. Daher wird der Laserstrahl daran reflektiert und über den zweiten Scanner 7 über den zusätzlichen Scanner 10 zur Probe P geleitet. Im Gegensatz zu 1 wird hier die Lumineszenzstrahlung am Verlaufsfilter 5 transmittiert, bevor sie zum Detektor 4 gelangt. Im übrigen stimmen Aufbau und Funktionsweise mit 1 überein. Die abgebildete Ausführungsform weist den Vorteil auf, dass von der Probe P oder von optischen Elementen, beispielsweise Objektivlinsen (nicht abgebildet) reflektiertes oder gestreutes Anregungslicht mit hoher Effizienz vom Verlaufsfilter 5 abgefangen wird und somit nicht zum Detektor 4 gelangt.
3 zeigt – ebenfalls in höchst schematischer Darstellung – eine Ausführungsform wie 2, in der jedoch Anregungslaser verschiedener Wellenlängen, hier ein durchstimmbarer Laser 3 und mehrere statische Laser 3A, 3B bis 3N (N = C, D, E, ...), beliebig miteinander simultan kombiniert werden können. In diesen Fällen weisen die spektral selektiven Bereiche des Filters 5 anstelle von Langpass- oder Kurzpassfiltern spektral verschiedene Kerbfilter auf, wobei die spektrale Lage des Sperrbereiches mit der Position auf dem Filter 5 variiert. Der durchstimmbare Laser 3 wird dazu mittels erstem Scanner 6 auf diejenige Position auf dem Filter 5 gelenkt, an der dieser eine hohe Reflektivität für die am Laser 3 eingestellte Lichtwellenlänge aufweist. Somit wird Licht des durchstimmbaren Lasers 3 in Richtung Probe P zur Fluoreszenzanregung abgelenkt, wobei Scanner 7 wiederum der Auslenkung von Scanner 6 entgegenwirkt. Da aufgrund des schmalbandigen Sperrbereiches des ausgewählten Kerbfilters Licht größerer und geringerer Wellenlängen durch das Filter 5 transmittiert wird, kann gemäß dem Stand der Technik ein herkömmlicher Dichroit als weiterer Strahlteiler 11 die Laser 3A, 3B, 3N fester Wellenlänge auf den Beleuchtungsstrahlengang B auffädeln. Dies ist insbesondere für Manipulationsexperimente wie FRAP oder Freisetzung (engl. „uncaging”) von Vorteil, da Laser mit fester Wellenlänge im sichtbaren Teil des Spektrums in der Regel eine größere spektrale Leistungsdichte aufweisen. Dabei kann der weitere Strahlteiler 11 in einem Teilerrad (nicht abgebildet) angeordnet oder als verschiebbarer Verlaufsfilter oder als weitere Filtervorrichtung 1 ausgebildet sein.
Eine weitere Ausführungsform ist in 4 auf höchst schematische Weise dargestellt. Teilfigur 4B illustriert am Rand höchst schematisch die in Teilfigur 4A nicht erkennbare räumliche Dimension der Strahlengänge. Hierin werden zwei unabhängig voneinander durchstimmbare Laser 3, 12 auf den Beleuchtungsstrahlengang B aufgefädelt. Zu diesem Zweck weist die Filtervorrichtung 1 eine zusätzliche Strahlablenkvorrichtung 13 und eine weitere zweckmäßigerweise einstellbare Strahlablenkvorrichtung M auf. Mittels der Scanner 6 und 13 werden die beiden resultierenden Strahlen auf die den eingestellten Wellenlängen entsprechenden spektral selektiven Bereiche auf dem Filter 5 abgelenkt. Der Scanner 7 kompensiert die Auslenkung durch die Scanner 6 und 13 und lenkt das Beleuchtungslicht in Richtung zusätzlicher Scanner 10 ab. Die von der Probe P emittierte Fluoreszenz durchläuft auf dem entgegengesetzten Weg zweimal in verschiedenen spektral selektiven Bereichen das Filter 5 und wird danach der Detektionsanordnung 4 zugeführt, ohne noch einmal am Scanner 7 reflektiert zu werden, wobei das Filter 5 zum Auffädeln der von der gewählten Emissionswellenlänge des durchstimmbaren Lasers 3 verschiedenen Emissionswellenlänge des durchstimmbaren Lasers 12 durch Scanner 13 in zwei verschiedenen Ebenen genutzt wird. Deswegen sind zumindest Scanner 7 und Scanner 13 zur Strahlablenkung in zwei Dimensionen ausgebildet.
In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann der Laser mindestens zwei relevante, unabhängig voneinander einstellbare Wellenlängen emittieren, die mittels eines dichroitischen Strahlteilers voneinander separiert werden.
Durch Einsatz von Abbildungsoptiken und Faltung der Strahlengänge mittels Planspiegeln und Retroreflektoren (nicht dargestellt) lassen sich die Anzahl der notwendigen Scanner in 1 bis 3 auf eins und in 4 auf zwei reduzieren. Zudem läßt sich durch eine Fokussierung der Lichtstrahlen auf den Verlaufsfilter die spektrale Auflösung der Anordnung erhöhen und die Größe des Filtersubstrates reduzieren.
5 zeigt einen Ausschnitt aus den Strahlenverläufen in einem Mikroskop 2 mit einer Filtervorrichtung 1 im Detail. Es handelt sich um ein Mikroskop wie in 2 gezeigt, jedoch mit einer dritten variablen Strahlablenkvorrichtung 20 ausgestattet, um die durch den Scanner 7 verursachten Richtungsfehler im Detektionsstrahlengang D zu kompensieren. Die Scanner 6, 7 und 20 befinden sich in zueinander optisch konjugierten Ebenen. Der Scanner 7 wird beispielsweise mittels einer Linse 14 sowohl auf Scanner 6 als auch auf Scanner 20 abgebildet. Eine Fokussierung des Laserstrahls mittels einer beispielhaften Linse 15 vor dem Scanner 6 reduziert die Genauigkeitsanforderung auf dem Scanner 6 und hat den Vorteil, dass das konfokale Pinhole 8 ohne Zusatzoptik im „descannten” Strahl hinter Scanner 20 angeordnet sein kann. Ein Nachteil ist hier, dass das Verlaufsfilter 5 für verschiedene Anregungswellenlängen unter unterschiedlichen Winkeln benutzt wird. Das bedingt im konvergenten Strahl einen spektral variierenden Astigmatismus. Um dies zu reduzieren, sind kleine Einfallswinkel am Verlaufsfilter 5 und eine geringe numerische Apertur der Fokussierung auf das Pinhole 8 vorteilhaft. Die Linse 21 kollimiert die durch die Anordnung propagierte Anregungsstrahlung, um die optische Schnittstelle 10 zur Anordnung der Strahlablenkvorrichtungen des Lichtrastermikroskops 2 bereitzustellen.
In 6 ist eine 5 entsprechende Ausführungsform dargestellt, die jedoch mit Kollimationsoptiken 16, 17 und einer Dekollimationsoptik 18 ausgestattet ist, so dass jedes am Filter 5 auftreffende Lichtbündel kollimiert ist. Dadurch wird ein in 5 auftretender Astigmatismus vermieden.
7 zeigt beispielhaft, wie durch Faltung des Beleuchtungsstrahlenganges B die Anzahl der notwendigen Strahlablenkvorrichtungen reduziert werden kann. Scanner 6 stellt hier durch die Spiegelung am Filter 5 auch die Funktion der zweiten Strahlablenkvorrichtung (Scanner 7 in 6) bereit. Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang können wie abgebildet über den Strahlwinkel oder alternativ (nicht abgebildet) über den Strahlort in einer fourierinversen Ebene getrennt werden.
In 8 ist dargestellt wie auf die dritte Strahlablenkvorrichtung (Scanner 20 in 6 und 7) verzichtet werden kann. Zu diesem Zweck wird der Scanner 6 direkt auf die konfokale Blende 8 abgebildet und ein zweidimensional ortsauflösender Detektor 4 eingesetzt. Mit einem 2D-Sensor 4 hinter der Blende 8 und können ohne dispersive Elemente verschiedene Elemente des Sensors ohne eine Ablenkungskompensation ausgelesen werden.
In einer erweiterten Ausführungsform kann eine spektral aufgelöste Detektion ohne „Descanning” des Detektionsstrahlenganges D realisiert werden, wenn Scanner 6 lediglich eine eindimensionale Abtastung durchführt und ein dispersives Element (nicht abgebildet) mit einer Dispersionsrichtung quer zu dieser Abtastrichtung vor dem Detektor 4 angeordnet ist. Die nutzbare Apertur des dispergierenden Elementes muss ausreichend groß sein, um die betreffenden Ablenkungsrichtungen des Scanners 6 aufnehmen zu können. Die resultierende dispergierte Abbildung ruht dann in der Sensorebene des Detektors 4. Für monofokale Bildgebung ist dann ein lineares Sensorarray als Detektor 4 ausreichend. Multifokale Bildgebung erfordert einen 2D-Sensor als Detektor 4. Der Vorteil einer solchen Anordnung ist die geringe Anzahl von Optiken und dadurch eine Erhöhung der Detektionsempfindlichkeit gegenüber dem Fluoreszenzsignal.
Schließlich zeigt 9 eine Ausführungsform mit Faltung wie in 7, in der ein Filter 5 mit einer hohen Dichte von spektral unterschiedlich selektiven Bereichen eingesetzt werden kann. Zu diesem Zweck sind Optiken 19 vorgesehen, welche den Querschnitt von auf das Filter 5 treffenden Lichtstrahlen verringern, indem sie diese auf das Filter 5 fokussieren beziehungsweise fokussierte Lichtstrahlen auf die Blende 8 abbilden. Der erste Scanner 6 wird dabei auf den dritten Scanner 20 abgebildet. Diese Ausführungsform kann auch ohne Faltung (nicht abgebildet) realisiert werden.
Mit den oben beschriebenen Filtervorrichtungen als Hauptfarbteiler sind Verfahren wie schnelle Mehrfachverfolgung mit einem schnell umschaltbaren durchstimmbaren Laser möglich, wie zum Beispiel beschrieben in „High power ultra-widely tuneable femtosecond pulses from a non-collinear optical parametric oscillator (NOPO)" von Lang et al. in Optics Express 20 (2012), S. 912, wobei eine saubere Trennung der Fluoreszenzsignale erfolgen kann und spektrales Übersprechen deutlich vermindert wird. Hierzu wird in einem entsprechenden Bildaufnahmeverfahren der Laser und der Hauptfarbteiler simultan angesteuert. Dabei ist beispielsweise eine Steuerung des Lasers durch den Hauptfarbteiler beziehungsweise dessen Steuereinheit und umgekehrt möglich. Durch die hohen erreichbaren Umschaltgeschwindigkeiten kann ein zeilenweises Multitracking erfolgen. Dies ist insbesondere bei dynamischen Proben wichtig, da in der Zeit zwischen zwei vollen Bildern (engl. „frames”) möglicherweise Veränderungen der Probe stattgefunden haben, die sonst in den aufgenommenen Bildern falsch interpretiert werden, beispielsweise im Rahmen einer Co-Lokalisationsanalyse.
Zudem kann der volle spektrale Bereich eines durchstimmbaren Lasers mit einer hohen spektralen Auflösung und damit einer nahezu kontinuierlichen Anpassung des spektralen Teilungsverhaltens genutzt werden. Das erlaubt zum Beispiel eine Feinabstimmung auf die bestmögliche spektrale Anregungs-/Emissionsposition für einen gegebenen Farbstoff. Dieses Maximum, welches nicht unbedingt im Anregungsmaximum des Farbstoffes liegen muss, kann aufgrund der hohen Schaltgeschwindigkeit der Erfindung adaptiv beispielsweise mittels eines Rückkopplungsalgorithmus ermittelt werden. Hierzu wird an einer Stelle der Probe, welche die gesuchten Farbstoffe enthält, die Anregungswellenlänge in Kombination mit der zur Filterung genutzten Stelle auf dem Verlaufsfilter auf ein Maximum optimiert.
Bezugszeichenliste

1: Filtervorrichtung
2: Mikroskop
3: Lichtquelle
4: Detektor
5: Filter
6: Erste variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung
7: Zweite variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung
8: Konfokale Blende
9: Emissionsfilter
10: Weitere Strahlablenkvorrichtung
11: Weiterer Strahlteiler
12: Durchstimmbarer Laser
13: Zusätzliche Strahlablenkvorrichtung
14: Linse
15: Linse
16: Kollimationsoptik
17: (De-)Kollimationsoptik
18: Dekollimationsoptik
19: Sammeloptik
20: Dritte variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung
21: Linse
C: Steuereinheit
B: Beleuchtungsstrahlengang
D: Detektionsstrahlengang
HFT: Hauptfarbteiler
M: Spiegel/Strahlablenkvorrichtung
P: Probe

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 6167173 [0004, 0005]
US 2008/0062511 A1 [0005]
US 2010/188741 A1 [0008]
US 2002/0097485 A1 [0009]
US 2008/062511 A1 [0010]
DE 202008016287 U1 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„High power ultra-widely tuneable femtosecond pulses from a non-collinear optical parametric oscillator (NOPO)” von Lang et al. in Optics Express 20 (2012), S. 912 [0068]

Claims

Optische Filtervorrichtung (1), die ein Filter (5), insbesondere mit dichroitischen Schichten, umfasst, das parallel zu einer seiner Oberflächen angeordnete Bereiche mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften aufweist, insbesondere für Mikroskope (2), gekennzeichnet durch zwei variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtungen (6, 7), wobei ein auf die erste Strahlablenkvorrichtung (6) einfallender Lichtstrahl mittels der ersten Strahlablenkvorrichtung (6) auf unterschiedliche Bereiche des Filters (5) ablenkbar ist und das Filter (5) und die Strahlablenkvorrichtungen (6) so angeordnet sind, dass der zum Filter (5) abgelenkte und dort reflektierte oder transmittierte Lichtstrahl auf die zweite Strahlablenkvorrichtung (7) trifft.
Filtervorrichtung (1) nach Anspruch 1, wobei das Filter und die Strahlablenkvorrichtungen so angeordnet sind, dass der am Filter reflektierte beziehungsweise durch das Filter transmittierte Lichtstrahl von der zweiten Strahlablenkvorrichtung so ablenkbar ist, dass er parallel, insbesondere koaxial, zum einfallendem Lichtstrahl verläuft.
Filtervorrichtung (1) nach Anspruch 2, umfassend eine Steuereinheit (C), die zur Einstellung der Strahlablenkvorrichtungen mit diesen verbunden ist und dazu eingerichtet ist, die erste Strahlablenkvorrichtung in Abhängigkeit eines vorgebbaren oder vorgegebenen Parameters die erste Strahlablenkvorrichtung einzustellen und die zweite Strahlablenkvorrichtung zu einzustellen, dass sie den an dem Filter reflektierten beziehungsweise durch das Filter transmittierten Lichtstrahl so ablenkt, dass er parallel, insbesondere koaxial, zum einfallendem Lichtstrahl verläuft.
Filtervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste und/oder die zweite Strahlablenkvorrichtung ein Spiegel, insbesondere basierend auf einem mikroelektromechanischen System, oder ein akustooptisches Element, insbesondere ein akusto-optisch einstellbarer Deflektor, ist.
Filtervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eine, insbesondere beide, der Strahlablenkvorrichtungen um zwei verschiedene Achsen drehbar sind, insbesondere mit einer Lage dieser Achsen in einer Ebene, insbesondere mit zueinander orthogonalem Verlauf der Achsen.
Filtervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bereiche mit unterschiedlichen spektralen Filtereigenschaften zweidimensional parallel zur Oberfläche des Filters verteilt angeordnet sind.
Filtervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite Strahlablenkvorrichtung durch die erste Strahlablenkvorrichtung gebildet ist, insbesondere mit Anordnung eines Spiegels, insbesondere gebildet durch das Filter selbst, derart, dass er von der ersten Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenktes und daraufhin am Filter reflektiertes Licht echt parallel zu dem auf das Filter abgelenkten Licht zur ersten Strahlablenkvorrichtung reflektiert, und/oder mit Anordnung eines Retroreflektors derart, dass er von der ersten Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenktes und daraufhin durch das Filter transmittiertes Licht echt parallel zu dem auf das Filter abgelenkten Licht abseits des Filters oder durch einen farbneutralen Bereich des Filters zur ersten Strahlablenkvorrichtung reflektiert.
Filtervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine dritte variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung, die so angeordnet ist, dass diejenigen spektralen Anteile des von der ersten Strahlablenkvorrichtung her auf das Filter treffenden Lichtstrahls, die vom Filter nicht zur zweiten Strahlablenkvorrichtung gelangen, auf die dritte Strahlablenkvorrichtung treffen.
Filtervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei optisch zwischen der ersten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine Kollimationsoptik angeordnet ist und/oder optisch zwischen der zweiten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine weitere variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine zur Kollimationsoptik invers wirkende Dekollimationsoptik angeordnet ist und/oder optisch zwischen der dritten Strahlablenkvorrichtung und dem Filter eine weitere variabel einstellbare Hilfsstrahlablenkvorrichtung oder eine zur Kollimationsoptik invers wirkende Dekollimationsoptik angeordnet ist.
Filtervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine Sammeloptik zum Verringern des Strahlquerschnitts auf dem Filter, insbesondere umfassend eine auf der entgegengesetzten Seite des Filters angeordnete Optik, zum Rückgängigmachen der fokussierenden Wirkung der Sammeloptik.
Mikroskop mit einer optischen Filtervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere als – Hauptfarbteiler zur optischen Kopplung eines Beleuchtungsstrahlengangs, der eine Lichtquelle umfasst, und eines Detektionsstrahlengang, der einen optoelektronischen Detektor umfasst, wobei der vom Filter her auf die zweite Strahlablenkvorrichtung treffende Lichtstrahl mittels der zweiten Strahlablenkvorrichtung in ein Objektiv des Mikroskops, insbesondere durch eine Pupille des Objektivs, ablenkbar ist, – Anregungsfilter im Beleuchtungsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Detektionsstrahlenganges, – Nebenfarbteiler im Detektionsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges, oder – Emissionsfilter im Detektionsstrahlengang, insbesondere außerhalb des Beleuchtungsstrahlenganges.
Mikroskop nach Anspruch 11, umfassend einen durchstimmbaren Laser (3), der unmittelbar oder mittelbar auf die erste Strahlablenkvorrichtung der Filtervorrichtung gerichtet ist, insbesondere mit Ausbildung des Filters als Kerbfilter.
Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, umfassend einen Farbteiler (11) und mindestens einen weiteren Laser (3A...3N), der auf den diesen Farbteiler (11) gerichtet ist, wobei der Farbteiler (11) so angeordnet ist, dass er Licht von dem weiteren Laser (3A...3N) zur zweiten Strahlablenkvorrichtung (7) reflektiert.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die erste und die zweite Strahlablenkvorrichtung in einem von der Oberfläche des Filters definierten ersten Halbraum angeordnet sind, umfassend – eine zusätzliche variabel einstellbare Strahlablenkvorrichtung (20), die in einem zweiten Halbraum angeordnet ist, – einen weiteren durchstimmbaren Laser, der unmittelbar oder mittelbar auf die zusätzliche Strahlablenkvorrichtung (20) gerichtet ist, oder einen Farbteiler, der einen spektralen Teilbereich des ersten durchstimmbaren Lasers separiert und unmittelbar oder mittelbar auf die zusätzliche Strahlablenkvorrichtung lenkt, und – einen Spiegel, der einen von der zusätzlichen Strahlablenkvorrichtung auf das Filter abgelenkten und dort reflektierten Lichtstrahl in seiner Richtung umkehrt und durch das Filter auf die zweite Strahlablenkvorrichtung reflektiert.
Lichtrastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 14, umfassend mindestens eine weitere Strahlablenkvorrichtung (10) zum Rastern des Lichtstrahls durch ein Sehfeld eines Objektivs des Lichtrastermikroskops, insbesondere mit Anordnung der weiteren Strahlablenkvorrichtung zwischen der Filtervorrichtung und dem Objektiv, insbesondere in einem gemeinsamen Abschnitt von Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang, und/oder mit einer konfokalen Blende im Beleuchtungsstrahlengang und/oder mit einer konfokalen Blende im Detektionsstrahlengang.
Lichtrastermikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, umfassend Mittel zum Erzeugen mehrerer disjunkter Beleuchtungsflecken im Fokus des Objektivs, die mittels der weiteren Strahlablenkvorrichtung simultan durch das Sehfeld rasterbar sind.
Verfahren zum Betrieb eines Mikroskops (2), insbesondere nach einem der Ansprüche 11 bis 16, mit einer Filtervorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einem durchstimmbaren Laser (3), wobei eine Einstellung des durchstimmbaren Lasers (3) und eine Einstellung der Strahlablenkvorrichtungen (6, 7) der Filtervorrichtung (1) mittels einer Steuereinheit (C) synchron, insbesondere simultan, durchgeführt werden.