DE102014003145A1

DE102014003145A1 - Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen

Info

Publication number: DE102014003145A1
Application number: DE102014003145.4A
Authority: DE
Inventors: Thorsten Kues; Ralf Steinmeyer
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2015-09-10
Also published as: US20150253562A1; US9891423B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen, wobei verschiede Aufnahmen von einer zu betrachtenden Probe aufgenommen und zum Zwecke der Veränderung der Einstellwerte der optischen Anordnung ausgewertet werden. Erfindungsgemäß sind die Korrekturwerte in einer Korrekturmatrix in Abhängigkeit von der Aufnahmeposition, der Aufnahmezeit, der Wellenlänge und der Temperatur gespeichert, wobei die Bestimmung und Speicherung der Korrekturwerte in jeder Aufnahmeposition in den Koordinaten x, y und z durchgeführt wird und/oder die Korrekturwerte nach einer Auswahl von Stützstellen durch Interpolation ermittelt werden, so dass die Korrekturwerte der interpolierten Korrekturmatrix die Startwerte für die sich daran anschließende exakte messtechnische Bestimmung sind.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen, wobei verschiede Aufnahmen von einer zu betrachtenden Probe aufgenommen und zum Zwecke der Veränderung der Einstellwerte der optischen Anordnung ausgewertet werden.
Bekannt sind Lösungen in der Lichtmikroskopie, insbesondere bei hochauflösenden Mikroskopsystemen für biomedizinische Anwendungen, bei denen die sphärische Aberration automatisiert korrigiert wird. Ursache für das Auftreten der sphärischen Aberration ist, dass Gefäßböden lokal schwankende Dicken und/oder Brechzahlen aufweisen. Ferner treten bedingt durch die Struktur und Zusammensetzung der biologischen Präparate lokal schwankende Dicken und Brechungsindizes auf. Die dadurch lokal variierende optische Weglänge führt zu einer lokal variierenden sphärischen Aberration.
Bekannterweise kann die sphärische Aberration durch die Verwendung von korrigierenden Objektiven beeinflusst werden. Erfolgt die Bildaufnahme lediglich an einer, beziehungsweise an wenigen Positionen, ist gegebenenfalls eine manuelle Korrektur der sphärischen Aberration noch akzeptabel. Sobald allerdings z-Stapel, Multipositions-, Panorama- und/oder Zeitserienexperimente in beispielsweise mehreren Fluoreszenzkanälen durchgeführt werden, ist eine manuelle Einstellung nicht mehr praktikabel.
Die Bestimmung der Korrektur der sphärischen Aberration erfordert je nach der Art der Korrekturverfahren in der Regel mehrere mikroskopische Aufnahmen. Die Vielzahl der Aufnahmen benötigen nicht nur mehr Zeit, sondern bedeuten auch eine hohe Phototoxität an den zu untersuchenden Proben. Bei Fluoreszenzaufnahme bedeutet dies verstärktes Bleichen der Probe. In Lebendzellapplikationen führt dies zu einer unerwünschten Belastung der Probe.
Die Messung und Korrektur der sphärischen Aberration kann je nach Methode und Aufnahmemodus, beispielsweise Fluoreszenz oder Durchlicht, etwa 0.5 bis 5 Sekunden betragen. Bei Experimenten, bei denen eine hohe Anzahl von Aufnahmen durchgeführt werden, führt dies zu einer signifikanten Verlängerung der Untersuchung sowie zu einer Limitierung der erzielbaren Zeitauflösung.
So würde sich beispielsweise das Abrastern einer 96er-Wellplatte mit nur einem Bild pro Well um 8 Minuten pro Durchlauf verlängern, was zu einer erheblichen Einschränkung der erzielbaren Zeitauflösung führt. Der zeitliche Aufwand für die Korrektur der sphärischen Aberration kann dabei die Dauer der eigentlichen Bildaufnahme übersteigen.
Die Erstellung einer Übersichtsaufnahme (Panoramaaufnahme) durch das Aneinanderreihen einzelner Aufnahmen in Kombination mit einer Korrektur der sphärischen Aberration erfordert ebenfalls einen Zeitaufwand von etwa 0.5 bis 5 Sekunden pro Bild. Bei einem Übersichtsbild von 20 × 20 Bildern würde sich dies auf etwa 3 bis 30 Minuten summieren.
Die sphärische Aberration kann je nach Applikation und/oder Probe, beispielsweise aufgrund von morphologischen Veränderungen in der Probe, zeitlich variieren. In kombinierten Zeitserien-/Multipositionsexperimenten erfordert das eine neue Bestimmung der Korrekturwerte vor jeder einzelnen Aufnahme. Die Anfangswerte für die Korrektur der sphärischen Aberration können sich dabei immer weiter von den aktuellen optimalen Korrekturwerten entfernen. Im besten Fall benötigt der Korrekturalgorithmus dann lediglich mehr Zeit. Je nach Korrekturverfahren kann es auch vorkommen, dass kein Optimum für die Korrektur gefunden wird. In einem solchen Fall muss der Korrekturwert geschätzt werden, beispielsweise in Form des suboptimalen Anfangswertes.
Die sphärische Aberration hängt auch von der Wellenlänge ab. Das ist insbesondere in Mehrkanal-Fluoreszenzapplikationen von Bedeutung. Um eine optimale Korrektur der sphärischen Aberration zu bewirken, ist nicht nur an jeder einzelnen Position, sondern auch zusätzlich in jedem einzelnen Fluoreszenzkanal eine Korrektur vorzunehmen, so dass die Anzahl der Aufnahmen und die Phototoxizität um den entsprechenden Faktor erhöht werden.
Ferner hängt die sphärische Aberration von der Fokusposition ab. So ändert sich in der Regel bei der Aufnahme von dreidimensionalen Datensätzen, wie beispielsweise von z-Stapeln die sphärische Aberration mit zunehmender Eindringtiefe in das Präparat. Es gibt dann für jede z-Position einen optimalen Wert für die Korrektur. Eine optimale Bildqualität erzielt man durch eine entsprechende adaptive Anpassung der Korrektur mit der Probentiefe. Auch hier sind für die Messung der sphärischen Aberration und die Ermittlung des Korrekturwertes zahlreiche, zeitaufwendige Bildaufnahmen notwendig. Insbesondere in Kombination mit Multipositions- und Zeitserienexperimenten führt das zu einer inakzeptablen Zeitauflösung und phototoxischen Belastung der Probe.
Die Bestimmung der Korrektur der sphärischen Aberration anhand des Bildinhaltes vom Präparat erfordert, dass in den Bildern geeignete Strukturen vorhanden sind, die aufgrund ihrer Eigenschaften, wie beispielsweise Kontrast und Formfaktor auch eine Korrektur ermöglichen. Das ist insbesondere bei Fluoreszenzmarkierungen, die in der Regel sehr heterogen sind, nicht zwangsläufig der Fall. Eine optimale Korrektur wäre dann nicht möglich.
In US 2002097406 werden Methoden und Systeme zur Überwachung der Herstellung eines Halbleiters beschrieben, wobei Probeneigenschaften, wie Probendicke und mindestens ein weiterer Parameter gemessen werden. Die ermittelten Daten werden von einer Rechnereinheit gespeichert. Nach der Analyse der Fehler der Probe werden die Positionen in der Rechnereinheit gespeichert. In Abhängigkeit von diesen Fehlern wird der Fertigungsprozess beeinflusst. Die Probe wechselt öfters zwischen zwei verschiedenen Geräten, wobei nur die Oberfläche der Probe ausgewertet wird.
US 2003103662 beschreibt Methoden zur automatisierten Mikroskopie, bei denen das Wiederansteuern von Positionen in x- und in y-Richtung besonders in Multiwells unter Zuhilfenahme von Referenzmarken und zum Teil auch durch Bildvergleich durchgeführt wird.
Ferner wird in US 2010172020 eine Methode zur Ermittlung von Längsfehlern einer Probe unter Ausnutzung der chromatischen Aberration beschrieben, wobei allerdings eine Ortsabhängigkeit nicht betrachtet wird.
Ausgehend von den Nachteilen der Lösungen nach dem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen dahingehend weiter zu entwickeln, dass die Anzahl der notwendigen Aufnahmen, die beispielsweise in Mehrkanal-, Multipositions-, 3D- und/oder Panorama-Experimenten für eine Korrektur notwendig sind, zu minimieren und dabei die Reproduzierbarkeit auch bei zeitlich variabler sphärischer Aberration zu verbessern.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäß durch die im Patentanspruch 1 angegebenen Verfahrensschritte gelöst. Vorteilhafte Ausführungen sind in den Unteransprüchen 2 bis 9 angegeben.
Die Korrekturwerte werden in einer Korrekturmatrix (Zuordnungstabelle) in Abhängigkeit von der Aufnahmeposition, der Aufnahmezeit und der Wellenlänge gespeichert, wobei die Bestimmung und Speicherung der Korrekturwerte in jeder Aufnahmeposition in den Koordinaten x, x und z durchgeführt wird und/oder die Korrekturwerte nach einer Auswahl von Stützstellen durch Interpolation ermittelt werden, so dass die Korrekturwerte der interpolierten Korrekturmatrix die Startwerte für die sich daran anschließende exakte messtechnische Bestimmung sind.
Eine andere Variante ist, direkt den interpolierten Wert zu benutzen.
Vorteilhafterweise wird die Veränderung der Einstellwerte (Experimentparameter und Korrekturwerte) über motorische Antriebe und/oder eine elektronische Schaltung und/oder optische Stellglieder gesteuert.
Die sphärische Aberration wird dabei an jeder Aufnahmeposition einzeln vermessen und korrigiert.
Vorteilhafterweise wird an jeder Stützstelle ein einzelner Mittelwert für alle genutzten Wellenlängen ermittelt.
Bei zahlreichen Anwendungen ist es in der Regel nicht erforderlich, die Korrektur der sphärischen Aberration über die Zeit nachzuregeln. Ist die Korrektur an den jeweiligen Aufnahmepositionen in den x-, y- und z-Koordinaten einmal bestimmt, können diese abgespeichert und bei Bedarf wieder abgerufen werden.
Zweckmäßigerweise erfolgt die Korrektur der sphärischen Aberration nach folgendem Algorithmus:

– Anfahren einer ersten Position,
– Bestimmung der notwendigen Korrektur,
– Speichern der sphärischen Aberration und der Korrekturwerte in Kombination mit den x-, y- und z Koordinaten der ersten Position,
– eventuell Anfahren weiterer Positionen und
– Bestimmung der entsprechenden Korrekturen,
– Speichern der sphärischen Aberration und der Korrekturwerte in Kombination mit den x-, y- und z Koordinaten der zweiten Position und so weiter, Starten des Experiments durch
– Anfahren der ersten Position
– Abrufen des gespeicherten Korrekturfaktors für die erste Position,
– Vornahme der notwendigen Einstellungen zur Korrektur der sphärischen Aberration, beispielsweise durch Drehen eines Korrekturrings,
– Aufnehmen eines ersten Bildes,
– eventuell Anfahren weiterer Positionen,
– Abrufen gespeicherter Korrekturfaktoren für diese Positionen und
– Vornahme der notwendigen Einstellungen zur Korrektur der sphärischen Aberration und so weiter.

Ist ein konstanter zeitlicher Abstand der Aufnahmen nicht notwendig, kann bereits im Korrekturlauf jeweils nach der Bestimmung der notwendigen Korrektur durch ein geeignetes Korrekturverfahren die erste Bildaufnahme des Experiments erfolgen.
Insbesondere bei der Aufnahme großer Übersichtsbilder ist es hilfreich, wenn die Messung der sphärischen Aberration und die Bestimmung der Korrekturwerte nicht durch eine Messung vor jedem Einzelbild durchgeführt werden muss. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Korrektur, ohne an jeder einzelnen Position zu messen. Dazu wird die Korrekturmatrix interpoliert, nach dem an definierten Stützstellen in den x-, y- und z-Koordinaten die Korrekturwerte ermittelt worden sind.
Eine derartige Reduktion der Korrekturbestimmung auf definierte Stützstellen erfolgt vorteilhafterweise durch folgenden Algorithmus:
Durchführung von mindestens zwei Korrekturdurchläufen mit

– Definieren von Stützstellen durch den Anwender oder automatisch, beispielsweise aus einem automatisch erkannten Probenbereich oder mit Hilfe einer durch den Anwender bestimmten, interessanten Region,
– Anfahren einer ersten Stützstelle
– Bestimmung der Korrektur für die erste Position,
– Speichern des ersten Korrekturwertes zusammen mit den x-, y- und z-Koordinaten der ersten Position in der Korrekturmatrix,
– Anfahren einer zweiten Stützstelle,
– Bestimmung der Korrektur für die zweite Position,
– Speichern des zweiten Korrekturwertes zusammen mit den x-, y- und z-Koordinaten der zweiten Position in der Korrekturmatrix und
– Interpolation der gesamten Korrekturmatrix aus den Stützstellenwerten usw., Starten des Experiments an mindestens zwei Positionen, durch
– Anfahren der ersten Position,
– Abrufen des Korrekturfaktors aus der interpolierten Korrekturmatrix für die erste Position,
– Vornahme der notwendigen Einstellungen zur Korrektur der sphärischen Aberration,
– Aufnahme eines ersten Einzelbildes,
– Anfahren der zweiten Position,
– Abrufen des Korrekturfaktors aus der interpolierten Korrekturmatrix für die zweite Position,
– Vornahme der notwendigen Einstellungen zur Korrektur der sphärischen Aberration und
– Aufnahme eines zweiten Einzelbildes und so weiter.

Auf diese Weise lassen sich Zeitbedarf und Phototoxizität minimieren und die Zeitauflösung maximieren.
Sollte die Genauigkeit der interpolierten Korrekturwerte für die Anwendung nicht ausreichen, können die Werte aus der interpolierten Korrekturmatrix vorteilhafterweise als Startwerte für die Korrekturdurchläufe verwendet werden. Die Startwerte liegen dann sehr nahe an den optimalen Werten. Dadurch kann die Anzahl der notwendigen Aufnahmen für den Korrekturalgorithmus minimiert werden. Das reduziert die notwendige Zeit, erhöht die Zeitauflösung und minimiert die Phototoxizität des gesamten Korrekturverfahrens. Durch Abarbeiten der zu bearbeitenden Positionen in geeigneter Reihenfolge kann das Netz der bereits bekannten Stützstellen schrittweise verfeinert werden, so dass die Interpolation immer genauer wird.
Lebende Präparate, wie beispielsweise Drosophila-Empryos oder Zellen auf einem Deckglas verändern ihre Struktur mit der Zeit. Dabei kann sich auch die sphärische Aberration lokal verändern. Um die Geschwindigkeit der Korrektur zu optimieren und die Phototoxizität so gering wie möglich zu halten können als Startwerte die im jeweils vorhergehenden Durchlauf ermittelten Korrekturwerte herangezogen werden. Dies ermöglicht eine optimale Bildqualität auch bei zeitlich veränderlichen Proben.
Ferner ist es von Vorteil, wenn bei axial in das Präparat gerichteter variierender sphärischer Aberration in den z-Stapeln an identischer lateraler Position die Korrekturmatrix aufgerufen und zur Bildaufnahme eingesetzt wird, wobei in Abhängigkeit vom Experiment zu unterschiedlichen Zeiten zum Zwecke der Erfassung von Änderungen der sphärischen Aberration und der Detektion mit der Zeit Testaufnahmen gemacht werden.
Wird keine Änderung festgestellt, kann die bestehende Korrekturmatrix für den z-Stapel verwendet werden. Sollte sich die sphärische Aberration über die Zeit ändern, kann ein erneuter Korrekturdurchlauf gestartet werden. Dies ermöglicht ebenfalls eine kontinuierliche Nachführung der Korrektur und eine optimale Bildqualität auch bei zeitlich veränderlichen Proben in 3D.
Je nach Aufbau der Probe und des Trägers sowie der Korrekturmöglichkeiten im Objektiv, ist es auch denkbar, die Korrektur anderer Bildfehler, wie beispielsweise der Farblängsfehler sowie der wellenlängenabhängigen Vergrößerung auch in Kombination auf analoge Weise zu optimieren. Voraussetzung ist jeweils eine durch eine elektronische Steuerung bedienbare Stellmöglichkeit für den entsprechenden Fehler.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine schnelle, sehr genaue sowie reproduzierbare Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen.
Nachfolgend soll das Verfahren anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die dazugehörende Figur zeigt in einer eindimensionalen Darstellung einen Messdurchgang, eine Korrekturmatrix sowie einen Aufnahmedurchgang.
Die sphärische Aberration hängt von zahlreichen Parametern ab. In einem typischen Experiment wird diese durch die Position x, y und z, die Wellenlänge λ, die Deckglasdicke d, den Brechungsindex des Deckglases n1, den Brechungsindex einer Probe n2 und der Eindringtiefe 1 in die Probe bestimmt, das heißt, es ergeben sich folgende Abhängigkeiten: S_ijk = S(x_i, y_i, z_k, λ_ij, l_ik, d_i, n1_i, n2_i, ...)
Dabei ist i der Index für die jeweilige Mess-/Aufnahmehmeposition, j der Index für die jeweilige Wellenlänge und k der Index für die axiale Position, beispielsweise innerhalb eines z-Stapels. Die genaue Bestimmung und Korrektur der sphärischen Aberration und die Erstellung der Korrekturmatrix ist abhängig vom verwendeten Korrekturverfahren.
In einem ersten Beispiel wird die Korrektur unter Verwendung eines Korrektur-Objektivs mittels Drehung eines Korrektur-Rings beschrieben. In diesem Fall korrespondiert die Position des Korrektur-Rings mit einem zu korrigierenden sphärischen Fehler. Es gibt also eine Zuordnung zwischen dem Einstellwert des Korrektur-Rings und der sphärischen Aberration, die dadurch korrigiert wird.
In diesem Fall besteht die Korrekturmatrix aus der Zuordnung der Korrektur-Ringpositionen zu den jeweiligen Aufnahmeparametern: K_ijk = K(x_i, y_i, z_k, λ_ij, l_ik, d_i, n1_i, n2_i, ...)
In einem weiteren Beispiel sollen Aufnahmen einer einfachen mikroskopischen Probe gemacht werden. Die Probe ist eingedeckelt mit einem Deckglas, dessen tatsächliche Dicke allerdings in der Regel unbekannt ist und zudem lokal schwankt. Für qualitativ hochwertige Aufnahmen, insbesondere mit hochaperturigen Luftobjektiven, sollte die Deckglasdicke d bestimmt werden, um entsprechend die auftretenden sphärische Aberration korrigieren zu können, beispielsweise mit einem Korrektur-Ring am Objektiv.
Zur Vereinfachung ist in der dazugehörenden Figur eine eindimensionale Darstellung zu sehen, das heißt die Dickenveränderung d des Deckglases erfolgt lediglich in x-Richtung. Alle anderen Parameter sollen als konstant angesehen werden. Aus der unterschiedlichen Deckglasdicke d₁ bis d₅ ergeben sich in Abhängigkeit von der x-Position unterschiedliche sphärische Fehler. Diese Fehler können an definierten Positionen in einem Messdurchgang gemessen und gespeichert werden.
Im Falle eines Korrektur-Objektivs ergibt sich daraus direkt die Korrekturmatrix als einfache Zuordnung der Ringpositionen zu den entsprechenden x-Positionen und damit zu den entsprechenden Deckglasdicken d₁ bis d₅. Diese Korrekturmatrix kann dann in einem späteren Aufnahmedurchgang aufgerufen und zur Korrektur eingesetzt werden, das heißt an den unterschiedlichen x-Positionen x₁ bis x₅ werden die Korrektur-Ringpositionen K₁ bis K₅ aus der Korrekturmatrix gelesen und eingestellt. Der resultierende sphärische Fehler wird damit minimiert oder sogar eliminiert.
Diese Korrekturmatrix kann auch herangezogen werden, um Korrekturwerte zwischen den Messpositionen zu interpolieren.
An einer nicht darstellten Position x₆ mit (x₄ < x₆ < x₅) kann im einfachsten Fall aus linearer Interpolation ein ebenfalls nicht dargestellter Korrekturwert K₆ ermittelt werden als K₆ = K₄ + (x₆ – x₄)·(K₅ – K₄)/(x₅ – x₄).
Alternative Verfahren, auch zur mehrdimensionalen Interpolation mit mehr Stützstellen sind ebenso möglich. Die durch Interpolation ermittelten Korrekturwerte können genutzt werden um diese in einer abgeleiteten Korrekturmatrix zu hinterlegen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2002097406 [0012]
US 2003103662 [0013]
US 2010172020 [0014]

Claims

Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen, wobei verschiede Aufnahmen von einer zu betrachtenden Probe aufgenommen und zum Zwecke der Veränderung der Einstellwerte der optischen Anordnung ausgewertet werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturwerte in einer Korrekturmatrix in Abhängigkeit von der Aufnahmeposition, der Aufnahmezeit, der Wellenlänge und der Temperatur gespeichert werden, wobei die Bestimmung und Speicherung der Korrekturwerte in jeder Aufnahmeposition in den Koordinaten x, y und z durchgeführt wird und/oder die Korrekturwerte nach einer Auswahl von Stützstellen durch Interpolation ermittelt werden, so dass die Korrekturwerte der interpolierten Korrekturmatrix die Startwerte für die sich daran anschließende exakte messtechnische Bestimmung sind.
Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Veränderung der Einstellwerte (Experimentparameter und Korrekturwerte) über motorische Antriebe und/oder eine elektronische Schaltung und/oder optische Stellglieder gesteuert wird.
Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die sphärische Aberration an jeder Aufnahmeposition einzeln vermessen und korrigiert wird.
Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration nach den Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass an jeder Stützstelle ein einzelner Mittelwert für alle genutzten Wellenlängen ermittelt wird.
Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration nach den Ansprüchen 1 bis 3, gekennzeichnet durch folgenden Algorithmus: – Anfahren einer ersten Position, – Bestimmung der notwendigen Korrektur, – Speichern der sphärischen Aberration und der Korrekturwerte in Kombination mit den x-, y- und z Koordinaten der ersten Position, – eventuell Anfahren weiterer Positionen und – Bestimmung der entsprechenden Korrekturen, – Speichern der sphärischen Aberration und der Korrekturwerte in Kombination mit den x-, y- und z Koordinaten einer weiteren Position und so weiter, Starten des Experiments durch – Anfahren der ersten Position – Abrufen des gespeicherten Korrekturfaktors für die erste Position, – Vornahme der notwendigen Einstellungen zur Korrektur der sphärischen Aberration, beispielsweise durch Drehen eines Korrekturringes – Aufnehmen eines ersten Bildes, – Eventuell Anfahren weiterer Positionen, – Abrufen gespeicherter Korrekturfaktoren für die diese Positionen und – Vornahme der notwendigen Einstellungen zur Korrektur der sphärischen Aberration und so weiter.
Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration nach den Ansprüchen 1 bis 4, gekennzeichnet durch folgenden Algorithmus: Durchführung von mindestens zwei Korrekturdurchläufen mit – Definieren von Stützstellen, – Anfahren einer ersten Stützstelle – Bestimmung der Korrektur für die erste Position, – Speichern des ersten Korrekturwertes zusammen mit den x-, y- und z-Koordinaten der ersten Position in der Korrekturmatrix, – Anfahren einer zweiten Stützstelle, – Bestimmung der Korrektur für die zweite Position, – Speichern des zweiten Korrekturwertes zusammen mit den x-, y- und z-Koordinaten der zweiten Position in der Korrekturmatrix und – Interpolation der gesamten Korrekturmatrix aus den Stützstellenwerten, Starten des Experiments an mindestens zwei Positionen, durch – Anfahren der ersten Position, – Abrufen des Korrekturfaktors aus der interpolierten Korrekturmatrix für die erste Position, – Vornahme der notwendigen Einstellungen zur Korrektur der sphärischen Aberration, – Aufnahme eines ersten Einzelbildes, – Anfahren der zweiten Position, – Abrufen des Korrekturfaktors aus der interpolierten Korrekturmatrix für die zweite Position, – Vornahme der notwendigen Einstellungen zur Korrektur der sphärischen Aberration und – Aufnahme eines zweiten Einzelbildes.
Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration nach den Ansprüchen 1, 3 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturfaktoren aus der interpolierten Korrekturmatrix als Startwerte für die Korrekturdurchläufe verwendet werden.
Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ermittelten Werte aus den exakten Korrekturdurchläufen als neue Werte für die Stützstellen der Korrekturmatrix verwendet werden.
Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei axial in das Präparat gerichteter variierender sphärischer Aberration in den z-Stapeln an identischer lateraler Position die Korrekturmatrix aufgerufen und zur Bildaufnahme eingesetzt wird, wobei in Abhängigkeit vom Experiment zu unterschiedlichen Zeiten zum Zwecke der Erfassung von Änderungen der sphärischen Aberration und der Detektion mit der Zeit Testaufnahmen gemacht werden.