DE102013210506A1

DE102013210506A1 - Alcohol oxidase with activity for glycerol

Info

Publication number: DE102013210506A1
Application number: DE102013210506.1A
Authority: DE
Inventors: Thomas Weber; Nina Mußmann; Marion Merkel; Inken Prüser; Timothy O'Connell; Diana Linke; Ralf Berger
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2013-06-06
Filing date: 2013-06-06
Publication date: 2014-12-11
Also published as: WO2014195214A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Oxidasen umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 52% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen, Wasch- und Reinigungsmittel die solche Oxidasen enthalten sowie deren Verwendung.The invention relates to oxidases comprising an amino acid sequence which has at least 52% sequence identity to that shown in SEQ ID NO. 1 have specified amino acid sequence over their entire length, detergents and cleaning agents that contain such oxidases and their use.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie. Die Erfindung betrifft Alkoholoxidasen mit nachweisbarer Aktivität für Glycerol deren Herstellung, alle hinreichend ähnlichen Oxidasen und für sie codierende Nukleinsäuren sowie Wirtsorganismen, die diese Nukleinsäuren enthalten. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren, die diese Oxidasen verwenden, sowie sie enthaltende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel. The present invention is in the field of enzyme technology. The invention relates to alcohol oxidases with detectable activity for glycerol their preparation, all sufficiently similar oxidases and nucleic acids encoding them and host organisms containing these nucleic acids. The invention further relates to processes which use these oxidases, as well as agents containing them, in particular washing and cleaning agents.

Der Einsatz von Enzymen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist im Stand der Technik etabliert. Sie dienen dazu, das Leistungsspektrum der betreffenden Mittel entsprechend ihren speziellen Aktivitäten zu erweitern. Hierzu gehören insbesondere hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen und Cellulasen. Die ersten drei genannten hydrolysieren Proteine, Stärke und Fette und tragen somit unmittelbar zur Schmutzentfernung bei. Cellulasen werden insbesondere wegen ihrer Gewebewirkung eingesetzt. Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung werden in den Wasch- oder Reinigungsmitteln aber auch Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen (die bei niedrigen H₂O₂-Konzentrationen als Peroxidase reagieren), Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Manganperoxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) verwendet. The use of enzymes in detergents and cleaners is well established in the art. They serve to extend the range of services of the funds concerned according to their specific activities. These include in particular hydrolytic enzymes such as proteases, amylases, lipases and cellulases. The first three hydrolyze proteins, starches and fats and thus contribute directly to soil removal. Cellulases are used in particular because of their tissue effect. However, in order to increase the bleaching effect, oxidoreductases, for example oxidases, oxygenases, catalases (which react as peroxidase at low H ₂ O ₂ concentrations), peroxidases, such as halo-, chloro-, bromo-, lignin, are also present in the detergents or cleaners , Glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases).

Geeignete enzymatische Bleichsysteme sind im Stand der Technik bekannt, beispielsweise aus den internationalen Patentveröffentlichungen WO 98/45398 A1 , WO 2004/058955 A2 , WO 2005/124012 und WO 2005/056782 A2 . Solche enzymatischen Systeme können vorteilhafterweise mit organischen, besonders bevorzugt aromatischen, mit den Enzymen wechselwirkenden Verbindungen kombiniert werden, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elektronenfluss zu gewährleisten (Mediatoren). Suitable enzymatic bleaching systems are known in the art, for example from International Patent Publications WO 98/45398 A1 . WO 2004/058955 A2 . WO 2005/124012 and WO 2005/056782 A2 , Such enzymatic systems can advantageously be combined with organic, particularly preferably aromatic, enzyme-interacting compounds to enhance the activity of the respective oxidoreductases (enhancers) or to ensure electron flow at greatly varying redox potentials between the oxidizing enzymes and the soils (mediators ).

Generell ist es wünschenswert, dass die eingesetzten Oxidasen ein Substrat umsetzen, das kostengünstig verfügbar, toxikologisch unbedenklich und einfach handhabbar ist. Die Hauptsubstrate der gut für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschriebenen Oxidasen, insbesondere Glucose-, Sorbitol-/Xylitol- und Cholinoxidasen, erfüllen diese Bedingungen aufgrund ihrer Preise und hohen Molekulargewichten und im Falle von Cholin auch aufgrund von Geruchsproblematik technischer Qualitäten weniger gut als beispielsweise Glycerol, welches in großen Mengen aus der Umsetzung z.B. pflanzlicher Triglyceride z.B. in Fettsäuremethylester (Biodiesel) als Nebenprodukt anfällt. Aus diesem Grund besteht Bedarf an Oxidasen, die Glycerol umsetzen. Des Weiteren ist es günstig, wenn derartige Oxidasen Aktivitäten auf unterschiedliche Substrate besitzen, so dass der Wechsel eines Formelbestandteils, d.h. hier des Enzymsubstrats, vereinfacht wird. In general, it is desirable that the oxidases used implement a substrate which is inexpensive, readily toxicologically acceptable and easy to handle. The main substrates of the well-described for use in detergents and cleaners oxidases, in particular glucose, sorbitol / xylitol and choline oxidases, meet these conditions due to their prices and high molecular weights and in the case of choline and odor problems of technical qualities less good than For example, glycerol, which in large quantities from the reaction, for example vegetable triglycerides e.g. obtained in fatty acid methyl ester (biodiesel) as a byproduct. For this reason, there is a need for oxidases that convert glycerol. Furthermore, it is beneficial if such oxidases have activities on different substrates such that the change of a formula component, i. here of the enzyme substrate, is simplified.

Um für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet zu sein, ist es ferner wünschenswert, dass derartige Oxidasen eine Enzymaktivität im neutralen bis leicht alkalischen pH-Wert Bereich und im Temperaturbereich ab 30, insbesondere bis möglichst auf 50 bis 60 °C aufweisen. In order to be suitable for use in detergents and cleaners, it is further desirable that such oxidases have an enzyme activity in the neutral to slightly alkaline pH range and in the temperature range from 30, in particular to possibly at 50 to 60 ° C.

Es wurde nun eine Alkoholoxidase (AOX) aus Phanerochaete chrysosporium gefunden, die die gewünschten Eigenschaften aufweist und daher besonders gut für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet ist. Die gefundene Oxidase gehört zu der Gruppe der Alkoholoxidasen (AOX, EC 1.1.3.13, Methanoloxidasen) und besitzt neben einer Hauptaktivität auf kurzkettige Alkohole, wie Methanol, auch eine, für Alkoholoxidasen unübliche, deutliche Aktivität auf Glycerol (20 % der Aktivität auf Methanol). Dadurch kann das Enzym sowohl mit Glycerol als auch mit Methanol, Ethanol, 1-Propanol und anderen Alkoholen zur Wasserstoffperoxid-Generierung eingesetzt werden. An alcohol oxidase (AOX) has now been found from Phanerochaete chrysosporium, which has the desired properties and therefore is particularly well suited for use in detergents and cleaners. The oxidase found belongs to the group of alcohol oxidases (AOX, EC 1.1.3.13, methanol oxidases) and in addition to a major activity on short-chain alcohols, such as methanol, also has a, for alcohol oxidases uncommon, significant activity on glycerol (20% of the activity on methanol) , Thus, the enzyme can be used both with glycerol and with methanol, ethanol, 1-propanol and other alcohols for hydrogen peroxide generation.

Im Gegensatz zu anderen Glycerol-umsetzenden Oxidasen, wie beispielsweise Sorbitol- oder Xylitol-Oxidasen aus Streptomyceten sind Alkoholoxidasen einfacher produzierbar, beispielsweise in Hefen wie Pichia pastoris, die Alkoholoxidasen natürlicherweise produzieren. Das erfindungsgemäße Enzym ist daher einfach herstellbar, vor allem durch die Möglichkeit der einfachen Sekretion in pilzlichen Expressionssystemen. Deswegen sind die erfindungsgemäßen Enzyme bevorzugt pilzlichen Ursprungs und bevorzugt homolog zu pilzlichen Alkoholoxidasen. In contrast to other glycerol-converting oxidases, such as streptomycete sorbitol or xylitol oxidases, alcohol oxidases are easier to produce, for example in yeasts such as Pichia pastoris, which naturally produce alcohol oxidases. The enzyme according to the invention is therefore easy to prepare, above all by the possibility of simple secretion in fungal expression systems. Therefore, the enzymes of the invention are preferably of fungal origin and preferably homologous to fungal alcohol oxidases.

Das gefundene Enzym zeigt ein pH-Optimum bei etwa pH=7, mit mehr als halbmaximaler Aktivität auch bei pH-Werten zwischen 7 und 9. Diese pH-Optima sind optimal für den Einsatz in Wasch- und vielen Reinigungsmitteln, insbesondere Waschmitteln, insbesondere flüssigen Waschmitteln. The enzyme found shows a pH optimum at about pH = 7, with more than half-maximal activity even at pH values between 7 and 9. These pH optima are optimal for use in detergents and many detergents, especially detergents, especially liquid detergents.

Das Enzym zeigt weiterhin deutliche Aktivität bereits bei 30 °C, die mit steigender Temperatur bis auf mindestens 50 °C weiter zunimmt. Dieses Temperaturprofil ist besonders gut für den Einsatz in beispielsweise Flüssigwaschmitteln geeignet. The enzyme also shows significant activity even at 30 ° C, which increases with increasing temperature up to at least 50 ° C on. This temperature profile is particularly well suited for use in, for example, liquid detergents.

In einem ersten Aspekt, betrifft die Erfindung daher eine Alkoholoxidase umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge eine Sequenzidentität von mindestens 52 %, vorzugsweise mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 80 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % aufweist. In verschiedenen Ausführungsformen besitzt die Alkoholoxidase eine deutliche Aktivität für Glycerol. Eine „deutliche Aktivität“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Aktivität für Glycerol als Substrat mindestens 5 %, vorzugsweise mindestens 10 %, noch bevorzugter mindestens 20 % der Aktivität für das Hauptsubstrat, beispielsweise Methanol, des entsprechenden Enzyms beträgt. Die hierin beschriebenen Enzyme sind vorzugsweise pilzlichen Ursprungs, insbesondere Homologe der Phanerochaete chrysosporium Alkoholoxidase mit der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz. In a first aspect, the invention therefore relates to an alcohol oxidase comprising an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 has a sequence identity of at least 52%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, most preferably at least 90%. In various embodiments, the alcohol oxidase has a marked activity for glycerol. A "significant activity" in this context means that the activity for glycerol as substrate is at least 5%, preferably at least 10%, more preferably at least 20% of the activity for the main substrate, for example methanol, of the corresponding enzyme. The enzymes described herein are preferably of fungal origin, in particular homologs of Phanerochaete chrysosporium alcohol oxidase having the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1.

Die hierin beschriebenen Alkoholoxidasen weisen eine enzymatische Aktivität auf, das heißt, sie sind befähigt die Reaktion einer Hydroxylgruppe eines Alkohols mit Sauerstoff zu dem korrespondierenden Aldehyd und Wasserstoffperoxid zu katalysieren. Eine hierin beschriebene Oxidase ist daher ein Enzym, welches die Oxidation von Hydroxylgruppen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Wasserstoffperoxid zu erzeugen, was dann wiederum in Wasch- und Reinigungsmitteln als Bleichmittel dienen kann. Ferner handelt es sich bei einer hierin beschriebenen Oxidase vorzugsweise um eine reife (mature) Oxidase, d.h. um das katalytisch aktive Molekül ohne Signal- und/oder Propeptid(e). Soweit nicht anders angegeben beziehen sich auch die angegebenen Sequenzen auf jeweils reife Enzyme. Es soll nicht ausgeschlossen werden, daß eine erfindungsgemäße Oxidase den entstandenen Aldehyd mit weiterem Sauerstoff gleich weiter oxidiert, so dass eine Carbonsäure entsteht, wie es z.B. für Cholinoxidase beschrieben ist. The alcohol oxidases described herein have enzymatic activity, that is, they are capable of catalyzing the reaction of a hydroxyl group of an alcohol with oxygen to form the corresponding aldehyde and hydrogen peroxide. An oxidase described herein is therefore an enzyme which catalyzes the oxidation of hydroxyl groups and thereby is capable of generating hydrogen peroxide, which in turn may serve as a bleaching agent in detergents and cleaners. Furthermore, an oxidase described herein is preferably a mature oxidase, i. to the catalytically active molecule without signal and / or propeptide (s). Unless otherwise stated, the sequences given refer to each mature enzyme. It should not be excluded that an oxidase according to the invention further oxidizes the resulting aldehyde with further oxygen, so that a carboxylic acid is formed, as described, for example, in US Pat. is described for choline oxidase.

Ferner verfügen bevorzugte Ausführungsformen der Oxidasen über eine besondere Stabilität in Wasch- oder Reinigungsmitteln, beispielsweise gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder gegenüber Temperatureinflüssen, insbesondere gegenüber hohen Temperaturen, beispielsweise zwischen 50 und 65°C, insbesondere 60°C, und/oder gegenüber sauren oder alkalischen Bedingungen und/oder gegenüber pH-Wert-Änderungen und/oder gegenüber denaturierenden oder oxidierenden Agentien und/oder gegenüber proteolytischem Abbau und/oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse. Furthermore, preferred embodiments of the oxidases have a particular stability in detergents or cleaners, for example with respect to surfactants and / or bleaches and / or to temperature influences, in particular to high temperatures, for example between 50 and 65 ° C, in particular 60 ° C, and / or to acidic or alkaline conditions and / or to changes in pH and / or to denaturing or oxidizing agents and / or to proteolytic degradation and / or to a change in the redox ratios.

In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Oxidase eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8% 98,8%, 99,0%, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5%, 99,6 %, 99,7%, 99,8 % und 99,9 % identisch ist. Zahlenwerte, die hierin ohne Dezimalstellen angegeben sind, beziehen sich jeweils auf den vollen angegebenen Wert. So steht beispielsweise „70%“ für „70,00%“. Der Ausdruck „ungefähr“, in Zusammenhang mit einem Zahlenwert, bezieht sich auf eine Varianz von ±10% bezogen auf den angegebenen Zahlenwert. In various embodiments of the invention, the oxidase comprises an amino acid sequence which corresponds to that shown in SEQ ID NO. 1 at least 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% 66%, 67%, 68%, 69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5% , 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.8% 98.8%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% and 99.9% identical is. Numbers given herein without decimals refer to the full value indicated. For example, "70%" stands for "70.00%". The term "approximately" in the context of a numerical value refers to a variance of ± 10% with respect to the given numerical value.

Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403–410 , und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389–3402 ) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497–3500 ), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205–217 ) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. In der vorliegenden Patentanmeldung wurden alle Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI^® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern erstellt, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert. The identity of nucleic acid or amino acid sequences is determined by a sequence comparison. This sequence comparison is based on the BLAST algorithm established in the prior art and commonly used (cf., for example, Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410 , and old school, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pp.3389-3402 ) and in principle occurs in that similar sequences of nucleotides or amino acids in the nucleic acid or amino acid sequences are assigned to each other. A tabular assignment of the respective positions is referred to as alignment. Another algorithm available in the prior art is the FASTA algorithm. Sequence comparisons (alignments), in particular multiple sequence comparisons, are created with computer programs. Frequently used, for example, the Clustal series (see, for example Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500 ), T-Coffee (cf., for example Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217 ) or programs based on these programs or algorithms. In the present application, all sequence comparisons were (alignments) (with the computer program Vector NTI ^® Suite 10.3 Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) with the default default parameters whose AlignX module for sequence comparisons is based on ClustalW.

Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz. Such a comparison also allows a statement about the similarity of the compared sequences to each other. It is usually given in percent identity, that is, the proportion of identical nucleotides or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions. The broader concept of homology involves conserved amino acid substitutions in the consideration of amino acid sequences, that is, amino acids with similar chemical activity, as these usually perform similar chemical activities within the protein. Therefore, the similarity of the sequences compared may also be stated as percent homology or percent similarity. Identity and / or homology information can be made about whole polypeptides or genes or only over individual regions. Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are therefore defined by matches in the sequences. Such areas often have identical functions. They can be small and comprise only a few nucleotides or amino acids. Often, such small regions exert essential functions for the overall activity of the protein. It may therefore be useful to relate sequence matches only to individual, possibly small areas. Unless otherwise indicated, identity or homology information in the present application, however, refers to the total length of the particular nucleic acid or amino acid sequence indicated.

Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die beanspruchten Oxidasen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu der in SEQ ID NO.1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 52 %, vorzugsweise mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 80 %, am bevorzugtesten mindestens 90 %, insbesondere 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8% 98,8%, 99,0%, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5%, 99,6 %, 99,7%, 99,8 % und 99,9 % Sequenzidentität aufweist und in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 an mindestens einer der Positionen 173, 174, 176, 177 und 198 in eine im Vergleich zu der SEQ ID NO. 1 unveränderte Aminosäure aufweist. Dies bedeutet, dass die bevorzugten Oxidasen eine Aminosäuresequenz aufweisen, die an mindestens einer, bevorzugt an mindestens zwei, insbesondere an mindestens drei, insbesondere bevorzugt an mindestens vier oder mehr der genannten Positionen in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 invariabel ist, d.h. an der entsprechenden Position befindet sich die Aminosäure, wie sie in der SEQ ID NO.1 vorkommt. Dies bedeutet, dass die Oxidasen eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens eine der folgenden Aminosäuren an der entsprechenden Position gemäß der Zählung nach SEQ ID NO. 1 G173, V174, Y176, T177 und/oder R198 aufweist. According to another particularly preferred embodiment of the invention, the claimed oxidases are characterized in that they comprise an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence given in SEQ ID NO.1 over the entire length thereof to at least 52%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%. , more preferably at least 80%, most preferably at least 90%, especially 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5% , 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.8% 98.8%, 99.0%, 99.1 %, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% and 99.9% sequence identity and in the count according to SEQ ID NO. 1 at at least one of the positions 173, 174, 176, 177 and 198 in a comparison with the SEQ ID NO. 1 unchanged amino acid. This means that the preferred oxidases have an amino acid sequence which is at least one, preferably at least two, in particular at least three, particularly preferably at least four or more of the positions mentioned in the counting according to SEQ ID NO. 1 is invariable, i. at the appropriate position is the amino acid as found in SEQ ID NO.1. This means that the oxidases comprise an amino acid sequence which comprises at least one of the following amino acids at the corresponding position according to the counting according to SEQ ID NO. 1 G173, V174, Y176, T177 and / or R198.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die beanspruchten Oxidasen dadurch gekennzeichnet, dass ihre katalytische Aktivität unter Verwendung von Glycerol als Substrat mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, insbesondere mindestens 90% der Aktivität einer Oxidase entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht. In a further embodiment of the invention, the claimed oxidases are characterized in that their catalytic activity using glycerol as substrate corresponds to at least 70%, preferably at least 80%, in particular at least 90% of the activity of an oxidase which comprises an amino acid sequence which corresponds to that in SEQ ID NO: 1 corresponds to the amino acid sequence indicated.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind als Oxidasen im Sinne der Erfindung insbesondere solche Oxidasen bevorzugt, die ein organisches Molekül als Cofaktor benötigen, besonders bevorzugte Cofaktoren sind FAD, bzw. NAD bzw. NAD(P). Solche Oxidasen, die statt eines organischen Moleküls ein- oder insbesondere zweiwertige Metallkationen benötigen, sind weniger stark bevorzugt. According to a further preferred embodiment, oxidases in the context of the invention are in particular those oxidases which require an organic molecule as cofactor, particularly preferred cofactors are FAD, or NAD or NAD (P). Such oxidases, which require mono- or especially divalent metal cations instead of an organic molecule, are less preferred.

Die hierin beschriebenen Oxidasen können im Vergleich zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Sequenz Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Oxidasen sind beispielsweise durch gezielte genetische Veränderung, d.h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert. Ferner können hierin beschriebene Nukleinsäuren in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Oxidasen oder anderer Polypeptide genutzt werden. The oxidases described herein may have amino acid changes, particularly amino acid substitutions, insertions or deletions, as compared to the sequence given in SEQ ID NO: 1. Such oxidases are, for example, by targeted genetic modification, i. by mutagenesis, further developed and optimized for specific applications or specific properties (for example, in terms of catalytic activity, stability, etc.). Furthermore, nucleic acids described herein can be incorporated into recombination approaches and thus used to generate completely novel oxidases or other polypeptides.

Das Ziel ist es, in die Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise die Leistung der hierin beschriebenen Enzyme zu verbessern oder um ihre Affinität für bestimmte Oberflächen zu beeinflussen. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen die Stabilität der Oxidase erhöht und dadurch ihre Leistung verbessert werden. The goal is to introduce into the molecules targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions, for example to improve the performance of the enzymes described herein or to influence their affinity for particular surfaces. For this purpose, in particular the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and thereby their interactions with the substrate can be changed. Thus, for example, the net charge of the enzymes can be changed in order to influence the substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners. Alternatively or In addition, one or more corresponding mutations can increase the stability of the oxidase and thereby improve its performance.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine Oxidase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ausgehend von einer Oxidase wie vorstehend beschrieben (als Ausgangsmolekül) erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution. Der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T. Another object of the invention is therefore an oxidase which is characterized in that it is obtainable starting from an oxidase as described above (as starting molecule) by one or more conservative amino acid substitution. The term "conservative amino acid substitution" means the substitution of one amino acid residue for another amino acid residue, which substitution does not result in a change in polarity or charge at the position of the exchanged amino acid, e.g. Example, the replacement of a nonpolar amino acid residue against another nonpolar amino acid residue. Conservative amino acid substitutions within the scope of the invention include, for example: G = A = S, I = V = L = M, D = E, N = Q, K = R, Y = F, S = T, G = A = I = V = L = M = Y = F = W = P = S = T.

Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteinen sind solche Varianten zu verstehen, die über an sich bekannte Methoden durch Einfügen eines Nukleinsäure-, beziehungsweise Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in chimären Proteinen. Proteins obtained by insertion mutation are to be understood as meaning those variants which have been obtained by methods known per se by inserting a nucleic acid or protein fragment into the starting sequences. They are due to their principle similarity to the chimeric proteins. They differ from those only in the size ratio of the unchanged protein part to the size of the entire protein. In such insertionsmutierten proteins, the proportion of foreign protein is lower than in chimeric proteins.

Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine oder solche, die vollständig translatierten Genen entsprechen, und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines Substrats. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche (unter Umständen nur ein oder mehrere Aminosäuren). So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms weitere einzelne Aminosäuren, insbesondere 1, bis zu 2, bis zu 3, bis zu 4, bis zu 5, insbesondere bis zu 10, bevorzugt bis zu 20, beispielsweise bis zu 30, besonders bevorzugt bis zu 40 Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die enzymatische Aktivität verloren oder vermindert wird. Besonders bevorzugt sind Deletionen von insbesondere 1, bis zu 2, bis zu 3, bis zu 4, bis zu 5, insbesondere bis zu 10, bevorzugt bis zu 20, insbesondere bevorzugt bis zu 28 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite des Enzyms und/oder 1 oder 2, bis zu 5, bis zu 10, bis zu 15, bis zu 20, bevorzugt bis zu 27 Aminosäuren auf der C-terminalen Seite des Enzyms. Dabei wird die enzymatische Aktivität der Oxidase bevorzugt nicht oder nur in einem geringen Maßen, insbesondere nur bis zu einer Reduktion von 15 % der Aktivität der Oxidase gemäß SeqID No. 1, reduziert. Fragments are understood to mean all proteins or peptides which are smaller than natural proteins or those which correspond to fully translated genes and, for example, can be obtained synthetically. Due to their amino acid sequences, they can be assigned to the relevant complete proteins. For example, they may adopt the same structures or perform proteolytic or partial activities, such as the complexation of a substrate. Fragments and deletion variants of starting proteins are in principle similar; while fragments are rather small fragments, the deletion mutants tend to lack only short regions (possibly only one or more amino acids). It is thus possible, for example, at the termini or in the loops of the enzyme, for further individual amino acids, in particular 1, up to 2, up to 3, up to 4, up to 5, in particular up to 10, preferably up to 20, for example up to to delete 30, more preferably up to 40 amino acids, without thereby losing or reducing the enzymatic activity. Especially preferred are deletions of in particular 1, up to 2, up to 3, up to 4, up to 5, in particular up to 10, preferably up to 20, especially preferred up to 28 amino acids on the N-terminal side of the enzyme and / or 1 or 2, up to 5, up to 10, up to 15, up to 20, preferably up to 27 amino acids on the C-terminal side of the enzyme. The enzymatic activity of the oxidase is preferably not or only to a small extent, in particular only up to a reduction of 15% of the activity of the oxidase according to SeqID no. 1, reduced.

Alternativ oder ergänzend ist die Oxidase dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer hierin beschriebenen Oxidase als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Fusions-, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 645 oder 650 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt. Alternatively or additionally, the oxidase is characterized in that it is obtainable from an oxidase described herein as the starting molecule by fragmentation, fusion, deletion, insertion or substitution mutagenesis and comprises an amino acid sequence over a length of at least 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 645, or 650 contiguous amino acids matches the parent molecule.

Ferner kann durch derartige Fragmentierung, Fusions-, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese beispielsweise auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der Mutagenese ihre enzymatische Aktivität, d.h. ihre enzymatische Aktivität entspricht mindestens derjenigen des Ausgangsenzyms, d.h. in einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die enzymatische Aktivität mindestens 80, vorzugsweise mindestens 90 % der Aktivität des Ausgangsenzyms. Auch Substitutionen können vorteilhafte Wirkungen zeigen. Sowohl einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden. Furthermore, such fragmentation, fusion, deletion, insertion or substitution mutagenesis can also reduce, for example, the allergenicity of the enzymes concerned and thus improve their overall applicability. Advantageously, even after mutagenesis, the enzymes retain their enzymatic activity, i. their enzymatic activity is at least equal to that of the starting enzyme, i. in a preferred embodiment, the enzymatic activity is at least 80, preferably at least 90% of the activity of the starting enzyme. Substitutions can also show beneficial effects. Both single and multiple contiguous amino acids can be substituted for other amino acids.

Weiterhin kann auch ein Fusionsprotein erzeugt werden, ausgehend von einer hierin beschriebenen Oxidase als Ausgangsmolekül (insbesondere welches erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese), welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 645 oder 650 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, und das einen weiteren Teil eines anderen Proteins enthält; beispielsweise geeignet ist die Einführung von zusätzlichen Domänen, bevorzugt aus anderen Proteinen, die die Expression, die Faltung, Oberflächenaffinität oder die Sekretion vorteilhaft beeinflussen. Furthermore, a fusion protein can also be generated, starting from an oxidase described herein as starting molecule (in particular, which is obtainable by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis), which comprises an amino acid sequence over a length of at least 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 645 or 650 contiguous amino acids matches the parent molecule, and another Contains part of another protein; for example, the introduction of additional domains, preferably from other proteins, which advantageously influence expression, folding, surface affinity or secretion is suitable.

Unter chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die natürlicherweise von verschiedenen Polypeptidketten aus demselben Organismus oder aus verschiedenen Organismen stammen. Dieses Vorgehen wird auch Shuffling oder Fusionsmutagenese genannt. Der Sinn einer solchen Fusion kann beispielsweise darin bestehen, mithilfe des heranfusionierten Proteinteils eine bestimmte enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf welche sich unterschiedliche Funktionen verteilen können. Zur Realisierung der letztgenannten Alternative ist es beispielsweise möglich, posttranslational oder erst nach einem Aufreinigungsschritt durch eine gezielte proteolytische Spaltung eine einzelne chimäre Polypeptidkette in mehrere zu zerlegen. Insbesondere kann auch die Fusionsmutagenese so eingesetzt werden, dass dabei in dem Fachmann bekannter Weise ein Fusionsprotein erzeugt wird, das einen Teil aufweist, der ausgehend von einer hierin beschriebenen Oxidase als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens mindestens 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 645 oder 650 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmend ist, und einen weiteren Teil eines anderen Proteins enthält. Bevorzugt wird eine Sequenz von einer oder mehreren anderen Proteine am C-Terminus und/oder am N-Terminus des von der Oxidase abgeleiteten Teils angehängt. For the purposes of the present application, chimeric or hybrid proteins are to be understood as meaning proteins which are composed of elements which naturally originate from different polypeptide chains from the same organism or from different organisms. This procedure is also called shuffling or fusion mutagenesis. For example, the purpose of such a fusion may be to induce or modify a particular enzymatic function using the fused protein portion. For the purposes of the present invention, it is irrelevant whether such a chimeric protein consists of a single polypeptide chain or several subunits to which different functions can be distributed. In order to realize the last-mentioned alternative, it is possible, for example, to break down a single chimeric polypeptide chain into several or more by post-translational or only after a purification step by means of a targeted proteolytic cleavage. In particular, fusion mutagenesis can also be used in such a way that a fusion protein is produced in a manner known to those skilled in the art which has a portion which can be obtained starting from an oxidase described herein as starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and an amino acid sequence over a length of at least at least 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640 , 645 or 650 contiguous amino acids is consistent with the parent molecule and contains another portion of another protein. Preferably, a sequence of one or more other proteins is attached at the C-terminus and / or at the N-terminus of the portion derived from the oxidase.

Beispielsweise geeignet ist die Einführung von zusätzlichen Domänen, bevorzugt aus anderen Proteinen, die die Expression, die Faltung, die Anheftung an bestimmte Substrate oder die Sekretion positiv beeinflussen. Insbesondere kann eine Kohlenhydratbindungsstelle (carbohydrate binding domain, CBD) in dem Fachmann bekannter Weise als zusätzliche Domäne am C- und/oder am N-Terminus des von der Oxidase abgeleiteten Teils eingefügt werden. Geeignete Domänen sind beispielsweise im Review-Artikel von Boraston, A. B., et al., Biochem. J. (2004), 382, S. 769–781 beschrieben, auf dessen Inhalt hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. Eine solche Modifikation führt aufgrund eines verbesserten Targetings bei Textilien mit Baumwollanteil zu einer verbesserten Reinigungsleistung. For example, it is suitable to introduce additional domains, preferably from other proteins, which positively influence the expression, the folding, the attachment to specific substrates or the secretion. In particular, a carbohydrate binding domain (CBD) may be incorporated in a manner known to those skilled in the art as an additional domain at the C and / or N-terminus of the portion derived from the oxidase. Suitable domains are, for example, in the review article of Boraston, AB, et al., Biochem. J. (2004), 382, pp. 769-781 , the contents of which are hereby incorporated by reference. Such a modification results in improved cleaning performance due to improved targeting of cotton textiles.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Oxidase, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer. Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit die Reinigungsleistung verbessert wird. Grundsätzlich kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht. Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Mutationen des Enzyms selbst erreicht werden, da solche Stabilisierungen im Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte erfordern. Another object of the invention is a previously described oxidase, which is additionally stabilized, in particular by one or more mutations, for example substitutions, or by coupling to a polymer. For an increase in stability during storage and / or during use, for example during the washing process, causes the enzymatic activity to last longer and thus improve the cleaning performance. In principle, all stabilization options described in the prior art and / or appropriate considerations come into consideration. Preference is given to those stabilizations which are achieved by mutations of the enzyme itself, since such stabilizations do not require any further working steps following the recovery of the enzyme.

Weitere Möglichkeiten der Stabilisierung sind beispielsweise:

– Veränderung der Bindung von Metallionen oder Kofaktoren, beispielsweise durch Austauschen von einer oder mehreren der an der Bindung beteiligten Aminosäure(n) gegen eine oder mehrere andere Aminosäuren;
– Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf oder an der Oberfläche des Proteins bewirken;
– Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.

Further possibilities of stabilization are, for example:

Changing the binding of metal ions or cofactors, for example by replacing one or more of the amino acid (s) involved in the binding with one or more other amino acids;
Protection against the influence of denaturing agents, such as surfactants, on mutations causing an alteration of the amino acid sequence on or at the surface of the protein;
Replacement of amino acids located near the N-terminus against those likely to contact non-covalent interactions with the rest of the molecule, thus contributing to the maintenance of the globular structure.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Oxidase wie vorstehend beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. Eine Oxidase mit einer solchen Veränderung wird als Derivat bezeichnet, d.h. die Oxidase ist derivatisiert. Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung demnach solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise in vivo durch die Wirtszelle erfolgen, die das Protein exprimiert. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Derivatisierungen können aber auch in vitro durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. Eine solche andere Verbindung kann auch ein weiteres Protein sein, das beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an ein hierin beschriebenes Protein gebunden wird. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, oder auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Derivatisierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können ferner auch dazu dienen, die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern. Another object of the invention is an oxidase as described above, which is characterized in that it has at least one chemical modification. An oxidase with such a change is called a derivative, ie the oxidase is derivatized. For the purposes of the present application, derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified. Such derivatizations can be done, for example, in vivo by the host cell expressing the protein. In this regard, couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy. However, derivatizations can also be carried out in vitro, for example by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent binding of another compound to the protein. For example, the coupling of amines to carboxyl groups of an enzyme to alter the isoelectric point is possible. Such another compound may also be another protein that is linked to a protein described herein, for example via bifunctional chemical compounds. Similarly, derivatization is understood to mean the covalent bond to a macromolecular carrier, or else a noncovalent inclusion in suitable Macromolecular cage structures. Derivatizations may, for example, affect the substrate specificity or binding strength to the substrate or cause a temporary blockage of the enzymatic activity when the coupled substance is an inhibitor. This can be useful, for example, for the period of storage. Such modifications may further affect stability or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility. For example, couplings with macromolecular compounds, for example, polyethylene glycol, can improve the protein in terms of stability and / or skin tolerance.

Unter Derivaten eines hierin beschriebenen Proteins können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfasst sind deshalb auch alle Präparationen eines hierin beschriebenen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Derivatives of a protein described herein may also broadly be understood to include preparations of these proteins. Depending on the extraction, processing or preparation, a protein may be associated with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms. A protein may also have been deliberately added to other substances, for example to increase its storage stability. Therefore, all preparations of a protein described herein are also included. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it may be desired that it has no or only low activity during storage, and unfolds its enzymatic function only at the time of use. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine hierin beschriebene Oxidase codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor. A further subject of the invention is a nucleic acid which codes for an oxidase described herein, as well as a vector containing such a nucleic acid, in particular a cloning vector or an expression vector.

Hierbei kann es sich DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Oxidasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei hierin beschriebenen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der hierin beschriebenen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Verwendung. Unter Codon-Verwendung wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden. Dementsprechend werden von der vorliegenden Erfindung ebenfalls solche Nukleotidsequenzen erfasst, die für die Expression in einem bestimmten Wirtsorganismus codon-optimiert sind. Die Sequenzidentität kann dabei im Vergleich zu der Vorlage niedrig sein, wobei das kodierte Protein aber identisch bleibt. These may be DNA or RNA molecules. They can be present as a single strand, as a single strand that is complementary to this single strand, or as a double strand. Especially in the case of DNA molecules, the sequences of both complementary strands must be taken into account in all three possible reading frames. Furthermore, it should be noted that different codons, so base triplets, can code for the same amino acids, so that a particular amino acid sequence can be encoded by several different nucleic acids. Due to this degeneracy of the genetic code, all nucleic acid sequences are included in this subject of the invention which can encode any of the oxidases described above. The person skilled in the art is able to determine these nucleic acid sequences unequivocally since, despite the degeneracy of the genetic code, individual codons are assigned defined amino acids. Therefore, the person skilled in the art can easily determine nucleic acids coding for this amino acid sequence on the basis of an amino acid sequence. Furthermore, in nucleic acids described herein, one or more codons may be replaced by synonymous codons. This aspect particularly relates to the heterologous expression of the enzymes described herein. Thus, each organism, for example a host cell of a production strain, has a particular codon usage. Codon usage is understood to mean the translation of the genetic code into amino acids by the particular organism. Bottlenecks in protein biosynthesis can occur if the codons lying on the nucleic acid in the organism face a comparatively small number of loaded tRNA molecules. Although coding for the same amino acid, this results in a codon being translated less efficiently in the organism than a synonymous codon encoding the same amino acid. Due to the presence of a higher number of tRNA molecules for the synonymous codon, it can be more efficiently translated in the organism. Accordingly, the present invention also detects such nucleotide sequences that are codon-optimized for expression in a particular host organism. The sequence identity may be low compared to the template, but the encoded protein remains identical.

Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. A person skilled in the art can use well-known methods such as chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular biological and / or proteinchemical standard methods, using known DNA and / or amino acid sequences, the corresponding nucleic acids to complete genes manufacture.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine hierin beschriebene Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine hierin beschriebene Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachromosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom oder chromosomale DNA integrieren. For the purposes of the present invention, vectors are understood to be elements consisting of nucleic acids which contain a nucleic acid described herein as a characteristic nucleic acid region. They can establish these in a species or cell line over several generations or cell divisions as a stable genetic element. Vectors, especially when used in bacteria, are special plasmids, ie circular genetic elements. In the context of the present invention, a nucleic acid described herein is cloned into a vector. The vectors include, for example, those whose origin are bacterial plasmids, viruses or bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of various origins. With the other genetic elements present in each case, vectors are able to establish themselves as stable units in the relevant host cells over several generations. They may be extrachromosomal as separate units or integrated into a chromosome or chromosomal DNA.

Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer hierin beschriebenen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene Nukleinsäure in Klonierungsvektoren nicht exprimiert. Expression vectors comprise nucleic acid sequences which enable them to replicate in the host cells containing them, preferably microorganisms, particularly preferably bacteria, and to express a contained nucleic acid there. In particular, expression is influenced by the promoter (s) that regulate transcription. In principle, the expression may be effected by the natural promoter originally located in front of the nucleic acid to be expressed, but also by a promoter of the host cell provided on the expression vector or also by a modified or completely different promoter of another organism or another host cell. In the present case, at least one promoter is provided for the expression of a nucleic acid described herein and used for its expression. Furthermore, expression vectors can be regulatable, for example by changing the culturing conditions or when a specific cell density of the host cells contained therein is reached or by addition of specific substances, in particular activators of gene expression. An example of such a substance is the galactose derivative isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), which is used as an activator of the bacterial lactose operon (lac operon). In contrast to expression vectors, the nucleic acid contained is not expressed in cloning vectors.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine hierin beschriebene Nukleinsäure oder einen hierin beschriebenen Vektor beinhaltet, oder die eine hierin beschriebene Oxidase beinhaltet, insbesondere eine, die die Oxidase in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Bevorzugt wird eine hierin beschriebene Nukleinsäure oder ein hierin beschriebener Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine Wirtszelle darstellt. Die hierin beschriebene Nukleinsäure ist vorzugsweise heterolog in Bezug auf den Wirtsorganismus, d.h. ist keine natürlich in dem Wirtsorganimus vorkommende Sequenz. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d.h. Nukleinsäure-Teile oder -Fragmente einer hierin beschriebenen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine hierin beschriebene Nukleinsäure oder einen hierin beschriebenen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer hierin beschriebenen Nukleinsäure oder eines hierin beschriebenen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte hierin beschriebene Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Ferner können die Oxidasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können die Oxidase funktionell beeinflussen. A further subject of the invention is a non-human host cell which contains a nucleic acid or a vector described herein, or which contains an oxidase described herein, in particular one which secretes the oxidase into the medium surrounding the host cell. Preferably, a nucleic acid or vector described herein is transformed into a microorganism which then constitutes a host cell. The nucleic acid described herein is preferably heterologous with respect to the host organism, i. is not a naturally occurring sequence in the host organism. Alternatively, individual components, i. Nucleic acid portions or fragments of a nucleic acid described herein are introduced into a host cell such that the resulting host cell contains a nucleic acid or vector described herein. This procedure is particularly suitable when the host cell already contains one or more constituents of a nucleic acid described herein or a vector described herein, and the other constituents are then supplemented accordingly. Methods of transforming cells are well established in the art and well known to those skilled in the art. In principle, all cells, that is to say prokaryotic or eukaryotic cells, are suitable as host cells. Preference is given to those host cells which can be handled genetically advantageously, for example as regards the transformation with the nucleic acid or the vector and its stable establishment, for example unicellular fungi or bacteria. Furthermore, preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling. This concerns, for example, easy culturing, high growth rates, low demands on fermentation media and good production and secretion rates for foreign proteins. Preferred host cells described herein secrete the (transgenially) expressed protein into the medium surrounding the host cells. Furthermore, the oxidases can be modified by the cells producing them after their production, for example by attachment of sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such post-translational modifications can functionally influence the oxidase.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der hierin beschriebenen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben. Further preferred embodiments are those host cells which are regulatable in their activity due to genetic regulatory elements which are provided, for example, on the vector, but may also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the culture conditions or when reaching a specific cell density, these can be excited for expression. This allows for economical production of the proteins described herein. An example of such a compound is IPTG as described above.

Wirtszellen können prokaryontische oder bakterielle Zellen sein. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren oder Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein. Host cells may be prokaryotic or bacterial cells. Bacteria are characterized by short generation times and low demands on cultivation conditions. As a result, inexpensive cultivation methods or production methods can be established. In addition, the expert has a wealth of experience in bacteria in fermentation technology. For a specific production, gram-negative or gram-positive bacteria may be suitable for a wide variety of reasons to be determined experimentally in individual cases, such as nutrient sources, product formation rate, time requirement, etc.

Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Verwendung verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. In Gram-negative bacteria, such as Escherichia coli, a large number of proteins are secreted into the periplasmic space, ie into the compartment between the two membranes enclosing the cells. This can be advantageous for special applications. Furthermore, Gram-negative bacteria can also be designed such that they eject the expressed proteins not only into the periplasmic space but into the medium surrounding the bacterium. In contrast, gram-positive bacteria such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of Actinomycetales have no outer membrane, so that secreted proteins are released immediately into the medium surrounding the bacteria, usually the nutrient medium, from which the expressed proteins can be purified. They can be isolated directly from the medium or further processed. In addition, Gram-positive bacteria are related or identical to most of the organisms of origin for technically important enzymes and usually form even comparable enzymes, so they have a similar codon use and their protein synthesizer is naturally aligned accordingly.

Hierin beschriebene Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren. Host cells described herein may be altered in their culture conditions requirements, have different or additional selection markers, or express other or additional proteins. In particular, it may also be those host cells which express several proteins or enzymes transgene.

Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen anwendbar, und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen hierin beschriebene Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar. The present invention is applicable in principle to all microorganisms, in particular to all fermentable microorganisms, and leads to the fact that can be produced by the use of such microorganisms proteins described herein. Such microorganisms then represent host cells in the sense of the invention.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia. In a further embodiment of the invention, the host cell is characterized in that it is a bacterium, preferably one selected from the genera of Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferably one selected from the group consisting of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, Staphylococcus carnosus , Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomonas maltophilia.

Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces, Pichia, Hansenula oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen oder Lipasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen. Pilzliche Expressionssysteme sind im Rahmen der Erfindung bevorzugt. The host cell may also be a eukaryotic cell, which is characterized in that it has a cell nucleus. A further subject of the invention therefore represents a host cell, which is characterized in that it has a cell nucleus. In contrast to prokaryotic cells, eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed. Examples thereof are fungi such as Actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces, Pichia, Hansenula or Kluyveromyces. This may be particularly advantageous, for example, if the proteins are to undergo specific modifications in the context of their synthesis that enable such systems. Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis, include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. Such oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to lower the allergenicity of an expressed protein. Also, coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases or lipases, may be advantageous. Furthermore, for example, thermophilic fungal expression systems may be particularly suitable for the expression of temperature-resistant proteins or variants. Fungal expression systems are preferred within the scope of the invention.

Die Wirtszellen werden in üblicher Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann. The host cells are cultured and fermented in the usual way, for example in discontinuous or continuous systems. In the first case, a suitable nutrient medium is inoculated with the host cells and the product is harvested from the medium after an experimentally determined period of time. Continuous fermentations are characterized by achieving a flow equilibrium, in which over a relatively long period of time cells partly die out but also regrow and at the same time the protein formed can be removed from the medium.

Die hierin beschriebenen Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um die hierin beschriebenen Oxidasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Oxidase umfassend

a) Kultivieren einer hierin beschriebenen Wirtszelle
b) Isolieren der Oxidase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.

The host cells described herein are preferably used to produce the oxidases described herein. Another object of the invention is therefore a method for producing an oxidase comprising

a) culturing a host cell described herein
b) isolating the oxidase from the culture medium or from the host cell.

Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der hierin beschriebenen Oxidase. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer hierin beschriebenen Oxidase beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar. This subject invention preferably comprises fermentation processes. Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, for example the oxidase described herein. All fermentation processes based on a corresponding process for the preparation of an oxidase described herein are embodiments of this subject of the invention.

Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse beziehungsweise Trockenmasse und/oder insbesondere in der Aktivität der interessierenden Oxidase erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden. Fermentation processes, which are characterized in that the fermentation is carried out via a feed strategy, come in particular into consideration. Here, the media components consumed by the ongoing cultivation are fed. As a result, considerable increases in both the cell density and in the cell mass or dry matter and / or in particular in the activity of the oxidase of interest can be achieved. Furthermore, the fermentation can also be designed so that undesired metabolic products are filtered out or neutralized by the addition of buffer or suitable counterions.

Die hergestellte Oxidase kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Oxidase aus der Wirtszelle, d.h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Bereitstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern oder -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Oxidase in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Oxidase aus der Wirtszelle, d.h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder durch chromatographische Reinigung. The produced oxidase can be harvested from the fermentation medium. Such a fermentation process is resistant to isolation of the oxidase from the host cell, i. however, requires the preparation of suitable host cells or one or more suitable secretion markers or mechanisms and / or transport systems for the host cells to secrete the oxidase into the fermentation medium. Alternatively, without secretion, the isolation of the oxidase from the host cell, i. a purification of the same from the cell mass, carried out, for example by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, or by chromatographic purification.

Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um hierin beschriebene Oxidasen herzustellen. All of the above issues may be combined into processes to produce oxidases described herein.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Oxidase wie vorstehend beschrieben enthält. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel. Da hierin beschriebene Oxidasen vorteilhafte Reinigungsleistungen insbesondere an bleiche-sensitiven Anschmutzungen aufweisen, sind die Mittel insbesondere zur Entfernung von solchen Anschmutzungen geeignet und vorteilhaft. Derartige Mittel enthalten die hierin beschriebenen Oxidasen in Mengen von 10 bis 30.000 U (auf Glycerol)/L Wasch- oder Reinigungsflotte, vorzugsweise in einer Menge von etwa 1000 U/L. Ferner enthalten sie in verschiedenen Ausführungsformen ein Substrat für die Oxidase, vorzugsweise Glycerol oder einen anderen kurzkettigen Alkohol. Die Oxidase kann in dem Mittel vorteilhafterweise in einer Menge von 1 × 10^–8 bis 5 Gew.-%, 1 × 10^–7 bis 3 Gew.-%, von 0,00001-1 Gew.-%, von 0,00005-0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% jeweils bezogen auf aktives Protein enthalten sein. Another object of the invention is an agent which is characterized in that it contains an oxidase as described above. The agent is preferably a washing or cleaning agent. Since oxidases described herein have advantageous cleaning performance, especially on pale-sensitive stains, the agents are particularly suitable and advantageous for removing such stains. Such agents contain the oxidases described herein in amounts of 10 to 30,000 U (on glycerol) / L washing or cleaning liquor, preferably in an amount of about 1000 U / L. Further, in various embodiments, they contain a substrate for the oxidase, preferably glycerol or other short chain alcohol. The oxidase may advantageously be present in the agent in an amount of from 1 x 10 ^-8 to 5 wt%, 1 x 10 ^-7 to 3 wt%, from 0.00001 to 1 wt%, from 0.00005 -0.5 wt .-%, from 0.0001 to 0.1 wt .-% and particularly preferably from 0.0001 to 0.05 wt .-% in each case based on active protein.

Die (Aktiv-)Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren bestimmt werden. The (active) protein concentration can be determined by known methods, for example the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method.

Die einzusetzenden Enzyme können zusammen mit Begleitstoffen, etwa aus der Fermentation, oder mit Stabilisatoren konfektioniert sein. In flüssigen Formulierungen werden die Enzyme bevorzugt als Enzymflüssigformulierung(en) eingesetzt. The enzymes to be used may be formulated together with accompanying substances, for example from the fermentation, or with stabilizers. In liquid formulations, the enzymes are preferably used as enzyme liquid formulation (s).

Die Oxidasen können besonders während der Lagerung gegen Schädigungen wie beispielsweise Inaktivierung, Denaturierung oder Zerfall etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden. Bei mikrobieller Gewinnung ist eine Inhibierung der Proteolyse besonders bevorzugt. Die beschriebenen Mittel können zu diesem Zweck Stabilisatoren enthalten. The oxidases can be protected especially during storage against damage such as inactivation, denaturation or disintegration such as by physical influences, oxidation or proteolytic cleavage. In microbial recovery, inhibition of proteolysis is particularly preferred. The agents described may contain stabilizers for this purpose.

Reinigungsaktive Oxidasen werden in der Regel nicht in Form des reinen Proteins sondern vielmehr in Form stabilisierter, lager- und transportfähiger Zubereitungen bereitgestellt. Zu diesen vorkonfektionierten Zubereitungen zählen beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren oder weiteren Hilfsmitteln versetzt. Cleaning-active oxidases are generally not provided in the form of the pure protein but rather in the form of stabilized, storable and transportable preparations. Such prefabricated preparations include, for example, the solid preparations obtained by granulation, extrusion or lyophilization or, especially in the case of liquid or gel-form detergents, solutions of the enzymes, advantageously as concentrated as possible, low in water and / or added with stabilizers or further auxiliaries.

Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil. Alternatively, the enzymes may be encapsulated for both the solid and liquid dosage forms, for example by spray-drying or extruding the enzyme solution together with a preferably natural polymer or in the form of capsules, for example those in which the enzymes are entrapped as in a solidified gel or in those of the core-shell type, in which an enzyme-containing core is coated with a water, air and / or chemical impermeable protective layer. In In addition, other active substances, for example stabilizers, emulsifiers, pigments, bleaches or dyes can be applied to layers which have been deposited. Such capsules are applied by methods known per se, for example by shaking or rolling granulation or in fluid-bed processes. Advantageously, such granules, for example by applying polymeric film-forming agent, low in dust and storage stable due to the coating.

Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so dass ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist. Furthermore, it is possible to assemble two or more enzymes together so that a single granule has several enzyme activities.

Wie aus der vorherigen Ausführungen ersichtlich, bildet das Enzym-Protein nur einen Bruchteil des Gesamtgewichts üblicher Enzym-Zubereitungen. Bevorzugt eingesetzte Oxidase-Zubereitungen enthalten zwischen 0,1 und 40 Gew.-%, bevorzugt zwischen 0,2 und 30 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 0,4 und 20 Gew.-% und insbesondere zwischen 0,8 und 10 Gew.-% des Enzymproteins. As can be seen from the previous comments, the enzyme protein forms only a fraction of the total weight of conventional enzyme preparations. Preferably used oxidase preparations contain between 0.1 and 40 wt .-%, preferably between 0.2 and 30 wt .-%, particularly preferably between 0.4 and 20 wt .-% and in particular between 0.8 and 10 wt .-% of the enzyme protein.

Die hierin beschriebenen Mittel umfassen alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet. The compositions described herein include all conceivable types of detergents or cleaners, both concentrates and neat agents, for use on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing or cleaning. These include detergents for textiles, carpets, or natural fibers, for which the term detergent is used. These include, for example, dishwashing detergents for dishwashers or manual dishwashing detergents or cleaners for hard surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramics, tiles, stone, painted surfaces, plastics, wood or leather, for which the term detergent is used, ie in addition to manual and machine Dishwashing agents, for example, scouring agents, glass cleaners, toilet scenters, etc. The washing and cleaning agents in the invention also include washing aids which are added to the actual detergent in the manual or machine textile laundry to achieve a further effect. Furthermore, laundry detergents and cleaners in the context of the invention also include textile pre-treatment and post-treatment agents, ie those agents with which the laundry item is brought into contact before the actual laundry, for example to dissolve stubborn soiling, and also agents which are in one of the actual Textile laundry downstream step to give the laundry further desirable properties such as comfortable grip, crease resistance or low static charge. Among the latter, i.a. calculated the fabric softener.

Ein hierin beschriebenes Mittel enthält die Oxidase vorteilhafterweise in einer Menge von 2µg bis 20mg, vorzugsweise von 5µg bis 17,5mg, besonders bevorzugt von 20µg bis 15mg und ganz besonders bevorzugt von 50µg bis 10mg pro g des Mittels. Ferner kann die in dem Mittel enthaltene Oxidase, und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels, mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidase mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Oxidase undurchlässigen Substanz umhüllt ist. Weiterhin kann auch das Wasch- oder Reinigungsmittel selbst in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird. A composition described herein advantageously contains the oxidase in an amount of from 2μg to 20mg, preferably from 5μg to 17.5mg, more preferably from 20μg to 15mg and most preferably from 50μg to 10mg per g of the agent. Further, the oxidase contained in the agent, and / or other ingredients of the agent, may be coated with a substance impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water, which becomes permeable to the enzyme under conditions of use of the agent. Such an embodiment of the invention is thus characterized in that the oxidase is coated with a substance which is impermeable to the oxidase at room temperature or in the absence of water. Furthermore, the washing or cleaning agent itself may be packaged in a container, preferably an air-permeable container, from which it is released shortly before use or during the washing process.

Diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen hierin beschriebener Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Auch ein flüssiges, gelförmiges oder pastöses Mittel kann in einer wasserlöslichen Umhüllung darbeboten werden, welche sich in der Anwendung des Produktes in Wasser auflöst, beispielsweise eingeschweißt in eine Polyvinylakkohol-Folie. Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt. These embodiments of the present invention include all solid, powdered, liquid, gelatinous or pasty administration forms of the agents described herein, which if appropriate can also consist of several phases and can be present in compressed or uncompressed form. The agent can be present as a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l. The solid dosage forms of the composition also include extrudates, granules, tablets or pouches. Alternatively, the agent can also be liquid, gelatinous or pasty, for example in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste. Also, a liquid, gel or pasty agent can be presented in a water-soluble wrapper which dissolves in the application of the product in water, for example, sealed in a polyvinyl alcohol film. Furthermore, the agent may be present as a one-component system. Such funds consist of one phase. Alternatively, an agent can also consist of several phases. Such an agent is therefore divided into several components.

Hierin beschriebene Wasch- oder Reinigungsmittel können zusätzlich zu der hierin beschriebenen Oxidase auch hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Die Enzyme können in Form der oben beschriebenen Enzymformulierungen vorliegen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem hierin beschriebenen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xanthanlyase, Xyloglucanase, ß-Glucosidase, Pektinase, Pectatlyase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase, Cutinase oder eine Lipase, sowie deren Gemische. Weitere Enzyme sind in dem Mittel vorteilhafterweise jeweils in einer Menge von 1 × 10^–8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein enthalten. Zunehmend bevorzugt ist jedes weitere Enzym in einer Menge von 1 × 10^–7-3 Gew.-%, von 0,00001-1 Gew.-%, von 0,00005-0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% in hierin beschriebenen Mitteln enthalten, bezogen auf aktives Protein. Detergents or detergents described herein, in addition to the oxidase described herein, may also contain hydrolytic enzymes or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent. The enzymes may be in the form of the enzyme formulations described above. A further embodiment of the invention thus represents means which further comprises one or more include other enzymes. Preferred enzymes which may be used as further enzymes are all enzymes which are able to display catalytic activity in the agent described here, in particular a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, xanthan lyase, xyloglucanase, β-glucosidase, pectinase, pectate lyase , Carrageenase, perhydrolase, oxidase, oxidoreductase, cutinase or lipase, and mixtures thereof. Additional enzymes are advantageously included in the agent each in an amount of 1 × 10 ^-8 to 5 weight percent based on active protein. More preferably, each further enzyme is in an amount of 1 × 10 ^-7 -3 wt%, from 0.00001-1 wt%, from 0.00005-0.5 wt%, from 0.0001 to 0.1% by weight and more preferably from 0.0001 to 0.05% by weight in the agents described herein based on active protein.

Die hierin beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können neben einer hierin beschriebenen Oxidase alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die hierin beschriebenen Mittel können insbesondere Tenside, Builder (Gerüststoffe), Persauerstoffverbindungen oder Bleichaktivatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare organische Lösungsmittel, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Farb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten. The detergents or cleaners described herein, which may be present as powdered solids, in densified particulate form, as homogeneous solutions or suspensions, may contain, in addition to an oxidase described herein, all known and conventional ingredients in such compositions, preferably at least one further ingredient in the composition is available. The agents described herein may in particular contain surfactants, builders, peroxygen compounds or bleach activators. Furthermore, they may contain water-miscible organic solvents, sequestering agents, electrolytes, pH regulators and / or further auxiliaries, such as optical brighteners, grayness inhibitors, foam regulators, as well as dyes and fragrances, and combinations thereof.

Besonders bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel zusätzlich mindestens eine Lipase oder Esterase. Diese sind geeignet, aus Triglyceriden oder Estern, wie sie als Hilfsstoffe in Wasch- oder Reinigungsmitteln vorkommen können, entsprechende Glyceride, Glycerol bzw. Methanol freizusetzen, welche als in situ erzeugte Substrate für die erfindungsgemäßen Oxidasen dienen. Somit müssen keine speziellen Substrate dem erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel zugefügt werden. Geeignete Lipasen sind beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Sie werden beispielsweise von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase^®, Lipolase^®Ultra, LipoPrime^®, Lipozyme^® und Lipex^® vertrieben. Eine ganz besonders bevorzugte Lipase, ist eine Variante der natürlich vorkommenden Lipase aus Humiculosa lanuginosa, welche an den Positionen 231 und/oder 233, gemäß der Zählung der natürlich vorkommenden Lipase, Aminosäuresubstitution(en) aufweist. Insbesondere bevorzugt sind Varianten, die an diesen Positionen die Austausche T231R und/oder N233R, bevorzugt als einzige Aminosäuresubstitutionen im Vergleich zur angegebenen Wildtyp-Lipase aufweisen. Eine weitere einsetzbare Lipase ist von der Firma Novozymes unter dem Handelsnamen Lipoclean^® erhältlich. Desweiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusarium solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von der Firma Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE^®, Lipase P^®, z.B. Lipase PS^®, Lipase B^®, beziehungsweise Lipase CES^®, Lipase AKG^®, Bacillus sp. Lipase^®, Lipase AP^®, Lipase M-AP^® und Lipase AML^® erhältlich. Von der Firma Genencor sind beispielsweise die Lipasen beziehungsweise Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige Handelsprodukte sind die ursprünglich von der Firma Gist-Brocades vertriebenen Präparationen M1 Lipase^® und Lipomax^® und die von der Firma Meito Sangyo KK, Japan, unter den Namen Lipase MY-30^®, Lipase OF^® und Lipase PL^® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast^® von der Firma Genencor. Besonders bevorzugte Lipasen sind offenbart in den internationalen Offenlegungsschriften WO 92/05249 , WO 00/60063 , WO 2007/087508 und WO 2007/087503 , auf deren Offenbarung daher ausdrücklich verwiesen wird bzw. deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt daher ausdrücklich in die vorliegende Patentanmeldung mit einbezogen wird. Particularly preferably, the washing or cleaning agents according to the invention additionally contain at least one lipase or esterase. These are suitable, from triglycerides or esters, as they may occur as auxiliaries in detergents or cleaners, release corresponding glycerides, glycerol or methanol, which serve as in situ generated substrates for the oxidases of the invention. Thus, no special substrates need to be added to the washing or cleaning agent according to the invention. Suitable lipases are, for example, the lipases originally obtainable from Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) or further developed, in particular those with the amino acid exchange D96L. They are sold, for example, by Novozymes under the trade names Lipolase ^®, Lipolase Ultra ^®, LipoPrime® ^®, Lipozyme® ^® and Lipex ^®. A most preferred lipase is a variant of the naturally occurring lipase from Humiculosa lanuginosa which has amino acid substitution (s) at positions 231 and / or 233, according to the count of the naturally occurring lipase. Especially preferred are variants which at these positions have the exchanges T231R and / or N233R, preferably as sole amino acid substitutions in comparison to the indicated wild-type lipase. Another usable lipase is available from Novozymes under the trade name Lipoclean ^®. Furthermore, for example, the cutinases can be used, which were originally isolated from Fusarium solani pisi and Humicola insolens. Lipases which are likewise useful are sold by Amano under the names Lipase ^CE® , Lipase ^P® , eg Lipase ^PS® , Lipase ^B® or Lipase ^CES® , Lipase ^AKG® , Bacillus sp. ^Lipase® , Lipase ^AP® , Lipase M- ^AP® and Lipase ^{AML® are} available. By Genencor, for example, the lipases or cutinases can be used, the initial enzymes were originally isolated from Pseudomonas mendocina and Fusarium solanii. Other important commercial products are the originally marketed by Gist-Brocades preparations M1 Lipase ^® and Lipomax® ^® and the enzymes marketed by Meito Sangyo KK, Japan under the names Lipase MY-30 ^®, Lipase OF ^® and lipase PL ^® to mention also the product Lumafast® ^® from Genencor. Particularly preferred lipases are disclosed in International Publications WO 92/05249 . WO 00/60063 . WO 2007/087508 and WO 2007/087503 , whose disclosure is therefore expressly referred to, or whose disclosure in this regard is therefore expressly incorporated into the present patent application.

Vorteilhafte Inhaltsstoffe hierin beschriebener Mittel sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO2009/121725 , dort beginnend auf Seite 5, vorletzter Absatz, und endend auf Seite 13 nach dem zweiten Absatz. Auf diese Offenbarung wird ausdrücklich Bezug genommen und der dortige Offenbarungsgehalt in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen. Advantageous ingredients of the agents described herein are disclosed in the international patent application WO2009 / 121725 starting there on page 5, penultimate paragraph, and ending on page 13 after the second paragraph. This disclosure is incorporated herein by reference and the disclosure is incorporated herein by reference.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein hierin beschriebenes Mittel angewendet wird, oder dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine hierin beschriebene Oxidase katalytisch aktiv wird, insbesondere derart, dass die Oxidase in einer Menge von 40µg bis 4g, vorzugsweise von 50µg bis 3g, besonders bevorzugt von 100µg bis 2g und ganz besonders bevorzugt von 200µg bis 1g eingesetzt wird. A further subject of the invention is a process for the cleaning of textiles or hard surfaces, which is characterized in that at least one process step, a means described herein is applied, or that in at least one process step, an oxidase described herein is catalytically active, in particular such that the Oxidase in an amount of 40μg to 4g, preferably from 50μg to 3g, more preferably from 100μg to 2g and most preferably from 200μg to 1g is used.

Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren bevorzugt sind. Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung oder Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, insbesondere von harten Oberflächen. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines hierin beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmittels oder einer hierin beschriebenen Oxidase bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für hierin beschriebene Oxidasen und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden beschriebenen Verfahren gilt. These include both manual and mechanical processes, with mechanical processes being preferred. Methods for cleaning textiles are generally characterized by the fact that in several Process steps are applied various cleaning-active substances on the items to be cleaned and washed off after the contact time, or that the items to be cleaned in any other way with a detergent or a solution or dilution of this agent is treated. The same applies to processes for cleaning all other materials than textiles, especially hard surfaces. All conceivable washing or cleaning methods may be enriched in at least one of the method steps for the use of a detergent or an oxidase described herein, and then constitute embodiments of the present invention. All of the facts, subjects, and embodiments that apply to oxidases described herein and agents containing them are also applicable to this subject of the invention. Therefore, reference is made at this point expressly to the disclosure in the appropriate place with the statement that this disclosure also applies to the above-described method.

Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine hierin beschriebene Oxidase aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide. Embodiments of this subject matter of the invention also provide processes for the treatment of textile raw materials or for textile care in which an oxidase described herein becomes active in at least one process step. Among these, methods for textile raw materials, fibers or textiles with natural components are preferred, and especially for those with wool or silk.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines hierin beschriebenen Mittels zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, oder einer hierin beschriebenen Oxidase zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, insbesondere derart, dass die Oxidase in einer Menge von 40µg bis 4g, vorzugsweise von 50µg bis 3g, besonders bevorzugt von 100µg bis 2g und ganz besonders bevorzugt von 200µg bis 1g eingesetzt wird. A further subject of the invention is the use of an agent described herein for the cleaning of textiles or hard surfaces, or an oxidase described herein for the purification of textiles or hard surfaces, in particular such that the oxidase in an amount of 40μg to 4g, preferably of 50μg to 3g, more preferably from 100μg to 2g and most preferably from 200μg to 1g is used.

Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für hierin beschriebene Oxidasen und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehend beschriebene Verwendung gilt. All aspects, objects, and embodiments described for oxidases and agents containing them described herein are also applicable to this subject matter. Therefore, reference is made at this point expressly to the disclosure in the appropriate place with the statement that this disclosure also applies to the use described above.

Beispiele Examples

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual“, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt. All molecular biology procedures are followed by standard methods such as those described in the Handbook of Fritsch, Sambrook and Maniatis "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, or similar pertinent works. Enzymes and kits were used according to the instructions of the respective manufacturers.

Beispiel 1: Example 1:

Kultivierung von Phanerochaete chrysosporium Cultivation of Phanerochaete chrysosporium

Vor der Verwendung wurden alle Medien und Laborgegenstände sterilisiert (autoklaviert). Stammkulturen von Phanerochaete chrysosporium wurden in Petri-Schalen auf Standard Agar Platten (30.0 g L^–1 Glucose Monohydrat; 4.5 g L^–1 L-Asparagin Monohydrat; 1.5 g L^–1 KH₂PO₄; 0.5 g L^–1 MgSO₄; 3.0 g L^–1 Hefeextrakt; 15.0 g L^–1 Agar Agar; 1.0 mL L^–1 Spurenelementlösung enthaltend 0.005 g L^–1 CuSO₄ ×5 H₂O, 0.08 g L^–1 FeCl₃ ×6 H₂O, 0.09 g L^–1 ZnSO₄ × 7 H₂O, 0.03 g L^–1 MnSO₄ × H₂O und 0.4 g L^–1 EDTA) angezogen. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisierung mit 1 M NaOH auf pH 6 eingestellt. Before use, all media and laboratory items were sterilized (autoclaved). Stock cultures of Phanerochaete chrysosporium were grown in petri dishes on standard agar plates (30.0 g L ^-1 glucose monohydrate; 4.5 g L ^-1 L-asparagine monohydrate; 1.5 g L ^-1 KH ₂ PO ₄ ; 0.5 g L ^-1 MgSO ₄ ; 3.0 g L ^-1 yeast extract, 15.0 g L ^-1 agar agar; 1.0 mL ^-1 L trace element solution containing 0.005 g L ^-1 CuSO ₄ 5 H ₂ O, 0.08 g L ^-1 FeCl ₃ × 6 H ₂ O, 0.09 g L ^-1 ZnSO ₄ .7H ₂ O, 0.03 g L ^-1 MnSO ₄ .H ₂ O and 0.4 g L ^-1 EDTA). The pH of the medium was adjusted to pH 6 with 1M NaOH prior to sterilization.

Ein 1 cm² Stück wurde aus der Stammkultur ausgeschnitten, in 125 mL of SNL Medium (dasselbe Medium ohne Agar Agar) überführt und dann mittels eines Ultra-Turrax homogenisiert. Nach der Inkubation bei 24 °C und 150 rpm in einem Inkubator für 6 bis 10 Tage wurden 25 mL der Vorkultur in 225 mL Lactat Medium (10.0 g L^–1 Natrium L-Lactat; 4.5 g L^–1 L-Asparagin Monohydrat; 1.5 g L^–1 KH₂PO₄; 0.5 g L^–1 MgSO₄; 3.0 g L^–1 Hefeextrakt; 1.0 mL L^–1 Spurenelementlösung) überführt und bei 24 °C inkubiert. A 1 cm ² piece was excised from the stock culture, transferred to 125 mL of SNL medium (the same medium without agar agar) and then homogenized using an Ultra-Turrax. After incubation at 24 ° C and 150 rpm in an incubator for 6 to 10 days, 25 mL of the preculture in 225 mL lactate medium (10.0 g L ^-1 sodium L-lactate; 4.5 g L ^-1 L-asparagine monohydrate; 1.5 g L ^-1 KH ₂ PO ₄ ; 0.5 g L ^-1 MgSO ₄ ; 3.0 g L ^-1 yeast extract; 1.0 mL L ^-1 trace element solution) and incubated at 24 ° C.

Nach 16 Tagen Kultivierung, wurde die Kultur filtriert, die Biomasse mit TRIS-HCl Buffer, 20 mM pH 7.0 gewaschen und bei –18 °C gelagert. After 16 days of culture, the culture was filtered, the biomass was washed with TRIS-HCl buffer, 20 mM pH 7.0 and stored at -18 ° C.

Aufreinigung des Enzyms aus P. chrysosporium Purification of the enzyme from P. chrysosporium

10 g der Biomasse wurden mit TRIS HCl 20 mM pH 7.0 mittels einer Precellys 24 Kugelmühle (peqlab, Erlangen, DE) homogenisiert. Nach der Zentrifugation für 5 min bei 16,000g wurde der Überstand für die weitere Aufreinigung verwendet. Der Überstand wurde auf eine Superdex 75 Gelfiltrationssäule gegeben und mit TRIS HCl 200 mM pH 7.0 mit einer Flussrate von 0.5 mL min^–1 eluiert. Es wurden 0.5 mL Fraktionen gesammelt und auf ihre Aktivität hin analysiert. 10 g of the biomass were homogenized with TRIS HCl 20 mM pH 7.0 using a Precellys 24 ball mill (peqlab, Erlangen, DE). After centrifugation for 5 min at 16,000g, the supernatant was used for further purification. The supernatant was applied to a Superdex 75 gel filtration column and TRIS HCl 200 mM pH 7.0 at a flow rate of 0.5 mL min ^-1 eluted. 0.5 mL fractions were collected and analyzed for activity.

Aktivitätsassay mit Aminoantipyrin Activity assay with aminoantipyrine

Für die Bestimmung von H₂O₂wurde der Test von Uwajima und Terada ( Uwajima & Terada (1980), Agric. Biol. Chem. 44:2039–2045 ) verwendet. Bei Verwendung von 4-Aminoantipyrin, Phenol und Meerrettichperoxidase, reagiert H₂O₂ zu einem rosafarbenen Chinoid-Produkt, das bei 500 nm gemessen wird. Der Assay wurde mit TRIS-HCl 200 mM, pH 7.0 durchgeführt. Kontrollen wurden 1) ohne Enzymprobe, 2) ohne Glycerol und 3) durch Inaktivieren der Enzymprobe für 10 min bei 95 °C durchgeführt. Die Bildung des Produkts wurde mittels eines Mikroplatten-Auslesegeräts verfolgt. Eine Enzymaktivitätseinheit wurde als die Menge Enzym, die erforderlich ist, um bei 30 °C 1 µM H₂O₂ pro Minute zu erzeugen, berechnet. For the determination of H ₂ O ₂ the test of Uwajima and Terada ( Uwajima & Terada (1980), Agric. Biol. Chem. 44: 2039-2045 ) used. When using 4-aminoantipyrine, phenol and horseradish peroxidase, H ₂ O ₂ reacts to produce a pink chinoid product which is measured at 500 nm. The assay was performed with TRIS-HCl 200mM, pH 7.0. Controls were performed 1) without enzyme sample, 2) without glycerol and 3) by inactivating the enzyme sample for 10 min at 95 ° C. The formation of the product was monitored by a microplate reader. An enzyme activity unit was calculated as the amount of enzyme required to produce 1 μM H ₂ O ₂ per minute at 30 ° C.

Produktion und Reinigung von AOX Production and cleaning of AOX

Während eines Screenings von 36 Basidiomyceten wurde gefunden, dass Phanerochaete chrysosporium (Pch) eine Glyceroloxidase produziert. Die Enzymaktivität wurde gefunden, wenn Pch in einem Medium mit 10 g L^–1 Natrium L-Lactat kultiviert wird. Die Enzymaktivität wurde nach Zellaufschluss mittels einer Kugelmühle gemessen. Die Aktivität wurde zuerst am 15. Tag der Kultivierung gefunden und war bis zum 30. Tag der Kultivierung stabil. Die Kultur wurde am 15. Tag geerntet und die Biomasse vom Überstand mittels Filtration getrennt. Nach dem Entfernen des restlichen Mediums durch Waschen mit Puffer wurde die Biomasse für die Enzymaufreinigung verwendet. Nach dem Zellaufschluss wurde die AOX mittels Gelfiltrationschromatographie vorgereinigt. 95 % anderer Proteine wurden abgetrennt und die endgültige Aktivität, die gemessen wurde betrug 17.5 mU mg^–1 Protein. During a screening of 36 basidiomycetes it was found that Phanerochaete chrysosporium (Pch) produces a glycerol oxidase. The enzyme activity was found when Pch was cultured in a medium with 10 g L- ¹ sodium L-lactate. The enzyme activity was measured after cell disruption by means of a ball mill. The activity was first found on the 15th day of cultivation and was stable until the 30th day of cultivation. The culture was harvested on the 15th day and the biomass separated from the supernatant by filtration. After removing the remaining medium by washing with buffer, the biomass was used for enzyme purification. After cell disruption, the AOX was pre-purified by gel filtration chromatography. 95% of other proteins were separated and the final activity measured was 17.5mU mg ^-1 protein.

Charakterisierung der AOX Characterization of the AOX

Die Untersuchung der Enzymeigenschaften wurde unter Verwendung der vorgereinigten Präparation durchgeführt. Die Gelfiltration zeigte ein Molekulargewicht von ungefähr 130 kDa. Auf einer denaturienden SDS-PAGE konnte eine 75 kDa Bande der Oxidaseaktivität zugeordnet und mittels Sequenzanalyse bestätigt werden. The investigation of the enzyme properties was carried out using the prepurified preparation. The gel filtration showed a molecular weight of about 130 kDa. On a denaturing SDS-PAGE, a 75 kDa band could be assigned to the oxidase activity and confirmed by sequence analysis.

Beispiel 2: Klonierung und Sequenzierung einer beispielhaften AOX Example 2: Cloning and sequencing of an exemplary AOX

Aus 500 mg Mycelium wurde die RNA präpariert. Primer wurden basierend auf mittels ESI-MS/MS identifizierten Peptidsequenzen und dem publizierten Phanerochaete chrysosporium Genom generiert:

The RNA was prepared from 500 mg mycelium. Primers were generated based on ESI-MS / MS identified peptide sequences and the published Phanerochaete chrysosporium genome:

Reverse Transkription und Gegenstrangsynthese wurden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt. Reverse transcription and counterstrand synthesis were performed using standard techniques.

PCRs wurden unter Verwendung von 25 pmol forward primer, 25 pmol reverse primer und einem Standard PCR Enzymmix durchgeführt. Die PCR Ergebnisse wurden mittels Agarose Gelelektrophorese analysiert. Die DNA Fragmente wurden in den pGEM^®T-Vektor (Promega) ligiert und damit Escherichia coli Zellen transformiert. Die Selektion positiver Klone wurde mittels colony PCR unter Verwendung von Standard-Primern M13 uni (–21) (TGTAAAACGACGGCCAGT; SEQ ID NO:4) und M13 rev (–29) (CAGGAAACAGCTATGACC; SEQ ID NO:5) durchgeführt. Aus den selektierten positiven Klonen wurde die DNA isoliert und beide Stränge unter Verwendung von Standardtechniken sequenziert. PCRs were performed using 25 pmol of forward primer, 25 pmol of reverse primer and a standard PCR enzyme mix. The PCR results were analyzed by agarose gel electrophoresis. The DNA fragments were cloned into the pGEM ^® T-vector (Promega) and transformed Escherichia coli cells. The selection of positive clones was performed by colony PCR using standard primers M13 uni (-21) (TGTAAAACGACGGCCAGT; SEQ ID NO: 4) and M13 rev (-29) (CAGGAAACAGCTATGACC; SEQ ID NO: 5). From the selected positive clones, the DNA was isolated and both strands were sequenced using standard techniques.

Um die Sequenz zu verifizieren, wurde genomische DNA aus Mycelium unter Verwendung des Genomic DNA Purification Kit (Fermentas) präpariert. Die vollständige AOX Sequenz wurde amplifiziert, kloniert und sequenziert. Die identifizierte Sequenz hatte die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:1 angegeben ist. To verify the sequence, genomic DNA from Mycelium was prepared using the Genomic DNA Purification Kit (Fermenta). The complete AOX sequence was amplified, cloned and sequenced. The identified sequence had the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1.

Beispiel 3: Temperatur- und pH-Abhängigkeit der Aktivität des Enzyms Example 3: Temperature and pH dependence of the activity of the enzyme

Für die Bestimmung des pH-Optimums wurde ein Assay mit ABTS (2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) Diammoniumsalz bei pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 7.6 und 8.2 unter Verwendung eines Citrat-Puffers 200 mM durchgeführt. Der Assay wurde bei 30 °C in 96 well Platten für einen hohen Probendurchsatz durchgeführt. Für den ABTS Assay wurde der folgende Ansatz gewählt: 150 µL TRIS-HCl Puffer 400 mM, pH 7.0, 75 µL Probe, 30 µL Glycerol 100 mM, 30 µL Meerrettichperoxidase 100 U mL^–1 und 15 µL ABTS wurden gemischt. Der Anstieg der Extinktion bei 420 nm wurde für 2 h gemessen. Jede Probe wurde dreifach bestimmt. Der ABTS Assay wurde bei 30, 37, 42 und 50 °C durchgeführt, um das Temperaturoptimum der AOX zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. For the determination of the pH optimum, an assay was carried out with ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt at pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 7.6 and 8.2 using a citrate buffer The assay was performed at 30 ° C in 96 well plates for a high sample throughput carried out. For the ABTS assay, the following approach was chosen: 150 μL TRIS-HCl buffer 400 mM, pH 7.0, 75 μL sample, 30 μL glycerol 100 mM, 30 μL horseradish peroxidase 100 U mL ^-1 and 15 μL ABTS were mixed. The increase in absorbance at 420 nm was measured for 2 hours. Each sample was determined in triplicate. The ABTS assay was performed at 30, 37, 42 and 50 ° C to determine the temperature optimum of the AOX. The results are in 1 shown.

Beispiel 4: Aktivität auf unterschiedlichen Substraten Example 4: Activity on Different Substrates

Der Aktivitätsassay aus Beispiel 3 wurde statt mit Glycerol mit unterschiedlichen anderen Alkoholen durchgeführt und die relative Aktivität auf den unterschiedlichen Substraten bestimmt: Substrat Relative Aktivität bezogen auf Glycerol Methanol 5 Ethanol 4 1-Propanol 2 Glycerol 1 2-Propanol 0,8 n-Pentanol 0,75 The activity assay from example 3 was carried out with glycerol with different other alcohols and the relative activity on the different substrates was determined: substratum Relative activity on glycerol methanol 5 ethanol 4 1-propanol 2 glycerol 1 2-propanol 0.8 n-pentanol 0.75

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 98/45398 A1 [0003] WO 98/45398 A1 [0003]
WO 2004/058955 A2 [0003] WO 2004/058955 A2 [0003]
WO 2005/124012 [0003] WO 2005/124012 [0003]
WO 2005/056782 A2 [0003] WO 2005/056782 A2 [0003]
WO 92/05249 A [0065] WO 92/05249 A [0065]
WO 00/60063 [0065] WO 00/60063 [0065]
WO 2007/087508 [0065] WO 2007/087508 [0065]
WO 2007/087503 [0065] WO 2007/087503 [0065]
WO 2009/121725 [0066] WO 2009/121725 [0066]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0014] SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic local alignment search tool." Biol. 215: 403-410 [0014]
Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389–3402 [0014] Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, p.3389-3402 [0014]
Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497–3500 [0014] Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500 [0014]
Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205–217 [0014] Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. Biol. 302, 205-217 [0014]
Boraston, A. B., et al., Biochem. J. (2004), 382, S. 769–781 [0028] Boraston, AB, et al., Biochem. J. (2004), 382, pp. 769-781 [0028]
Uwajima & Terada (1980), Agric. Biol. Chem. 44:2039–2045 [0077] Uwajima & Terada (1980), Agric. Biol. Chem. 44: 2039-2045 [0077]

Claims

Oxidase umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 52 %, vorzugsweise mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 80 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist. An oxidase comprising an amino acid sequence having at least 52%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, most preferably at least 90% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO. 1 has indicated amino acid sequence over the entire length.

Oxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass (i) sie aus einer Oxidase nach Anspruch 1 als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution; und/oder (ii) sie aus einer Oxidase nach Anspruch 1 als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Fusions-, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 645 oder 650 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt. Oxidase according to claim 1, characterized in that (i) it is obtainable from an oxidase according to claim 1 as starting molecule by single or multiple conservative amino acid substitution; and / or (ii) it is obtainable from an oxidase according to claim 1 as starting molecule by fragmentation, fusion, deletion, insertion or substitution mutagenesis and comprises an amino acid sequence of at least 200, 250, 300, 350, 400 in length , 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 645, or 650 contiguous amino acids matches the parent molecule.

Oxidase nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO.1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 52 %, vorzugsweise mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 80 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität aufweist und in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 an mindestens einer der Positionen 173, 174, 176, 177 und 198 in eine im Vergleich zu der SEQ ID NO. 1 unveränderte Aminosäure aufweist. Oxidase according to claim 1 or 2, characterized in that it comprises an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence given in SEQ ID NO.1 over the total length of at least 52%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%. , most preferably at least 90% sequence identity and in the count according to SEQ ID NO. 1 at at least one of the positions 173, 174, 176, 177 and 198 in a comparison with the SEQ ID NO. 1 unchanged amino acid.

Oxidase nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie nachweisbare Aktivität für Glycerol als Substrat aufweist. Oxidase according to one of the preceding claims, characterized in that it has detectable activity for glycerol as substrate.

Nukleinsäure codierend für eine Oxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4. Nucleic acid coding for an oxidase according to one of claims 1 to 4.

Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 5, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor. Vector containing a nucleic acid according to claim 5, in particular a cloning vector or an expression vector.

Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 5 oder einen Vektor nach Anspruch 6 beinhaltet, oder die eine Oxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4 beinhaltet, insbesondere eine, die die Oxidase in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. A non-human host cell comprising a nucleic acid according to claim 5 or a vector according to claim 6 or which comprises an oxidase according to any one of claims 1 to 4, in particular one which secretes the oxidase into the medium surrounding the host cell.

Nicht menschliche Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pilzzelle ist. Non-human host cell according to claim 7, characterized in that the cell is a fungal cell.

Verfahren zur Herstellung einer Oxidase umfassend a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 7 oder 8 b) Isolieren der Oxidase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle. A method for producing an oxidase comprising a) culturing a host cell according to claim 7 or 8 b) isolating the oxidase from the culture medium or from the host cell.

Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Oxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält. Agent, in particular a washing or cleaning agent, characterized in that it contains at least one oxidase according to one of claims 1 to 4.

Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach Anspruch 10 angewendet wird. A method for cleaning textiles or hard surfaces, characterized in that in at least one method step, an agent according to claim 10 is applied.