DE102013209312B3 - Kit, useful for in vivo detection of extracellular primary signal by interspecies communication, comprises yeast cells of different species, where yeast cells comprise sensor-cell, and actuator-cells comprising e.g. receptor for pheromone - Google Patents

Abstract

Kit comprises yeast cells of different species comprising (a) a sensor-cell of a first type comprising a gene, which leads to the synthesis of a pheromone and is provided under transcriptional control of a primary signal-dependent promoter and (b) actuator-cells of at least one type comprising (i) at least one receptor for a pheromone, (ii) at least one target gene that is coded for a secondary signal and is placed under the control of promoters. An independent claim is included for in vivo detection of at least one extracellular primary signal using the kit, comprising (a) contacting the sensor cells with the primary signal leading to the synthesis and secretion of the pheromone from the sensor cells, and (b) activating the receptor of the actuator cells by the pheromone, by which a target gene is functionally expressed, and/or (c) activating the receptor of amplifier cells by the pheromone of the sensor cells leading to the synthesis and secretion of a pheromone of the amplifier cells.

Description

Die Erfindung betrifft ein Kit und ein Verfahren zur Perzeption und intrinsischen Amplifikation von extrazellulären Primärsignalen über eine Interspezies-Kommunikation.The invention relates to a kit and a method for the perception and intrinsic amplification of extracellular primary signals via interspecies communication.

Konventionelle Konzepte für Ganzzellsensoren beruhen ausschließlich auf einer Spezies von Sensor-Zellen, die als Antwort auf einen Analyten ein (Marker-)Protein synthetisieren, dessen Anwesenheit mittels geeigneter Messtechnik nachgewiesen werden kann. Da die Änderung der Transkription, welche ursächlich für die Expression des (Marker-)Proteins ist, zum Teil nur gering ist, erscheint eine Verstärkung des Signals häufig vorteilhaft.Conventional concepts for whole-cell sensors are based solely on a species of sensor cells that, in response to an analyte, synthesize a (marker) protein whose presence can be detected by appropriate measurement techniques. Since the change in the transcription, which is the cause of the expression of the (marker) protein, is in part only small, amplification of the signal often appears advantageous.

Diese Signalverstärkung basiert beispielsweise auf dem Pheromonsystem der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ( DE 10 2008 030 907 B4 ; Groß et al., Lett Appl Microbiol. 2011, 52(5), 521–526). Etablierte Systeme umfassen nur eine Population von Sensor-Zellen, die für die Steuerung einer großen Population von Aktor-Zellen verantwortlich ist. Dabei führt die Wahrnehmung eines Signals (z. B. Analyt, Nährstofflimitation) zur Freisetzung eines Pheromons durch die Sensor-Zellen, wodurch das Signal amplifiziert wird. Die Aktor-Zellen reagieren auf die freigesetzten Signalmoleküle und synthetisieren ein spezifisches (Marker-)Protein.This signal amplification is based, for example, on the pheromone system of the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae ( DE 10 2008 030 907 B4 ; Gross et al., Lett Appl Microbiol. 2011, 52 (5), 521-526). Established systems comprise only a population of sensor cells responsible for controlling a large population of actuator cells. The perception of a signal (eg analyte, nutrient imitation) leads to the release of a pheromone by the sensor cells, whereby the signal is amplified. The actor cells respond to the released signaling molecules and synthesize a specific (marker) protein.

Weitere Ansätze zur Nutzung der Pheromone und Rezeptoren anderer Spezies in der Bäckerhefe können zurzeit, aufgrund der sehr geringen Effizienz, nicht für die Amplifikation von Signalen in Betracht gezogen werden (Gonçalves-Sá J, Murray A., Curr Biol. 2011, 21(16), 1337–1346).Other approaches to using the pheromones and receptors of other species in baker's yeast can not currently be considered for amplification of signals because of their very low efficiency (Gonçalves-Sá J, Murray A., Curr Biol. 2011, 21 (16 ), 1337-1346).

Etablierte Sensor-Aktor-Systeme haben jedoch den Nachteil, dass sie ausschließlich auf dem Einsatz einer (Hefe-)Spezies beruhen. Da Hefen einer Spezies nur zwei verschiedene Pheromone besitzen, können Sensor-Zellen auf der Basis des Pheromonsystems der Hefe maximal zwei verschiedene Subpopulationen von Aktor-Zellen über die Freisetzung von Pheromonen steuern. Eine Anwendung für Sensor-Aktor-Systeme, die auf multiple Parameter ihrer chemischen Umgebung reagieren und die entsprechenden Signale amplifizieren sowie die unterschiedlichen physiologischen Eigenschaften verschiedener Hefespezies nutzen, ist daher nicht möglich.However, established sensor-actuator systems have the disadvantage that they are based solely on the use of a (yeast) species. Since yeasts of one species possess only two different pheromones, sensor cells based on the yeast pheromone system can control a maximum of two different subpopulations of actor cells via the release of pheromones. An application for sensor-actuator systems that react to multiple parameters of their chemical environment and amplify the corresponding signals and use the different physiological properties of different yeast species is therefore not possible.

Die Integration von Zellen verschiedener Spezies in Sensor-Aktor-Systemen sowie deren Steuerung auf der Basis der entsprechenden Pheromone konnte bisher nicht realisiert werden. Die Systeme sind daher hinsichtlich der physiologischen Eigenschaften, die die Sensor- und Aktor-Zellen aufweisen können, stark limitiert.The integration of cells of different species in sensor-actuator systems and their control based on the corresponding pheromones could not be realized so far. The systems are therefore severely limited in terms of the physiological properties which the sensor and actuator cells can have.

Aufgabe der Erfindung ist die Integration von Hefezellen verschiedener Hefespezies in einem Sensor-Aktor-System, wobei verschiedene Subpopulationen von Aktor-Zellen und Verstärker-Zellen individuell gesteuert werden.The object of the invention is the integration of yeast cells of different yeast species in a sensor-actuator system, wherein different subpopulations of actuator cells and amplifier cells are individually controlled.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch eine Vorrichtung (auch Kit) zur in vivo Detektion und Amplifikation von mindestens einem Primärsignal mittels Interspezies-Kommunikation, die die Hefezellen sich unterscheidender Spezies enthält:

• a. Sensor-Zellen eines ersten Typs, die folgende Merkmale aufweisen: i. ein Gen, welches zur Synthese eines Pheromons führt, ist unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt,
• b. Aktor-Zellen mindestens eines Typs, wobei die Aktor-Zellen eines Typs folgende Merkmale aufweisen: i. mindestens einen Rezeptor für ein Pheromon, ii. mindestens ein Zielgen, das für ein Sekundärsignal kodiert, ist unter die Kontrolle eines Promotors gestellt, wobei

According to the invention the object is achieved by a device (also kit) for in vivo detection and amplification of at least one primary signal by means of interspecies communication containing the yeast cells of different species:

• a. Sensor cells of a first type, which have the following features: i. a gene which leads to the synthesis of a pheromone is placed under the transcriptional control of a primary signal-dependent promoter,
• b. Actuator cells of at least one type, the actuator cells of one type having the following characteristics: i. at least one receptor for a pheromone, ii. at least one target gene encoding a secondary signal is placed under the control of a promoter, wherein

Primärsignale zur Expression der für die Synthese von Pheromonen vermittelnden Gene in und zur Sekretion der Pheromone aus den Sensor-Zellen führen, was zur Aktivierung eines Rezeptors der Aktor-Zellen durch ein Pheromon führt, wodurch ein Zielgen funktionell exprimiert wird.Primary signals for expression of the pheromone-mediating genes in and for secretion of the pheromones from the sensor cells result in the activation of a receptor of the actor cells by a pheromone, thereby functionally expressing a target gene.

Vorteilhaft ermöglicht die Anordnung der Hefezellen die Nutzung der entsprechenden physiologischen Leistungen mehrerer Hefe-Spezies sowohl als Sensor-Zelle (Sensitivität gegenüber dem Analyten, relative Änderung der Genexpression als Antwort auf den Analyten), als Aktor-Zelle (Synthese spezieller Enzyme, Nutzung individueller Biosynthese- und Stoffwechselwege), als auch als Verstärker-Zellen (Sensitivität gegenüber einem Pheromon der Sensor-Zelle, relative Änderung der Genexpression als Antwort auf ein Pheromon).Advantageously, the arrangement of the yeast cells allows the use of the corresponding physiological performances of several yeast species both as a sensor cell (sensitivity to the analyte, relative change of gene expression in response to the analyte), as an actor cell (synthesis of specific enzymes, use of individual biosynthesis and metabolic pathways) as well as enhancer cells (sensitivity to a pheromone of the sensor cell, relative change in gene expression in response to a pheromone).

Weiterhin vorteilhaft findet eine intrinsische Signalverstärkung verschiedener Primärsignale statt, wodurch die Nachweisgrenze für die zu detektierenden Primärsignale moduliert wird.Further advantageously, an intrinsic signal amplification of various primary signals takes place, whereby the detection limit for the primary signals to be detected is modulated.

Erfindungsgemäß können sowohl diploide als auch haploide Hefezellen zum Einsatz kommen, wobei genetisch modifizierte und/oder authentische Hefezellen eingesetzt werden können.According to the invention, both diploid and haploid yeast cells can be used, wherein genetically modified and / or authentic yeast cells can be used.

Beispielsweise exprimieren diploide Zellen von Schizosaccharomyces (S.) pombe unter entsprechenden Umweltbedingungen (z. B. Stickstoff-, Kohlenstoffmangel) Pheromonrezeptoren. Vorteilhaft muss bei solchen Hefestämmen keine genetische Modifikation erfolgen, damit entsprechende Pheromonrezeptoren in den diploiden Hefezellen exprimiert werden.For example, diploid cells of Schizosaccharomyces (S.) pombe express pheromone receptors under appropriate environmental conditions (eg, nitrogen, carbon deficiency). Advantageously, in such yeast strains no genetic modification must be done so that appropriate Pheromone receptors are expressed in the diploid yeast cells.

Diploide Zellen einiger anderer Hefestämme weisen naturgemäß keine Pheromonrezeptoren auf. In diesem Fall bietet sich eine genetische Modifikation authentischer Hefezellen an.By nature, diploid cells of some other yeast strains have no pheromone receptors. In this case, a genetic modification of authentic yeast cells is appropriate.

Zellen besitzen zahlreiche Kommunikationssysteme, über die sie mit anderen Zellen Informationen austauschen können. Die Zellkommunikation kann dabei zwischen Zellen innerhalb einer Spezies (Intraspezies-Kommunikation) oder mehrerer Spezies (Interspezies-Kommunikation) erfolgen.Cells have many communication systems that allow them to exchange information with other cells. The cell communication can take place between cells within one species (intraspecies communication) or multiple species (interspecies communication).

Oft beruhen Kommunikationssysteme zwischen Zellen auf der Sezernierung eines Signalmoleküls durch eine Zelle in das umgebende Medium. Andere Zellen besitzen geeignete Rezeptorsysteme für diese Signalmoleküle und können diese wahrnehmen und dementsprechend auf diese reagieren.Often, communication systems between cells rely on the secretion of a signaling molecule by a cell into the surrounding medium. Other cells have suitable receptor systems for these signaling molecules and can perceive them and respond to them accordingly.

Solche Kommunikationssysteme umfassen beispielsweise das Quorum sensing von Mikroorganismen, Ammoniakpulse in Hefezellen, Pheromonsysteme, z. B. bei der Paarung von Hefezellen, sezernierte Wachstumsfaktoren, die innerhalb von Zellverbänden zur Kommunikation zwischen Zellen verwendet werden, Virulenzfaktoren von Mikroorganismen, die spezifisch an eukaryotische Rezeptoren binden oder immunmodulierende und Zelldifferenzierungen beeinflussende Faktoren. Die bei diesen Kommunikationssystemen sezernierten Signalmoleküle sind in der erfindungsgemäßen Einrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar.Such communication systems include, for example, quorum sensing of microorganisms, ammonia pulses in yeast cells, pheromone systems, e.g. For example, in the mating of yeast cells, secreted growth factors used within cell assemblies for communication between cells, virulence factors of microorganisms that specifically bind to eukaryotic receptors or immunomodulatory and cell differentiation affecting factors. The signal molecules secreted in these communication systems can be used in the device according to the invention and in the method according to the invention.

Viele Hefespezies, darunter die Bäckerhefe (Saccharomyces (S.) cerevisiae) und die Spalthefe (Schizosaccharomyces (S.) pombe), weisen einen asexuellen und einen sexuellen Reproduktionszyklus auf.Many yeast species, including baker's yeast (Saccharomyces (S.) cerevisiae) and fission yeast (Schizosaccharomyces (S.) pombe), have an asexual and a sexual reproductive cycle.

Heterothallische Hefespezies zeichnen sich durch einen stabilen haploiden Lebenszyklus aus. Dabei können die haploiden Zellen in zwei verschiedenen Paarungstypen vorliegen. Bei S. cerevisiae werden die beiden unterschiedlichen Paarungstypen als MATa (a) und MATα (α) bezeichnet.Heterothallic yeast species are characterized by a stable haploid life cycle. The haploid cells can be present in two different mating types. In S. cerevisiae, the two different mating types are called MATa (a) and MATα (α).

Haploide Zellen können sich mitotisch teilen, wobei zwei Tochterzellen entstehen, die sich hinsichtlich ihres Paarungstyps nicht von der Mutterzelle unterscheiden (asexuelle Reproduktion). Die haploiden Zellen synthetisieren zudem kurze Peptidhormone (Hefe-Pheromone) und setzen diese in die Umgebung frei um den eigenen Paarungstyp mitzuteilen. Beide Paarungstypen weisen zudem einen spezifischen Rezeptor für das Pheromon des anderen Paarungstyps auf, der an der Oberfläche der Zelle exponiert wird. Demnach synthetisieren beispielsweise α-Zellen von S. cerevisiae den α-Faktor und den Rezeptor für den a-Faktor, während Zellen vom Paarungstyp a den a-Faktor sowie einen Rezeptor für den α-Faktor produzieren.Haploid cells can divide mitotically, producing two daughter cells that are not different from the mother cell in their mating type (asexual reproduction). The haploid cells also synthesize short peptide hormones (yeast pheromones) and release them into the environment to communicate their own mating type. Both mating types also have a specific receptor for the pheromone of the other mating type, which is exposed on the surface of the cell. Thus, for example, S. cerevisiae α cells synthesize the α-factor and the a-factor receptor, while mating-type a cells produce the α-factor as well as a receptor for the α-factor.

Die Erfindung ist bei allen heterothallischen Hefezellen einsetzbar, die über einen Rezeptor für ein Primärsignal verfügen. Dabei ist es unerheblich, ob es sich um einen authentischen oder heterologen Rezeptor handelt. Gleiches gilt für die sich ggf. anschließende Signalkaskade sowie die Bildung der Signalmoleküle.The invention can be used with all heterothallic yeast cells which have a receptor for a primary signal. It does not matter whether it is an authentic or heterologous receptor. The same applies to the possibly subsequent signal cascade and the formation of the signal molecules.

Das erfindungsgemäße Kit umfasst zwei Typen von Hefezellen, die als Sensor-Zellen und Aktor-Zellen bezeichnet werden, die aus mindestens zwei unterschiedlichen Hefespezies ausgewählt sind.The kit of the invention comprises two types of yeast cells, referred to as sensor cells and actor cells, selected from at least two different yeast species.

Erfindungsgemäß kann zusätzlich zu den zwei Typen an Hefezellen, die als Sensor-Zellen und Aktor-Zellen bezeichnet werden, ein dritter Typ an Hefezellen vorhanden sein, die als Verstärker-Zellen bezeichnet werden.According to the invention, in addition to the two types of yeast cells, referred to as sensor cells and actor cells, there may be a third type of yeast cells, termed enhancer cells.

Die Sensor-Zellen weisen erfindungsgemäß mindestens ein Gen auf, das zur Synthese eines Pheromons führt. Bevorzugt ist ein Pheromon ein Hefe-Pheromon der gleichen Hefespezies, welches von haploiden Hefezellen des komplementären Paarungstyps erkannt werden kann. Haploide Hefezellen des komplementären Paarungstyps sind bevorzugt Aktor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen.According to the invention, the sensor cells have at least one gene which leads to the synthesis of a pheromone. Preferably, a pheromone is a yeast pheromone of the same yeast species which can be recognized by hippocampal yeast cells of the complementary mating type. Haploid yeast cells of the complementary mating type are preferably actor cells and / or enhancer cells.

Bei den Sensor-Zellen eines ersten Typs handelt es sich besonders bevorzugt um genetisch modifizierte haploide Hefezellen einer ersten heterothallischen Hefespezies, die einen stabilen haploiden und diploiden Lebenszyklus (Paarungstyp) aufweisen. Die erfindungsgemäßen Sensor-Zellen eines ersten Typs genetisch modifizierter haploider Hefezellen sind dabei ausschließlich aus einem Paarungstyp der zwei verschiedenen Paarungstypen einer ersten heterothallischen Hefespezies ausgewählt.The sensor cells of a first type are more preferably genetically modified haploid yeast cells of a first heterothallic yeast species having a stable haploid and diploid life cycle (mating type). The sensor cells of a first type of genetically modified haploid yeast cells according to the invention are selected exclusively from a mating type of the two different mating types of a first heterothallic yeast species.

Erfindungsgemäß weist ein Typ an Aktor-Zellen mindestens einen Pheromon-spezifischen Rezeptor auf, der durch ein Pheromon, das von den Sensor-Zellen sekretiert wird, aktiviert werden kann. Dies führt zur Expression eines Zielgens in dem Typ von Aktor-Zellen, wobei das Zielgen unter der Kontrolle eines Promotors gestellt ist.According to the invention, one type of actuator cells has at least one pheromone-specific receptor which can be activated by a pheromone secreted by the sensor cells. This results in expression of a target gene in the type of actor cells, with the target gene placed under the control of a promoter.

Bei mehreren zum Einsatz kommenden Typen an Aktor-Zellen, ist vorteilhaft ein Typ der Aktor-Zellen ausgewählt aus derselben Hefe-Spezies wie die Sensor-Zellen. In diesem Fall weist dieser Typ der Aktor-Zellen den komplementären Paarungstyp zu der Sensor-Zelle auf, was eine Intraspezies-Kommunikation zwischen diesem Typ der Aktor-Zellen und den Sensor-Zellen ermöglicht.When several types of actuator cells are used, one type of actuator cell is advantageously selected from the same yeast species as the sensor cells. In this case, this type of actuator cell has the complementary mating type to the sensor cell, which is an intraspecies Communication between this type of actuator cells and the sensor cells allows.

Die anderen Typen der Aktor-Zellen sind ausgewählt aus mindestens einer Hefe-Spezies, die sich von der der Sensor-Zellen unterscheidet. In diesem Fall findet eine Interspezies-Kommunikation zwischen den einzelnen Typen der Aktor-Zellen und den Sensor-Zellen statt.The other types of actuator cells are selected from at least one yeast species that is different from that of the sensor cells. In this case, interspecies communication takes place between the individual types of actuator cells and the sensor cells.

In einem Fall unterscheiden sich alle Pheromon-spezifischen Rezeptoren unterschiedlicher Typen an Aktor-Zellen untereinander, wobei jeder Pheromon-spezifische Rezeptor durch ein anderes Pheromon aktivierbar ist.In one case, all pheromone-specific receptors of different types of actor cells differ from each other, each pheromone-specific receptor being activatable by another pheromone.

In einem anderen Fall sind alle Pheromon-spezifischen Rezeptoren unterschiedlicher und/oder gleicher Typen an Aktor-Zellen durch das gleiche Pheromon aktivierbar.In another case, all pheromone-specific receptors of different and / or the same types of actuator cells can be activated by the same pheromone.

In den übrigen, dazwischen liegenden Fällen können bevorzugt einzelne oder mehrere zum Einsatz kommende Pheromon-spezifische Rezeptoren unterschiedlicher und/oder gleicher Typen an Aktor-Zellen durch das gleiche Pheromon aktiviert werden.In the other intervening cases, single or multiple pheromone-specific receptors of different and / or the same types of actuator cells may preferably be activated by the same pheromone.

Die Aktor-Zellen des erfindungsgemäßen Kits sind besonders bevorzugt genetisch modifizierte haploide Hefezellen sich unterscheidender Hefespezies, die einen stabilen Paarungstyp aufweisen. Jeder Typ der Aktor-Zellen weist einen Pheromon-spezifisch aktivierbaren Rezeptor und ein Zielgen auf, dessen Expression Pheromon-spezifisch induziert werden kann. Der jeweilige Rezeptor ist dabei durch ein Pheromon, das von der Sensor-Zelle synthetisiert und sekretiert werden kann, aktivierbar.The actor cells of the kit of the invention are particularly preferably genetically modified haploid yeast cells of distinct yeast species having a stable mating type. Each type of actuator cell has a pheromone-specifically activatable receptor and a target gene whose expression can be induced pheromone-specifically. The respective receptor is activated by a pheromone, which can be synthesized and secreted by the sensor cell.

Pheromone sind kleine interzelluläre Botenstoffe, die zur biochemischen Kommunikation zwischen den Sensor-, Aktor- und Verstärker-Zellen dienen. Als Pheromone können im erfindungsgemäßen Sinn neben den natürlichen Hefe-Pheromonen auch homologe oder modifizierte Peptide oder Peptidanaloga, oder andere organische Signalmoleküle zum Einsatz kommen, die in der Lage sind, an die Pheromon-Rezeptoren von Hefezellen zu binden und diese zu aktivieren.Pheromones are small intercellular messengers that serve for biochemical communication between the sensor, actuator and amplifier cells. As pheromones, in the sense of the invention, in addition to the natural yeast pheromones, it is also possible to use homologous or modified peptides or peptide analogues, or other organic signal molecules capable of binding to the pheromone receptors of yeast cells and activating them.

Beispielsweise kommunizieren beim Quorum Sensing Mikroorganismen mittels kleiner hormonähnlicher Signalmoleküle. Die als Autoinducer bezeichneten Signalmoleküle werden von bestimmten Bakterien mit Hilfe entsprechender Gene produziert und in das umliegende Kulturmedium abgegeben. Bakterien besitzen ein passendes Rezeptorsystem für diese Liganden und können nach Erreichen einer gewissen Konzentration an Signalmolekülen im Medium die Transkription bestimmter Gene aktivieren. Dabei gibt es speziesspezifische Autoinducer, mit denen Bakterien innerhalb der eigenen Bakterienspezies kommunizieren. Der sogenannte Autoinducer-2 hingegen ermöglicht die Kommunikation zwischen verschiedenen Bakterienspezies (Interspezies-Kommunikation).For example, in quorum sensing microorganisms communicate by means of small hormone-like signal molecules. The signal molecules known as autoinducers are produced by certain bacteria with the help of appropriate genes and released into the surrounding culture medium. Bacteria possess a suitable receptor system for these ligands and, after reaching a certain concentration of signal molecules in the medium, can activate the transcription of specific genes. There are species-specific autoinducers with which bacteria communicate within their own bacterial species. The so-called autoinducer-2, however, allows communication between different bacterial species (interspecies communication).

Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung nach Anspruch 2 können zusätzlich zu den Sensor-Zellen und Aktor-Zellen Verstärker-Zellen mindestens eines Typs an Hefezellen enthalten sein, wobei die Verstärker-Zellen eines Typs folgende Merkmale aufweisen:

• i. mindestens einen Rezeptor für ein Pheromon,
• ii. mindestens ein Gen, welches zur Synthese eines Pheromons führt, ist unter die Kontrolle eines Promotors gestellt.

According to an embodiment of the invention as claimed in claim 2, in addition to the sensor cells and actuator cells, amplifier cells of at least one type may be contained in yeast cells, wherein the amplifier cells of one type have the following features:

• i. at least one receptor for a pheromone,
• ii. at least one gene which leads to the synthesis of a pheromone is placed under the control of a promoter.

Ein Typ Verstärker-Zellen weist vorteilhaft mindestens ein Gen auf, das zur Synthese und Sekretion mindestens eines authentischen Pheromons oder eines davon abgeleiteten Pheromons führt, wobei bevorzugt mindestens ein Pheromon identisch gegenüber mindestens einem Pheromon der Sensor-Zellen ist.A type of enhancer cell advantageously has at least one gene which results in the synthesis and secretion of at least one authentic pheromone or a pheromone derived therefrom, wherein preferably at least one pheromone is identical to at least one pheromone of the sensor cells.

Bei einem authentischen Pheromon handelt es sich um ein gentechnisch hergestelltes Pheromon mit sämtlichen Eigenheiten (einschließlich posttranslationaler Modifikationen) des natürlich vorkommenden Gegenstücks.An authentic pheromone is a genetically engineered pheromone with all the peculiarities (including post-translational modifications) of its naturally occurring counterpart.

Bei einem abgeleiteten Pheromon handelt es sich um ein gentechnisch modifiziertes Pheromon, das strukturell nicht identisch gegenüber dem authentischen Pheromon ist und gegebenenfalls nicht sämtliche Eigenheiten des natürlich vorkommenden Gegenstücks aufweist. Ein abgeleitetes Pheromon ist in der Lage denselben Rezeptor zu aktivieren, wie das authentische Pheromon und das natürlich vorkommende Gegenstück.A derived pheromone is a genetically modified pheromone that is structurally not identical to the authentic pheromone and may not have all the peculiarities of its naturally occurring counterpart. A derived pheromone is able to activate the same receptor as the authentic pheromone and its naturally occurring counterpart.

Durch den Einsatz von Verstärker-Zellen, bei denen sich mindestens eines der synthetisierten und sekretierten Pheromone von denen der Sensor-Zellen unterscheidet, können vorteilhaft zusätzliche Aktor-Zellen aktiviert werden, ohne die Genetik der Sensor-Zellen modifizieren zu müssen. In diesem Fall können durch den Einsatz von demselben Typ an Sensor-Zellen in Kombination mit geeigneten Verstärker-Zellen, die einen Rezeptor für ein von den Sensor-Zellen sekretiertes Pheromon besitzen, simultan zusätzliche Aktor-Zellen (indirekt über Verstärker-Zellen) aktiviert werden.Through the use of amplifier cells in which at least one of the synthesized and secreted pheromones differs from those of the sensor cells, additional actor cells can advantageously be activated without having to modify the genetics of the sensor cells. In this case, by using the same type of sensor cells in combination with suitable enhancer cells possessing a receptor for a pheromone secreted by the sensor cells, it is possible to simultaneously activate additional actor cells (indirectly via enhancer cells) ,

Vorteilhaft kann durch die verschiedenen Typen an Hefezellen eine Signalübertragungskaskade aufgebaut werden. Dabei erkennen zunächst Sensor-Zellen mindestens ein Primärsignal, was zur Synthese mindestens eines Pheromons und somit zur intrinsischen Verstärkung des Primärsignals führt. Verstärker-Zellen erkennen über einen Pheromon-spezifischen Rezeptor ein von den Sensor-Zellen sekretiertes Pheromon, was zur Synthese und Sekretion eines Pheromons führt, das bevorzugt identisch zu einem Pheromon der Sensor-Zellen ist. Somit wird vorteilhaft das Primärsignal erneut intrinsisch verstärkt. Am Ende der Signalübertragungskaskade stehen Aktor-Zellen, in denen als Antwort auf das Pheromon, welches von Sensor- und/oder Verstärker-Zellen gebildet und sekretiert wird, ein Zielgen exprimiert wird. Die Expression des Zielgens kann über analytische Methoden detektiert werden.Advantageously, a signal transmission cascade can be established by the different types of yeast cells. At first, sensor cells recognize at least one primary signal, which leads to the synthesis of at least one pheromone and thus to the intrinsic amplification of the primary signal. Amplifier cells recognize a pheromone secreted by the sensor cells via a pheromone-specific receptor, resulting in the synthesis and secretion of a pheromone that is preferably identical to a pheromone of the sensor cells. Thus, advantageously, the primary signal is again amplified intrinsically. At the end of the signal transmission cascade are actuator cells in which a target gene is expressed in response to the pheromone, which is formed and secreted by sensor and / or amplifier cells. The expression of the target gene can be detected by analytical methods.

Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung nach Anspruch 3 sind die Sensor- und/oder Aktor- und/oder Verstärker-Zellen bevorzugt ausgewählt aus S. cerevisiae und/oder S. pombe.According to an embodiment of the invention according to claim 3, the sensor and / or actuator and / or amplifier cells are preferably selected from S. cerevisiae and / or S. pombe.

S. pombe weist ein analoges System der Paarungstypen zur sexuellen Vermehrung zu S. cerevisiae auf. Haploide Zellen der Spezies S. pombe existieren in zwei verschiedenen Paarungstypen, die als Plus (P) und Minus (M) bezeichnet werden. Auch die haploiden Zellen von S. pombe besitzen das Potential zur mitotischen Teilung (asexuelle Reproduktion). Zudem können die haploiden Zellen dieser Spezies ebenfalls Paarungstyp-spezifische Pheromone und entsprechende Rezeptoren synthetisieren, wobei P-Zellen den P-Faktor sowie einen Rezeptor für den M-Faktor produzieren, während Zellen des Paarungstyps M den M-Faktor in die Umgebung freisetzen und einen Rezeptor für den P-Faktor auf der Zelloberfläche exponieren. Im Gegensatz zu S. cerevisiae erfolgt die sexuelle Reproduktion der Spalthefe ausschließlich unter Bedingungen, die keine weitere mitotische Teilung der haploiden Zellen erlauben – vorrangig ein Mangel verfügbarer Stickstoffquellen. Während der asexuellen Reproduktion werden weder die Pheromone noch die entsprechenden Rezeptoren gebildet.S. pombe has an analogous system of mating types for sexual reproduction to S. cerevisiae. Haploid cells of the S. pombe species exist in two different mating types called plus (P) and minus (M). The haploid cells of S. pombe also have the potential for mitotic division (asexual reproduction). In addition, the haploid cells of these species can also synthesize mating type-specific pheromones and corresponding receptors, with P-cells producing the P-factor as well as an M-factor receptor, while M-type cells release the M-factor into the environment and one Expose the receptor for the P-factor on the cell surface. In contrast to S. cerevisiae, the sexual reproduction of fission yeast takes place exclusively under conditions that do not allow further mitotic division of haploid cells - primarily a lack of available nitrogen sources. During asexual reproduction, neither the pheromones nor the corresponding receptors are formed.

Weiterhin können die Sensor-Zellen mindestens ein weiteres Gen enthalten, das zur Synthese weiterer Pheromone führt, die sich von dem ersten Pheromon der Sensor-Zellen unterscheiden, und das unter die Transkriptionskontrolle eines weiteren Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt ist.Furthermore, the sensor cells may contain at least one further gene, which leads to the synthesis of further pheromones, which differ from the first pheromone of the sensor cells, and which is placed under the transcriptional control of a further primary signal-dependent promoter.

Die Pheromone, die von der Sensor-Zelle synthetisiert und sekretiert werden können, sind dabei bevorzugt authentische und/oder rekombinante Pheromone, die sich untereinander unterscheiden. Besonders bevorzugt sind die weiteren Pheromone Hefe-Pheromone anderer Hefespezies.The pheromones, which can be synthesized and secreted by the sensor cell, are thereby preferably authentic and / or recombinant pheromones which differ from one another. More preferably, the other pheromones are yeast pheromones of other yeast species.

Bevorzugt unterscheiden sich die Primärsignal-abhängigen Promotoren voneinander. Die spezifisch regulierbaren Promotoren können somit getrennt voneinander durch Primärsignale aktiviert werden, wodurch die Expression der Gene, die zur Synthese von Pheromonen führen, getrennt voneinander induziert wird. Durch das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem und/oder weiteren Primärsignalen werden die einzelnen Pheromone Primärsignal-spezifisch synthetisiert und von den Sensor-Zellen sekretiert.The primary signal-dependent promoters preferably differ from one another. The specific regulatable promoters can thus be activated separately from one another by primary signals, whereby the expression of the genes which lead to the synthesis of pheromones is induced separately from one another. By contacting the sensor cells with one and / or further primary signals, the individual pheromones are synthesized primary signal-specifically and secreted by the sensor cells.

Über eine Weiterentwicklung der Erfindung unterscheiden sich die signalabhängigen Promotoren voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind.Via a further development of the invention, the signal-dependent promoters differ from one another, so that the promoters can be activated in a primary-signal-specific manner.

Erfindungsgemäß kann somit die Anwesenheit unterschiedlicher Primärsignale in den Sensor-Zellen eines Typs zur Synthese und Sekretion unterschiedlicher Pheromone führen. Somit ist die Freisetzung eines Pheromons von der Anwesenheit des Primärsignals und der Wahl des Promotors abhängig, welcher ausschließlich nach der Wahrnehmung eines Primärsignals aktiviert wird.Thus, according to the invention, the presence of different primary signals in the sensor cells of one type can lead to the synthesis and secretion of different pheromones. Thus, the release of a pheromone depends on the presence of the primary signal and the choice of promoter, which is activated only after the perception of a primary signal.

Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung können die Gene, die für die Synthese sich unterscheidender Pheromone vermitteln, chimäre Leserahmen sein. Bevorzugt kodieren die enthaltenen Gensequenzen für das Signalpeptid sowie das Propeptid eines Sensor-Zell-spezifischen Hefe-Pheromons sowie die kodierende Sequenz eines Hefe-Pheromons, welches entweder komplementär zum Paarungstyp der Sensor-Zelle ist oder ein Hefe-Pheromon einer anderen Hefespezies darstellt. Dadurch kann vorteilhaft sichergestellt werden, dass das entsprechende Hefe-Pheromon effizient in den Sensor-Zellen synthetisiert und sekretiert wird.According to one embodiment of the invention, the genes that mediate the synthesis of distinct pheromones may be chimeric reading frames. Preferably, the gene sequences contained encode the signal peptide as well as the propeptide of a sensor cell-specific yeast pheromone and the coding sequence of a yeast pheromone which is either complementary to the mating type of the sensor cell or represents a yeast pheromone of another yeast species. This advantageously ensures that the corresponding yeast pheromone is efficiently synthesized and secreted in the sensor cells.

Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung sind die von der Sensor-Zelle sekretierten Pheromone bevorzugt Hefe-Pheromone.According to an embodiment of the invention, the pheromones secreted by the sensor cell are preferably yeast pheromones.

Hefe-Pheromone sind kurze natürliche, interzelluläre Signalpeptide in Hefezellen. Ihre Synthese und Sekretion aus der Hefezelle stellt einen komplexen biochemischen Prozess dar. Bei haploiden Hefezellen einer Spezies dienen Hefe-Pheromone dazu, ihrer Umgebung den eigenen Paarungstyp mitzuteilen. Hefe-Pheromone haploider Hefezellen eines Paarungstyps sind in der Lage mit entsprechenden Rezeptoren auf Hefezellen des komplementären Paarungstyps zu interagieren. Yeast pheromones are short natural, intercellular signal peptides in yeast cells. Their synthesis and secretion from the yeast cell represents a complex biochemical process. In haploid yeast cells of a species, yeast pheromones serve to communicate their own mating type to their environment. Yeast pheromone haploid yeast cells of a mating type are capable of interacting with corresponding receptors on yeast cells of the complementary mating type.

Befinden sich Zellen unterschiedlicher Paarungstypen in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander, wird ein umfassendes genetisches Programm initiiert, dessen Ziel die Fusion der haploiden Zellen zu einer diploiden Zygote darstellt (sexuelle Reproduktion).When cells of different mating types are in close proximity to each other, a comprehensive genetic program is initiated, the goal of which is to fuse the haploid cells into a diploid zygote (sexual reproduction).

Zum Beispiel kodiert der Leserahmen von MFα1, dem Strukturgen für den α-Faktor von S. cerevisiae, für ein NH₂-terminales Signalpeptid sowie vier Moleküle des α-Faktors. Nach der Transkription und Translation vermittelt das Signalpeptid den Import in das endoplasmatische Retikulum. Dort wird das Protein glykosyliert, anschließend erfolgt die Prozessierung durch die Aktivität mehrerer Proteasen, wobei der α-Faktor aus dem Peptid freigesetzt wird. Der α-Faktor, ein nicht-modifiziertes Peptidhormon aus 13 Aminosäuren, wird somit durch den Standard-Sekretionsweg der Bäckerhefe in die Umgebung abgegeben. Im Gegensatz dazu stellt der a-Faktor ein Lipid-modifiziertes und methyliertes Peptid aus zwölf Aminosäuren dar, dessen Prozessierung im Cytoplasma erfolgt und dessen Freisetzung die Aktivität eines spezifischen Transporter-Proteins erfordert.For example, the reading frame encodes MFα1, the structural gene for the S. cerevisiae α-factor, for an NH ₂ -terminal signal peptide and four Molecules of the α-factor. After transcription and translation, the signal peptide mediates the import into the endoplasmic reticulum. There, the protein is glycosylated, followed by the processing by the activity of several proteases, the α-factor is released from the peptide. The α-factor, an unmodified peptide hormone of 13 amino acids, is thus released into the environment through the standard secretory pathway of baker's yeast. In contrast, the a-factor is a lipid-modified and methylated peptide of twelve amino acids whose processing takes place in the cytoplasm and whose release requires the activity of a specific transporter protein.

Das Gen map2 kodiert für den P-Faktor von S. pombe und weist eine strukturelle Analogie zu MFα1 von S. cerevisiae auf. Nach der Translation enthält das Polypeptid ebenfalls eine Signalsequenz am NH₂-Terminus, die den Import des Proteins in das endoplasmatische Retikulum vermittelt, sowie vier Moleküle des P-Faktors. Im endoplasmatischen Retikulum erfolgt, analog zur Biosynthese des α-Faktors in der Bäckerhefe, die Modifikation des Proteins mit Zucker-Polymeren und die Freisetzung des aktiven P-Faktors durch proteolytische Spaltung des Peptids. Der P-Faktor von S. pombe stellt dabei ein nicht-modifiziertes Peptidhormon aus 23 Aminosäuren dar. Der M-Faktor hingegen ist, analog zum a-Faktor von S. cerevisiae, ein Lipid-modifiziertes und methyliertes Peptid. Dieses Pheromon wird ebenfalls im Cytoplasma prozessiert und durch einen spezifischen Transporter in der Plasmamembran in die Umgebung freigesetzt.The gene map2 encodes the p-factor of S. pombe and has a structural analogy to MFα1 of S. cerevisiae. After translation, the polypeptide also contains a signal sequence at the NH ₂ -terminus, which mediates the import of the protein into the endoplasmic reticulum, as well as four molecules of the P-factor. In the endoplasmic reticulum, similar to the biosynthesis of the α-factor in the baker's yeast, the modification of the protein with sugar polymers and the release of the active P-factor by proteolytic cleavage of the peptide. The p-factor of S. pombe represents a non-modified peptide hormone of 23 amino acids. The M-factor, however, is analogous to the a-factor of S. cerevisiae, a lipid-modified and methylated peptide. This pheromone is also processed in the cytoplasm and released into the environment by a specific transporter in the plasma membrane.

Die Rezeptoren für ein Pheromon verschiedener Typen an Aktor-Zellen, die bevorzugt an der Zelloberfläche exponiert sind, sind durch das gleiche Pheromon und/oder sich unterscheidende Pheromone aktivierbar. In Abhängigkeit der vorliegenden und/oder gewählten Rahmenbedingungen und dem daraus resultierenden Aufbau der Signalkaskade können die zum Einsatz kommenden Pheromon-spezifischen Rezeptoren verschiedener Typen an Aktor-Zellen identisch sein und/oder sich untereinander unterscheiden.The receptors for a pheromone of various types of actor cells, which are preferentially exposed on the cell surface, are activatable by the same pheromone and / or differing pheromones. Depending on the present and / or selected framework conditions and the resulting structure of the signal cascade, the pheromone-specific receptors of different types of actuator cells used can be identical and / or differ from one another.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind die Pheromon-spezifischen Rezeptoren verschiedener Typen an Verstärker-Zellen, die bevorzugt an der Zelloberfläche exponiert sind, durch das gleiche Pheromon und/oder sich unterscheidende Pheromone aktivierbar. In Abhängigkeit der vorliegenden und/oder gewählten Rahmenbedingungen und dem daraus resultierenden Aufbau der Signalkaskade, können die zum Einsatz kommenden Pheromon-spezifischen Rezeptoren verschiedener Typen an Verstärker-Zellen identisch sein und/oder sich untereinander unterscheiden.In a further embodiment of the invention, the pheromone-specific receptors of different types of enhancer cells, which are preferably exposed on the cell surface, can be activated by the same pheromone and / or differing pheromones. Depending on the present and / or selected framework conditions and the resulting structure of the signal cascade, the pheromone-specific receptors of different types of amplifier cells used can be identical and / or differ from one another.

Bevorzugt sind bei einem simultanen Einsatz von mindestens einem Typ an Aktor-Zellen und mindestens einem Typ an Verstärker-Zellen, die Rezeptoren von mindestens einem Typ an Aktor-Zellen und mindestens einem Typ an Verstärker-Zellen identisch oder können zumindest durch ein Pheromon aktiviert werden, das von der Sensor-Zelle synthetisiert wird.Preferably, in a simultaneous use of at least one type of actuator cells and at least one type of amplifier cells, the receptors of at least one type of actuator cells and at least one type of amplifier cells are identical or at least be activated by a pheromone which is synthesized by the sensor cell.

Pheromonrezeptoren sind hochspezifisch und zudem hochaffin, da Pheromone üblicherweise nur in kleinsten Mengen vorhanden sind. Dadurch ermöglichen sie vorteilhaft die hochsensitive Erfassung kleinster Mengen wirksamer Substanzen. Pheromone receptors are highly specific and also highly affine, as pheromones are usually only present in the smallest amounts. As a result, they advantageously enable the highly sensitive detection of the smallest amounts of active substances.

Die erfindungsgemäßen Rezeptoren für Pheromone sind authentische oder heterologe Pheromonrezeptoren. Pheromonrezeptoren sind dabei bevorzugt intrazelluläre oder membranständige Pheromonrezeptoren, die durch die haploiden Hefezellen exprimiert werden. The receptors for pheromones according to the invention are authentic or heterologous pheromone receptors. Pheromone receptors are preferably intracellular or membrane-bound pheromone receptors that are expressed by the haploid yeast cells.

Intrazelluläre bzw. nukleäre Rezeptoren ermöglichen vorteilhaft die Detektion von Pheromonen, ohne dass sichergestellt werden muss, dass die verwendeten haploiden Hefezellen auch über geeignete second messenger-Systeme für die Weiterleitung des Hormonsignals an den Zellkern verfügen. Intrazelluläre und nukleäre Pheromonrezeptoren binden vorteilhaft direkt an die DNA im Zellkern und regulieren so die Genexpression.Intracellular or nuclear receptors advantageously allow the detection of pheromones, without having to ensure that the haploid yeast cells used also have suitable second messenger systems for the transmission of the hormone signal to the nucleus. Intracellular and nuclear pheromone receptors preferentially bind directly to DNA in the nucleus and thus regulate gene expression.

Beim Einsatz von Sensor-Zellen einer Spezies, die einen stabilen Paarungstyp aufweisen, werden bevorzugt als ein Typ von Aktor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen Hefezellen derselben Spezies eingesetzt, die einen komplementären Paarungstyp zur Sensor-Zelle aufweisen. In diesem Fall wird der Rezeptor an der Oberfläche der Aktor- und/oder Verstärker-Zellen (membranständig) exponiert und durch ein von der Sensor-Zelle synthetisiertes und sekretiertes Hefe-Pheromon aktiviert. When using sensor cells of a species having a stable mating type, yeast cells of the same species having a complementary mating type to the sensor cell are preferably used as a type of actuator cells and / or enhancer cells. In this case, the receptor is exposed on the surface of the actuator and / or enhancer cells (membrane-bound) and activated by a yeast pheromone synthesized and secreted by the sensor cell.

Die weiteren Typen an Aktor- und/oder Verstärker-Zellen des erfindungsgemäßen Kits exponieren vorteilhaft an ihrer Zelloberfläche Rezeptoren, die durch andere von der Sensor-Zelle synthetisierte und sekretierte Hefe-Pheromone aktiviert werden können.The other types of actuator and / or enhancer cells of the kit of the invention advantageously expose receptors on their cell surface which can be activated by other yeast pheromones synthesized and secreted by the sensor cell.

Vorteilhaft werden nach einer Ausgestaltung die Rezeptoren der verschiedenen Typen an Aktor-Zellen und der Verstärker-Zellen konstitutiv exprimiert.Advantageously, according to one embodiment, the receptors of the different types of actuator cells and the amplifier cells are constitutively expressed.

Im Falle der Verwendung von S. pombe als Aktor- und/oder Verstärker-Zellen, sind die Aktor- und/oder Verstärker-Zellen durch eine Inaktivierung der Proteinkinase A gekennzeichnet. Dadurch wird vorteilhaft sichergestellt, dass die Zellen zu jedem Zeitpunkt den Rezeptor für das Pheromon sowie weitere Proteine, die für die Wahrnehmung des Pheromons und die Weiterleitung des Pheromonsignals notwendig sind, synthetisieren.In the case of using S. pombe as actor and / or enhancer cells, the actor and / or enhancer cells are characterized by an inactivation of protein kinase A. This advantageously ensures that the cells at all times the receptor for the pheromone as well synthesize additional proteins necessary for the perception of the pheromone and the transmission of the pheromone signal.

In S. pombe ist die Initiation sexueller Prozesse von einer Limitation der Stickstoff- bzw. Kohlenstoffquelle abhängig, die die mitotische Teilung der haploiden Zellen unterbinden. Die Wahrnehmung dieser Limitation führt zu einer Reduktion der Aktivität der Adenylatcyclase, die ein intrazelluläres Signalmolekül (cyclisches Adenosin-Monophosphat, cAMP) synthetisiert. Dieses Protein hat eine zentrale Funktion in der Signaltransduktion der Verfügbarkeit von Glucose. Die Anwesenheit von cAMP führt zur Aktivierung der Proteinkinase A. Die Signalkaskade kann durch eine Funktionsverlust-Mutation in einem der Gene, dessen Genprodukt an der Signaltransduktion beteiligt ist, unterbunden werden (z. B. durch eine Funktionsverlust-Mutation des Adenylatcyclase-Gens). Dies führt zu einer Inaktivierung der Proteinkinase A und somit zu einer sexuellen Differenzierung unabhängig von Nährstofflimitationen. Durch die Inaktivierung der Proteinkinase A entfällt daher die Notwendigkeit einer Nährstofflimitation der Aktor- und/oder Verstärker-Zellen. Dadurch werden die Anforderungen an die biochemische Umgebung des Sensor-Aktor-Systems vorteilhaft reduziert.In S. pombe, the initiation of sexual processes is dependent on a limitation of the nitrogen or carbon source, which prevents the mitotic division of haploid cells. The perception of this limitation leads to a reduction in the activity of adenylate cyclase, which synthesizes an intracellular signaling molecule (cyclic adenosine monophosphate, cAMP). This protein has a central function in the signal transduction of the availability of glucose. The presence of cAMP leads to activation of protein kinase A. The signaling cascade can be prevented by a loss of function mutation in one of the genes whose gene product is involved in signal transduction (eg, by a loss of function mutation of the adenylate cyclase gene). This leads to an inactivation of the protein kinase A and thus to a sexual differentiation independent of nutrient imitations. Inactivation of protein kinase A therefore eliminates the need for nutrient limitation of the actor and / or enhancer cells. As a result, the requirements for the biochemical environment of the sensor-actuator system are advantageously reduced.

Durch eine vorteilhafte genetische Modifikation (z. B. Inaktivierung) können die Aktor- und/oder Verstärker-Zellen eine höhere Sensitivität gegenüber den Hefe-spezifischen Pheromonen aufweisen als authentische Hefezellen.By an advantageous genetic modification (eg inactivation), the actor and / or enhancer cells may have a higher sensitivity to the yeast-specific pheromones than authentic yeast cells.

So kann beispielsweise bei S. pombe das Gen für die Protease Sxa2p inaktiviert werden. Die Protease Sxa2p wird von M-Zellen von S. pombe als Antwort auf ein Pheromonsignal in die Umgebung freigesetzt und degradiert den P-Faktor. Eine Funktionsverlust-Mutation im codierenden Gen vermittelt eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem Pheromon. Eine Hypersensitivität gegenüber dem P-Faktor kann z. B. auch durch eine Funktionsverlust-Mutation in den Genen rgs1 oder gap1 sowie durch ein dauerhaft aktives Allel von ras1 (ras1^Val17) oder gpa1 (gpa1^QL) erreicht werden.For example, in S. pombe the gene for the protease Sxa2p can be inactivated. The protease Sxa2p is released by S. pombe M cells into the environment in response to a pheromone signal and degrades the P factor. A loss of function mutation in the coding gene mediates an increased sensitivity to the pheromone. Hypersensitivity to the P-factor may e.g. B. by a loss of function mutation in the genes rgs1 or gap1 and by a permanently active allele of ras1 (ras1 ^Val17 ) or gpa1 (gpa1 ^QL ) can be achieved.

Die Aktor-Zellen von S. pombe werden vorteilhaft genetisch so modifiziert, dass sie nach der Wahrnehmung des Hefe-Pheromons ein spezifisches Protein synthetisieren. Die Pheromon-abhängige Synthese des Proteins wird durch einen Pheromon-spezifisch aktivierten Promotor, der die Expression des spezifischen Gens kontrolliert, vermittelt. Dabei werden beispielsweise die Promotoren von rep1 bzw. sxa2 eingesetzt.Advantageously, the S. pombe actor cells are genetically engineered to synthesize a specific protein following the perception of the yeast pheromone. The pheromone-dependent synthesis of the protein is mediated by a pheromone-specifically activated promoter that controls the expression of the specific gene. For example, the promoters of rep1 or sxa2 are used.

Der Meiose-spezifische Transkriptionsfaktor Rep1p hat eine bedeutende Funktion für die Initiation der Meiose in diploiden Zellen von S. pombe. Er ist für die Replikation der DNA vor der ersten meiotischen Teilung essentiell und reguliert die Transkription einer Subpopulation der frühen meiotischen Gene. Die Transkription von rep1 wird durch die Perzeption des Pheromons induziert. Bereits nach 2 h kann eine hohe Konzentration der rep1-mRNA nachgewiesen werden. Dabei erfolgt durch die Anwesenheit von Pheromonen eine Stimulation der Transkription um den Faktor zehn.The meiosis-specific transcription factor Rep1p has an important function for the initiation of meiosis in S. pombe diploid cells. It is essential for the replication of DNA prior to the first meiotic division and regulates the transcription of a subpopulation of early meiotic genes. The transcription of rep1 is induced by the perception of the pheromone. After only 2 h, a high concentration of the rep1 mRNA can be detected. The presence of pheromones stimulates transcription by a factor of ten.

Die Carboxypeptidase Sxa2p degradiert den P-Faktor im Medium. Die Transkription von sxa2 ist dabei direkt abhängig von der Anwesenheit des P-Faktors und findet nur in M-Zellen statt. Dabei kann die mRNA bereits 2 h nach Applikation des Pheromons nachgewiesen werden. Dieser Promotor vermittelt eine P-Faktor-induzierte Transkriptionsinduktion, wobei die Transkription um den Faktor 1616 stimuliert wird (Xue-Franzén et al., BMC Genomics 2006, 7, 303).The carboxypeptidase Sxa2p degrades the P-factor in the medium. The transcription of sxa2 is directly dependent on the presence of the P-factor and occurs only in M-cells. In this case, the mRNA can already be detected 2 h after application of the pheromone. This promoter mediates P-factor induced transcription induction, stimulating transcription by a factor of 1616 (Xue-Franzén et al., BMC Genomics 2006, 7, 303).

Durch die Wahl der Promotoren von rep1 bzw. sxa2 kann vorteilhaft sichergestellt werden, dass die Synthese des spezifischen Proteins in den Aktor-Zellen ausschließlich nach der Wahrnehmung des Pheromons erfolgt. Dabei vermitteln diese Promotoren zudem eine sehr starke Expression des Gens für das spezifische Protein.By choosing the promoters of rep1 or sxa2 it can be advantageously ensured that the synthesis of the specific protein in the actor cells takes place exclusively after the perception of the pheromone. Moreover, these promoters mediate a very strong expression of the gene for the specific protein.

Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Hefezellen um heterothallische haploide Hefezellen mit einem stabilen Paarungstyp. Vorteilhaft exprimieren diese Zellen bereits einen Rezeptor für ein Pheromon, welches von den Sensor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen synthetisiert wird.Preferably, the yeast cells according to the invention are heterothallic haploid yeast cells with a stable mating type. Advantageously, these cells already express a receptor for a pheromone which is synthesized by the sensor cells and / or enhancer cells.

Nach einer Weiterbildung der Erfindung ist der Promotor der Aktor-Zellen und der Verstärker-Zellen ein authentischer Hefepromotor oder ein davon abgeleiteter Promotor.According to a development of the invention, the promoter of the actor cells and the enhancer cells is an authentic yeast promoter or a promoter derived therefrom.

Vorteilhaft werden die Aktor-Zellen genetisch derart modifiziert, dass sie nach der Wahrnehmung eines von den Sensor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen synthetisierten und sekretierten Pheromons ein spezifisches Protein synthetisieren, das von dem Zielgen kodiert wird.Advantageously, the actor cells are genetically modified to synthesize a specific protein encoded by the target gene following the perception of a pheromone synthesized and secreted by the sensor cells and / or enhancer cells.

Vorteilhaft werden z. B. die Aktor-Zellen von S. cerevisiae genetisch derart modifiziert, dass sie nach der Wahrnehmung des α-Faktors ein spezifisches Protein synthetisieren. Dafür wird der Leserahmen für das spezifische Protein beispielsweise unter die Transkriptionskontrolle des FIG1-Promotors gestellt. Dieser Promotor wird nach Wahrnehmung des α-Faktors durch a-Zellen der Bäckerhefe aktiviert, wobei innerhalb von 20 min nach Zugabe des Pheromons die Konzentration der FIG1-mRNA um den Faktor 97 erhöht wird (Roberts et al., Science 2000, 287(5454), 873–880). Das Protein Fig1p hat eine Funktion bei der Aufnahme von Ca²⁺ in die Zellen während der Konjugation haploider Zellen. Auf Proteinebene kann Fig1p bereits eine Stunde nach Zugabe des α-Faktors nachgewiesen werden. Der FIG1-Promotor vermittelt daher eine schnelle und starke, Pheromon-abhängige Expression des Gens für das spezifische Protein.Advantageously z. For example, the S. cerevisiae actor cells are genetically modified to synthesize a specific protein following the perception of the α-factor. For example, the reading frame for the specific protein is placed under the transcriptional control of the FIG1 promoter. This promoter is activated after perception of the α-factor by a-cells of the baker's yeast, wherein within 20 minutes after addition of the pheromone, the concentration of FIG1 mRNA is increased by a factor of 97 (Roberts et al., Science 2000, 287 (5454 ), 873-880). The protein Fig1p has a function in the uptake of Ca ²⁺ into the cells during the conjugation of haploid cells. At the protein level Fig1p can already be detected one hour after the addition of the α-factor. The FIG1 promoter therefore mediates rapid and strong, pheromone-dependent expression of the gene for the specific protein.

Beim Einsatz von S. cerevisiae als Aktor-Zelle und/oder Verstärker-Zelle ist vorteilhaft das Protein Fig1p inaktiviert. Hohe lokale Konzentrationen an Pheromonen lösen bei Hefezellen Zelltod aus. Durch die Inaktivierung des Fig1p wird dieser Effekt verhindert. Dadurch wird vorteilhaft verhindert, dass die Hefezellen durch eine hohe Konzentration an Pheromon, die durch ein starkes Primärsignal verursacht wird, absterben und damit für das Verfahren nicht mehr zur Verfügung stehen (Zhang et al., Mol Biol Cell. 2006, 17, 3409–3422).When S. cerevisiae is used as the actor cell and / or enhancer cell, the protein Fig 1p is advantageously inactivated. High local concentrations of pheromones trigger cell death in yeast cells. The inactivation of Fig1p prevents this effect. This advantageously prevents the yeast cells from dying off due to a high concentration of pheromone, which is caused by a strong primary signal, and thus is no longer available for the process (Zhang et al., Mol Biol Cell. 2006, 17, 3409- 3422).

Nach einer der erfindungsgemäßen Ausgestaltungen gehören die Aktor-Zellen eines ersten Typs genetisch modifizierter haploider Hefezellen und die Sensor-Zellen zur gleichen Hefespezies, wobei die Aktor-Zellen des ersten Typs genetisch modifizierter haploider Hefezellen den komplementären Paarungstyp zu den Sensor-Zellen aufweisen.According to one embodiment of the invention, the actor cells of a first type of genetically modified haploid yeast cells and the sensor cells belong to the same yeast species, wherein the actor cells of the first type of genetically modified haploid yeast cells have the complementary mating type to the sensor cells.

Erfindungsgemäß kann die Expression des Zielgens, das für ein Sekundärsignal kodiert, mittels analytischer Methoden detektiert werden. Die zum Einsatz kommenden analytischen Methoden sind dabei dem Fachmann bekannt und sind z. B. ausgewählt aus spektrophotometrischen Methoden, Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie, Quarzkristallmikrowaage und Immunoassays.According to the invention, the expression of the target gene which codes for a secondary signal can be detected by analytical methods. The analytical methods used are known in the art and are for. Selected from spectrophotometric methods, surface plasmon resonance spectroscopy, quartz crystal microbalance and immunoassays.

Die Bildung eines Sekundärsignals in Folge der Expression des Zielgens kann dabei entweder in Form der Beeinflussung der physiologischen Leistung und/oder der Stoffwechselleistung der Aktor-Zelle detektiert werden, oder als extrazelluläre oder intrazelluläre katalytische Reaktion, oder in Form eines Markerproteins.The formation of a secondary signal as a result of the expression of the target gene can be detected either in the form of influencing the physiological performance and / or the metabolic performance of the actuator cell, or as an extracellular or intracellular catalytic reaction, or in the form of a marker protein.

Viele Hefe-Spezies erweisen sich hinsichtlich bestimmter physiologischer Leistungen als einzigartig. Meist haben nur wenige Hefe-Spezies das Potential, bestimmte Nährstoff- und Energiequellen für den eigenen Metabolismus nutzen zu können. So weisen beispielsweise nur wenige Arten die Fähigkeit auf, bestimmte organische Substrate wie Fette, Alkane und aromatische Verbindungen bzw. organische Polymere wie Cellulose und Chitin enzymatisch abzubauen und diese Verbindungen somit als Substrat nutzen zu können. Des Weiteren werden viele Stoffwechselendprodukte und Sekundärmetabolite nur von sehr wenigen Hefe-Spezies synthetisiert, wobei jede Art durch ihren individuellen Anabolismus gekennzeichnet ist.Many yeast species are unique in terms of specific physiological benefits. In most cases, only a few yeast species have the potential to use certain nutrient and energy sources for their own metabolism. For example, only a few species have the ability to enzymatically degrade certain organic substrates such as fats, alkanes and aromatic compounds or organic polymers such as cellulose and chitin and thus to be able to use these compounds as a substrate. Furthermore, many metabolic end products and secondary metabolites are synthesized by only a very few yeast species, each species being characterized by its individual anabolism.

Die vorliegende Vorrichtung ermöglicht die Integration verschiedener Hefe-Spezies in einem Sensor-Aktor-System und deren gezielte Steuerung auf der Basis der Pheromon-basierten Interspezies-Kommunikation. Damit können die individuellen physiologischen Leistungen, die als Alleinstellungsmerkmal bestimmter Spezies gelten, in einem gemeinsamen System vorteilhaft eingesetzt werden.The present device enables the integration of various yeast species in a sensor-actuator system and their targeted control based on the pheromone-based interspecies communication. Thus, the individual physiological performances, which are regarded as a unique selling point of certain species, can be advantageously used in a common system.

Die Umsetzung von Substraten zu einem Produkt mithilfe enzymatischer Reaktionen wird in industriellem Maßstab als Biokatalyse bezeichnet. Dabei weist der Einsatz von Enzymen im Vergleich zur chemischen Synthese meist einige Vorteile auf, insbesondere in Bezug auf die Substratspezifität, die Regio- und Stereoselektivität und die – im Vergleich zur chemischen Synthese – milden Reaktionsbedingungen. Dies ermöglicht die Synthese komplexer organischer Verbindungen mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit. Für biokatalytische Prozesse werden teilweise isolierte Enzyme eingesetzt, die jedoch im Verlauf der Zeit ihre Aktivität verlieren können. Der Einsatz intakter Zellen, die das entsprechende Enzym kontinuierlich synthetisieren, kann den Aktivitätsverlust dagegen unterbinden.The reaction of substrates into a product by enzymatic reactions is termed biocatalysis on an industrial scale. The use of enzymes in comparison to the chemical synthesis usually has some advantages, in particular with respect to the substrate specificity, the regio- and stereoselectivity and - in comparison to the chemical synthesis - mild reaction conditions. This allows the synthesis of complex organic compounds in high yield and high purity. For biocatalytic processes partially isolated enzymes are used, which can lose their activity over time, however. The use of intact cells that synthesize the corresponding enzyme continuously, however, can prevent the loss of activity.

Die Synthese komplexer organischer Verbindungen erfordert teilweise mehrere enzymatische Reaktionen. Um in diesen Prozessen die isolierten Enzyme durch intakte Hefe-Zellen ersetzen zu können, ist aufgrund der individuellen physiologischen Charakteristika der Einsatz verschiedener Hefe-Spezies unerlässlich. Die gezielte und effiziente Steuerung mehrstufiger Biokatalyse-Prozesse auf der Basis intakter Hefe-Zellen unterschiedlicher Spezies kann mithilfe der vorliegenden Vorrichtung realisiert werden. So katalysiert eine Population von Hefe-Zellen einer ersten Spezies die erste Reaktion des Biokatalyse-Prozesses, wobei ein Substrat in ein Zwischenprodukt umgesetzt wird. Der Abschluss der ersten enzymatischen Reaktion, der mit einer Abnahme der Substratkonzentration und der Akkumulation des Zwischenproduktes korreliert, wird durch die Zellen der ersten Spezies wahrgenommen. Die Perzeption dieses Primärsignals führt erfindungsgemäß in den Zellen der ersten Spezies zur Synthese und Sekretion eines Pheromons einer zweiten Spezies. Die Aktor-Zellen der zweiten Spezies reagieren auf die Anwesenheit des Pheromons, wobei deren Pheromonantwort mit der Synthese eines zweiten Enzyms gekoppelt ist. Dieses Enzym katalysiert den zweiten Schritt des Biokatalyse-Prozesses. Somit kann eine gezielte und effiziente Steuerung mehrstufiger Biokatalyse-Prozesse auf der Basis einer Pheromon-basierten Interspezies-Kommunikation realisiert werden.The synthesis of complex organic compounds sometimes requires several enzymatic reactions. In order to be able to replace the isolated enzymes by intact yeast cells in these processes, the use of different yeast species is indispensable because of the individual physiological characteristics. The targeted and efficient control of multi-stage biocatalysis processes based on intact yeast cells of different species can be realized using the present device. Thus, a population of yeast cells of a first species catalyzes the first reaction of the biocatalysis process, converting a substrate into an intermediate. The completion of the first enzymatic reaction, which correlates with a decrease in substrate concentration and accumulation of the intermediate, is sensed by the cells of the first species. The perception of this primary signal results according to the invention in the cells of the first species for the synthesis and secretion of a pheromone of a second species. The second-species actor cells respond to the presence of the pheromone, with their pheromone response coupled with the synthesis of a second enzyme. This enzyme catalyzes the second step of the biocatalysis process. Thus, a targeted and efficient control of multi-stage biocatalysis processes based on a pheromone-based interspecies communication can be realized.

Unter Primärsignalen sind dabei detektierbare Umweltfaktoren zu verstehen, für die die erfindungsgemäßen Sensor-Zellen geeignete Rezeptorsysteme besitzen.Primary signals are understood to be detectable environmental factors for which the inventive sensor cells have suitable receptor systems.

Bei den detektierbaren Umweltfaktoren handelt es sich beispielsweise um Änderungen physikalischer Parameter, chemische Additive oder um Limitationen bestimmter für die Hefezelle essentieller Nährstoffe.The detectable environmental factors are, for example, changes in physical parameters, chemical additives or limitations of certain essential nutrients for the yeast cell.

Über eine Weiterentwicklung der Erfindung kann das Primärsignal durch eine Nährstofflimitation ausgelöst werden, wobei die Nährstofflimitation detektiert wird. Unter Limitationen bestimmter für die Hefezelle essentieller Nährstoffe versteht man z. B. einen Mangel an verfügbaren Stickstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Eisen- oder Kupferquellen, Kohlenstoffquellen, essentieller Aminosäuren, Sauerstoff, oder andere Signale wie z. B. Temperatur, DNA-Schäden, Stress im endoplasmatischen Retikulum oder oxidativer Stress.Via a further development of the invention, the primary signal can be triggered by a nutrient limitation, wherein the nutrient limitation is detected. Under limitations of certain for the yeast cell essential nutrients are understood z. As a lack of available nitrogen, sulfur, phosphorus, iron or copper sources, carbon sources, essential amino acids, oxygen, or other signals such. Temperature, DNA damage, stress in the endoplasmic reticulum or oxidative stress.

Wird das Primärsignal durch eine Nährstofflimitation ausgelöst, so handelt es sich bei dem signalabhängigen Promotor der Sensor-Zellen bevorzugt um einen Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefel-spezifisch regulierten Promotor. Das zu verstärkende Primärsignal ist Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefelmangel.If the primary signal is triggered by a nutrient limitation, the signal-dependent promoter of the sensor cells is preferably a nitrogen, phosphate or sulfur-specifically regulated promoter. The primary signal to be amplified is nitrogen, phosphate or sulfur deficiency.

Bevorzugt wird als Promotor ein DNA-Abschnitt verwendet, der bis zu 1000 bp 5`-seitig des Startcodons des von ihm kontrollierten Gens umfasst, oder ein Teilabschnitt dieses DNA-Abschnitts, der in der Lage ist, z. B. auf die Limitierung von Stickstoff, Phosphor oder Schwefel hin das unter Kontrolle dieser Sequenz liegende Zielgen zu aktivieren oder zu unterdrücken. The promoter used is preferably a DNA segment which comprises up to 1000 bp 5 'of the start codon of the gene which it controls, or a partial segment of this DNA segment which is capable, e.g. B. on the limitation of nitrogen, phosphorus or sulfur to activate or suppress the target gene under control of this sequence.

Der Stickstoff-, Phosphat- bzw. Schwefel-spezifisch regulierte Promotor ist bevorzugt ausgewählt aus den Promotoren der Gene YIR028W, YJR152W, YAR071W, YHR136C, YFL055W und YLL057C von S. cerevisiae.The nitrogen-, phosphate- or sulfur-specifically regulated promoter is preferably selected from the promoters of the genes YIR028W, YJR152W, YAR071W, YHR136C, YFL055W and YLL057C from S. cerevisiae.

Gleichzeitig oder Alternativ kann das Primärsignal durch das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einer Substanz (chemisches Additiv) ausgelöst werden, wobei die Substanz detektiert wird.Simultaneously or alternatively, the primary signal can be triggered by contacting the sensor cells with a substance (chemical additive), wherein the substance is detected.

Die Sensor-Zellen können dabei auch dahingehend genetisch verändert sein, dass sie ein Rezeptorsystem exprimieren, das die Hefezellen natürlicherweise nicht besitzen. Die extrazellulären Primärsignale, die diese Rezeptorsysteme empfangen und verarbeiten können, sind chemische Additive, beispielsweise Ionen, anorganische und organische Verbindungen und Biomoleküle wie Proteine, Peptide, Lipide, Zucker oder Nukleinsäuren, oder auch Änderungen physikalischer Parameter, beispielsweise elektromagnetische Strahlung, Druck, Temperatur oder Leitfähigkeit.The sensor cells can also be genetically modified to express a receptor system that the yeast cells naturally do not possess. The extracellular primary signals which these receptor systems can receive and process are chemical additives, for example ions, inorganic and organic compounds and biomolecules such as proteins, peptides, lipids, sugars or nucleic acids, or also changes in physical parameters, for example electromagnetic radiation, pressure, temperature or Conductivity.

Im Falle, dass es sich bei dem zu detektierenden Primärsignal um einen chemischen Analyten handelt, kann sowohl eine extrazelluläre Detektion über membranständige Rezeptoren, als auch eine intrazelluläre Detektion über einen nukleären Rezeptor erfolgen.In the case where the primary signal to be detected is a chemical analyte, both extracellular detection via membrane-bound receptors and intracellular detection via a nuclear receptor can take place.

Bevorzugt kann das Primärsignal auch durch das Kontaktieren der Sensorzelle mit einem stressinduzierenden Agens ausgelöst werden.Preferably, the primary signal can also be triggered by contacting the sensor cell with a stress-inducing agent.

Hefe-Zellen weisen Rezeptoren für viele stressinduzierende Agenzien und physikalische Faktoren auf. Dabei werden zelluläre Stressreaktionen beispielsweise durch Oxidationsmittel (z. B. Wasserstoffperoxid und Sauerstoffradikale), Schwermetallionen (z. B. Cadmium, Blei und Kupfer), DNA-schädigende Agenzien (z. B. alkylierende Agenzien), Agenzien mit stabilisierender oder destabilisierender Wirkung auf das Cytoskelett (z. B. Colchizin, Phalloidin) oder antimikrobielle Agenzien ausgelöst. Yeast cells have receptors for many stress-inducing agents and physical factors. In this case, cellular stress reactions, for example by oxidants (eg hydrogen peroxide and oxygen radicals), heavy metal ions (eg cadmium, lead and copper), DNA-damaging agents (eg alkylating agents), agents with stabilizing or destabilizing effect the cytoskeleton (eg, colchicine, phalloidin) or antimicrobial agents.

Erfindungsgemäß kodiert das Zielgen der Aktor-Zellen für ein Markerprotein. Als Markerproteine werden dabei bevorzugt fluoreszierende Proteine wie das Grünfluoreszierende Protein (GFP) oder das Turbo-Rot-fluoreszierende Protein (tRFP) eingesetzt oder Enzyme wie Luciferasen und/oder β-Galactosidasen verwendet.According to the invention, the target gene of the actor cells encodes a marker protein. Fluorescent proteins such as the green fluorescent protein (GFP) or the turbo-red fluorescent protein (tRFP) are preferably used as marker proteins, or enzymes such as luciferases and / or β-galactosidases are used.

Als fluoreszierende Proteine werden besonders bevorzugt GFP, YFP, CFP, BFP, RFP, DsRed, PhiYFP, JRed, emGFP („Emerald Green“), Azami-Green, Zs-Green oder AmCyan 1. Ganz besonders bevorzugt verwendet werden fluoreszierende Proteine, die so verändert wurden, dass sie besonders stark fluoreszieren wie eGFP, eYFP, TagCFP, TagFP365, TagGFP, TagRFP und TagYFP. Weiterhin werden ganz besonders bevorzugt fluoreszierende Proteine wie dsRed-Express, TurboFP602, TurboFP635, TurboGFP, TurboRFP und TurboYFP verwendet, deren Aminosäuresequenz dahingehend verändert wurde, dass sie möglichst schnell nach ihrer Bildung beginnen zu fluoreszieren.Particularly preferred fluorescent proteins are GFP, YFP, CFP, BFP, RFP, DsRed, PhiYFP, JRed, emGFP (Emerald Green), Azami-Green, Zs-Green or AmCyan 1. Fluorescent proteins which are very particularly preferably used have been engineered to fluoresce particularly strongly, such as eGFP, eYFP, TagCFP, TagFP365, TagGFP, TagRFP and TagYFP. Furthermore, very particular preference is given to using fluorescent proteins such as dsRed-Express, TurboFP602, TurboFP635, TurboGFP, TurboRFP and TurboYFP, whose amino acid sequence has been modified such that they begin to fluoresce as soon as possible after their formation.

In dem erfindungsgemäß verwendeten Kit liegen die Sensor-Zellen und/oder die Aktor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen in einem Kulturmedium vor, über das der Austausch von Signalmolekülen zwischen den Zellen erfolgt. Die Zellen des Kits liegen dabei entweder suspendiert in Lösung oder immobilisiert auf einem Träger vor. Vorzugsweise handelt es sich beim Kulturmedium um ein flüssiges, vorzugsweise wässriges Nährmedium, über das der Austausch von Signalmolekülen zwischen den Zellen erfolgt. Das Nährmedium weist dabei eine dem Fachmann bekannte Zusammensetzung auf, die für die Kultivierung von Hefezellen geeignet ist. Dem Kulturmedium können dabei auch noch andere Additive wie z. B. Antibiotika oder Pufferkomponenten zugesetzt sein. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung verschiedener Additive wie lösliche organische Salze, d.h. Metallsalze organischer Carbon- oder Sulfonsäuren bzw. offenkettige oder cyclische Ammoniumsalze und Quartärsalze von N-Heterocyclen sowie niedermolekulare Polyanionen oder Polykationen, oder wasserlösliche organische Verbindungen wie Polycarbonsäuren, Harnstoff-Derivate, Kohlenhydrate, Polyole, wie Glycerin, Polyethylenglycol und Polyvinylalkohol, oder Gelatine, die als Weichmacher, Feuchthaltemittel und Porenbildner wirken, die Zelllyse hemmen und die Überlebensfähigkeit der eingebetteten Zellen beträchtlich verlängern. Diese Additive führen nicht zu einem detektierbaren Signal.In the kit used according to the invention, the sensor cells and / or the actuator cells and / or the amplifier cells are present in a culture medium, via which the exchange of signal molecules takes place between the cells. The cells of the kit are either suspended in solution or immobilized on a support. The culture medium is preferably a liquid, preferably aqueous nutrient medium, via which the exchange of signal molecules takes place between the cells. The nutrient medium in this case has a known to the expert composition, which for the cultivation of yeast cells is suitable. The culture medium while other additives such. As antibiotics or buffer components may be added. The invention also includes the use of various additives such as soluble organic salts, ie metal salts of organic carboxylic or sulfonic acids or open-chain or cyclic ammonium salts and quaternary salts of N-heterocycles and low molecular weight polyanions or polycations, or water-soluble organic compounds such as polycarboxylic acids, urea derivatives, carbohydrates , Polyols such as glycerol, polyethylene glycol, and polyvinyl alcohol, or gelatin, which act as plasticizers, humectants, and pore-forming agents, inhibit cell lysis, and significantly prolong the survivability of embedded cells. These additives do not lead to a detectable signal.

Die Suspension befindet sich in einem geeigneten Behältnis, das die Erfassung der Expression des Zielgens gewährleistet. Der Träger ist ebenfalls so gestaltet, dass von den Zellen ausgesandte Signale durch ein Detektionssystem erfasst werden können.The suspension is in a suitable container which ensures the detection of the expression of the target gene. The carrier is also designed so that signals emitted by the cells can be detected by a detection system.

Bevorzugt können die Sensor-Zellen und/oder die Aktor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen in einer porösen und optisch transparenten organischen oder anorganischen Matrix eingebettet vorliegen.The sensor cells and / or the actuator cells and / or the amplifier cells can preferably be embedded in a porous and optically transparent organic or inorganic matrix.

Vorteilhaft sind die Zellen in inerten Xerogelen immobilisiert. Xerogele sind Gele, die ihre Flüssigkeit beispielsweise durch Verdampfen oder Absaugen verloren haben. Gele sind formbeständige, leicht deformierbare disperse Systeme aus mindestens zwei Komponenten, die zumeist aus einem festen Stoff mit langen oder stark verzweigten Teilchen (z. B. Kieselsäure, Gelatine, Kollagene, Polysaccharide, Pektine, spezielle Polymere, wie z. B. Polyacrylate, und andere, oft als Verdickungsmittel bezeichnete Geliermittel) und einer Flüssigkeit (meist Wasser) als Dispersionsmittel bestehen. Dabei bildet die feste Substanz im Dispersionsmittel ein räumliches Netzwerk. Bei der Entstehung von Xerogelen verändert sich die räumliche Anordnung des Netzes.Advantageously, the cells are immobilized in inert xerogels. Xerogels are gels that have lost their fluid, for example by evaporation or suction. Gels are dimensionally stable, easily deformable disperse systems composed of at least two components, which are usually made of a solid substance with long or highly branched particles (eg silica, gelatin, collagens, polysaccharides, pectins, special polymers, such as, for example, polyacrylates, and other gelling agents, often referred to as thickeners) and a liquid (usually water) as a dispersing agent. The solid substance in the dispersion medium forms a spatial network. The formation of xerogels changes the spatial arrangement of the network.

Die vorteilhafte Verwendung von anorganischen oder biologisch inerten organischen Xerogelen zur Einbettung der Zellen erlaubt vorteilhaft das Überleben der Zellen bei gleichzeitiger Stabilität der erzeugten Strukturen, denn sie sind toxikologisch und biologisch inert und werden im Allgemeinen nicht durch die Zellen abgebaut. Sie ermöglichen weiterhin vorteilhaft die Einlagerung von Nährstoffen und Feuchthaltemitteln, die das Überleben der Zellen sichern.The advantageous use of inorganic or biologically inert organic xerogels for embedding the cells advantageously allows the survival of the cells with simultaneous stability of the structures produced, because they are toxicologically and biologically inert and are generally not degraded by the cells. They also allow advantageous storage of nutrients and humectants that ensure the survival of the cells.

Bevorzugt können die Zellen in ein Gefüge mit einer hierarchischen Porenstruktur eingebettet sein, so dass neben der für anorganische Gele typischen Nanoporosität das Gefüge zusätzlich von miteinander verbundenen Mesoporen durchzogen wird, deren Durchmesser typischerweise zwischen 100 nm bis 100 µm variiert und die einen Stoffaustausch zwischen der Umgebung und den eingebetteten Zellen sowie deren Reaktionsprodukten wie den Enzymen ermöglichen.The cells may preferably be embedded in a structure with a hierarchical pore structure, so that in addition to the nanoporosity typical for inorganic gels, the microstructure is additionally traversed by interconnected mesopores, the diameter of which typically varies between 100 nm to 100 μm, and which permits mass transfer between the surroundings and allow the embedded cells and their reaction products such as the enzymes.

Dadurch können vorteilhaft die Zellen des ersten Typs und die Zellen des zweiten Typs sowie ggf. Zellen des drittens Typs in verschiedenen Schichten auf das Substrat aufgebracht werden. Durch die Nanoporosität können sowohl die spezifischen Primärsignale an die Zellen des ersten Typs gelangen, die sich in der äußeren Schicht des Sensors befinden, als auch die von diesen Zellen sezernierten Pheromone an die Zellen des zweiten und/oder dritten Typs gelangen, die sich in der darunter befindlichen Schicht befinden, die direkten Kontakt zum Signaldetektor hat.As a result, it is advantageous to apply the cells of the first type and the cells of the second type and, if appropriate, cells of the third type in different layers to the substrate. Due to the nanoporosity, both the specific primary signals can reach the cells of the first type, which are located in the outer layer of the sensor, and the pheromones secreted by these cells can reach the cells of the second and / or third type which are located in the underneath layer which has direct contact with the signal detector.

Durch eine erfindungsgemäße Ausgestaltung liegen die Sensor-Zellen und/oder die Aktor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen in separaten Kammern vor, die durch eine semipermeable Membran und/oder ein Sterilfilter und/oder eine Flüssigkeitsbrücke miteinander verbunden sind.By means of an embodiment according to the invention, the sensor cells and / or the actuator cells and / or the amplifier cells are present in separate chambers, which are connected to one another by a semipermeable membrane and / or a sterile filter and / or a liquid bridge.

Besonders bevorzugt eignen sich semipermeable Membranen und/oder Sterilfilter, die eine Porengröße von 10–500 nm, besonders bevorzugt 50–250 nm aufweisen.Semipermeable membranes and / or sterile filters which have a pore size of 10-500 nm, particularly preferably 50-250 nm, are particularly preferably suitable.

Hefezellen verschiedener Spezies stehen im Normalfall in Konkurrenz zueinander, was im Extremfall zum Überwachsen von Hefezellen einer Spezies führen kann. Durch die erfindungsgemäße Ausgestaltung kann vorteilhaft verhindert werden, dass sich Hefezellen unterschiedlicher Spezies vermischen. Ein Überwachsen der Hefezellen verschiedener Spezies kann somit unterbunden werden. Yeast cells of different species are usually in competition with each other, which in extreme cases can lead to the overgrowth of yeast cells of a species. The inventive design can be advantageously prevented that mix yeast cells of different species. Overgrowth of the yeast cells of different species can thus be prevented.

Da Pheromone kleine organische Moleküle wie z. B. Signalpeptide oder Peptidanaloga darstellen, deren Molekulargewicht typischerweise zwischen 0,01 und 5 kDa, bevorzugt zwischen 0,1 und 3 kDa, liegt, sind sie weiterhin in der Lage eine semipermeable Membran zu passieren und diffundieren so in die separierten Kammern.Since pheromones contain small organic molecules such as As signal peptides or peptide analogues whose molecular weight is typically between 0.01 and 5 kDa, preferably between 0.1 and 3 kDa, they are still able to pass through a semipermeable membrane and thus diffuse into the separated chambers.

Weiterhin wird ein erfindungsgemäßes Verfahren zur in vivo Detektion von mindestens einem extrazellulären Primärsignal mittels Interspezies-Kommunikation beansprucht, dass die folgenden Schritte umfasst:

• a. Bereitstellung von Sensor-Zellen eines ersten Typs, die die folgenden Merkmale aufweisen: i. ein Gen, welches zur Synthese eines Pheromons führt, ist unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt, ii. optional ist ein weiteres Gen, welches zur Synthese eines Pheromons führt, das sich vom ersten Pheromon unterscheidet, ist unter die Transkriptionskontrolle eines weiteren Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt, und
• b. Bereitstellung von mindestens einem Typ Aktor-Zellen, die die folgenden Merkmale aufweisen: i. einen Rezeptor für ein Pheromon aus a(i.) oder a(ii.) und/oder c(ii), ii. ein Zielgen, das für ein Sekundärsignal kodiert, ist unter die Kontrolle eines Promotors gestellt, und/oder
• c. Bereitstellung von mindestens einem Typ Verstärker-Zellen, die die folgenden Merkmale aufweisen: i. einen Rezeptor für ein Pheromon aus a(i.) oder a(ii.), ii. ein Gen, welches zur Synthese eines Pheromons führt, ist unter die Kontrolle eines Promotors gestellt
• d. Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem Primärsignal, was zur Synthese eines Pheromons in und zur Sekretion eines Pheromons aus den Sensor-Zellen führt,
• e. Aktivierung eines Rezeptors der Aktor-Zellen wie in Anspruch 1 durch ein Pheromon, wodurch ein Zielgen funktionell exprimiert wird.
• f. Aktivierung eines Rezeptors der Verstärker-Zellen wie in Anspruch 1 durch ein Pheromon der Sensor-Zellen, was zur Synthese und zur Sekretion eines Pheromons aus den Verstärker-Zellen führt.

Furthermore, a method according to the invention for in vivo detection of at least one extracellular primary signal by means of interspecies communication is claimed, which comprises the following steps:

• a. Providing sensor cells of a first type having the following features: i. a gene which leads to the synthesis of a pheromone is placed under the transcriptional control of a primary signal-dependent promoter, ii. Optionally, another gene which results in the synthesis of a pheromone other than the first pheromone is placed under the transcriptional control of another primary signal dependent promoter, and
• b. Providing at least one type of actuator cell having the following characteristics: i. a receptor for a pheromone from a (i.) or a (ii.) and / or c (ii), ii. a target gene coding for a secondary signal is placed under the control of a promoter, and / or
• c. Providing at least one type of amplifier cells having the following characteristics: i. a receptor for a pheromone from a (i.) or a (ii.), ii. a gene which leads to the synthesis of a pheromone is placed under the control of a promoter
• d. Contacting the sensor cells with a primary signal resulting in the synthesis of a pheromone in and secretion of a pheromone from the sensor cells,
• e. Activation of a receptor of the actor cells as in claim 1 by a pheromone, whereby a target gene is functionally expressed.
• f. Activation of a receptor of the enhancer cells as in claim 1 by a pheromone of the sensor cells resulting in the synthesis and secretion of a pheromone from the enhancer cells.

Die erfindungsgemäß verwendete biologische Detektions- und Verstärkungseinrichtung kann beispielsweise genutzt werden, um

• • die Limitierung von Stoffen wie z. B. Phosphat, Schwefel, Stickstoff oder einer Kohlenstoffquelle wie z. B. Glucose in Kulturmedien frühzeitig zu detektieren,
• • eine Belastung von Zellen durch Stressoren wie z. B. Strahlung oder chemische Agenzien effektiver nachzuweisen,
• • das Auftreten von Zielmolekülen wie beispielsweise bestimmte Stoffwechselintermediate frühzeitig zu detektieren,
• • Bioassays zum Nachweis von Substanzen in wässrigen Lösungen effektiver zu gestalten,
• • Biokatalyse-Prozesse unter Einsatz der physiologischen Leistungen verschiedener Zellen effizient zu steuern.

The biological detection and amplification device used according to the invention can be used, for example, to

• • the limitation of substances such. For example, phosphate, sulfur, nitrogen or a carbon source such. B. early detection of glucose in culture media,
• • stress on cells caused by stressors such as B. to detect radiation or chemical agents more effectively,
• • early detection of the presence of target molecules, such as certain metabolic intermediates,
• • to make bioassays for the detection of substances in aqueous solutions more effective,
• • Efficiently controlling biocatalysis processes using the physiological performances of different cells.

Über eine erfindungsgemäße Ausgestaltung werden das erfindungsgemäße Kit und/oder das Verfahren zur simultanen Detektion von mindestens zwei extrazellulären Primärsignalen verwendet. Vorteilhaft führt dabei das Kontaktieren von Sensor-Zellen mit mindestens einem Primärsignal zur Expression der für die Synthese von Pheromonen vermittelnden Gene in der Sensor-Zelle und zur Sekretion der Pheromone aus den Sensor-Zellen. Die aus den Sensor-Zellen sekretierten Pheromone führen wiederum zur Aktivierung eines Rezeptors der Aktor-Zellen, wodurch ein Zielgen funktionell exprimiert wird.By means of an embodiment according to the invention, the kit according to the invention and / or the method for the simultaneous detection of at least two extracellular primary signals are used. The contacting of sensor cells with at least one primary signal advantageously leads to the expression of the genes mediating the synthesis of pheromones in the sensor cell and to the secretion of the pheromones from the sensor cells. The pheromones secreted from the sensor cells in turn lead to the activation of a receptor of the actor cells, whereby a target gene is functionally expressed.

Die Expression des Zielgens, das für ein Signalmolekül kodiert, kann dabei nach einer Ausgestaltung der Erfindung vorteilhaft durch dem Fachmann bekannte analytische Methoden detektiert werden.The expression of the target gene which codes for a signal molecule can, according to one embodiment of the invention, advantageously be detected by analytical methods known to those skilled in the art.

Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.Reference to the following figures and embodiments, the invention will be explained in more detail, without limiting the invention to these.

1: Einfluss des heterolog in S. cerevisiae BY4742 exprimierten P-Faktors auf den Zellzyklus von S. pombe PN1707. Die Kalibrierung der G₁-Phase (weißer Pfeil) und der G₂-Phase (schwarzer Pfeil) erfolgte anhand einer Kultur von S. pombe PN1707 in Minimalmedium ohne Stickstoffquelle (Daten nicht dargestellt). 1 : Influence of the heterologous S. perevisiae BY4742 expressed P-factor on the cell cycle of S. pombe PN1707. The calibration of the G ₁ phase (white arrow) and the G ₂ phase (black arrow) was carried out on a culture of S. pombe PN1707 in minimal medium without nitrogen source (data not shown).

2: Reportergen-basierte Analyse der Aktivität Pheromon-spezifischer Promotoren in S. pombe PN1707 in Abhängigkeit von der Applikation heterolog exprimierter Pheromone. 2 : Reporter gene-based analysis of the activity of pheromone-specific promoters in S. pombe PN1707 as a function of the application of heterologously expressed pheromones.

3: Einfluss des heterolog in S. pombe HE620 exprimierten α-Faktors auf den Zellzyklus von S. cerevisiae BY4741 ∆bar1. Die Kalibrierung der G₁-Phase (weißer Pfeil) und der G₂-Phase (schwarzer Pfeil) erfolgte anhand einer Kultur von S. cerevisiae BY4741 in Minimalmedium (Daten nicht dargestellt). 3 : Influence of heterologous S. pombe HE620 expressed α-factor on the cell cycle of S. cerevisiae BY4741 Δbar1. The calibration of the G ₁ phase (white arrow) and the G ₂ phase (black arrow) was carried out on a culture of S. cerevisiae BY4741 in minimal medium (data not shown).

4: Immunologischer Nachweis von tRFP und Pgk1p in S. cerevisiae BY4741 ∆bar1 FIG1-tRFP in Abhängigkeit von der Applikation heterolog exprimierter Pheromone. 4 : Immunological detection of tRFP and Pgk1p in S. cerevisiae BY4741 Δbar1 FIG1-tRFP depending on the application of heterologously expressed pheromones.

5: Einsatz der Interspezies-Kommunikation für die Entwicklung von Sensoren. 5 : Use of interspecies communication for the development of sensors.

6: Einsatz der Interspezies-Kommunikation für die Entwicklung von Sensoren, die mehrere extrazelluläre Primärsignale unabhängig voneinander amplifizieren können. 6 : Use of interspecies communication for the development of sensors capable of amplifying several extracellular primary signals independently.

7: Einsatz der Interspezies-Kommunikation zur gezielten Steuerung von Aktor-Zellen in Sensor-Aktor-Systemen für Biokatalyse-Prozesse. 7 : Use of interspecies communication for targeted control of actuator cells in sensor-actuator systems for biocatalysis processes.

Ausführungsbeispiel 1: Synthese des P-Faktors als Pheromon von S. pombe in S. cerevisiae. EMBODIMENT 1 Synthesis of P factor as pheromone of S. pombe in S. cerevisiae.

Um eine effiziente Synthese des P-Faktors in S. cerevisiae zu erreichen, wurden zwei Konstrukte generiert. Sowohl map2, das Strukturgen für den P-Faktor aus S. pombe, als auch ein chimärer Leserahmen (MFα1/map2) wurden in einen für S. cerevisiae geeigneten Expressionsvektor (p425GPD) eingebracht. Der chimäre Leserahmen bestand dabei aus dem N-terminalen Bereich von MFα1 sowie der codierenden Sequenz für den P-Faktor. Somit wurden die Vektoren p425-map2 sowie p425-MFα/map2 generiert. In order to achieve an efficient synthesis of the P-factor in S. cerevisiae, two constructs were generated. Both map2, the S. pombe P-factor structural gene, and a chimeric reading frame (MFα1 / map2) were inserted into a S. cerevisiae appropriate expression vector (p425GPD). The chimeric reading frame consisted of the N-terminal region of MFα1 and the coding sequence for the P-factor. Thus, the vectors p425-map2 and p425-MFα / map2 were generated.

Des Weiteren wurden Reportergenkonstrukte erstellt, die eine Pheromon-abhängige Expression eines Zielgens in S. pombe vermitteln. Dafür wurde der Leserahmen für EGFP in einen für S. pombe geeigneten Vektor (pJR1-3XL) eingebracht. Anschließend wurden die Pheromon-abhängig aktivierten Promotoren von rep1 bzw. sxa2 aus S. pombe in diesen Vektor eingebracht, wobei der vorhandene nmt1-Promotor des Vektors ersetzt wurde. Somit stand die Expression des beispielhaften Zielgens (EGFP) in den resultierenden Vektoren pJR1-rep1>EGFP und pJR1-sxa2>EGFP unter der Kontrolle der Pheromon-abhängigen Promotoren.Furthermore, reporter gene constructs were created that mediate pheromone-dependent expression of a target gene in S. pombe. For this, the reading frame for EGFP was introduced into a vector suitable for S. pombe (pJR1-3XL). Subsequently, the pheromone-dependent activated promoters of rep1 or sxa2 from S. pombe were introduced into this vector, replacing the existing nmt1 promoter of the vector. Thus, the expression of the exemplary target gene (EGFP) in the resulting vectors pJR1-rep1> EGFP and pJR1-sxa2> EGFP was under the control of the pheromone-dependent promoters.

Die Plasmide p425-map2 und p425-MFα1/map2 sowie der leere Vektor p425GPD als Kontrolle wurden in Sensor-Zellen von S. cerevisiae BY4742 transformiert. Die Transformanden wurden für 24 h in Minimalmedium mit entsprechenden Supplementen bei 30°C kultiviert und anschließend durch Zentrifugation aus den Kulturmedien entfernt. Die dabei gewonnenen Kulturüberstände werden nachfolgend als M_p425GPD, M_p425-map2 bzw. M_{p425-MFα1/map2} bezeichnet. The plasmids p425-map2 and p425-MFα1 / map2 and the empty vector p425GPD as a control were transformed into sensor cells of S. cerevisiae BY4742. The transformants were cultured for 24 h in minimal medium with appropriate supplements at 30 ° C and then removed by centrifugation from the culture media. The culture supernatants obtained are referred to below as M _p425GPD , M _p425-map2 or M _{p425-MFα1 / map2} .

Anschließend wurden Zellen von S. pombe PN1707 (Aktor-Zellen) in die Kulturüberstände transferiert. Dieser Stamm vom Paarungstyp M weist eine Funktionsverlustmutation der Adenylatcyclase (cyr1::ura4⁺) auf, sodass eine Pheromonantwort unabhängig von einer Nährstofflimitation ermöglicht wird. Des Weiteren ist dieser Stamm durch eine Inaktivierung der Protease Sxa2p gekennzeichnet (sxa2::ura4⁺), sodass eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem P-Faktor erreicht wird. Zusätzlich wurden Zellen dieses Stammes mit den Plasmiden pJR1-rep1>EGFP bzw. pJR1-sxa2>EGFP transformiert, sodass die Wahrnehmung des P-Faktors in diesen Zellen mit der Expression von EGFP gekoppelt wurde.Subsequently, cells of S. pombe PN1707 (actor cells) were transferred into the culture supernatants. This mating-type M strain has a function-loss mutation of adenylate cyclase (cyr1 :: ura4 ⁺ ), allowing a pheromone response independent of nutrient limitation. Furthermore, this strain is characterized by an inactivation of the protease Sxa2p (sxa2 :: ura4 ⁺ ), so that an increased sensitivity to the P-factor is achieved. In addition, cells of this strain were transformed with the plasmids pJR1-rep1> EGFP and pJR1-sxa2> EGFP, respectively, so that the perception of the P-factor in these cells was coupled with the expression of EGFP.

Nach Transfer dieser Zellen in die Kulturüberstände wurde die Pheromonantwort der Zellen von S. pombe in Bezug auf den Zellzyklus (1), die Morphologie der Zellen sowie die Expression von EGFP (2) untersucht. After transfer of these cells into the culture supernatants, the pheromone response of S. pombe cells was compared with respect to the cell cycle ( 1 ), the morphology of the cells as well as the expression of EGFP ( 2 ).

Die Arretierung des Zellzyklus in der G₁-Phase ist ein charakteristisches Merkmal der Pheromonantwort von Hefen wie S. cerevisiae oder S. pombe und dient der Synchronisation des Zellzyklus der sich potentiell paarenden Zellen. Um diese Zellzyklus-Arretierung in S. pombe nachweisen zu können, wurden die Aktor-Zellen von S. pombe PN1707 nach Transfer in die Kulturüberstände zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert. Anschließend erfolgte eine quantitative DNA-Färbung mit dem fluoreszierenden Farbstoff Propidiumiodid, da sich Zellen in der G₁-Phase und in der G₂-Phase des Zellzyklus hinsichtlich ihres DNA-Gehaltes unterscheiden. Die Fluoreszenz wurde anschließend mithilfe eines CyFlow^® SL Durchflusszytometers (Partec GmbH) quantifiziert (1). The arrest of the cell cycle in the G ₁ phase is a characteristic feature of the pheromone response of yeasts such as S. cerevisiae or S. pombe and serves to synchronize the cell cycle of the potentially mating cells. In order to be able to detect this cell cycle arrest in S. pombe, the actor cells of S. pombe PN1707 were fixed at different times after transfer into the culture supernatants. This was followed by quantitative DNA staining with the fluorescent dye propidium iodide, since cells in the G ₁ phase and in the G ₂ phase of the cell cycle differ in their DNA content. Fluorescence was then using a CyFlow ^® SL flow cytometer (Partec GmbH) quantified ( 1 ).

Nach Transfer der Aktor-Zellen in den Kulturüberstand M_p425GPD konnte keine Veränderung des Anteils von Zellen in der G₁-Phase innerhalb von 8 h nach Transfer in den Kulturüberstand festgestellt werden (1, links). Dies impliziert, dass die Zellen in diesem Medium keine Pheromonantwort durchführten. Im Gegensatz dazu wurde nach Transfer der Aktor-Zellen in die Kulturüberstände M_p425-map2 sowie M_{p425-MFα1/map2} ein starker Anstieg des Anteils der Zellen in der G₁-Phase des Zellzyklus detektiert (1, Mitte und rechts), wobei nach 6 bis 8 h nahezu alle Zellen in der G₁-Phase arretierten. Dies deutet darauf hin, dass die Zellen in diesen Kulturüberständen eine Pheromonantwort ausführten. Daher kann geschlossen werden, dass die Sensor-Zellen von S. cerevisiae nach Transformation der Vektoren p425-map2 sowie p425-MFα1/map2 in der Lage sind, den P-Faktor als Pheromon von S. pombe effizient zu synthetisieren und zu sekretieren.After transfer of the Aktor cells into the culture supernatant M _p425GPD , no change in the proportion of cells in the G ₁ phase could be detected within 8 h after transfer into the culture supernatant ( 1 , Left). This implies that the cells in this medium did not perform a pheromone response. In contrast, after transfer of the Aktor cells into the culture supernatants M _p425-map2 and M _{p425-MFα1 / map2,} a strong increase in the proportion of cells in the G ₁ phase of the cell cycle was detected ( 1 , Middle and right), with almost all cells in the G ₁ phase arrested after 6 to 8 h. This indicates that the cells in these culture supernatants performed a pheromone response. Therefore, it can be concluded that the sensor cells of S. cerevisiae after transformation of the vectors p425-map2 and p425-MFα1 / map2 are capable of efficiently synthesizing and secreting the p-factor as a pheromone of S. pombe.

Die Pheromonantwort von Hefen ist zudem von der Veränderung der Morphologie geprägt, die als Shmoo-Effekt bezeichnet wird. Dieser umfasst eine gerichtete Elongation der Zellen zur Pheromonquelle hin, sodass die Zellen unterschiedlicher Paarungstypen in Richtung der jeweils anderen Zelle auswachsen. Dadurch wird die Fusion der Zellen ermöglicht. Um eine Veränderung der Morphologie der Aktor-Zellen von S. pombe PN1707 nach Transfer in die Kulturüberstände nachweisen zu können, wurden die Zellen 24 h nach dem Transfer fixiert. Anschließend wurden die Zellen lichtmikroskopisch auf eine Veränderung der Morphologie untersucht.The pheromone response of yeasts is also characterized by the change in morphology, which is referred to as the Shmoo effect. This involves a directed elongation of the cells to the source of pheromone, so that the cells of different mating types grow towards each other's cell. This allows the fusion of the cells. In order to be able to detect a change in the morphology of the actor cells of S. pombe PN1707 after transfer into the culture supernatants, the cells were fixed 24 h after the transfer. Subsequently, the cells were examined by light microscopy for a change in morphology.

Nach Transfer der Aktor-Zellen von S. pombe PN1707 in den Kulturüberstand M_p425GPD wurde die charakteristische Morphologie mitotischer Zellen dieses Stammes festgestellt. Aufgrund der Inaktivierung der Adenylatcyclase ist der Stamm PN1707 im Vergleich zu Wildtyp-Zellen von S. pombe durch eine geringere Elongation der Zellen gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu wurde eine deutliche Elongation der Zellen nach Transfer in die Kulturüberstände M_p425-map2 sowie M_{p425-MFα1/map2} nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass diese Aktor-Zellen eine Pheromonantwort ausführten. Daher kann anhand der Morphologie der Zellen von S. pombe PN1707 geschlossen werden, dass die Sensor-Zellen von S. cerevisiae nach Transformation der Vektoren p425-map2 sowie p425-MFα1/map2 einen funktionalen P-Faktor synthetisierten und in den Kulturüberstand sekretierten. After transfer of the Aktor cells of S. pombe PN1707 into the culture supernatant M _p425GPD , the characteristic morphology of mitotic cells of this strain was determined. Due to the inactivation of adenylate cyclase, the strain PN1707 is characterized by a lower elongation of the cells in comparison to S. pombe wild-type cells. In contrast, a marked elongation of the cells was detected after transfer to the culture supernatants M _p425-map2 and M _{p425-MFα1 / map2} . This suggests that these actor cells performed a pheromone response. Therefore, it can be concluded from the morphology of the cells of S. pombe PN1707 that the S. cerevisiae sensor cells synthesized a functional P-factor after transformation of the vectors p425-map2 and p425-MFα1 / map2 and secreted into the culture supernatant.

Die Wahrnehmung des Pheromons initiiert in Hefen ein umfassendes genetisches Programm, wobei die Transkription vieler Gene verändert wird. Dabei wird die Transkription einiger Gene, deren Genprodukt für die sexuellen Prozesse von Bedeutung ist, erst nach der Perzeption des Pheromons aktiviert. So werden beispielsweise die Gene rep1 und sxa2 von S. pombe ausschließlich im Rahmen der Pheromonantwort exprimiert, da deren Promotoren Pheromon-abhängig aktiviert werden. Die spezifische Aktivierung dieser Promotoren kann eingesetzt werden um die Pheromonantwort dieser Hefe mit der Expression eines Zielgens zu koppeln. Um die Funktionalität und Spezifität der Promotoren nachweisen zu können, wurde als Zielgen der Leserahmen für EGFP verwendet, unter die Kontrolle eines dieser Promotoren gestellt und in einen Vektor eingebracht (pJR1-rep1>EGFP und pJR1-sxa2>EGFP), der anschließend in die Aktor-Zellen von S. pombe PN1707 transformiert wurde. Die resultierenden Transformanden wurden in die Kulturüberstände überführt und die Expression von EGFP mithilfe von SDS-PAGE, Western Blot und eines immunologischen Nachweises unter Verwendung von spezifischen Antikörpern zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert (2). Dazu wurden 15 µg Gesamtprotein der Zellen von S. pombe PN1707 elektrophoretisch mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran transferiert. Anschließend erfolgte der immunologische Nachweis auf der Basis eines Anti-GFP Antikörpers unter Exposition des Röntgenfilmes für das jeweils angegebene Zeitintervall (1 min; 15 s).The perception of the pheromone initiates a comprehensive genetic program in yeast, modifying the transcription of many genes. In this case, the transcription of some genes whose gene product is important for the sexual processes is activated only after the perception of the pheromone. Thus, for example, the genes rep1 and sxa2 of S. pombe are exclusively expressed as part of the pheromone response, since their promoters are activated pheromone-dependent. The specific activation of these promoters can be used to couple the pheromone response of this yeast with the expression of a target gene. In order to be able to demonstrate the functionality and specificity of the promoters, the target gene used was the EGFP reading frame, placed under the control of one of these promoters and inserted into a vector (pJR1-rep1> EGFP and pJR1-sxa2> EGFP), which was then inserted into the vector Actuator cells of S. pombe PN1707 was transformed. The resulting transformants were transferred to the culture supernatants and the expression of EGFP was analyzed by SDS-PAGE, Western blot and immunological detection using specific antibodies at various times ( 2 ). For this purpose, 15 μg total protein of the S. pombe PN1707 cells were electrophoretically separated by SDS-PAGE and subsequently transferred to a PVDF membrane. Subsequently, the immunological detection was carried out on the basis of an anti-GFP antibody with exposure of the X-ray film for the specified time interval (1 min, 15 s).

Nach Transfer der Zellen von S. pombe PN1707 mit den Vektoren pJR1-rep1>EGFP bzw. pJR1-sxa2>EGFP in den Kulturüberstand M_p425GPD konnte immunologisch keine Expression von EGFP nachgewiesen werden (2, oben). Im Gegensatz dazu konnte die Expression von EGFP detektiert werden, sofern die Aktor-Zellen in die Kulturüberstände M_p425-map2 bzw. M_{p425-MFα1/map2} transferiert wurden (2, Mitte und unten). Die Promotoren von rep1 und sxa2 erwiesen sich daher als gleichermaßen geeignet, die Pheromonantwort von S. pombe mit der Expression eines spezifischen Zielgens zu koppeln, da in Abwesenheit des Pheromons (im Kulturüberstand M_p425GPD) keine Expression des Zielgens erfolgte, während als Reaktion auf das Pheromon eine schnelle und starke Expression von EGFP induziert wurde. Somit kann auch auf der Basis dieser Daten geschlossen werden, dass eine effiziente Synthese und Sekretion des P-Faktors in Sensor-Zellen von S. cerevisiae mithilfe der Vektoren p425-map2 und p425-MFα1/map2 realisiert werden kann.After transfer of the cells of S. pombe PN1707 with the vectors pJR1-rep1> EGFP or pJR1-sxa2> EGFP into the culture supernatant M _p425GPD , no expression of EGFP could be detected immunologically ( 2 , above). In contrast, the expression of EGFP could be detected if the actor cells were transferred into the culture supernatants M _p425-map2 or M _{p425-MFα1 / map2} ( 2 , Middle and bottom). The promoters of rep1 and sxa2 were therefore equally well suited to couple the pheromone response of S.pombe with the expression of a specific target gene, since in the absence of the pheromone (in the culture supernatant M _p425GPD ) no expression of the target gene occurred, while in response to the Pheromone induced a rapid and strong expression of EGFP. Thus, it can also be concluded on the basis of these data that efficient synthesis and secretion of the P-factor can be realized in S. cerevisiae sensor cells using the vectors p425-map2 and p425-MFα1 / map2.

Ausführungsbeispiel 2: Synthese des α-Faktors als Pheromon von S. cerevisiae in S. pombeExemplary Embodiment 2 Synthesis of the α Factor as Pheromone of S. cerevisiae in S. pombe

Um eine effiziente Synthese und Sekretion des α-Faktors, eines Pheromons von S. cerevisiae, durch Sensor-Zellen von S. pombe zu erreichen, wurden zwei Konstrukte generiert. Dabei wurden sowohl MFα1, das Strukturgen für den α-Faktor aus S. cerevisiae, als auch ein chimärer Leserahmen (map2/MFα1) in einen für S. pombe geeigneten Vektor (pJR1-3XL) unter der Kontrolle des Thiamin-regulierten nmt1-Promotors eingebracht. Die resultierenden Plasmide pJR1-MFα1 und pJR1-map2/MFα1 sowie der leere Vektor pJR1-3XL als Kontrolle wurden in die Sensor-Zellen von S. pombe HE620 transformiert. In order to achieve efficient synthesis and secretion of S. cerevisiae pheromone α-factor by S. pombe sensor cells, two constructs were generated. Both MFα1, the structural gene for the α-factor from S. cerevisiae, and a chimeric reading frame (map2 / MFα1) were transformed into a vector suitable for S. pombe (pJR1-3XL) under the control of the thiamine-regulated nmt1 promoter brought in. The resulting plasmids pJR1-MFα1 and pJR1-map2 / MFα1 and the empty vector pJR1-3XL as a control were transformed into the sensor cells of S. pombe HE620.

Des Weiteren wurden Aktor-Zellen von S. cerevisiae BY4741 ∆bar1 FIG1-tRFP eingesetzt, deren Reaktion auf den heterolog exprimierten α-Faktor analysiert wurde. Diese Zellen wiesen eine Deletion von bar1 auf (YIL015w::kanMX4), wodurch vorteilhaft die Sensitivität der Zellen gegenüber dem α-Faktor erhöht wird. Zudem wiesen diese Zellen ein Reportergenkonstrukt, basierend auf dem FIG1-Promotor und dem Leserahmen für tRFP, integriert in das Genom der Hefezellen, auf. Da der FIG1-Promotor nach der Wahrnehmung des α-Faktors durch a-Zellen von S. cerevisiae sehr spezifisch und sehr stark aktiviert wird, ermöglicht dieses Konstrukt die Kopplung der Pheromonantwort von S. cerevisiae mit der Expression von tRFP als beispielhaftes Zielgen. Furthermore, actor cells of S. cerevisiae BY4741 Δbar1 FIG1-tRFP were used whose reaction to the heterologously expressed α-factor was analyzed. These cells had a deletion of bar1 (YIL015w :: kanMX4), which advantageously increased the sensitivity of the cells to the α-factor. In addition, these cells had a reporter gene construct based on the FIG1 promoter and the reading frame for tRFP integrated into the genome of the yeast cells. Since the FIG1 promoter is activated very specifically and very strongly following the perception of the α-factor by S. cerevisiae a-cells, this construct makes it possible to couple the pheromone response of S. cerevisiae with the expression of tRFP as an exemplary target gene.

Die Sensor-Zellen von S. pombe HE620, die mit den Vektoren pJR1-3XL, pJR1-MFα1 bzw. pJR1-map2/MFα1 transformiert wurden, wurden für 24 h bei 30°C in Minimalmedium mit entsprechenden Supplementen kultiviert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, sodass die Kulturüberstände gewonnen wurden. Die Kulturüberstände werden nachfolgend als M_pJR1-3XL, M_pJR1-MFα1 bzw. M_{pJR1-map2/MFα1} bezeichnet. Anschließend wurden die Aktor-Zellen von S. cerevisiae BY4741 ∆bar1 FIG1-tRFP in die Kulturüberstände transferiert. Die Pheromonantwort dieser Zellen wurde auf der Basis des Zellzyklus (3), der Veränderung der Morphologie sowie der Pheromon-abhängigen Expression von tRFP (4) analysiert.The S. pombe HE620 sensor cells transformed with the vectors pJR1-3XL, pJR1-MFα1 and pJR1-map2 / MFα1, respectively, were cultured for 24 h at 30 ° C. in minimal medium with appropriate supplements. Subsequently, the cells were removed by centrifugation, so that the culture supernatants were recovered. The culture supernatants are hereinafter referred to as M _pJR1-3XL , M _pJR1-MFα1 and M _{pJR1-map2 / MFα1} . Subsequently, the actor cells of S. cerevisiae BY4741 Δbar1 FIG1-tRFP were transferred into the culture supernatants. The pheromone response of these cells was determined on the basis of the cell cycle ( 3 ), the morphology as well as the pheromone-dependent expression of tRFP ( 4 ) analyzed.

Die Pheromonantwort von S. cerevisiae ist, analog zur Pheromonantwort von S. pombe, durch eine Arretierung des Zellzyklus in der G₁-Phase gekennzeichnet. Um den Zellzyklus der Aktor-Zellen von S. cerevisiae analysieren zu können, wurden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert und anschließend eine quantitative DNA-Färbung mithilfe des fluoreszierenden Farbstoffes Propidiumiodid durchgeführt. Die Fluoreszenz der Zellen, die mit deren DNA-Gehalt korreliert, wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert (3).The pheromone response of S. cerevisiae, analogous to the pheromone response of S. pombe, is characterized by a arrest of the cell cycle in the G ₁ phase. In order to be able to analyze the cell cycle of the actor cells of S. cerevisiae, the cells were fixed at different times and then a quantitative DNA staining using the fluorescent dye propidium iodide carried out. The fluorescence of the cells, which correlates with their DNA content, was quantified by flow cytometry ( 3 ).

Nach Transfer der Aktor-Zellen von S. cerevisiae BY4741 ∆bar1 in den Kulturüberstand M_pJR1-3XL wurde im Verlauf der Inkubationszeit ein kontinuierlicher Anstieg des Anteils der Zellen in der G₂-Phase des Zellzyklus nachgewiesen (3, links). Im Gegensatz dazu wurden etwa 4 h nach Transfer der Aktor-Zellen von S. cerevisiae in die Kulturüberstände M_pJR1-MFα1 und M_{pJR1-map2/MFα1} nahezu ausschließlich Zellen in der G₁-Phase des Zellzyklus detektiert (3, Mitte und links). Es kann daher von einer Pheromonantwort der Zellen in diesen Kulturüberständen ausgegangen werden. Die Arretierung des Zellzyklus dauerte bei den Zellen in M_pJR1-MFα1 bis etwa 4–6 h nach dem Transfer an, während die Zellen in M_{pJR1-map2/MFα1} auch 8 h nach dem Transfer noch in der G₁-Phase arretiert vorlagen. Dies deutet auf eine höhere Pheromonaktivität in dem Kulturüberstand M_{pJR1-map2/MFα1} hin. Zusammenfassend kann geschlossen werden, dass eine effiziente Synthese und Sekretion des α-Faktors in Sensor-Zellen von S. pombe HE620 durch die Vektoren pJR1-MFα1 und pJR1-map2/MFα1 vermittelt werden kann. After transfer of the actor cells of S. cerevisiae BY4741 Δbar1 into the culture supernatant M _pJR1-3XL , a continuous increase in the proportion of cells in the G ₂ phase of the cell cycle was detected during the incubation period ( 3 , Left). In contrast, approximately 4 h after transfer of the actor cells of S. cerevisiae into the culture supernatants M _pJR1-MFα1 and M _{pJR1-map2 / MFα1,} almost exclusively cells were detected in the G ₁ phase of the cell cycle ( 3 , Middle and left). It can therefore be assumed that the cells have a pheromone response in these culture supernatants. The arrest of the cell cycle persisted in the cells in M _pJR1-MFα1 until approximately 4-6 h after the transfer, while the cells in M _{pJR1-map2 / MFα1 were} still arrested in the G ₁ phase even 8 h after the transfer. This indicates a higher pheromone _activity in the culture supernatant M _{pJR1-map2 / MFα1} . In summary, it can be concluded that efficient synthesis and secretion of the α-factor in S. pombe HE620 sensor cells can be mediated by the vectors pJR1-MFα1 and pJR1-map2 / MFα1.

Auch in S. cerevisiae, analog zur Pheromonantwort von S. pombe, wird durch die Wahrnehmung des Pheromons ein gerichtetes Wachstum initiiert, das als Shmoo-Effekt bezeichnet wird. Um diesen Parameter der Pheromonantwort detektieren zu können, wurden Aktor-Zellen von S. cerevisiae BY4741 ∆bar1 FIG1-tRFP in die Kulturüberstände transferiert und nach 8 h Inkubation in diesen Kulturüberständen fixiert. Anschließend wurden die Zellen mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops auf deren Morphologie sowie auf die Expression von tRFP hin untersucht.Also in S. cerevisiae, analogous to the pheromone response of S. pombe, the perception of the pheromone initiates a directed growth, called the Shmoo effect. In order to be able to detect this parameter of the pheromone response, actor cells of S. cerevisiae BY4741 Δbar1 FIG 1-tRFP were transferred into the culture supernatants and after 8 h of incubation were fixed in these culture supernatants. Subsequently, the cells were examined by means of a fluorescence microscope for their morphology and for the expression of tRFP.

Die Aktor-Zellen, die in den Kulturüberstand M_pJR1-3XL transferiert wurden, wiesen die charakteristische Morphologie mitotischer Zellen von S. cerevisiae auf. Zudem konnte mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie keine Expression von tRFP in diesen Zellen detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte nach Transfer der Zellen in die Kulturüberstände M_pJR1-MFα1 und M_{pJR1-map2/MFα1} das Auftreten von Zellen mit veränderter Morphologie festgestellt werden, die zudem eine hohe Fluoreszenz aufwiesen. Nach Transfer der Zellen in den Kulturüberstand M_{pJR1-map2/MFα1} wiesen nahezu alle Zellen eine stark veränderte Morphologie sowie eine sehr hohe Fluoreszenz auf, während nach Transfer der Zellen in den Kulturüberstand M_pJR1-MFα1 eine geringere Effizienz erreicht wurde. Dies deutet auf eine höhere Pheromonaktivität im Kulturüberstand M_{pJR1-map2/MFα1} hin. Das Auftreten des Shmoo-Effektes nach Transfer der Aktor-Zellen in diese Kulturüberstände deutet, in Kombination mit der Induktion der Expression von tRFP als Zielgen unter der Kontrolle eines Pheromon-abhängig aktivierten Promotors, auf die Anwesenheit des α-Faktors in diesen Kulturüberständen hin. Daher kann auf eine effiziente Synthese und Sekretion des α-Faktors durch die Sensor-Zellen von S. pombe geschlossen werden, die durch die Plasmide pJR1-MFα1 bzw. pJR1-map2/MFα1 vermittelt wird.The Aktor cells, which were transferred to the culture supernatant M _pJR1-3XL , exhibited the characteristic morphology of mitotic cells of S. cerevisiae. In addition, fluorescence microscopy was unable to detect expression of tRFP in these cells. In contrast, after transfer of the cells into the culture supernatants M _pJR1-MFα1 and M _{pJR1-map2 / MFα1, it was possible to detect} the appearance of cells with altered morphology, which also had high fluorescence. After transfer of the cells to the culture supernatant M _{pJR1-map2 / MFα1,} almost all of the cells exhibited a greatly altered morphology and a very high fluorescence, whereas after transfer of the cells to the culture supernatant M _pJR1-MFα1 a lower efficiency was achieved. This indicates a higher pheromone _activity in the culture supernatant M _{pJR1-map2 / MFα1} . The appearance of the Shmoo effect after transfer of the Aktor cells into these culture supernatants, in combination with the induction of the expression of tRFP as a target gene under the control of a pheromone-dependent activated promoter, indicates the presence of the α-factor in these culture supernatants. Therefore, efficient synthesis and secretion of the α-factor by the S. pombe sensor cells mediated by the plasmids pJR1-MFα1 and pJR1-map2 / MFα1, respectively, can be concluded.

Die Expression von tRFP unter der Kontrolle des Pheromon-abhängig aktivierten FIG1-Promotors wurde des Weiteren mithilfe von SDS-PAGE, Western Blot und immunologischem Nachweis unter Verwendung spezifischer Antikörper detektiert (4, oben). Dazu wurden 15 µg Gesamtprotein der Zellen von S. cerevisiae BY4741 ∆bar1 FIG1-tRFP elektrophoretisch mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran transferiert. Anschließend erfolgte der immunologische Nachweis auf der Basis eines Anti-tRFP Antikörpers unter Exposition des Röntgenfilmes für ein Zeitintervall von 5 min. Der immunologische Nachweis der Phosphoglyceratkinase Pgk1p mit einem Anti-Pgk1p Antikörper diente als Kontrolle zum Nachweis vergleichbarer Proteinmengen in jeder Spur (4, unten).The expression of tRFP under the control of the pheromone-dependent activated FIG1 promoter was further detected using SDS-PAGE, Western blot and immunological detection using specific antibodies ( 4 , above). For this purpose, 15 μg total protein of the cells of S. cerevisiae BY4741 Δbar1 FIG 1-tRFP were separated by electrophoresis by SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Subsequently, the immunological detection on the basis of an anti-tRFP antibody under exposure of the X-ray film was carried out for a time interval of 5 min. Immunological detection of phosphoglycerate kinase Pgk1p with an anti-Pgk1p antibody served as a control to detect comparable levels of protein in each lane ( 4 , below).

Nach Transfer der Aktor-Zellen in den Kulturüberstand M_pJR1-3XL konnte immunologisch keine Expression von tRFP nachgewiesen werden (4, oben), dies deutet auf die Abwesenheit des α-Faktors in diesem Kulturüberstand hin. Wurden die Zellen jedoch in die Kulturüberstände M_pJR1-MFα1 oder M_{pJR1-map2/MFα1} überführt, so konnte bereits nach 2 h die Expression von tRFP detektiert werden (4, oben). Der FIG1-Promotor eignet sich daher, eine schnelle, starke und Pheromon-abhängige Expression eines Zielgens zu vermitteln. Dabei wurde nach Transfer der Aktor-Zellen in den Kulturüberstand M_{pJR1-map2/MFα1}, im Vergleich zum Transfer in den Kulturüberstand M_pJR1-MFα1, eine stärkere Expression von tRFP erreicht. Daher kann geschlossen werden, dass in dem Kulturüberstand M_{pJR1-map2/MFα1} eine höhere Pheromonaktivität erzielt wurde. Dennoch vermitteln sowohl pJR1-MFα1 als auch pJR1-map2/MFα1 eine effiziente Synthese und Sekretion des α-Faktors durch die Sensor-Zellen von S. pombe. After transfer of the actor cells into the culture supernatant M _pJR1-3XL , no immunological expression of tRFP could be detected ( 4 , supra), indicating the absence of the α-factor in this culture supernatant. However, when the cells were transferred to the culture supernatants M _pJR1-MFα1 or M _{pJR1-map2 / MFα1} , the expression of tRFP could already be detected after 2 h ( 4 , above). The FIG1 promoter is therefore suitable for mediating rapid, strong and pheromone-dependent expression of a target gene. In this _case , a stronger expression of tRFP was achieved after transfer of the Aktor cells into the culture supernatant M _{pJR1-map2 / MFα1} , in comparison to the transfer into the culture supernatant M _pJR1-MFα1 . Therefore, it can be concluded that a higher pheromone _{activity was} obtained in the culture supernatant M _{pJR1-map2 / MFα1} . Nevertheless, both pJR1-MFα1 and pJR1-map2 / MFα1 mediate efficient synthesis and secretion of the α-factor by the S. pombe sensor cells.

Zusammenfassend kann daher festgestellt werden, dass die Synthese und Sekretion des α-Faktors in Sensor-Zellen von S. pombe mithilfe der eingesetzten Plasmide realisiert werden kann. Die dabei hinsichtlich der Pheromonaktivität auftretenden Unterschiede zwischen pJR1-MFα1 und pJR1-map2/MFα1 sind wahrscheinlich auf eine ineffiziente oder unvollständige Prozessierung von Mfα1p in S. pombe zurückzuführen und bestätigen somit den vorteilhaften Einsatz chimärer Leserahmen, die eine effizientere Synthese und Sekretion heterolog exprimierter Pheromone ermöglichen.In summary, it can therefore be stated that the synthesis and secretion of the α-factor in S. pombe sensor cells can be realized by means of the plasmids used. The differences in pheromone activity between pJR1-MFα1 and pJR1-map2 / MFα1 are probably due to inefficient or incomplete processing of Mfα1p in S. pombe, thus confirming the beneficial use of chimeric reading frames for more efficient synthesis and secretion of heterologously expressed pheromones enable.

Ausführungsbeispiel 3: Einsatz von Hefepheromonen verschiedener Spezies zur Wahrnehmung multipler Analyten mit intrinsischer Signalverstärkung durch einen GanzzellsensorEMBODIMENT 3 Use of yeast pheromones of different species for the detection of multiple analytes with intrinsic signal amplification by a whole cell sensor

Die Sensor-Zellen des Paarungstyps α von S. cerevisiae werden genetisch modifiziert, sodass die Anwesenheit verschiedener Analyten zu einer unterschiedlichen Antwort der Sensor-Zellen führt. Dafür wird der Leserahmen für MFα1 unter die Transkriptionskontrolle eines Promotors gestellt, der durch die Anwesenheit eines ersten Analyten aktiviert wird. Des Weiteren wird der Leserahmen für ein chimäres Gen aus MFα1 und der codierenden Sequenz für den P-Faktor in die Sensor-Zellen eingebracht, wobei dieser Leserahmen unter der Kontrolle eines zweiten Promotors gestellt wird, der durch die Anwesenheit eines zweiten Analyten aktiviert wird.The S. cerevisiae mating type α sensor cells are genetically modified so that the presence of different analytes results in a different response of the sensor cells. For this, the reading frame for MFα1 is placed under the transcriptional control of a promoter which is activated by the presence of a first analyte. Furthermore, the reading frame for a chimeric gene of MFα1 and the coding sequence for the P-factor is introduced into the sensor cells, this reading frame being placed under the control of a second promoter which is activated by the presence of a second analyte.

Als Aktor-Zellen werden a-Zellen von S. cerevisiae mit einer Deletion von bar1 (YIL015w::kanMX4) eingesetzt, welche zudem den Leserahmen für GFP unter der Kontrolle des FIG1-Promotors enthalten. Zusätzlich kommen M-Zellen von S. pombe als Aktor-Zellen zum Einsatz, die Funktionsverlust-Mutationen in den Genen cyr1 (cyr1::ura4⁺) und sxa2 (sxa2::ura4⁺) aufweisen. In die Aktor-Zellen von S. pombe wird zudem der Leserahmen für tRFP unter der Kontrolle des sxa2-Promotors eingebracht.The actor cells used are S. cerevisiae a cells with a deletion of bar1 (YIL015w :: kanMX4), which also contain the reading frame for GFP under the control of the FIG1 promoter. In addition, S. pombe M cells are used as actor cells that exhibit loss of function mutations in the genes cyr1 (cyr1 :: ura4 ⁺ ) and sxa2 (sxa2 :: ura4 ⁺ ). In the S. pombe actor cells, the reading frame for tRFP is also introduced under the control of the sxa2 promoter.

Die Anwesenheit des ersten Analyten führt in den Sensor-Zellen zur Freisetzung des α-Faktors. Eine Subpopulation der Aktor-Zellen, die a-Zellen von S. cerevisiae, reagiert auf den α-Faktor mit einer Akkumulation von GFP, sodass eine grüne Fluoreszenz dieser Aktor-Zellen nachweisbar ist.The presence of the first analyte in the sensor cells leads to the release of the α-factor. A subpopulation of the Aktor cells, the S. cerevisiae a cells, reacts to the α-factor with an accumulation of GFP, so that a green fluorescence of these actor cells is detectable.

Die Anwesenheit des zweiten Analyten führt hingegen zu der Freisetzung des P-Faktors durch die Sensor-Zellen. Dies resultiert in einer Pheromonantwort der Aktor-Zellen von S. pombe, die aufgrund der genetischen Modifikation zur Synthese von tRFP führt. Damit ist eine rote Fluoreszenz dieser Aktor-Zellen nachweisbar.In contrast, the presence of the second analyte leads to the release of the P-factor by the sensor cells. This results in a pheromone response of the S. pombe actor cells, which results in the synthesis of tRFP due to the genetic modification. Thus, a red fluorescence of these actor cells is detectable.

Durch das neu entwickelte System kann die Wahrnehmung mehrerer Analyten in Ganzzellsensoren mit intrinsischer Signalverstärkung realisiert werden. Die Perzeption dieser Analyten wird durch den Einsatz des Sensor-Aktor-Systems dabei vorteilhaft verstärkt, sodass die Nachweisgrenze für die jeweiligen Analyten reduziert wird. Durch den Einsatz der Pheromone verschiedener Spezies können mehrere Signale unabhängig voneinander amplifiziert werden.The newly developed system allows the detection of multiple analytes in whole-cell sensors with intrinsic signal amplification. The perception of these analytes is advantageously enhanced by the use of the sensor-actuator system, so that the detection limit for the respective analytes is reduced. By using the pheromones of different species several signals can be amplified independently.

Claims (20)

Kit zur in vivo Detektion von mindestens einem extrazellulären Primärsignal mittels Interspezies-Kommunikation enthaltend folgende Hefezellen sich unterscheidender Spezies: a. Sensor-Zellen eines ersten Typs, die folgende Merkmale aufweisen: i. ein Gen, welches zur Synthese eines Pheromons führt, ist unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt, b. Aktor-Zellen mindestens eines Typs, wobei die Aktor-Zellen eines Typs folgende Merkmale aufweisen: i. mindestens einen Rezeptor für ein Pheromon, ii. mindestens ein Zielgen, das für ein Sekundärsignal kodiert, ist unter die Kontrolle eines Promotors gestellt,Kit for in vivo detection of at least one extracellular primary signal by means of interspecies communication comprising the following yeast cells of different species: a. Sensor cells of a first type, which have the following features: i. a gene which leads to the synthesis of a pheromone is placed under the transcriptional control of a primary signal-dependent promoter, b. Actuator cells of at least one type, wherein the actor cells of a type have the following features: i. at least one receptor for a pheromone, ii. at least one target gene coding for a secondary signal is placed under the control of a promoter, Kit gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Verstärker-Zellen mindestens eines Typs an Hefezellen enthalten sind, wobei die Verstärker-Zellen eines Typs folgende Merkmale aufweisen: i. mindestens einen Rezeptor für ein Pheromon, ii. mindestens ein Gen, welches zur Synthese eines Pheromons führt, ist unter die Kontrolle eines Promotors gestellt,Kit according to claim 1, characterized in that in addition amplifier cells of at least one type are contained in yeast cells, wherein the amplifier cells of one type have the following characteristics: i. at least one receptor for a pheromone, ii. at least one gene which leads to the synthesis of a pheromone is placed under the control of a promoter, Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensor-Zellen und/oder Aktor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen ausgewählt sind aus Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe.Kit according to one of claims 1 or 2, characterized in that the sensor cells and / or actuator cells and / or amplifier cells are selected from Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensor-Zellen mindestens ein weiteres Gen enthalten, welches zur Synthese eines Pheromons führt, das sich vom ersten Pheromon unterscheidet, unter die Transkriptionskontrolle eines weiteren Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt ist. Kit according to one of claims 1 to 3, characterized in that the sensor cells contain at least one further gene, which leads to the synthesis of a pheromone, which differs from the first pheromone, is placed under the transcriptional control of another primary signal-dependent promoter. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sich die signalabhängigen Promotoren voneinander unterscheiden, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind.Kit according to one of claims 1 to 4, characterized in that the signal-dependent promoters differ from each other, so that the promoters are activated primary signal specific. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene, die zur Synthese sich unterscheidender Pheromone führen, chimäre Leserahmen enthalten können.Kit according to one of claims 1 to 5, characterized in that the genes which lead to the synthesis of distinctive pheromones may contain chimeric reading frames. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die aus der Sensor-Zelle sekretierten Pheromone Hefe-Pheromone sind.Kit according to one of claims 1 to 6, characterized in that the pheromones secreted from the sensor cell are yeast pheromones. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren für ein Pheromon verschiedener Typen an Aktor-Zellen durch das gleiche Pheromon und/oder unterschiedliche Pheromone aktivierbar sind. Kit according to one of claims 1 to 7, characterized in that the receptors for a pheromone of different types of actuator cells are activated by the same pheromone and / or different pheromones. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren für ein Pheromon verschiedener Typen an Verstärker-Zellen durch das gleiche Pheromon und/oder unterschiedliche Pheromone aktivierbar sind.Kit according to one of claims 1 to 8, characterized in that the receptors for a pheromone of different types of booster cells by the same pheromone and / or different pheromones are activated. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren der Aktor-Zellen und der Verstärker-Zellen konstitutiv exprimiert werden.Kit according to one of claims 1 to 9, characterized in that the receptors of the actor cells and the enhancer cells are constitutively expressed. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellen haploide Hefezellen mit einem stabilen Paarungstyp sind.Kit according to one of claims 1 to 10, characterized in that the yeast cells are haploid yeast cells with a stable mating type. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor der Aktor-Zellen und der Verstärker-Zellen ein authentischer Hefepromotor oder ein davon abgeleiteter Promotor ist.Kit according to one of claims 1 to 11, characterized in that the promoter of the actuator cells and the enhancer cells is an authentic yeast promoter or a promoter derived therefrom. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktor-Zellen eines ersten Typs genetisch modifizierter haploider Hefezellen und die Sensor-Zellen zur gleichen Hefespezies gehören, wobei die Aktor-Zellen des ersten Typs genetisch modifizierter haploider Hefezellen den komplementären Paarungstyp zu den Sensor-Zellen aufweisen.Kit according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the actuator cells of a first type of genetically modified haploid yeast cells and the sensor cells belong to the same yeast species, wherein the actuator cells of the first type of genetically modified haploid yeast cells are of the complementary mating type have the sensor cells. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Primärsignal durch eine Nährstofflimitation und/oder durch das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einer Substanz und/oder einem stressinduzierenden Agens und/oder einem physikalischen Faktor ausgelöst wird. Kit according to one of claims 1 to 13, characterized in that the primary signal is triggered by a Nährstoffimimitation and / or by contacting the sensor cells with a substance and / or a stress-inducing agent and / or a physical factor. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielgen für ein Markerprotein kodiert.Kit according to one of claims 1 to 14, characterized in that the target gene codes for a marker protein. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensor-Zellen und/oder die Aktor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen in einem Kulturmedium vorliegen und/oder in einer porösen organischen oder anorganischen Matrix eingebettet sind.Kit according to one of claims 1 to 15, characterized in that the sensor cells and / or the actuator cells and / or the amplifier cells are present in a culture medium and / or embedded in a porous organic or inorganic matrix. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorzellen und/oder die Aktor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen in separaten Kammern vorliegen, wobei die Kammern miteinander verbunden sind.Kit according to one of claims 1 to 16, characterized in that the sensor cells and / or the actuator cells and / or the amplifier cells are present in separate chambers, wherein the chambers are interconnected. Verfahren zur in vivo Detektion von mindestens einem extrazellulären Primärsignal mit einem Kit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend die folgenden Schritte: a. Kontaktieren von Sensor-Zellen wie in Anspruch 1 definiert mit einem Primärsignal, was zur Synthese und zur Sekretion eines Pheromons aus den Sensor-Zellen führt, und b. Aktivierung eines Rezeptors der Aktor-Zellen wie in Anspruch 1 definiert durch ein Pheromon, wodurch ein Zielgen funktionell exprimiert wird, und/oder c. Aktivierung eines Rezeptors der Verstärker-Zellen wie in Anspruch 2 definiert durch ein Pheromon der Sensor-Zellen, was zur Synthese und zur Sekretion eines Pheromons aus den Verstärker-Zellen führt.A method for in vivo detection of at least one extracellular primary signal with a kit according to any one of claims 1 to 17, comprising the following steps: a. Contacting sensor cells as defined in claim 1 with a primary signal resulting in the synthesis and secretion of a pheromone from the sensor cells, and b. Activation of a receptor of the actor cells as defined in claim 1 by a pheromone, whereby a target gene is functionally expressed, and / or c. Activation of a receptor of the enhancer cells as defined in claim 2 by a pheromone of the sensor cells resulting in the synthesis and secretion of a pheromone from the enhancer cells. Verwendung eines Kits und/oder eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur simultanen Detektion von mindestens zwei extrazellulären Primärsignalen. Use of a kit and / or a method according to any one of claims 1 to 18 for the simultaneous detection of at least two extracellular primary signals. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Zielgens, das für ein Sekundärsignal kodiert, mittels analytischer Methoden detektiert wird.Use according to claim 19, characterized in that the expression of the target gene which codes for a secondary signal is detected by means of analytical methods.

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