DE102013207561A1

DE102013207561A1 - Self-separating microorganisms

Info

Publication number: DE102013207561A1
Application number: DE201310207561
Authority: DE
Inventors: Mark Matzas; Maximilian Fleischer
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2014-10-30
Also published as: WO2014173661A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Ernten von Mikroorganismen aus einem flüssigen Medium beschrieben, das die Schritte Kultivierung der Mikroorganismen in dem Medium, Induzieren einer Bildung eines Lipids durch die Mikroorganismen, und Abschöpfen der Mikroorganismen von der Oberfläche des Mediums, umfasst.A method for harvesting microorganisms from a liquid medium is described, which comprises the steps of cultivating the microorganisms in the medium, inducing formation of a lipid by the microorganisms, and skimming the microorganisms from the surface of the medium.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ernten von Mikroorganismen aus einem flüssigen Medium. The invention relates to a method for harvesting microorganisms from a liquid medium.

Die Kultivierung von Mikroorganismen in industriellem Maßstab hat in den letzten Jahren vielseitige Anwendungen gefunden. So werden beispielsweise mit Hilfe von Mikroorganismen verschiedene Substanzen biologischen Ursprungs, beispielsweise für Nahrungsergänzungsmittel, Feinchemikalien oder Medikamente hergestellt. Außerdem werden Mikroorganismen gezüchtet, um Biomasse zur Stromgewinnung oder zur Produktion von Biodiesel zu produzieren. Bakterien und Hefen werden in der Regel in Fermentern oder Bioreaktoren kultiviert, wohingegen Algen und Cyanobakterien in offenen oder geschlossenen Aquakulturen gezüchtet werden. Die Kultivierung in großen Mengen erfolgt üblicherweise in einem flüssigen Medium, in welchem sich die Mikroorganismen vermehren und, gegebenenfalls, die gewünschten Substanzen produzieren. Anschließend werden die Mikroorganismen geerntet, wobei sie vom Kultivierungsmedium getrennt werden müssen. Herkömmlich geschieht dies durch Filtration, Sedimentation oder Zentrifugation. Daneben sind aber auch Verfahren bekannt, bei denen die Mikroorganismen mit Hilfe von Chemikalien ausflocken und anschließend sedimentieren. Kürzlich wurde ein Verfahren beschrieben, in dem die Mikroorganismen elektronischen Pulsen ausgesetzt werden, wodurch sie schneller sedimentieren ( WO 2012/010969 ). Alle diese Verfahren benötigen jedoch relativ viel Energie (z.B. Filtration, Zentrifugation, Elektroporation) oder bedürfen der Zugabe von chemischen Stoffen (Ausflockung). Dies trägt erheblich zu den ohnehin hohen Kosten der Kultivierung von Mikroorganismen bei, die vor allem bei der Produktion von Biomasse zur Energieerzeugung kaum amortisiert werden können. The cultivation of microorganisms on an industrial scale has found versatile applications in recent years. Thus, for example, with the help of microorganisms various substances of biological origin, for example, for food supplements, fine chemicals or drugs produced. In addition, microorganisms are grown to produce biomass for power generation or for the production of biodiesel. Bacteria and yeasts are usually cultured in fermenters or bioreactors, whereas algae and cyanobacteria are grown in open or closed aquaculture. Cultivation in large quantities is usually carried out in a liquid medium in which the microorganisms multiply and, if appropriate, produce the desired substances. Subsequently, the microorganisms are harvested, whereby they must be separated from the cultivation medium. Conventionally, this is done by filtration, sedimentation or centrifugation. In addition, however, methods are known in which the microorganisms flocculate with the aid of chemicals and then sediment. Recently, a method has been described in which the microorganisms are exposed to electronic pulses, causing them to sediment faster ( WO 2012/010969 ). However, all of these methods require relatively much energy (eg, filtration, centrifugation, electroporation) or require the addition of chemicals (flocculation). This contributes significantly to the already high costs of cultivating microorganisms, which can hardly be amortized, especially in the production of biomass for energy production.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein effizientes Verfahren zum Kultivieren und Ernten von Mikroorganismen bereitzustellen, wodurch der gesamte Prozess wirtschaftlicher wird. It is therefore an object of the present invention to provide an efficient method of cultivating and harvesting microorganisms, thereby making the whole process more economical.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Ernten von Mikroorganismen aus einem flüssigen Medium gelöst. Das Verfahren umfasst die Schritte Kultivierung der Mikroorganismen in dem Medium, Induzieren einer Bildung eines Lipids durch die Mikroorganismen, und Abschöpfen der Mikroorganismen von der Oberfläche des Mediums. Indem die Mikroorganismen auf die Induktion hin erhöhte Mengen eines Lipids bilden und speichern, nimmt die Menge an Lipiden innerhalb der Mikroorganismen stetig zu. Durch die geringe Dichte der Lipide nimmt gleichzeitig die Dichte der Mikroorganismen ab. Als Folge daraus steigen die Mikroorganismen an die Oberfläche des Mediums, so dass es zu einer Trennung der Mikroorganismen vom Kulturmedium kommt. Die Mikroorganismen können anschließend von der Oberfläche des Mediums abgeschöpft werden. Dies kann beispielsweise mit einem Sieb, durch einen Skimmer oder durch einen Überlauf erfolgen. Dadurch, dass die Trennung der Mikroorganismen vom Medium automatisch bzw. passiv erfolgt, wird keine zusätzliche Energie benötigt. Zudem muss nicht das komplette Medium zum Ernten der Mikroorganismen umgewälzt werden, wodurch weitere Energieeinsparungen möglich sind. Das Verfahren bedarf auch keiner Zugabe von chemischen Stoffen, die vor allem bei der Produktion von Substanzen für Lebensmittelzusätze und Medikamente durch Mikroorganismen nachteilig wären. This object is achieved by a method for harvesting microorganisms from a liquid medium. The method comprises the steps of culturing the microorganisms in the medium, inducing formation of a lipid by the microorganisms, and skimming the microorganisms from the surface of the medium. As the microorganisms generate and store increased amounts of lipid upon induction, the amount of lipids within the microorganisms steadily increases. Due to the low density of the lipids, the density of the microorganisms decreases at the same time. As a result, the microorganisms rise to the surface of the medium, so that there is a separation of the microorganisms from the culture medium. The microorganisms can then be skimmed off the surface of the medium. This can be done for example with a sieve, through a skimmer or through an overflow. The fact that the separation of the microorganisms from the medium takes place automatically or passively, no additional energy is needed. In addition, it is not necessary to circulate the entire medium for harvesting the microorganisms, which allows further energy savings. The process also requires no addition of chemicals that would be detrimental, especially in the production of substances for food additives and drugs by microorganisms.

In einer vorteilhaften Weiterbildung werden die Mikroorganismen bis zur stationären Phase kultiviert, bevor die Bildung des Lipids induziert wird. Bei der Kultivierung von Mikroorganismen werden vier Wachstumsphasen unterschieden, Anlaufphase, exponentielle Phase, stationäre Phase und Absterbephase. In der stationären Phase wird die Zellteilung reduziert und die Zellen produzieren bevorzugt Stoffe, die nicht der Zellteilung dienen, sondern in der Zelle gespeichert werden. Dementsprechend begünstigt die stationäre Phase auch die Bildung und Speicherung von Lipiden. In an advantageous development, the microorganisms are cultured until the stationary phase, before the formation of the lipid is induced. In the cultivation of microorganisms, four growth phases are distinguished: start-up phase, exponential phase, stationary phase and dying-off phase. In the stationary phase, cell division is reduced and the cells prefer to produce substances that are not cell division but are stored in the cell. Accordingly, the stationary phase also promotes the formation and storage of lipids.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das Lipid ein Triacylglycerid, ein Fettsäureester, ein Alkan und/oder ein Wachs. Der Begriff "Lipid" bezeichnet ganz oder teilweise hydrophobe Moleküle, die aufgrund ihrer langen Kohlenwasserstoffketten, von beispielsweise 5 bis 25 Kohlenstoffatomen, bevorzugt von 15 bis 25 Kohlenstoffatomen, wasserabweisend sind. Zu den Lipiden zählen Alkane, Fettsäuren, Triacylglyceride und Wachse sowie Membran-bildende Lipide wie Phospholipide, Sphingolipide und Glykolipide. Für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind insbesondere Fettsäuren und Triacylglyceride mit hoher molekularer Masse und hohem Sättigungsgrad geeignet. Die Fettsäuren, bzw. die Fettsäuren der Triacylglyceride enthalten vorzugsweise mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 15, ferner bevorzugt mindestens 20 Kohlenstoffatome. Des Weiteren sind insbesondere vollständig gesättigte und mono-ungesättigte Fettsäuren sowie Triacylglyceride mit vollständig gesättigten und/oder monoungesättigten Fettsäuren geeignet. In an advantageous embodiment of the invention, the lipid is a triacylglyceride, a fatty acid ester, an alkane and / or a wax. The term "lipid" refers, wholly or in part, to hydrophobic molecules that are hydrophobic because of their long hydrocarbon chains, for example, of from 5 to 25 carbon atoms, preferably from 15 to 25 carbon atoms. The lipids include alkanes, fatty acids, triacylglycerols and waxes as well as membrane-forming lipids such as phospholipids, sphingolipids and glycolipids. In particular, fatty acids and triacylglycerides having a high molecular mass and a high degree of saturation are suitable for carrying out the process according to the invention. The fatty acids or the fatty acids of the triacylglycerides preferably contain at least 10, more preferably at least 15, further preferably at least 20 carbon atoms. Furthermore, in particular completely saturated and monounsaturated fatty acids and triacylglycerides with completely saturated and / or monounsaturated fatty acids are suitable.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung, weist das Lipid eine Dichte von unter 1 g/cm³, bevorzugt unter 0,95 g/cm³, ferner bevorzugt von unter 0,9 g/cm³auf. Fettsäuren und Triacylglyceride mit hoher molekularer Masse und hohem Sättigungsgrad haben eine besonders niedrige Dichte. Bilden die Mikroorganismen solche Lipide, steigen sie zügig an die Oberfläche des Mediums und bilden dort eine stabile Schicht. Dadurch kommt es zu einer schärferen Trennung der Mikroorganismen vom flüssigen Medium, wodurch das Abschöpfen der Mikroorganismen erleichtert wird. Besonders bevorzugt ist die Bildung von Fettsäuren wie Ölsäure, Linolsäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, und Docosahexaensäure, sowie Triacylglyceride mit diesen Fettsäuren. In an advantageous development of the invention, the lipid has a density of less than 1 g / cm ³ , preferably less than 0.95 g / cm ³ , more preferably less than 0.9 g / cm ³ . Fatty acids and triacylglycerides with high molecular mass and high saturation have a particularly low density. If the microorganisms form such lipids, they rise rapidly to the surface of the medium and form a stable layer. This results in a sharper separation of the microorganisms from the liquid medium, which facilitates the skimming of the microorganisms. Particularly preferred is the formation of fatty acids such as oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid, as well as triacylglycerides with these fatty acids.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung sind die Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Algen, Mikroalgen, Archaeen, Cyanobakterien, Kieselalgen und Hefen. Zur Produktion von chemischen Substanzen und Naturstoffen wie beispielsweise Arzneimitteln, Feinchemikalien und Zusatzstoffen für die Lebensmittelindustrie werden vor allem Bakterien und Hefen verwendet. Zur Produktion von Biomasse hingegen werden bevorzugt Algen, Mikroalgen und Cyanobakterien verwenden. In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung werden die Mikroorganismen jedoch nicht zur Produktion von Flüssigkraftstoffen, wie beispielsweise Biodiesel, verwendet. Die Verwendung von Mikroorganismen, die auf Induktion hin ein Lipid bilden, ist insbesondere geeignet, zur Produktion von chemischen Substanzen und Naturstoffen. Die Mikroorganismen können kultiviert werden, bis ausreichende Mengen der Substanz oder des Naturstoffs gebildet wurden. Anschließend wird die Bildung des Lipids induziert, so dass die Mikroorganismen an die Oberfläche des Mediums steigen und geerntet werden können. Ebenso ist die Verwendung von Mikroorganismen, die auf Induktion hin ein Lipid bilden, insbesodere geeignet, zur Produktion von Biomasse. Die Mikroorganismen werden in der exponentiellen Phase kultiviert, wodurch eine optimale Zellteilung gewährleistet ist. Sobald die Zellteilung der Mikroorganismen abnimmt und somit die maximal mögliche Menge an Biomasse erreicht wurde, wird die Bildung des Lipids induziert. Auf diese Weise wird die Zellteilung, und damit der Aufbau von Biomasse, nicht durch die Produktion eines Lipids beeinträchtigt. In an advantageous embodiment of the invention, the microorganisms are selected from the group consisting of bacteria, algae, microalgae, archaea, cyanobacteria, diatoms and yeasts. For the production of chemical substances and natural substances such as pharmaceuticals, fine chemicals and additives for the food industry, especially bacteria and yeasts are used. In contrast, algae, microalgae and cyanobacteria are preferred for the production of biomass. In a particularly preferred embodiment of the invention, however, the microorganisms are not used for the production of liquid fuels, such as biodiesel. The use of microorganisms which form a lipid upon induction is particularly suitable for the production of chemical substances and natural products. The microorganisms can be cultured until sufficient quantities of the substance or natural product have been formed. Subsequently, the formation of the lipid is induced so that the microorganisms can rise to the surface of the medium and be harvested. Likewise, the use of microorganisms that form a lipid upon induction is particularly suitable for the production of biomass. The microorganisms are cultured in the exponential phase, ensuring optimal cell division. As soon as the cell division of the microorganisms decreases and thus the maximum possible amount of biomass has been reached, the formation of the lipid is induced. In this way, the cell division, and thus the build-up of biomass, is not affected by the production of a lipid.

In einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird die Bildung des Lipids durch einen externen Auslöser induziert. Der Begriff "externer Auslöser" bezeichnet eine Einwirkung auf die Mikroorganismen von außen. Dadurch kann der Zeitpunkt der Bildung der Lipide exakt bestimmt werden. Es ist daher möglich, die Mikroorganismen bis zu einer optimalen Zelldichte im Medium zu kultivieren, um erst dann die Lipidproduktion zu induzieren. Dadurch kommt es in der Zelle nicht zu einer Konkurrenz zwischen Stoffwechselwegen, die die Zellteilung fördern und Stoffwechselwegen zur Bildung und Speicherung von Lipiden. Es wird zudem verhindert, dass die Lipidproduktion das Zellwachstum hemmt, wodurch es zu einer längeren exponentiellen Wachstumsphase käme und die Dauer der Kultivierung insgesamt verlängert würde. In a preferred embodiment of the invention, the formation of the lipid is induced by an external trigger. The term "external trigger" refers to an effect on the microorganisms from the outside. As a result, the time of formation of the lipids can be determined exactly. It is therefore possible to cultivate the microorganisms up to an optimal cell density in the medium only to induce lipid production. Thus, there is no competition in the cell between metabolic pathways that promote cell division and metabolic pathways for the formation and storage of lipids. It also prevents lipid production from inhibiting cell growth, resulting in a longer exponential growth phase and prolonging the duration of cultivation as a whole.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist der externe Auslöser ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Reduzieren oder Absetzen mindestens eines Nährstoffs des Mediums, Zugeben einer Substanz zu dem Medium, Verändern der Temperatur des Mediums, und Verändern des pH-Werts des Mediums. Der Begriff „Nährstoffe“ bezeichnet alle Substrate, die im Nährmedium vorhanden sein müssen, um ein optimales Wachstum der Mikroorganismen zu ermöglichen. Hierzu zählen, je nach kultiviertem Mikroorganismus, insbesondere organische oder anorganische Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phosphatverbindungen, Salze, Ammonium, Kalium, Natrium, Spurenelemente, und Kieselsäure. Die Bildung von Lipiden innerhalb der Mikroorganismen erfolgt über Lipidbiosynthesewege, wobei zuerst einzelne Fettsäuren gebildet werden, die anschließend zu Triacylglyceriden verknüpft werden. Die Fettsäurebildung wird durch verschiedene Moleküle, wie das Acyl-Carrier-Protein (ACP), die Fettsäure-Acly-ACP-Thioesterase (fatty acyl-ACP-thioesterase, FAT) und die Acyl-CoA-Synthetase (acyl-CoA-synthetase, ACS), durchgeführt. Die Bildung der Triacylglyceride erfolgt anschließend im sogenannten Kennedy Pathway. Die natürlichen Lipidbiosynthesewege von Mikroorganismen lassen sich durch die Änderung der Kultivierungsbedingungen induzieren bzw. fördern. Beispielsweise kann der Entzug von Nitrat oder Phosphat bei Algen, Mikroalgen und Cyanobakterien zur Bildung und Speicherung von Lipiden führen ( Sharma et al., 2012 ). Ebenso kann die Lipidbiosynthese und speicherung durch die Zugabe, von Eisen, Zink oder Cadmium, induziert werden (Sharma et al., 2012). Auch eine Änderung des pH-Werts des Medium ins Basische, oder eine Erhöhung der Kultivierungstemperatur führt zu einer gesteigerten Lipidbildung und -speicherung. Nicht zuletzt kann die Lipidbildung auch durch die Änderung der Belichtung der Kultur beeinflusst werden. So bilden viele Algen vermehrt Lipide, wenn sie im Dunkeln kultiviert werden (Sharma et al., 2012). In an advantageous development of the invention, the external trigger is selected from the group consisting of reducing or depositing at least one nutrient of the medium, adding a substance to the medium, changing the temperature of the medium, and changing the pH of the medium. The term "nutrients" refers to all substrates that must be present in the nutrient medium to allow optimal growth of the microorganisms. These include, depending on the cultured microorganism, in particular organic or inorganic carbon, nitrogen, sulfur and phosphate compounds, salts, ammonium, potassium, sodium, trace elements, and silica. The formation of lipids within the microorganisms via Lipidbiosynthesewege, wherein first individual fatty acids are formed, which are then linked to triacylglycerides. Fatty acid formation is mediated by various molecules such as acyl carrier protein (ACP), fatty acid acyl-ACP thioesterase (fatty acyl-ACP thioesterase, FAT) and acyl-CoA synthetase (acyl-CoA synthetase, ACS). The formation of triacylglycerides then takes place in the so-called Kennedy Pathway. The natural lipid biosynthetic pathways of microorganisms can be induced or promoted by the change of cultivation conditions. For example, the withdrawal of nitrate or phosphate from algae, microalgae and cyanobacteria can lead to the formation and storage of lipids ( Sharma et al., 2012 ). Likewise, lipid biosynthesis and storage can be induced by the addition of iron, zinc or cadmium (Sharma et al., 2012). Also, changing the pH of the medium to basic, or increasing the culture temperature results in increased lipid formation and storage. Last but not least, lipid formation can also be influenced by changing the exposure of the culture. For example, many algae produce more lipids when cultured in the dark (Sharma et al., 2012).

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung tragen die Mikroorganismen ein genetisches Konstrukt, welches ein Gen zur Bildung des Lipids enthält, wobei das Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht; und die Bildung des Lipids durch das Zugeben eines Stoffes induziert wird, der den induzierbaren Promotor steuert. Durch ein solches Konstrukt kann die Lipidbildung einerseits gezielt induziert und andererseits zusätzlich gesteigert werden, indem ein Protein der Lipidbiosynthese überexprimiert wird. Als äußerer Auslöser wird dem Medium beispielsweise eine Substanz zugegeben, die mit dem Promotor derart interagiert, dass sie ihn aktiviert. Alternativ ist es möglich dem Kulturmedium während der Anzucht der Mikroorganismen eine Substanz zuzusetzen, die mit dem Promotor derart interagiert, dass sie diesen inaktiviert. Sobald die Mikroorganismen ein optimales Wachstum erreicht haben, wird der Promotor dann durch Entzug der Substanz aus dem Medium aktiviert. Bei Bakterien und Hefen sind eine Vielzahl von induzierbarer Promotoren bekannt. In an advantageous embodiment of the invention, the microorganisms carry a genetic construct which contains a gene for the formation of the lipid, wherein the gene is under the control of an inducible promoter; and the formation of the lipid is induced by the addition of a substance that controls the inducible promoter. By means of such a construct, lipid formation on the one hand can be specifically induced and, on the other hand, additionally increased by overexpressing a protein of the lipid biosynthesis. As an external trigger, for example, a substance is added to the medium, which interacts with the promoter such that it activates it. Alternatively, it is possible to add to the culture medium during the culture of the microorganisms a substance which interacts with the promoter such that it inactivates it. Once the microorganisms have reached optimal growth, the promoter is then activated by withdrawal of the substance from the medium. In bacteria and yeasts, a variety of inducible promoters are known.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist der induzierbare Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nitrate-Reduktase-Promotor, HSP70 Promotor, Cab-II Promotor, Cab-I Promotor, Cyc6 copper responsive element und PNR/TNR Kassette. Diese Promotoren können zur induzierbaren Überexpression von Genen in Algen, Mikroalgen und Cyanobakterien genutzt werden ( Quinn und Merchant, 1995; Poulsen und Kröger, 2005 ). In an advantageous embodiment of the invention, the inducible promoter is selected from the group consisting of nitrate reductase promoter, HSP70 promoter, Cab-II promoter, Cab-I promoter, Cyc6 copper responsive element and PNR / TNR cassette. These promoters can be used for inducible overexpression of genes in algae, microalgae and cyanobacteria ( Quinn and Merchant, 1995; Poulsen and Kröger, 2005 ).

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung kodiert das Gen zur Bildung des Lipids die Fettsäure-Acly-ACP-Thioesterase (FAT), Acyl-CoA Synthetase (ACS), Bifunktionelle DGAT/Wachsester Synthase (Bifunctional DGAT/wax ester synthase) oder ein Protein des Kennedy Pathway, bevorzugt ein Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycerin-3-Phosphat Acyltransferase (glycerol-3-phosphat acyltransferase, GPAT), Acylglycerinphosphat-Acyltransferase (acyl-glycerol-phosphat acyltransferase, AGPAT), Phosphorsäure Phosphohydrolase (phosphatidic acid phosphohydrolase, PAP), und Diacylglycerin-Acyltransferase (diacylglycerol acyltransferase, DGAT). In an advantageous embodiment of the invention, the gene for the formation of the lipid encodes the fatty acid acyl-ACP thioesterase (FAT), acyl-CoA synthetase (ACS), bifunctional DGAT / wax ester synthase (BAT) or a protein of the Kennedy Pathway, prefers a protein that is selected from the group consisting of glycerol-3-phosphate acyltransferase (glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT), acylglycerol phosphate acyltransferase (acyl-glycerol-phosphate acyltransferase, AGPAT), phosphoric acid phosphohydrolase (phosphatidic acid phosphohydrolase, PAP), and diacylglycerol acyltransferase (diacylglycerol acyltransferase, DGAT).

Durch die Einbringung eines zusätzlichen Gens eines Proteins, das an der Lipidbiosynthese beteiligt ist, kann die Bildung des Lipids nicht nur induziert sondern auch noch zusätzlich gefördert werden. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn das Gen für ein Protein kodiert, dessen Menge in der Zelle für die Lipidbiosynthese limitierend ist, wie beispielsweise die Acyl-CoA-Synthetase (ACS) oder die Glycerin-3-Phosphat Acyltransferase (GPAT). Alternativ können auch mehrere Gene, die für unterschiedliche Proteine der Lipidbiosynthese kodieren, exprimiert werden. Die Lipidbildung und -speicherung in den Mikroorganismen kann weiter gesteigert werden, indem intrinsische Mechanismen, welche die Lipidbiosynthese begrenzen (sogenannte "Negativ-Feedback-Loop" Mechanismen), gehemmt werden. By introducing an additional gene of a protein which is involved in the lipid biosynthesis, the formation of the lipid can not only be induced but also additionally promoted. It is particularly advantageous if the gene encodes a protein whose amount in the cell is limiting for lipid biosynthesis, such as acyl-CoA synthetase (ACS) or glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT). Alternatively, several genes that code for different proteins of lipid biosynthesis can be expressed. Lipid formation and storage in microorganisms can be further enhanced by inhibiting intrinsic mechanisms that limit lipid biosynthesis (so-called "negative feedback loop" mechanisms).

Im Folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung anhand der beigefügten schematischen Zeichnung erläutert. In the following, a preferred embodiment of the invention will be explained with reference to the accompanying schematic drawing.

1 zeigt die Abfolge der Kultivierungsstadien von Mikroorganismen über die Zeit (t). Eine Impfkultur Mikroorganismen (1) von Phaeodactylum tricornutum wird in einem flüssigen Medium (3) aus künstlichem Meerwasser, das mit Phosphat, Nitrat und Kieselsäure angereichert ist, angeimpft. Die Kultur wird in einem Bioreaktor (2) unter Lichteinfall (4) kultiviert. Mit fortschreitender Zeit (t) wächst die Kultur durch Zellteilung der Mikroorganismen (1). Sobald das Wachstum der Mikroorganismen (1) die stationäre Phase erreicht, wird als externer Auslöser (5) dem Medium (3) Nitrat entzogen. Dazu wird der Kultur neues Medium (3) ohne Nitrat zugeführt. Durch den Entzug von Nitrat beginnen die Mikroorganismen (1) mit der Bildung und Speicherung von Lipiden, wodurch sie an die Oberfläche des Mediums (3) steigen. Von dort können sie durch Abschöpfung (6) geerntet werden. 1 shows the sequence of the cultivation stages of microorganisms over time (t). A seed culture of microorganisms ( 1 ) of Phaeodactylum tricornutum is dissolved in a liquid medium ( 3 ) from artificial seawater enriched with phosphate, nitrate and silica. The culture is stored in a bioreactor ( 2 ) under light ( 4 ). With increasing time (t) the culture grows by cell division of the microorganisms ( 1 ). Once the growth of microorganisms ( 1 ) reaches the stationary phase is called external trigger ( 5 ) the medium ( 3 ) Deprived of nitrate. For this purpose, culture becomes a new medium ( 3 ) supplied without nitrate. By removing nitrate, the microorganisms ( 1 ) with the formation and storage of lipids, causing them to reach the surface of the medium ( 3 ) climb. From there they can be removed by skimming ( 6 ) are harvested.

Referenzen: References:

WO 2012/010969WO 2012/010969
Chen J.E., Smith A.G.; A look at diacylglycerol acyltransferases (DGATs) in algae; Journal of Biotechnology, 2012, 162, 28–39; Chen J.E., Smith A.G .; A look at diacylglycerol acyltransferases (DGATs) in algae; Journal of Biotechnology, 2012, 162, 28-39;
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Quinn J.M., Merchant S.; Two copper-responsive elements associated with the Chlamydomonas Cyc6 gene function as targets for transcriptional activators; The Plant Cell, 1995, 7, 623–638; Quinn J.M., Merchant S .; Two copper-responsive elements associated with the Chlamydomonas cyc6 gene function as targets for transcriptional activators; The Plant Cell, 1995, 7, 623-638;
Sharma K.K., Schuhmann H., Schenk P.M.; High lipid induction in microalgae for biodiesel production; Energies 2012, 5, 1532–1553; Sharma K.K., Schuhmann H., Schenk P.M .; High lipid induction in microalgae for biodiesel production; Energies 2012, 5, 1532-1553;

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 2012/010969 [0002] WO 2012/010969 [0002]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

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Quinn und Merchant, 1995; Poulsen und Kröger, 2005 [0012] Quinn and Merchant, 1995; Poulsen and Kröger, 2005 [0012]

Claims

Verfahren zum Ernten von Mikroorganismen aus einem flüssigen Medium, umfassend die Schritte –Kultivierung der Mikroorganismen in dem Medium, – Induzieren einer Bildung eines Lipids durch die Mikroorganismen, und – Abschöpfen der Mikroorganismen von der Oberfläche des Mediums. A method of harvesting microorganisms from a liquid medium comprising the steps Culturing the microorganisms in the medium, Inducing formation of a lipid by the microorganisms, and - Skimming the microorganisms from the surface of the medium.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen bis zur stationären Phase kultiviert werden, bevor die Bildung des Lipids induziert wird. A method according to claim 1, characterized in that the microorganisms are cultured to the stationary phase before the formation of the lipid is induced.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid ein Triacylglycerid, ein Fettsäureester, ein Alkan und/oder ein Wachs ist. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the lipid is a triacylglyceride, a fatty acid ester, an alkane and / or a wax.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid eine Dichte von unter 1 g/cm³, bevorzugt unter 0,95 g/cm³, ferner bevorzugt von unter 0,9 g/cm³ aufweist. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the lipid has a density of less than 1 g / cm ³ , preferably below 0.95 g / cm ³ , further preferably below 0.9 g / cm ³ .

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Algen, Mikroalgen, Archaeen, Cyanobakterien, Kieselalgen, und Hefen. A method according to claim 1, characterized in that the microorganisms are selected from the group consisting of bacteria, algae, microalgae, archaea, cyanobacteria, diatoms, and yeasts.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung des Lipids durch einen externen Auslöser induziert wird. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the formation of the lipid is induced by an external trigger.

Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der externe Auslöser ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Reduzieren oder Absetzen mindestens eines Nährstoffs des Mediums, Zugeben einer Substanz zu dem Medium, Verändern der Temperatur des Mediums, und Verändern des pH-Werts des Mediums ist. A method according to claim 6, characterized in that the external trigger is selected from the group consisting of reducing or depositing at least one nutrient of the medium, adding a substance to the medium, changing the temperature of the medium, and changing the pH of the medium ,

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ein genetisches Konstrukt tragen, welches ein Gen zur Bildung des Lipids enthält und das Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht; und dass die Bildung des Lipids durch das Zugeben eines Stoffs induziert wird, der den induzierbaren Promotor steuert. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the microorganisms carry a genetic construct which contains a gene for forming the lipid and the gene is under the control of an inducible promoter; and that the formation of the lipid is induced by the addition of a substance which controls the inducible promoter.

Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der induzierbare Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nitratreduktase-Promotor, HSP70 Promotor, Cab-II Promotor, Cab-I Promotor, Cyc6 copper responsive element und PNR/TNR Kassette. A method according to claim 8, characterized in that the inducible promoter is selected from the group consisting of nitrate reductase promoter, HSP70 promoter, Cab-II promoter, Cab-I promoter, Cyc6 copper responsive element and PNR / TNR cassette.

Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen zur Bildung des Lipids Fettsäure-Acly-ACP-Thioesterase (FAT), Acyl-CoA Synthetase (ACS), Bifunktionelle DGAT/Wachsester Synthase oder ein Protein des Kennedy Pathway kodiert, bevorzugt ein Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycerin-3-Phosphat Acyltransferase (GPAT), Acylglycerinphosphat-Acyltransferase (AGPAT), Phosphorsäure Phosphohydrolase (PAP), und Diacylglycerin-Acyltransferase (DGAT). A method according to claim 8, characterized in that the gene for forming the lipid encodes fatty acid acyl-ACP thioesterase (FAT), acyl-CoA synthetase (ACS), bifunctional DGAT / waxester synthase or a Kennedy Pathway protein, preferably a protein which is selected from the group consisting of glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT), acylglycerol phosphate acyltransferase (AGPAT), phosphoric acid phosphohydrolase (PAP), and diacylglycerol acyltransferase (DGAT).