DE102013020703B4 - Raman probe device and method using this device - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vorrichtung und ein Verfahren zur Erzeugung und zur Detektion von Red-Flag-Strahlung und eines Raman-Spektrums, insbesondere zur endoskopischen in vivo-Untersuchung von biologischem Gewebe. Die Aufgabe der Erfindung, ein Vorrichtung zur Erzeugung und zur Detektion von Red-Flag-Strahlung und eines Raman-Spektrums anzugeben, welche eine endoskopische Untersuchung von biologischem Gewebe in vivo ermöglicht, wobei eine Klassifizierung nach Gewebetyp erfolgt, wird dadurch gelöst, dass die Vorrichtung einen Detektor (18) zur Detektion eines Red-Flag-Übersichtsbildes, eine Detektions- und Steuereinheit (16) zur Auswertung des Red-Flag-Übersichtsbildes und zur Steuerung der Raman-Anregungsstrahlung, sowie eine, ein Bündel von Lichtleitern mit mindestens einer Faser (1) enthaltende Messsonde (14) zum Aufsetzen auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe umfasst, wobei Laserlicht in eine oder mehrere Fasern (1) einkoppelbar und über ein Fokussierelement auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe führbar ist und von der Gewebeprobe emittiertes Licht über das Fokussierelement auf den Detektor (18) für Red-Flag-Signalstrahlung und/oder ein Raman-Spektrometer (17) für Raman-Signalstrahlung leitbar ist, wobei das Fokussierelement am Kopf der Messsonde (14) in Form einer transparenten optischen Linse und einer unmittelbar daneben angeordneten transparenten optischen Linse angeordnet ist, vermittels derer das Laserlicht der Faser (1) des Bündels von Lichtleitern als Raman-Anregungsstrahlung kollimiert einkoppelbar und die Raman-Signalstrahlung in die externe Faser (9) auskoppelbar ist, wobei der Linse ein transparenter optischer Kubus mit anschließender transparenter optischer Linse nachgeordnet ist, so dass der Kubus direkt zwischen der Linse und der Linse positioniert ist, wobei in dem Kubus eine Filterschicht, eine Absorber, ein Spiegel und ein Filter in der Art eingebracht sind, dass durch die Filterschicht der in den Fasern (1) entstandene Untergrund auf den Absorber lenkbar und Anregungsstrahlung durch eine Linse auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe führbar ist, durch die Gewebeprobe generierte Raman-Signalstrahlung durch die Linse sammel- und kollimierbar ist, die Raman-Anregungs- und die Raman-Signalstrahlung durch den Filter im Kubus trennbar ist, so dass die durch den Filter abgetrennte Raman-Signalstrahlung im Kubus durch den Spiegel umlenkbar und über die Linse ...The present invention relates to an apparatus and a method for generating and detecting red-flag radiation and a Raman spectrum, in particular for endoscopic in vivo examination of biological tissue. The object of the invention to provide a device for generating and detecting red-flag radiation and a Raman spectrum, which allows an endoscopic examination of biological tissue in vivo, wherein a classification by tissue type, is achieved in that the device a detector (18) for detecting a red flag overview image, a detection and control unit (16) for evaluating the red flag overview image and for controlling the Raman excitation radiation, and one, a bundle of light guides with at least one fiber ( 1) for placement on the surface of the biological tissue sample, wherein laser light can be coupled into one or more fibers (1) and guided to the surface of the biological tissue sample via a focusing element and light emitted by the tissue sample is emitted via the focusing element the detector (18) for red-flag signal radiation and / or a Raman spectrometer (17) f for the Raman signal radiation, the focusing element being arranged at the head of the measuring probe (14) in the form of a transparent optical lens and a directly adjacent transparent optical lens, by means of which the laser light of the fiber (1) of the bundle of light guides is denoted Raman. Collimating coupled excitation radiation and the Raman signal radiation in the external fiber (9) is decoupled, wherein the lens is followed by a transparent optical cube followed by a transparent optical lens, so that the cube is positioned directly between the lens and the lens, wherein in the Cube a filter layer, an absorber, a mirror and a filter are introduced in the way that through the filter layer in the fibers (1) resulting substrate on the absorber steerable and excitation radiation through a lens on the surface of the biological tissue sample is feasible, through the tissue sample generated Raman signal radiation through the L can be collected and collimated, the Raman excitation and the Raman signal radiation is separated by the filter in the cube, so that the separated by the filter Raman signal radiation in the cube can be deflected by the mirror and through the lens ...
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer Raman-Sonde und ein Verfahren unter Verwendung dieser Vorrichtung zur Erzeugung und zur Detektion von Red-Flag-Strahlung, wie bspw. Fluoreszenzstrahlung, und eines Raman-Spektrums, insbesondere zur endoskopischen in vivo-Untersuchung von biologischem Gewebe, wobei eine Klassifizierung nach Gewebetyp erfolgt.The present invention relates to a device with a Raman probe and a method using this device for the generation and detection of red-flag radiation, such as. Fluorescence radiation, and a Raman spectrum, in particular for in vivo endoscopic examination of biological Tissue, classified according to tissue type.
Laser-Scanning-Mikroskope, insbesondere Multiphotonen-Fluoreszenz-Mikroskope (meist Zwei-Photonen-Fluoreszenz) oder faserbasierte Fluoreszenzendoskope werden u. a. für die Detektion verschiedener biologischer Gewebe eingesetzt.Laser scanning microscopes, in particular multiphoton fluorescence microscopes (usually two-photon fluorescence) or fiber-based fluorescence endoscopes, may be used. a. used for the detection of various biological tissues.
Bei der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie wird in einem fluoreszierenden Molekül ein Elektron durch die Absorption jeweils eines Photons angeregt, also in einen höheren Energiezustand versetzt.In conventional fluorescence microscopy, in a fluorescent molecule, an electron is excited by the absorption of one photon, that is, put into a higher energy state.
Die Methode der Fluoreszenzbildgebung erfordert meistens einen Farbstoff, welcher in irgendeiner geeigneten Weise im Zielgebiet eines biologischen Gewebes (bspw. dem Tumorgewebe) angereichert werden muss. In manchen Fällen kann auch die so genannte Autofluoreszenz des biologischen Gewebes genutzt werden, also die Fluoreszenz, die in verschiedenen Geweben ohne die Zugabe eines Farbstoffes auftritt. Fluoreszenz hat den Vorteil einer hohen Quanteneffizienz des Prozesses, wodurch eine Echtzeit-Bildgebung des betrachteten biologischen Gewebes möglich ist. Standard sind hier Bildwiederholfrequenzen bis 60 Hz. Dadurch ist die schnelle Erzeugung eines Übersichtsbildes, bspw. von biologischem Gewebe, möglich, wobei voneinander verschiedene Gewebeareale/-typen bildlich unterschiedlich dargestellt werden können.The method of fluorescence imaging most often requires a dye which must be enriched in any suitable manner in the target area of a biological tissue (eg the tumor tissue). In some cases, the so-called autofluorescence of the biological tissue can be used, ie the fluorescence that occurs in different tissues without the addition of a dye. Fluorescence has the advantage of high quantum efficiency of the process, allowing real-time imaging of the biological tissue under consideration. Standard are here frame rates up to 60 Hz. Thus, the rapid generation of an overview image, for example. Of biological tissue, possible, where different tissue areas / types can be displayed differently represented.
Bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie wird die Anregung des Elektrons durch die gleichzeitige Absorption zweier Photonen hervorgerufen (Zwei-Photonen-Absorption). Auch eine Anregung mit drei oder mehr gleichzeitig eintreffenden Photonen ist möglich. Mit Hilfe eines starken, fokussierten Laserstrahls werden beim Multiphotonen-Fluoreszenz-Mikroskop nichtlineare optische Effekte erzeugt, die auf dem Zusammenspiel mehrerer gleichzeitig in einem Molekül eintreffenden Photonen beruhen. Die Stärke des erzeugten Signals steigt daher nicht linear mit der Zahl der eingestrahlten Photonen, sondern mit dem Quadrat (bei Zwei-Photonen-Effekten) oder der dritten Potenz (bei Drei-Photonen-Effekten).In two-photon fluorescence microscopy, the excitation of the electron is caused by the simultaneous absorption of two photons (two-photon absorption). An excitation with three or more simultaneously arriving photons is possible. With the help of a strong, focused laser beam, the multiphoton fluorescence microscope generates non-linear optical effects based on the interaction of several photons arriving simultaneously in one molecule. Therefore, the strength of the generated signal does not increase linearly with the number of irradiated photons, but with the square (for two-photon effects) or the third power (for three-photon effects).
Mit der Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie können tiefere Bereiche, bspw. von 200 μm bis zu 1000 μm erreicht werden, wodurch Fluoreszenzaufnahmen von lebenden, biologischen Geweben möglich sind, die anderweitig für die Bildgebung unerreichbar sind. (Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie weist bspw. eine Eindringtiefe je nach Präparat von nur 50 bis 80 μm auf).With the multi-photon fluorescence microscopy deeper areas, for example. From 200 microns to 1000 microns can be achieved, which fluorescence images of living biological tissues are possible, which are otherwise unattainable for imaging. (Confocal laser scanning microscopy has, for example, a penetration depth of only 50 to 80 μm, depending on the preparation).
Mittels 2-Photonen-Laser-Mikroskopie können bspw. die Tumorzellen in der Kokultur anhand der GFP-Fluoreszenz identifiziert werden (Martin Edelmann, Rudolf Maria Huber und Albrecht Bergner: „Tumoranalyse in einem dreidimensionalen Kokulturmodell”; Pneumologie 02/2009, Seite 63–92).By means of 2-photon laser microscopy, for example, the tumor cells in coculture can be identified on the basis of GFP fluorescence (Martin Edelmann, Rudolf Maria Huber and Albrecht Bergner: "Tumor Analysis in a Three-Dimensional Kokultur Model"; Pulmonology 02/2009, page 63- 92).
Mit der Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie kann ausgewertet werden, ob der Farbstoff bzw. das biologische Gewebe eine Fluoreszenz zeigt, was jedoch in den meisten Fällen nicht spezifisch genug ist, um zu erkennen, ob es sich um tumoröses Gewebe handelt, oder zu charakterisieren, um welchen Tumortyp es sich handelt. Daher werden in vielen Fällen mehrere Farbstoffe verwendet oder, im Falle der Autofluoreszenz, mehrere Fluorophore angeregt, um die Spezifität zu erhöhen. Dies gelingt jedoch nur begrenzt, da bspw. verschiedene Färbemethoden für den gleichen Gewebetyp gefunden werden müssen.Multiphoton fluorescence microscopy can be used to evaluate whether the dye or biological tissue exhibits fluorescence, which in most cases is not specific enough to detect whether or not it is tumorous tissue Type of tumor. Therefore, in many cases, multiple dyes are used or, in the case of autofluorescence, multiple fluorophores are stimulated to increase specificity. However, this is only possible to a limited extent since, for example, different staining methods for the same tissue type have to be found.
Der Nachteil der bekannten Fluoreszenztechniken zur Untersuchung von biologischem Gewebe besteht somit darin, dass man durch sie nur erkennen kann, dass bspw. eine Gewebeveränderung vorliegt. Diese Erkennung kann, wie zuvor stehend bereits beschrieben, sehr schnell an Hand eines Fluoreszenzübersichtsbildes gewonnen werden. Diese Technik der Bereitstellung eines schnellen Übersichtsbildes, bspw. zur Anzeige, ob eine Veränderung im biologischen Gewebe vorliegt oder nicht, wird als „Red-Flag”-Technik bezeichnet. Die Strahlung, die bei dieser Technik verwendet wird, ist im Folgenden als „Red-Flag-Strahlung” bezeichnet.The disadvantage of the known fluorescence techniques for the examination of biological tissue is thus that they can only recognize through them that, for example, a tissue change is present. This recognition can, as already described above, be obtained very quickly on the basis of a fluorescence overview image. This technique of providing a quick overview image, for example, to indicate whether there is a change in biological tissue or not, is referred to as the "red flag" technique. The radiation used in this technique is hereinafter referred to as "red-flag radiation".
Nachteilig an den bekannten Fluoreszenztechniken (Fluoreszenzmikroskopie und -endoskopie) ist somit, dass man mit ihnen nicht klassifizieren/charakterisieren kann, um welche Gewebeveränderung es sich konkret handelt (bspw. ob ein Tumorgewebe vorliegt und wenn „ja”, welche Art von Tumorgewebe gegeben ist).A disadvantage of the known fluorescence techniques (fluorescence microscopy and endoscopy) is thus that they can not classify / characterize with them what tissue change is actually (for example, whether a tumor tissue is present and if "yes", what type of tumor tissue is given ).
Ansatzpunkte für eine gegenüber der Fluoreszenzmikroskopie und -endoskopie spezifischen Klassifizierung von biologischem Gewebe bietet die Raman-Spektroskopie.Starting points for a classification of biological tissue that is specific to fluorescence microscopy and endoscopy are provided by Raman spectroscopy.
Diese Raman-Spektroskopie basiert auf der inelastischen Lichtstreuung von Photonen, welche detaillierte, chemische Informationen über die Probe enthalten, anhand derer eine Klassifikation vorgenommen werden kann.This Raman spectroscopy is based on the inelastic light scattering of photons, which contain detailed, chemical information about the sample, which can be used to classify it.
Bei der Raman-Spektroskopie wird die zu untersuchende Materie mit monochromatischem Licht bestrahlt, üblicherweise aus einem Laser. Im Spektrum des an der Probe gestreuten Lichts werden neben der eingestrahlten Frequenz (Rayleigh-Streuung) noch weitere Frequenzen beobachtet, die auf einer Wechselwirkung des Lichtes mit der Materie, dem sogenannten Raman-Effekt beruhen. Die Frequenzunterschiede zum eingestrahlten Licht entsprechen den für das Material charakteristischen Energien von Rotations-, Schwingungs-, Phonon- oder Spin-Flip-Prozessen. Da die Wellenlänge des Lichts, d. h. seine Farbe, von der Energie des Lichtes abhängt, bewirkt dieser Energieübertrag eine Verschiebung der Wellenlänge des gestreuten Lichtes gegenüber dem eingestrahlten Licht, die sogenannte Raman-Verschiebung. In Raman spectroscopy, the matter to be examined is irradiated with monochromatic light, usually from a laser. In addition to the incident frequency (Rayleigh scattering), other frequencies are observed in the spectrum of the light scattered on the sample, which are based on an interaction of the light with matter, the so-called Raman effect. The frequency differences to the incident light correspond to the characteristic of the material energy of rotation, vibration, phonon or spin-flip processes. Since the wavelength of the light, ie its color, depends on the energy of the light, this energy transfer causes a shift of the wavelength of the scattered light with respect to the incident light, the so-called Raman shift.
Aus dem erhaltenen Spektrum („Stokes-Seite” bzw. „Anti-Stokes-Seite” des Spektrums) lassen sich, ähnlich dem Spektrum der Infrarotspektroskopie, Rückschlüsse auf die untersuchte Substanz ziehen.From the spectrum obtained ("Stokes side" or "anti-Stokes side" of the spectrum), similar to the spectrum of infrared spectroscopy, conclusions can be drawn on the substance under investigation.
Neben der klassischen Raman-Spektroskopie existieren noch einige Varianten und Weiterentwicklungen. Dazu gehören:
- • auf der nichtlinearen Raman-Streuung basierende Verfahren, wie bspw. die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (s. g. CARS),
- • auf der oberflächenverstärkten Raman-Streuung basierende Verfahren (s. g. SERS) und
- • die spitzenverstärkten Raman-Spektroskopie (s. g. TERS) als Kombination aus SERS und Rasterkraftmikroskopie (s. g. AFM).
- Methods based on nonlinear Raman scattering, such as, for example, coherent anti-Stokes-Raman scattering (see CARS),
- • methods based on surface enhanced Raman scattering (see SERS) and
- • tip-enhanced Raman spectroscopy (see TERS) as a combination of SERS and Atomic Force Microscopy (AFG).
Die Raman-Spektroskopie erlaubt auch Aussagen über wässrige Systeme, welche über Infrarot-Spektroskopie schwer zugänglich sind. So sind nicht nur abiotische, sondern auch biotische Systeme der Analyse zugänglich. Es ist prinzipiell sogar möglich, einzelne Spezies von Bakterien oder biologisches Gewebe mittels Raman-Spektroskopie zu unterscheiden.The Raman spectroscopy also allows statements about aqueous systems, which are difficult to access via infrared spectroscopy. Thus, not only abiotic but also biotic systems are accessible to analysis. In principle, it is even possible to distinguish individual species from bacteria or biological tissue by means of Raman spectroscopy.
Durch die schwache Quanteneffizienz bei der Raman-Spektroskopie sind jedoch lange Messzeiten notwendig. Die Dauer der Aufnahme eines s. g. Raman-Spektrums liegt im Bereich von mehreren 100 Millisekunden, was den Anforderungen einer schnellen Bildgebung nicht gerecht wird.Due to the weak quantum efficiency in Raman spectroscopy, however, long measurement times are necessary. The duration of the recording of a s. G. Raman spectrum is in the range of several 100 milliseconds, which does not meet the requirements of a fast imaging.
Weiterhin müssen diese Art von Sonden gefiltert werden um die intrinischen Untergründe zu unterdrücken. Dies geschieht zum Beispiel durch separat gefertigte Filter, welche dann auf die Sonde gebracht werden (siehe dazu bspw.
Auch ist bekannt, einen Messkopf in seinen Dimensionen größer zu gestalten und die beide Lichtwege (Anregungs- und Detektionslichtweg) getrennt über Linsen/Spiegel und Filter zu trennen. Dies wird u. a. von Shim, M. G. in ”Evaluation of fiber optic probes for in-vivo Raman spectroscopy” [Proceedings of SPIE 3257 208–217 (1998)] und von Short, M. A. et al. in ”Development and preliminary results of an endoscopic Raman probe for potential in vivo diagnosis of lung cancer.” [Optics Letters 33, 711–713 (2008)] vorgeschlagen. Da Anregungsweg und Sammelweg unterschiedliche sowie genau gegensätzliche Filter benötigen, werden gemäß diesem Stand der Technik immer Sonden mit getrenntem Anregungs- und Sammelweg vorgeschlagen, welche Punktsonden sind.It is also known to make a measuring head larger in size and separate the two light paths (excitation and detection light path) separately via lenses / mirrors and filters. This will u. a. by Shim, M.G. in "Evaluation of fiber optic probes for in vivo Raman spectroscopy" [Proceedings of SPIE 3257 208-217 (1998)] and by Short, M.A. et al. in "Development and preliminary results of an endoscopic Raman sample for potential in vivo diagnosis of lung cancer." [Optics Letters 33, 711-713 (2008)]. Since excitation path and collection path require different as well as exactly opposite filters, according to this prior art probes with separate excitation and collection path are always proposed, which are point probes.
Dieser Aufbau hat den Nachteil, dass er sehr voluminös ist und nicht in kleine Gefäße oder Katheter eingeführt werden kann bzw. der ungefilterte Teil der Fasern nur sehr kurz sein darf, da sonst die Störsignale die gewünschten Raman-Signale überlagern. Auch kann mit diesen Punktsonden keine Bildgebung für schnelle Übersichtsbilder erfolgen.This structure has the disadvantage that it is very bulky and can not be inserted into small vessels or catheters or the unfiltered part of the fibers may only be very short, otherwise the interfering signals superimpose the desired Raman signals. Also, no imaging for fast overview images can be done with these point probes.
Aus der
Das Fokussierelement ist dabei lösbar auf das Ende des Lichtleiterbündels aufgesteckt und in die zentralen Fasern des Lichtleiterbündels ist ein optischer Filtereinsatz eingesetzt.The focusing element is releasably attached to the end of the optical fiber bundle and in the central fibers of the optical fiber bundle, an optical filter cartridge is inserted.
Der optische Filtereinsatz enthält zwei transparente Kugeln oder Gradientenindexlinsen (GRIN-Linsen) zur Lichtkollimation, zwischen denen sich eine Filterplatte (Interferenzfilter) befindet, deren Ebene nicht exakt senkrecht auf der Verbindungslinie der Mittelpunkte der beiden Kugeln oder GRIN-Linsen steht.The optical filter insert contains two transparent spheres or gradient index lenses (GRIN lenses) for light collimation, between which there is a filter plate (interference filter) whose plane is not exactly perpendicular to the connecting line of the centers of the two spheres or GRIN lenses.
Dieser Filtereinsatz dient der Unterdrückung von unerwünschter Raman-Streuung des Fasermaterials in die zentralen Fasern. Die leicht geneigte Filterplatte (der leicht geneigte Interferenzfilter) bewirkt, dass Licht des Lasers nicht direkt rückreflektiert wird. This filter insert serves to suppress unwanted Raman scattering of the fiber material into the central fibers. The slightly inclined filter plate (the slightly inclined interference filter) causes light from the laser is not reflected directly back.
Die
Der Nachteil der beiden technischen Lösungen gemäß
Hinzu kommt, dass die Raman-Spektren gemäß
Aus der Publikation von Kenny Kong et al. „Diagnosis of tumors during tissue-conserving surgery with integrated autofluorescence and Raman scattering microscopy” PNAS, 09/2013, Vol. 110 no. 38, page 15189–15194 ist die Kombination beider Techniken (Fluoreszenz- und Raman-Spektroskopie) vermittels eines kombinierten Fluoreszenz- und Raman-Mikroskops bekannt, welche zu einem enormen Zeitvorteil gegenüber den bekannten Untersuchungsmethoden führt.From the publication by Kenny Kong et al. "Diagnosis of tumors during tissue-conserving surgery with integrated autofluorescence and Raman scattering microscopy" PNAS, 09/2013, Vol. 110 no. 38, page 15189-15194 is the combination of both techniques (fluorescence and Raman spectroscopy) by means of a combined Fluorescence and Raman microscope known, which leads to an enormous time advantage over the known investigation methods.
Die Fluoreszenzspektroskopie wird bei dieser kombinierten Methode genutzt, um das erfasste Bild des biologischen Gewebes in s. g. Cluster aufzuteilen. Dies wird durch die Anregung der Autofluoreszenz bei zwei verschiedenen Wellenlängen realisiert. Die Intensitäten der auftretenden Autofluoreszenz werden dabei zueinander ins Verhältnis gesetzt und das Bild so in viele Cluster mit gleichen Intensitätsverhältnissen geteilt. Innerhalb eines solchen Abschnittes, so postuliert Kong et al., ändert sich der Gewebetyp nicht. D. h. mit der Aufnahme und Klassifikation eines einzelnen (oder mehreren) Raman-Spektren innerhalb eines solchen Clusters kann der vorliegende Gewebecluster sehr spezifisch klassifiziert werden und die Aufnahmedauer eines gesamten und gleichzeitig sehr spezifischen Bildes extrem reduziert werden.Fluorescence spectroscopy is used in this combined method to capture the captured image of the biological tissue in s. G. Split up clusters. This is realized by the excitation of autofluorescence at two different wavelengths. The intensities of the occurring autofluorescence are set in relation to each other and the image is thus divided into many clusters with the same intensity ratios. Within such a section, says Kong et al., The tissue type does not change. Ie. With the inclusion and classification of a single (or more) Raman spectra within such a cluster, the subject tissue clusters can be classified very specifically and the acquisition time of an entire and at the same time very specific image can be extremely reduced.
Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass ein Mikroskop mit Objektiv verwendet werden muss, um das biologische Gewebe in vitro zu charakterisieren, da die faserbasierte Aufnahme von Raman-Spektren Filter auf einer Sondenspitze erfordert.The disadvantage of this technical solution is that a microscope with objective must be used to characterize the biological tissue in vitro, since the fiber-based recording of Raman spectra requires filters on a probe tip.
Eine endoskopische Untersuchung von biologischem Gewebe in vivo (bspw. im Lungen, Prostata- oder Darmbereich eines Patienten) ist mit dieser technischen Lösung nicht möglich.An endoscopic examination of biological tissue in vivo (for example in the lungs, prostate or intestine region of a patient) is not possible with this technical solution.
Der Nachteil dieser technischen Lösung besteht darin, dass lediglich fluide Proben, welche die Mikrofluid-Plattform durchströmen, untersucht werden können und somit kein biologisches Gewebe in vivo charakterisiert werden kann (insbesondere keine endoskopische Untersuchung von Gewebe im Lungen, Prostata- oder Darmbereich eines Patienten möglich ist).The disadvantage of this technical solution is that only fluid samples which flow through the microfluidic platform can be examined and thus no biological tissue can be characterized in vivo (in particular no endoscopic examination of tissue in the lungs, prostate or intestinal region of a patient possible is).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung mit einer Raman-Sonde sowie ein Verfahren unter Verwendung dieser Vorrichtung anzugeben, welche die Nachteile des Standes der Technik vermeiden, insbesondere eine schnelle endoskopische Untersuchung von biologischem Gewebe in vivo ermöglichen, wobei eine Klassifizierung nach Gewebetyp erfolgt.The invention has for its object to provide a device with a Raman probe and a method using this device, which avoid the disadvantages of the prior art, in particular allow rapid endoscopic examination of biological tissue in vivo, with a classification by tissue type ,
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung zur Erzeugung und zur Detektion von Red-Flag-Strahlung sowie eines Raman-Spektrums gemäß dem ersten Patentanspruch sowie einem Verfahren gemäß dem 9. Patentanspruch. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den nachgeordneten Ansprüchen angegeben.This object is achieved according to the invention by a device for generating and detecting red-flag radiation and a Raman spectrum according to the first claim and a method according to the ninth claim. Advantageous embodiments of the invention are specified in the subordinate claims.
Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass durch die endoskopische Bereitstellung eines schnellen Red-Flag-Strahlungsübersichtsbildes (bspw. eines schnellen Fluoreszenzübersichtsbildes) eine Unterteilung eines zu untersuchenden Ausschnitts eines biologischen Gewebes in vivo erfolgt und in Kombination mit einer anschließenden spezifischen Charakterisierung mittels Raman-Spektroskopie in vivo in den entsprechend unterteilten, ausgewählten Regionen des im Übersichtsbild dargestellten Gewebes eine Klassifizierung nach Gewebetyp erfolgt, ohne eine Entnahme von biologischem Gewebe aus inneren oder äußeren Körperregionen vornehmen und ohne die Position der Sonde nachstellen zu müssen. The essence of the invention is that the endoscopic provision of a rapid red-flag radiation overview image (for example a fast fluorescence overview image) subdivides a section of biological tissue to be examined in vivo and in combination with a subsequent specific characterization by means of Raman spectroscopy a tissue type classification is made in vivo in the correspondingly divided, selected regions of the tissue depicted in the overview image without having to remove biological tissue from internal or external body regions and without having to readjust the position of the probe.
Dazu umfasst die Vorrichtung zur Erzeugung und zur Detektion von Red-Flag-Strahlung sowie eines Raman-Spektrums eine Laserlichtquelle zur Generierung von Strahlung in einer biologischen Gewebeprobe und eine, ein Bündel von Lichtleitern (zentrale Faser) und eine externe Faser enthaltende Messsonde zum Aufsetzen auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe, wobei diese Gewebeprobe durch die über das Bündel von Lichtleitern führbare Strahlung der Laserlichtquelle (Red-Flag-Anregungsstrahlung) abrasterbar ist, um ein Red-Flag-Übersichtsbild der Gewebeprobe mittels der gleichen oder einer anderen externen Faser zu erzeugen, welches in das Gehäuse einer Detektions- und Steuereinheit auf einen Detektor für Red-Flag-Strahlung leitbar ist.For this purpose, the device for generating and detecting red-flag radiation as well as a Raman spectrum comprises a laser light source for generating radiation in a biological tissue sample and a measuring probe containing a bundle of optical fibers (central fiber) and an external fiber for placement the surface of the biological tissue sample, which tissue sample can be scanned by the radiation of the laser light source (red-flag excitation radiation) that can be guided via the bundle of optical fibers in order to produce a red-flag overview image of the tissue sample by means of the same or another external fiber, which is in the housing of a detection and control unit on a detector for red-flag radiation can be conducted.
Dabei ist anschließend Laserlicht (Raman-Anregungsstrahlung) in eine (oder mehrere) zentrale Faser(n) des Bündels vermittels der Detektions- und Steuereinheit an Hand des Red-Flag-Übersichtsbildes gezielt, adressierbar einkoppelbar und über ein Fokussierelement auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe führbar, so dass an jedem Punkt des Red-Flag-Übersichtsbildes gezielt adressierbar Raman-Strahlung für die Aufnahme von Ramanspektren erzeugbar ist, ohne die Messsonde bewegen zu müssen.In this case, then laser light (Raman excitation radiation) in one (or more) central fiber (s) of the bundle by means of detection and control unit on the hand of the red-flag overview image targeted, addressable einkoppelbar and a focusing on the surface of the biological tissue sample feasible, so that at each point of the red-flag overview image specifically addressable Raman radiation for the acquisition of Raman spectra can be generated without having to move the probe.
Die von der Gewebeprobe emittierte, von der Messsonde erfasste Raman-Strahlung ist dabei über die externe Faser der Messsonde in das Gehäuse der Detektionseinheit in ein Raman-Spektrometer leitbar.The Raman radiation emitted by the tissue sample and detected by the measuring probe can be conducted via the external fiber of the measuring probe into the housing of the detection unit in a Raman spectrometer.
Wesentlich dabei ist, dass das Fokussierelement am Kopf der Messsonde in Form einer transparenten optischen Linse (für die Anregungsstrahlung für die Red-Flag- und die Raman-Strahlung) und einer unmittelbar daneben angeordneten transparenten optischen Linse (für die Signalstrahlung in Form der Red-Flag- und der Raman-Strahlung) angeordnet ist. Vermittels dieser beiden Linsen ist das Laserlicht der Fasern des Lichtleiterbündels als Anregungsstrahlung kollimiert einkoppelbar und die Signalstrahlung in die bildgebenden Fasern auskoppelbar.It is essential that the focusing element at the head of the measuring probe in the form of a transparent optical lens (for the excitation radiation for the red-flag and Raman radiation) and a directly adjacent arranged transparent optical lens (for the signal radiation in the form of Red- Flag and the Raman radiation) is arranged. By means of these two lenses, the laser light of the fibers of the optical fiber bundle can be collimated as excitation radiation and the signal radiation can be decoupled into the imaging fibers.
Wesentlich ist dabei weiterhin, dass der Linse, welche das Anregungslicht für die Raman-Strahlung kollimiert, ein transparenter optischer Kubus mit einer anschließenden transparenten dritten optischen Linse nachgeordnet ist, so dass der Kubus direkt zwischen der Linse der Raman-Anregungsstrahlung und dieser dritten Linse positioniert ist, wobei in dem Kubus eine Filterschicht, ein Absorber, ein Spiegel und ein Filter in der Art eingebracht sind, dass durch die Filterschicht der in den Fasern (der Raman-Anregungsstrahlung) entstandene Untergrund auf den Absorber lenkbar ist (Adsorption von Strahlung größer als 800 nm aus der Raman-Anregungsstrahlung) und die „bereinigte” Raman-Anregungsstrahlung durch die dritte Linse auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe führbar ist.It is also essential here that the lens which collimates the excitation light for the Raman radiation is followed by a transparent optical cube with a subsequent transparent third optical lens, so that the cube is positioned directly between the lens of the Raman excitation radiation and this third lens is, wherein in the cube a filter layer, an absorber, a mirror and a filter are introduced in such a way that through the filter layer in the fibers (the Raman excitation radiation) resulting substrate is steerable on the absorber (adsorption of radiation greater than 800 nm from the Raman excitation radiation) and the "clean" Raman excitation radiation through the third lens on the surface of the biological tissue sample is feasible.
Die durch die Probe generierte Raman-Signalstrahlung ist vermittels der dritten Linse sammel- und kollimierbar.The Raman signal radiation generated by the sample can be collected and collimated by means of the third lens.
Wichtig dabei ist, dass die Raman-Anregungs- und die Raman-Signalstrahlung durch den Filter im Kubus trennbar ist, so dass die durch den Filter (in Form eines Notchs oder Bandpass) abgetrennte Raman-Signalstrahlung im Kubus durch den Spiegel umlenkbar und über Linse (für die Raman-Signalstrahlung) in die externe bildgebende Faser einkoppelbar ist. Dadurch erfolgt durch den Filter die „Bereinigung” des Raman-Signals von der Anregungsstrahlung, wobei die bereinigte Raman-Signalstrahlung in das Gehäuse der Detektionseinheit mit Raman-Spektrometer mündet.It is important that the Raman excitation and Raman signal radiation through the filter in the cube is separable, so that the separated by the filter (in the form of a notch or bandpass) Raman signal radiation in the cube through the mirror deflected and the lens (for the Raman signal radiation) can be coupled into the external imaging fiber. As a result, the "cleanup" of the Raman signal from the excitation radiation takes place through the filter, with the adjusted Raman signal radiation discharging into the housing of the detection unit with Raman spectrometer.
Die Detektions- und Steuereinheit dient dabei der Detektion und Auswertung des schnellen Red-Flag-Übersichtsbildes eines biologischen Gewebes (bspw. in Form eines schnellen Fluoreszenzübersichtsbildes), der Bildunterteilung und der Auswahl der Gebiete des unterteilten Red-Flag-Übersichtsbildes zur Steuerung für die anschließende spezifische Charakterisierung des Gewebeausschnittes vermittels Raman-Spektroskopie im Sinne der Publikation „Diagnosis of tumors during tissue-conserving surgery with integrated autofluorescence and Raman scattering microscopy” von Kong et. al PNAS, 09/2013, Vol. 110 no. 38, page 15189–15194. Dabei ist Laserlicht in Form der Raman-Anregungsstrahlung gezielt und adressierbar in eine (oder mehrere) zentrale Faser(n) des Bündels einkoppelbar und über den Kubus mit dem Fokussierelement auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe führbar.The detection and control unit serves to detect and evaluate the rapid red-flag overview image of a biological tissue (for example in the form of a fast fluorescence overview image), the image subdivision and the selection of the areas of the subdivided red flag overview image for the control of the subsequent specific characterization of the tissue section by means of Raman spectroscopy in the sense of the publication "Diagnosis of tumors during tissue-conserving surgery with integrated autofluorescence and Raman scattering microscopy" by Kong et. al PNAS, 09/2013, Vol. 110 no. 38, page 15189-15194. In this case, laser light in the form of the Raman excitation radiation can be coupled in a targeted and addressable manner into one (or more) central fiber (s) of the bundle and can be guided via the cube with the focusing element onto the surface of the biological tissue sample.
Besonders vorteilhaft sind dabei die drei verwendeten Linsen als Gradientenindexlinsen ausgeführt, wobei das Bündel von Lichtleitern sowie die externe Faser zu einem Faserkombinationsbündel zusammengefasst ist und gemeinsam mit der Messsonde von einer im Wesentlichen hohlzylindrischen Umhüllung umgeben wird (bspw. ein Kanal eines Endoskops). Dabei ist die Stirnfläche der dritten Linse nicht umhüllt und der Innendurchmesser des Hohlzylinders stimmt im Wesentlichen mit dem Außendurchmesser des Faserkombinationsbündels und der Messsonde überein.In this case, the three lenses used are particularly advantageously designed as gradient index lenses, the bundle of optical fibers and the external fiber becoming a fiber combination bundle is summarized and together with the probe surrounded by a substantially hollow cylindrical enclosure (eg, a channel of an endoscope). In this case, the end face of the third lens is not enveloped and the inner diameter of the hollow cylinder substantially coincides with the outer diameter of the fiber combination bundle and the measuring probe.
Das Faserkombinationsbündel kann bis zu 10 Meter lang sein und einen Außendurchmesser von bis zu 10 mm aufweisen.The fiber combination bundle can be up to 10 meters long and have an outside diameter of up to 10 mm.
Das Faserkombinationsbündel aus dem Bündel von Lichtleitern mit zentraler Faser und der externen Faser besteht aus Quarzglasfasern, wobei das Bündel von Lichtleitern die Red-Flag-Anregungsstrahlung sowie die Red-Flag-Strahlung transportiert und die zentrale bildgebende Faser (Imaging-Faser) umfasst, welche die Raman-Anregungsstrahlung transportiert. Die externe Faser ist dabei eine Multimode-Faser mit einem Durchmesser von bspw. 100 μm, welche sämtlich Raman-Signalstrahlung transportiert. Die bildgebende Faser kann dabei mit vielen lichtleitenden Kernen umgeben sein oder als Faserbündel aus vielen einzelnen zu dem Bündel zusammengesetzten Fasern bestehen.The fiber combination bundle of the bundle of central fiber optical fibers and the external fiber is made of quartz glass fibers, the bundle of optical fibers carrying the red flag excitation radiation and the red flag radiation and comprising the central imaging fiber (imaging fiber) transports the Raman excitation radiation. The external fiber is a multimode fiber with a diameter of, for example, 100 .mu.m, which transports all Raman signal radiation. The imaging fiber may be surrounded by many light-guiding cores or may consist of many individual fibers combined to form the bundle.
Der Adsorper adsorbiert sämtliche Strahlung über 800 nm.The adsorber adsorbs all radiation over 800 nm.
Der Filter (bspw. ein Notch oder Bandpass) „bereinigt” das Raman-Signals, die größer als 800 nm ist, von der Anregungsstrahlung.The filter (eg, a notch or bandpass) "cleans up" the Raman signal, which is greater than 800 nm, from the excitation radiation.
Die verwendete Laserlichtquelle ist bspw. ein Nd-YAG-Laser, ein He-Ne-Laser oder ein Halbleiterlaser.The laser light source used is, for example, an Nd-YAG laser, a He-Ne laser or a semiconductor laser.
Die von diesem Laser vermittels Anregungsstrahlung erzeugte Red-Flag-Strahlung kann eine Autofluoreszenz-Strahlung, eine Zwei- oder Dreiphotonenfluoreszenz-Strahlung, kohärente Anti-Stokes-Raman-Strahlung oder stimulierte Raman-Streuungsstrahlung sein.The red-flag radiation generated by this laser via excitation radiation may be autofluorescence radiation, two- or three-photon fluorescence radiation, coherent anti-Stokes-Raman radiation, or stimulated Raman scattering radiation.
Die Detektions- und Steuereinheit ist eine geeignete, an sich bekannte Scanneroptik (bspw. Laserscanningmikroskop), vermittels derer die Red-Flag-Strahlung detektierbar ist, welche datenleitend mit der Software eines Computers in Verbindung steht.The detection and control unit is a suitable, known per se scanner optics (for example. Laserscanningmikroskop), by means of which the red-flag radiation is detectable, which is data-conducting with the software of a computer in connection.
Der Steuerteil der Detektions- und Steuereinheit übernimmt dabei die von dem Detektionsteil der Detektions- und Steuereinheit erzeugten, vermittels der Software des Computers bearbeiteten Signale (ausgewertetes Red-Flag-Übersichtsbild) und dient der Steuerung der Raman-Anregungsstrahlung, in dem die Position der von der Laserlichtquelle in das Bündel von Lichtleitfasern einkoppelbaren Raman-Anregungsstrahlung gezielt, adressierbar auf Punkte des im Red-Flag-Übersichtsbild dargestellten, zu untersuchenden biologischen Gewebes richtbar ist, welche den zuvor gezielt ausgewählten Punkten/Spots im Red-Flag-Übersichtsbild oder dem entsprechenden Clusterbild (wie Kenny Kong et al.) entsprechen.The control part of the detection and control unit takes over the signals generated by the detection part of the detection and control unit, processed by means of the software of the computer (evaluated red flag overview image) and serves to control the Raman excitation radiation in which the position of the laser light source in the bundle of optical fibers einkopoppelbaren Raman excitation radiation targeted, addressable to points of the red flag overview image displayed, to be examined biological tissue can be directed, which previously selectively selected points / spots in the red flag overview image or the corresponding cluster image (as Kenny Kong et al.) correspond.
Bei dem Verfahren zur Erzeugung und zur Detektion von Red-Flag-Strahlung und eines Raman-Spektrums unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird mittels der Laserlichtquelle eine Anregungsstrahlung über die bildgebende Faser durch die Linse für die Anregungsstrahlung, durch die Filterschicht des Kubus und dritte, dem Kubus nachgeordnete Linse hindurch auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe geführt und vergrößert oder verkleinert abgebildet.In the method for generating and detecting red-flag radiation and a Raman spectrum using the device according to the invention by the laser light source excitation radiation through the imaging fiber through the lens for the excitation radiation, through the filter layer of the cube and third, the Cube subordinate lens passed through the surface of the biological tissue sample and displayed enlarged or reduced.
Die von der Probe emittierte Red-Flag-Signalstrahlung wird dann von der dritten, dem Kubus nachgeordneten Linse über die Filterschicht des Kubus, durch den Filter hindurch über den Spiegel im Kubus durch die Linse für die Faser hindurch in die Bildleitfaser geführt.The red-flag signal radiation emitted by the sample is then passed from the third cube-subordinate lens via the filter layer of the cube, through the filter, through the mirror in the cube, through the lens for the fiber, into the image guide fiber.
Die Signalstrahlung in Form der Red-Flag-Strahlung wird in die Detektionseinheit geleitet, wobei auf Grundlage der ausgewerteten Signale der Detektionseinheit über die Auswerte- und Steuereinheit die Raman-Anregungsstrahlung von der Laserlichtquelle gezielt adressierbar, einzeln in eine zentrale Faser des Bündels eingeleitet wird.The signal radiation in the form of the red-flag radiation is conducted into the detection unit, wherein based on the evaluated signals of the detection unit via the evaluation and control unit, the Raman excitation radiation from the laser light source specifically addressed, individually introduced into a central fiber of the bundle.
Die Raman-Anregungsstrahlung wird dabei ebenfalls über die bildgebende Faser, durch die Linse für die Anregungsstrahlung, durch die Filterschicht des Kubus und die dritte, dem Kubus nachgeordnete Linse hindurch auf die Oberfläche der biologischen Gewebeprobe geführt.The Raman excitation radiation is also guided via the imaging fiber, through the lens for the excitation radiation, through the filter layer of the cube and the third, the cube downstream lens on the surface of the biological tissue sample.
Die von der Probe emittierte Raman-Signalstrahlung wird ebenfalls von der dritten, dem Kubus nachgeordnete Linse über die Filterschicht des Kubus, durch den Filter im Kubus hindurch über den Spiegel im Kubus durch die Linse für die Signalstrahlung hindurch in die externe Faser (Multimodefaser) geführt.The Raman signal radiation emitted by the sample is also passed from the third, cube-subordinate lens through the filter layer of the cube, through the filter in the cube, through the mirror in the cube through the lens for the signal radiation, into the external fiber (multimode fiber) ,
Die Signalstrahlung in Form von Raman-Strahlung wird dabei in das Raman-Spektrometer weitergeleitet, wobei aus dem detektierten Raman-Spektrum des gezielt ausgewählt untersuchten Ausschnitts aus der Oberfläche der biologischen Gewebeprobe Strukturparameter des Gewebes ermittelt werden, die Rückschlüsse auf die Eigenschaften des zu charakterisierenden Gewebeausschnitts liefern.The signal radiation in the form of Raman radiation is thereby forwarded to the Raman spectrometer, wherein structural parameters of the tissue are determined from the detected Raman spectrum of the selectively selected section from the surface of the biological tissue sample, the conclusions about the properties of the tissue section to be characterized deliver.
Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen kombinierten Vorrichtung zur Erzeugung und zur Detektion von Red-Flag-Strahlung und eines Raman-Spektrums ist es möglich, eine endoskopische Untersuchung von biologischem Gewebe in vivo durchzuführen, wobei die Messdauer gering ist, da vermittels der angewendeten „Red-Flag”-Technik (bspw. Bereitstellung eines Fluoreszenzübersichtsbildes für die Gewebeausschnittunterteilung) eine Bildunterteilung mit gezielter Bereichsauswahl für eine anschließende spezifische Charakterisierung des biologischen Gewebes im ausgewählten Bereich mittels Raman-Spektroskopie (bspw. Tumorgewebe, kein Tumorgewebe) möglich ist. By using the combined device according to the invention for generating and detecting red-flag radiation and a Raman spectrum, it is possible to carry out an endoscopic examination of biological tissue in vivo, the duration of the measurement being low, since by means of the applied Flag "technique (for example, providing a fluorescence overview image for the tissue excision subdivision) an image subdivision with targeted range selection for a subsequent specific characterization of the biological tissue in the selected area by Raman spectroscopy (eg tumor tissue, no tumor tissue) is possible.
Durch die kleine Bauform sind die bildgebende Faser, die Bildleitfaser und der Faserkopf/die Messsonde mit erfindungsgemäß ausgestaltetem Kubus in eine Umhüllung, insbesondere einen Kanal eines Endoskops integrierbar, so dass eine Klassifizierung nach dem Typ des biologischen Gewebes erfolgen kann, ohne eine Entnahme von biologischem Gewebe aus inneren Körperregionen vornehmen zu müssen.Due to the small design, the imaging fiber, the Bildleitfaser and the fiber head / the probe with inventively ausgestaltetem cube in an enclosure, in particular a channel of an endoscope can be integrated so that a classification according to the type of biological tissue can be done without a removal of biological To make tissue from inner body regions.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand des Ausführungsbeispiels und der Figuren näher erläutert. Dabei zeigen:The invention will be explained in more detail below with reference to the embodiment and the figures. Showing:
Die in
Dabei ist der Linse (
Die durch die Probe generierte Raman-Signalstrahlung ist durch die Linse (
Die in eine externe Faser (
Die in der
Das Bündel von Lichtleitern, welches mindestens eine Faser (
Die Faser (
Die externe Faser (
Der Adsorber (
Der Filter (
Die Laserlichtquelle kann bspw. ein Nd-YAG-Laser, ein He-Ne-Laser oder ein Halbleiterlaser sein.The laser light source can be, for example, an Nd-YAG laser, a He-Ne laser or a semiconductor laser.
Die Red-Flag-Strahlung, welche bei der bestimmungsgemäßen Verwendung der Vorrichtung eingesetzt wird, kann bspw. eine Autofluoreszenz-Strahlung, Zwei- oder Dreiphotonenfluoreszenz-Strahlung (SHG oder THG), kohärente Anti-Stokes-Raman-Strahlung (CARS) oder stimulierte Raman-Streuungsstrahlung (SRS) sein.The red-flag radiation which is used in the intended use of the device can, for example, an autofluorescence radiation, two- or three-photon fluorescence radiation (SHG or THG), coherent anti-Stokes-Raman radiation (CARS) or stimulated Raman scattering radiation (SRS).
Der von der Detektions- und Steuereinheit umfasste Detektor (
Die Vorrichtung weist, wie in
Bei dem Verfahren zur Erzeugung und zur Detektion von Red-Flag-Strahlung und eines Raman-Spektrums wird unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mittels der Laserlichtquelle (
Die durch die Raman-Anregungsstrahlung von der Probe emittierte Raman-Signalstrahlung wird von der Linse (
Dabei wird die Raman-Anregungsstrahlung auf Grundlage zuvor vom Detektor (
Die Raman-Anregungsstrahlung wird dabei gezielt in die Faser (
Mit Hilfe der Faser (
Durch die Filterschicht (
In dem Raman-Spektrometer (
Alle in der Beschreibung, den Ausführungsbeispielen und den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.All features described in the description, the exemplary embodiments and the following claims may be essential to the invention both individually and in any combination with one another.
BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS
- 11
- Faser (Imaging Faser/bildgebende Faser)Fiber (Imaging fiber / Imaging fiber)
- 1212
- LaserlichtquelleLaser light source
- 1313
- FaserkombinationsbündelFiber combination bundle
- 1414
- Messsondeprobe
- 1616
- Detektions- und SteuereinheitDetection and control unit
- 1717
- Raman-SpektrometerRaman spectrometer
- 1818
- Detektordetector
- 22
- Linselens
- 33
- Kubuscube
- 44
- Filterschichtfilter layer
- 55
- Absorberabsorber
- 66
- Linselens
- 77
- Spiegelmirror
- 88th
- Linselens
- 99
- externe Faser (Sammelfaser)external fiber (collecting fiber)
- 1010
- Filterfilter
Claims (10)
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