Stand der TechnikState of the art
Wenn Mikroskopobjektive nicht in Luft, sondern in einem Immersionsmedium betrieben werden, müssen sie für den Brechungsindex des betreffenden Mediums optisch angepaßt sein. Dies wird für Wasser mit dem Brechungsindex n = 1,33 oder Immersionsöl mit dem Brechungsindex n = 1.515 durch entsprechende Berechnung des Objektivs erreicht. Geringe Abweichungen vom Brechungsindex können bei speziellen Objektiven durch Korrekturringe, die im Objektiv Linsenglieder verschieben, ausgeglichen werden. Es gibt jedoch keinerlei Objektive für höhere Brechungsindices zB n = 1,56. Für die Mikroskope geklärter Präparate in solchen Klärmedien mit hohem Brechungsindex ist die Neuberechnung und Herstellung geeigneter Objektive notwendig, oder die Verwendung geeigneter Linsengruppen, die zwischen Mikroskop und unkorrigiertem Objektiv geschraubt werden.If microscope objectives are operated not in air, but in an immersion medium, they must be optically matched to the refractive index of the medium in question. This is achieved for water with the refractive index n = 1.33 or immersion oil with the refractive index n = 1.515 by appropriate calculation of the objective. Small deviations from the refractive index can be compensated for special lenses by correcting rings, which move lens elements in the lens. However, there are no lenses for higher refractive indices eg n = 1.56. For the microscopes of clarified preparations in such high refractive index media, it is necessary to recalculate and produce suitable objectives, or to use appropriate lens groups screwed between the microscope and the uncorrected objective.
Beschreibungdescription
Zunächst wird die Berechnung geeigneter Objektive für die Immersion in Medien mit Brechungsindices größer 1,45 mit langem Arbeitsabstand vorgeschlagen, vorteilhaft größer als 1,51. Langer Arbeitsabstand meint hier Arbeitsabstände größer 2 mm, bevorzugt in der Größenordnung von 10 mm, die für die Mikroskopie großer geklärter Präparate notwendig sind. Diese Objektive sind so berechnet, daß sie die optischen Aberrationen durch die Klärmedien, insbesondere die sphärische Aberration ausgleichen. Vorteilhaft können sie auch mit verstellbaren Korrekturgliedern zur Anpassung an Medien mit Brechungsindices von 1,45 bis 1,57, bevorzugt von 1,51 bis 1,57 ausgestattet werden. Der in das Klärmedium eintauchende Teil des Objektivs mit der Frontlinse muß so ausgelegt werden, daß die Linsen und ihre Halterung von den zum Teil chemisch agressiven Klärmedien nicht angegriffen werden. Vorteilhaft können auch optische Korrektionsglieder berechnet und hergestellt werden, die das für ein Klärmedium berechnete Objektiv für den Brechungsindex eines anderen anpassen. Die Korrektionsglieder werden dabei zwischen Objektiv und Mikroskoptubus geschraubt. Somit erhält man ein modulares Mikroskopobjektiv, daß für Immersionsmedien verschiedener Brechungsindices verwendet werden kann.First, the calculation of suitable objectives for immersion in media with refractive indices greater than 1.45 with a long working distance is proposed, advantageously greater than 1.51. Long working distance here means working distances greater than 2 mm, preferably of the order of 10 mm, which are necessary for the microscopy of large clarified preparations. These lenses are calculated to compensate for the optical aberrations of the clarifying media, in particular the spherical aberration. Advantageously, they can also be equipped with adjustable correction members for adaptation to media with refractive indices of 1.45 to 1.57, preferably from 1.51 to 1.57. The dipping into the clarifying part of the lens with the front lens must be designed so that the lenses and their support are not attacked by the sometimes chemically aggressive treatment media. Advantageously, it is also possible to calculate and produce optical correction elements which adapt the refractive index objective calculated for one clarification medium to another. The correction elements are screwed between the lens and the microscope tube. Thus, a modular microscope objective is obtained which can be used for immersion media of different refractive indices.
Eine Alternative zur Neuberechnung von ganzen Objektiven stellt die Korrektur vorhandener für Luft gerechneter Objektive durch ein zusätzliches optisches Korrektionsglied dar. Hierbei können insbesondere sehr langbrennweitige Objektive, die in der Materialmikroskopie eingesetzt werden, Verwendung finden. Hierbei wird das Korrektionsglied zwischen Objektivende und Mikroskoptubus geschraubt. Das Korrektionsglied aus Metall, vorzugsweise Stahl, dient als Halterung von mehreren vorzugsweise achromatischen Linsen. Diese Linsen sind in ihrer Brennweite und ihrem Abstand nun so berechnet, daß sie die Aberrationen, die durch das von Luft abweichende Immersionsmedium erzeugt werden, ausgleichen. Dadurch können Punkte in der Fokusebene des Objektivs auch als beugungsbegrenzte Punkte in der Bildebene des optischen Systems abgebildet werden. Die optische Korrektur findet vorzugsweise für alle möglichen optischen Fehler statt, wie zB sphärische und chromatische Aberration, Koma, tonnen- und kissenförmige Verzeichnung. Das Korrekturglied kann so ausgelegt werden, daß für jedes Objektiv ein eigenes Korrekturglied benötigt wird. Alternativ können im Korrekturglied auch Linsen verschieblich gegenüber einander angeordnet werden, sodaß ein Korrekturglied auch für verschiedene Objektive und Immersionsmedien verschiedener Brechungsindices verwendet werden kann. Die Verschiebung der Linsen wird dabei vorteilhaft durch einen von außen zugänglichen Stellring erreicht.An alternative to the recalculation of entire lenses is the correction of existing lenses calculated for air by an additional optical correction element. In particular, very long focal length lenses used in material microscopy can be used. Here, the correction element is screwed between the lens end and microscope tube. The correction member made of metal, preferably steel, serves as a holder of several preferably achromatic lenses. These lenses are now calculated in their focal length and distance to compensate for the aberrations produced by the non-air immersion medium. As a result, points in the focal plane of the objective can also be imaged as diffraction-limited points in the image plane of the optical system. The optical correction preferably takes place for all possible optical errors, such as spherical and chromatic aberration, coma, barrel and pincushion distortion. The correction element can be designed so that a separate correction element is required for each objective. Alternatively, lenses may also be displaceable relative to one another in the correction element, so that a correction element can also be used for different objectives and immersion media of different refractive indices. The displacement of the lenses is advantageously achieved by an externally accessible adjusting ring.
Dem Objektiv aufgeschoben findet sich eine Tauchkappe, die das für den Gebrauch in Luft ausgelegte Objektiv vor dem Immersionsmedium schützt. Das Deckglas der Tauchkappe ist hierbei vorteilhafterweise aus Fluoritglas gefertigt. Fluoritglas zeigt geringere optische Aberrationen im Vergleich zu normalem Glas. Durch Verwendung einer Tauchkappe wird die optische Weglänge in Klärmedium und Luft konstant gehalten, sodaß bei Verschiebung des Präparats relativ zum Objektiv in der z Achse nicht aufwendig nachkorrigiert werden muß.Sliding the lens there is a dive cap, which protects the designed for use in air lens from the immersion medium. The cover glass of the dip cap is advantageously made of fluorite glass. Fluorite glass shows lower optical aberrations compared to normal glass. By using a dip cap, the optical path length in clarifying medium and air is kept constant, so that when the preparation is displaced relative to the objective in the z axis, it does not have to be postcorrected.
Die für Klärmedium korrigierten Objektive werden insbesondere in der Lichtblatt Mikroskopie Verwendung finden. Hier werden chemisch durchsichtig gemachte Präparate wie zB Mäusgehirne oder -embryos von der Seite mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet, sodaß optische Schnitte entstehen. Durch Fluoreszensfärbung sichtbar gemachte Strukturen wie zB Nervenzellen können so dreidimensional rekonstruiert werden. Feinste Verzweigungen dieser Nervenzellen können nur mit den zusätzlich korrigierten Objektiven sichtbar gemacht werden. Zur Darstellung zB ganzer Mäusegehirne müssen dabei Objektive mit zB 10 mm Arbeitsabstand verwendet werden.The lenses which have been corrected for clarification medium are used in particular in light-sheet microscopy. Here chemically transparent preparations such as mouse brains or embryos are illuminated from the side with a thin light sheet, so that optical sections are formed. Fluorescence staining visualized structures such as nerve cells can be reconstructed in three dimensions. Finest branches of these nerve cells can only be visualized with the additionally corrected lenses. For example, to represent entire mouse brains, lenses with eg 10 mm working distance must be used.
