DE102013009145A1 - Process for the preparation of cathin - Google Patents

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Dörte Rother
Martina Pohl
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zu Herstellung von Cathin. Erfindungsgemäß wird 1-Phenylpropan-1-2dion nach Formel (1)in einem ersten Schritt mit einer S-selektiven Transaminase zu (S)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on nach Formel (2)umgesetzt und das (S)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on weiter nach Formel (2) in einem zweiten Schritt mit einer (S)-selektiven Alkoholdehydrogenase zu (1S,2S)-Norpseudoephedrin (Cathin) nach Formel (3)reduziert.The invention relates to a method for producing cathine. According to the invention, 1-phenylpropan-1-2dione according to formula (1) is converted in a first step with an S-selective transaminase to (S) -2-amino-1-phenylpropan-1-one according to formula (2) and the (S. ) -2-Amino-1-phenylpropan-1-one further reduced according to formula (2) in a second step with an (S) -selective alcohol dehydrogenase to (1S, 2S) -norpseudoephedrine (cathine) according to formula (3).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cathin.The invention relates to a process for the preparation of cathine.

Cathin ((1S,2S)-Norspeudoephedrin)) gehört zur Substanzklasse der Ephedrea-Alkaloide und kann aus den Blättern des Kathstrauches gewonnen werden. Es findet auf Grund der symphatomimetrischen, das vegetative Nervensystem anregenden, Funktion Anwendung als Herzkreislaufmittel und kommt häufig als Appetitzügler zum Einsatz.Cathin ((1S, 2S) -norspeudoephedrine)) belongs to the class of ephedra alkaloids and can be obtained from the leaves of the cat shrub. It is used as a cardiovascular agent because of the sympathomimetic, stimulating the autonomic nervous system, and is often used as an appetite suppressant.

Für die synthetische Herstellung sind nach dem Stand der Technik verschiedene Verfahren bekannt.For the synthetic preparation, various methods are known in the prior art.

So ist aus der Veröffentlichung „Stereoselective Synthesis of Norphenedrine and Norpseudoephedrine by Using Asymmetric Transfer Hydrogenation Accompanied by Dynamic Kinetic Resolution” von Hyeon-Kyu Lee et al. im Journal of Organic Chemistry 2012, S 5454–5460 eine 7-Schrittsynthese bekannt. Die Veröffentlichung ”Efficient Synthesis of Ephedra Alkaloid Analogous Using an Enantiomerically Pure N-[(R)-(+)-α-Methylbenzyl]aziridine-2-carboxaldehyde” von Gwon-II Hwang et al. aus dem J. Org:Chem. 1996, 61, 6183–6188 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Cathin mit hohen Enantiomerenüberschüssen, das von enantiomerenreinem Substrat ausgeht und daher sehr teuer ist. Andere Verfahren wie beispielsweise in der Veröffentlichung „Asymetric N1 Unit Transfer to Olefins with a Chiral Nitridomanganese Complex: Novel Stereoselective Pahtways to Aziridines or Oxazolines” von Massaki Nishimura et al. beschrieben, Verfahren, bei denen Cathin als Nebenprodukt gebildet wird.So is from the publication "Stereoselective Synthesis of Norphenedrins and Norpseudoephedrines by Using Asymmetric Transfer Hydrogenation Accompanied by Dynamic Kinetic Resolution" by Hyeon-Kyu Lee et al. in the Journal of Organic Chemistry 2012, pp. 5454-5460 a 7-step synthesis known. The publication "Efficient Synthesis of Ephedra Alkaloid Analogous Using Enantiomerically Pure N - [(R) - (+) - α-methylbenzyl] aziridine-2-carboxaldehydes" by Gwon-II Hwang et al. from J. Org: Chem. 1996, 61, 6183-6188 discloses a process for preparing cathin with high enantiomeric excess, starting from enantiomerically pure substrate and therefore very expensive. Other methods such as in the publication "Asymetric N1 Unit Transfer to Olefins with a Chiral Nitridomanganese Complex: Novel Stereoselective Pahtways to Aziridines or Oxazolines" by Massaki Nishimura et al. described methods in which cathin is formed as a by-product.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung ein einfaches Herstellungsverfahren von Cathin zur Verfügung zu stellen, welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet und das mit wenigen Reaktionsschritten auskommt, preisgünstig ist, zu einer hohen Enantiomeren- und Diastereomerenreinheit, und einer hohen Ausbeute führt und möglichst wenige Aufarbeitungsschritte erfordert. Die Maßstabsvergrößerung soll einfach zu realisieren sein.It is therefore the object of the invention to provide a simple production process of cathin which overcomes the disadvantages of the prior art and which manages with few reaction steps, is inexpensive, leads to a high enantiomeric and diastereomeric purity, and a high yield and possibly requires few processing steps. The scale-up should be easy to implement.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.Starting from the preamble of claim 1, the object is achieved by the features specified in the characterizing part of claim 1.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann Cathin mit einer Enantiomerenreinheit und Diastereomerenreinheit von 99% oder mehr hergestellt werden. Es kann ein Umsatz von bis zu 61,4% erzielt werden.With the method of the present invention, cathin having an enantiomeric purity and diastereomeric purity of 99% or more can be produced. It can be achieved a turnover of up to 61.4%.

Die Herstellung verläuft in einem zweistufigen Verfahren, ist einfach, preisgünstig und erfordert keine aufwändige Aufarbeitung. Es können kommerziell erhältliche Edukte eingesetzt werden und die beiden Reaktionsschritte können in einem Reaktionsgefäß ohne Isolierung des Zwischenproduktes durchgeführt werden. Die Syntheseschritte können entweder mit vorzugsweise gereinigten und lyophilisierten Enzymen oder mit rekombinanten E. coli-Zellen durchgeführt werden, die die erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme enthalten. Das Verfahren kann gut hochskaliert werden und ist daher für großtechnische Prozesse geeignet.The preparation proceeds in a two-stage process, is simple, inexpensive and requires no elaborate workup. Commercially available starting materials can be used and the two reaction steps can be carried out in a reaction vessel without isolation of the intermediate product. The synthesis steps can be carried out either with preferably purified and lyophilized enzymes or with recombinant E. coli cells which contain the enzymes used according to the invention. The process can be scaled up well and is therefore suitable for large-scale processes.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.Advantageous developments of the invention are specified in the subclaims.

Unter einem S-selektiven Enzym im Sinne der Erfindung ist ein Enzym zu verstehen, welches ein Substrat zu einem S-konfigurierten Produkt umsetzt.An S-selective enzyme in the context of the invention means an enzyme which converts a substrate into an S-configured product.

In einem ersten Reaktionsschritt wird 1-Phenylpropan-1,2-dion (PPDO) nach Formel (1),

Figure DE102013009145A1_0005
wie in 1 dargestellt, in vitro mit einem Amindonor, wie Methylbenzylamin mit einer S-selektiven Transaminase zu (S)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on (APPO) nach Formel (2)
Figure DE102013009145A1_0006
umgesetzt.In a first reaction step, 1-phenylpropane-1,2-dione (PPDO) of formula (1),
Figure DE102013009145A1_0005
as in 1 shown in vitro with an amine donor such as methylbenzylamine with an S-selective transaminase to give (S) -2-amino-1-phenylpropan-1-one (APPO) of formula (2)
Figure DE102013009145A1_0006
implemented.

Methylbenzylamin ist dabei ein Beispiel für einen Amindonor. Es können jedoch auch andere Amindonoren eingesetzt werden. Beispielhaft können Benzylamin, Isopropylamin, L-Alanin, (±)-1-Methyl-3-phenylpropylamin und (±)-1-Aminoindan genannt werden.Methylbenzylamine is an example of an amine donor. However, other amine donors may be used. By way of example, mention may be made of benzylamine, isopropylamine, L-alanine, (±) -1-methyl-3-phenylpropylamine and (±) -1-aminoindan.

Für den ersten Reaktionsschritt der chemischen reduktiven Aminierung können Transaminasen eingesetzt werden, die das Substrat mit hoher Stereoselektivität zum (S)-Produkt umsetzen. Die Transaminase kann aus einem Chromobakterium, beispielsweise Chromobakterium violacaeum, vorzugsweise CV2025 sein. Weiterhin können Transaminasen aus Alcaligens denitrificans, Arthrobacter citreus, Bacillus megaterium, Pseudomonas fluoreszens, Vibrio flurialis oder Caulobacter crescentus eingesetzt werden.For the first reaction step of the chemical reductive amination transaminases can be used, which convert the substrate with high stereoselectivity to the (S) product. The transaminase may be from a chromobacterium, for example Chromobacterium violacaeum, preferably CV2025. Furthermore, transaminases from Alcaligens denitrificans, Arthrobacter citreus, Bacillus megaterium, Pseudomonas fluorescens, Vibrio flurialis or Caulobacter crescentus.

Vorzugsweise werden gereinigte und lyophilisierte Enzyme eingesetzt. Dies hat den Vorteil, dass mit gereinigten Enzymen Produkte mit deutlich höheren optischen Reinheiten, also höherem Enantiomeren- und Diastereomerenüberschüssen entstehen. Die Enzyme sind stabil und können hohe Substratkonzentrationen umsetzen.Preferably, purified and lyophilized enzymes are used. This has the advantage that products with significantly higher optical purities, ie higher enantiomeric and diastereomeric excesses, are produced with purified enzymes. The enzymes are stable and can convert high substrate concentrations.

Die Reaktion kann in einem wässrigen Medium in einem pH-Bereich von 6 bis 11, vorzugsweise pH 7,5 bis 8,5 durchgeführt werden.The reaction may be carried out in an aqueous medium in a pH range of 6 to 11, preferably pH 7.5 to 8.5.

Dazu können geeignete Puffer, wie HEPES, Kaliumphosphat, MOPS, TEA oder IRIS-HCl eingesetzt werden.For this purpose, suitable buffers, such as HEPES, potassium phosphate, MOPS, TEA or IRIS-HCl can be used.

Der bevorzugte Temperaturbereich liegt bei Raumtemperatur, die Reaktion kann in einem Temperaturbereich von 20°C bis 30°C gut durchgeführt werden.The preferred temperature range is room temperature, the reaction can be performed well in a temperature range of 20 ° C to 30 ° C.

Die Reaktion wird vorzugsweise bei Atmosphärendruck durchgeführt.The reaction is preferably carried out at atmospheric pressure.

Als Kofaktor kann Pyridoxal-5'-phsophat eingesetzt werden.The cofactor used can be pyridoxal-5'-phosphate.

Vorzugsweise liegt die Pyridoxal-5'-phosphat-Konzentration zwischen 100–200 μM.Preferably, the pyridoxal-5'-phosphate concentration is between 100-200 μM.

Der Prozess kann in vitro durchgeführt werden.The process can be performed in vitro.

Alternativ kann die enzymatische Umsetzung in vivo erfolgen.Alternatively, the enzymatic reaction can be done in vivo.

Dazu können E. coli Bakterien als Produktionsorganismen eingesetzt werden.For this purpose, E. coli bacteria can be used as production organisms.

Dabei können Gene, die für eine Transaminase kodieren in einen Vektor ligiert werden.Genes coding for a transaminase can be ligated into a vector.

Vorzugsweise sind die E. coli Stämme rekombinant und enthalten Plasmide, die Gene für eine (S)-selektive Transaminase tragen.Preferably, the E. coli strains are recombinant and contain plasmids carrying genes for a (S) -selective transaminase.

Vorzugsweise können die Plasmide die Gene für die o. g. Transaminasen beinhaltet.Preferably, the plasmids may contain the genes for the o. G. Transaminases includes.

Als Plasmide können beispielsweise pET29a oder pKK233-Grundkörper eingesetzt werden, die die entsprechenden Transaminasegene beinhalten.As plasmids, it is possible to use, for example, pET29a or pKK233 basic bodies which contain the corresponding transaminase genes.

Die Produktionsorganismen sekretieren das gewünschte Produkt nach Formel (2) in die wässrige Lösung.The production organisms secrete the desired product according to formula (2) into the aqueous solution.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Transaminase nach dem ersten Reaktionsschritt desaktiviert. Das kann durch eine Veränderung des pH-Wertes in den sauren Bereich, beispielsweise pH 2, erfolgen. Dazu kann eine Säure, vorzugsweise eine nichtoxidierende Säure, beispielsweise HCl oder H2SO4, zugegeben werden. Alternativ kann die Inaktivierung auch durch Ultrafiltration des Enzyms erfolgen. Dazu kann eine Membran mit einem molekularen Ausschluss von beispielsweise 10 kDa (kilo Dalton) verwendet werden.In a preferred embodiment, the transaminase is deactivated after the first reaction step. This can be done by changing the pH to the acidic range, for example pH 2. For this purpose, an acid, preferably a non-oxidizing acid, for example HCl or H 2 SO 4 , can be added. Alternatively, the inactivation can also be carried out by ultrafiltration of the enzyme. For this purpose, a membrane with a molecular exclusion of, for example, 10 kDa (kilo daltons) can be used.

Im einem zweiten Reaktionsschritt wird (S)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on (APPO) nach Formel (2) mittels einer (S)-selektiven Alkoholdehydrogenase in vitro zu (1S,2S)-Norpseudoephedrin (NPE) (Cathin) nach Formel (3)

Figure DE102013009145A1_0007
umgesetzt.In a second reaction step, (S) -2-amino-1-phenylpropan-1-one (APPO) according to formula (2) is converted into (1S, 2S) -norpseudoephedrine (NPE) by means of an (S) -selective alcohol dehydrogenase in vitro ( Cathine) according to formula (3)
Figure DE102013009145A1_0007
implemented.

Generell kann diese Reaktion, eine reduktive Hydrogenierung, mit Alkoholdehydrogenasen, die das Substrat umsetzen und die (S)-selektiv sind durchgeführt werden.In general, this reaction, a reductive hydrogenation, can be carried out with alcohol dehydrogenases, which convert the substrate and which are (S) -selective.

Die Alkoholdehydrogenase kann aus Lactobacillus, vorzugsweise aus Lactobacillus brevis (LbADH) sein. Alternativ können Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus kefir, Candida magnoliae, Leifsonia species, Sporobolomyces salmonicolor oder Trichosporon cutaneum eingesetzt werden.The alcohol dehydrogenase may be from Lactobacillus, preferably from Lactobacillus brevis (LbADH). Alternatively, alcohol dehydrogenases from Lactobacillus kefir, Candida magnoliae, Leifsonia species, Sporobolomyces salmonicolor or Trichosporon cutaneum can be used.

Vorzugsweise werden gereinigte und lyophilisierte Enzyme eingesetzt. Dies hat den Vorteil, dass mit gereinigten Enzymen Produkte mit deutlich höheren optischen Reinheiten, also höherem Enantiomeren- und Diastereomerenüberschüssen entstehen. Die Enzyme sind stabil und können hohe Substratkonzentrationen umsetzen.Preferably, purified and lyophilized enzymes are used. This has the advantage that products with significantly higher optical purities, ie higher enantiomeric and diastereomeric excesses, are produced with purified enzymes. The enzymes are stable and can convert high substrate concentrations.

Die Reaktion kann in einem wässrigen Medium in einem pH-Bereich von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise pH 7,5 bis 8,5, durchgeführt werden.The reaction may be carried out in an aqueous medium in a pH range of 6.5 to 8.5, preferably pH 7.5 to 8.5.

Dazu können geeignete Puffer, wie HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethansulfonsäure), Kaliumphosphat, TEA (Triethanolamin), IRIS-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) oder MOPS(3-(N-Morpholino)-Propansulsonsäure) eingesetzt werden.Suitable buffers such as HEPES (2- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethanesulfonic acid), potassium phosphate, TEA (triethanolamine), IRIS-HCl (tris (hydroxymethyl) aminomethane) or MOPS (3- (N -Morpholino) -Propansulsonsäure) can be used.

Der bevorzugte Temperaturbereich liegt bei Raumtemperatur, die Reaktion kann in einem Temperaturbereich von 20°C bis 30°C gut durchgeführt werden.The preferred temperature range is room temperature, the reaction can be in a Temperature range of 20 ° C to 30 ° C well performed.

Die Reaktion wird vorzugsweise bei Atmosphärendruck durchgeführt.The reaction is preferably carried out at atmospheric pressure.

Als Kofaktor kann NADPH + H+ oder NADP+ mit Magnesiumionen (Mg2+), z. B. als Magnesiumsulphat, eingesetzt werden, wenn als Enzym LbADH eingesetzt wird. Bei anderen ADH's können NADH + H+, NAD+ und andere Ionen, wie Ca2+, Mn2+, K+, Na+, Co2+, Li+, Zn2+ oder Rb+ eingesetzt werden. Der Zusatz der Metallionen ist fakultativ und wirkt sich positiv auf die Kofaktorregenerierung aus.As a cofactor, NADPH + H + or NADP + can be mixed with magnesium ions (Mg 2+ ), e.g. As magnesium sulphate, be used when LbADH is used as the enzyme. For other ADH's NADH + H + , NAD + and other ions such as Ca 2+ , Mn 2+ , K + , Na + , Co 2+ , Li + , Zn 2+ or Rb + may be used. The addition of metal ions is optional and has a positive effect on cofactor regeneration.

Bei der Verwendung von NADPH + H+ als Kofaktor kann zur Kofaktorregenerierung eine Formiatdehydrogenase (FDH) mit Formiat als Kosubstrat, bei TbADH aus Thermoanaerobium brockii mit Ethanol oder Isopropanol als Kosubstrat oder bei GDH (Glucose-Dehydrogenase) mit Glucose als Kosubstrat eingesetzt werden.When NADPH + H + is used as cofactor, a formate dehydrogenase (FDH) with formate as cosubstrate can be used for cofactor regeneration, with TbADH from Thermoanaerobium brockii with ethanol or isopropanol as cosubstrate or with GDH (glucose dehydrogenase) with glucose as cosubstrate.

Der Prozess kann in vitro durchgeführt werden.The process can be performed in vitro.

Alternativ kann die enzymatische Umsetzung in vivo erfolgen.Alternatively, the enzymatic reaction can be done in vivo.

Dazu können E. coli Bakterien als Produktionsorganismen eingesetzt werden.For this purpose, E. coli bacteria can be used as production organisms.

Dazu können die Gene, die für eine Alkoholdehydrogenase kodieren, in einen Vektor ligiert werden.For this purpose, the genes which code for an alcohol dehydrogenase can be ligated into a vector.

Vorzugsweise sind die E. coli Stämme rekombinant und enthalten Plasmide, die Gene für eine Alkoholdehydrogenase tragen.Preferably, the E. coli strains are recombinant and contain plasmids carrying genes for alcohol dehydrogenase.

Werden Vektoren, beispielsweise Plasmide eingesetzt, so müssen diese Gene für eine Alkoholdehydrogenase enthalten. Die Alokholdehydrogenasen können beispielsweise aus Lactobacillus, vorzugsweise aus Lactobacillus brevis (LbADH) sein. Alternativ können die Vektoren bzw. Plasmide Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus kefir, Candida magnoliae, Leifsonia species, Sporobolomyces salmonicolor oder Trichosporon cutaneum beinhalten.If vectors, for example plasmids are used, then these genes must contain an alcohol dehydrogenase. The Alokholdehydrogenasen can be for example from Lactobacillus, preferably from Lactobacillus brevis (LbADH). Alternatively, the vectors or plasmids may include alcohol dehydrogenases from Lactobacillus kefir, Candida magnoliae, Leifsonia species, Sporobolomyces salmonicolor or Trichosporon cutaneum.

Als Plasmide können beispielsweise pET21a oder pKK233 Grundkörper eingesetzt werden, die die entsprechenden Alkoholdehydrogenasegene tragen.As plasmids, for example pET21a or pKK233 basic bodies can be used which carry the corresponding alcohol dehydrogenase genes.

Die Produktionsorganismen sekretieren das gewünschte Produkt nach Formel (2) in die wässrige Lösung.The production organisms secrete the desired product according to formula (2) into the aqueous solution.

Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kann sowohl in vitro als auch in vivo betrieben werden. Dabei können die Teilschritte entweder beide in vivo oder in vitro sein oder die Teilschritte können gemischt in vivo oder in vitro sein.The production method according to the invention can be operated both in vitro and in vivo. The partial steps may either be either in vivo or in vitro, or the partial steps may be mixed in vivo or in vitro.

Vorteilhafterweise kann das Verfahren in einer Eintopfreaktion durchgeführt werden, so dass es einfach durchzuführen ist und nur wenige Aufarbeitungsschritte für das Produkt nach Formel 3 benötigt.Advantageously, the process can be carried out in a one-pot reaction, so that it is easy to carry out and requires only a few work-up steps for the product according to formula 3.

Im Folgenden werden Beispiele für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgeführt.In the following examples of the implementation of the method according to the invention are listed.

In den Figuren sind ein Reaktionsschema und kinetische Untersuchungsergebnisse dargestellt.In the figures, a reaction scheme and kinetic examination results are shown.

Es zeigt:It shows:

1: Ein Formelschema für ein erfindungsgemäßes Verfahren. 1 : A formula scheme for a method according to the invention.

2: Den zeitlichen Verlauf der Eduktabnahme (1,2-PPDO) und eine Nebenproduktzunahme (Acetophenon) für Reaktionsschritt 1. 2 : The time course of educt decrease (1,2-PPDO) and a byproduct increase (acetophenone) for reaction step 1.

3: Den zeitlichen Verlauf der Abnahme von APPO (Zwischenprodukt) und der Zunahme von Cathin (Entprodukt). 3 : The time course of the decrease of APPO (intermediate) and the increase of cathin (de-product).

Beispiel:Example:

Die 2-Schritt Synthese wird mit der Kombination der S-selektiven Transaminase CV2025 aus Chromobacterium violaceum im ersten Schritt und der S-selektiven LbADH aus Lactobacillus brevis im zweiten Schritt durchgeführt. Mit den gereinigten, lyophilisierten Enzymen beträgt der Umsatz über beide Schritte bei einer Reaktionszeit von jeweils 24 Stunden 57,3%. Das entstandene Cathin hat eine sehr hohe optische Reinheit: ee und de > 99%. Im Ganzzellansatz wurde ein Umsatz von > 95% im ersten Schritt (2) und ≈ 65% im zweiten Schritt (3) erzielt. Über beide Schritte betrug der Umsatz 61,4%. Das entstandene Cathin hat einen ee von 97,4% und einen de von 89,8%.The 2-step synthesis is carried out with the combination of the S-selective transaminase CV2025 from Chromobacterium violaceum in the first step and the S-selective LbADH from Lactobacillus brevis in the second step. With the purified, lyophilized enzymes, the conversion over both steps with a reaction time of 24 hours is 57.3%. The resulting cathine has a very high optical purity: ee and de> 99%. In the whole-china-set, a turnover of> 95% in the first step ( 2 ) and ≈ 65% in the second step ( 3 ) achieved. Over both steps, sales were 61.4%. The resulting cathin has an ee of 97.4% and a de of 89.8%.

Reaktionsbedingungen:Reaction conditions:

  • Schritt 1: 10 mM 1-Phenylpropan-1,2-dion, 15 mM (S)-alpha-Methylbenzylamin, 10 mg-Zellen/ml CV2025 (bzw. 1 mg/ml gereinigtes Enzym), 100 mM HEPES mit 0,1 mM Pyridoxal-5'-phosphat, pH 7,5; Reaktionszeit 24 h; Raumtemperatur.Step 1: 10 mM 1-phenylpropane-1,2-dione, 15 mM (S) -alpha-methylbenzylamine, 10 mg cells / ml CV2025 (or 1 mg / ml purified enzyme), 100 mM HEPES with 0.1 mM pyridoxal-5'-phosphate, pH 7.5; Reaction time 24 h; Room temperature.

Inaktivierung der Transaminase nach dem reduktiven Aminierungsschritt: Inactivation of transaminase after the reductive amination step:

  • A) pH-Shift zur Inantivierung bei Verwendung von lyophilisierten Zellen: mit HCl (20% v/v) auf pH 2 titriert, dann wieder auf pH 7,5 mit 5 M NaOH. Anschließend wurden die Zelltrümmer und denaturierte, unlösliche Proteine durch Zentrifugation sedimentiert.A) pH shift for inactivation using lyophilized cells: titrated to pH 2 with HCl (20% v / v), then back to pH 7.5 with 5 M NaOH. Subsequently, the cell debris and denatured, insoluble proteins were sedimented by centrifugation.
  • B) Ultrafiltration zur Inaktivierung bei Verwendung von gereinigten Enzymen: Centricon mit Membran cutoff: 10 kDa-Zentrifugation: 4000 rpm.B) Ultrafiltration for inactivation using purified enzymes: Centricon with membrane cutoff: 10 kDa centrifugation: 4000 rpm.

Schritt 2:Step 2:

Zur Reaktionslösung wurden nach dem pH-Shift hinzugefügt: 100 mM Natriumformiat, 10 mg-Zellen/ml LbADH (bzw. 1 mg/ml gereinigtes Enzym), 10 μl/ml FDH, 0,2 mM NADP+, Reaktionszeit 24 h.To the reaction solution after pH-shift were added: 100 mM sodium formate, 10 mg cells / ml LbADH (or 1 mg / ml purified enzyme), 10 μl / ml FDH, 0.2 mM NADP + , reaction time 24 h.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • „Stereoselective Synthesis of Norphenedrine and Norpseudoephedrine by Using Asymmetric Transfer Hydrogenation Accompanied by Dynamic Kinetic Resolution” von Hyeon-Kyu Lee et al. im Journal of Organic Chemistry 2012, S 5454–5460 [0004] "Stereoselective Synthesis of Norphenedrins and Norpseudoephedrines by Using Asymmetric Transfer Hydrogenation Accompanied by Dynamic Kinetic Resolution" by Hyeon-Kyu Lee et al. in the Journal of Organic Chemistry 2012, S 5454-5460 [0004]
  • ”Efficient Synthesis of Ephedra Alkaloid Analogous Using an Enantiomerically Pure N-[(R)-(+)-α-Methylbenzyl]aziridine-2-carboxaldehyde” von Gwon-II Hwang et al. aus dem J. Org:Chem. 1996, 61, 6183–6188 [0004] "Efficient Synthesis of Ephedra Alkaloid Analogous Using Enantiomerically Pure N - [(R) - (+) - α-methylbenzyl] aziridine-2-carboxaldehydes" by Gwon-II Hwang et al. from J. Org: Chem. 1996, 61, 6183-6188 [0004]
  • „Asymetric N1 Unit Transfer to Olefins with a Chiral Nitridomanganese Complex: Novel Stereoselective Pahtways to Aziridines or Oxazolines” von Massaki Nishimura et al. [0004] "Asymetric N1 Unit Transfer to Olefins with a Chiral Nitridomanganese Complex: Novel Stereoselective Pahtways to Aziridines or Oxazolines" by Massaki Nishimura et al. [0004]

Claims (17)

Verfahren zur Herstellung von (1S,2S)-Norspeudoephedrin dadurch gekennzeichnet, dass 1-Phenylpropan-1,2-dion nach Formel (1)
Figure DE102013009145A1_0008
in einem ersten Schritt mit einer (S)-selektiven Transaminase und einem Amindonor zu (s)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on nach Formel (2)
Figure DE102013009145A1_0009
umgesetzt wird und das (S)-2-Amino-1-Phenylpropan-1-on nach Formel (2) in einem zweiten Schritt mit einer (S)-selektiven Alkoholdehydrogenase zu (1S,2S)-Norpseudoephedrin nach Formel (3)
Figure DE102013009145A1_0010
umgesetzt wird.Process for the preparation of (1S, 2S) -norspeudoephedrine, characterized in that 1-phenylpropane-1,2-dione of the formula (1)
Figure DE102013009145A1_0008
in a first step with an (S) -selective transaminase and an amine donor to give (s) -2-amino-1-phenylpropan-1-one according to formula (2)
Figure DE102013009145A1_0009
and (S) -2-amino-1-phenylpropan-1-one of formula (2) in a second step with an (S) -selective alcohol dehydrogenase to (1S, 2S) -norpseudoephedrine according to formula (3)
Figure DE102013009145A1_0010
is implemented. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transaminase aus Chromobakterium violacaeum eingesetzt wird.A method according to claim 1, characterized in that a transaminase from Chromobakterium violacaeum is used. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Transaminase CV2025 eingesetzt wird.A method according to claim 1, characterized in that the transaminase CV2025 is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Schritt eine Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that in the second step, an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei Schritt 1 als Amindonor eine Komponente aus der Gruppe Methylbenzylamin, Benzylamin, Isopropylamin, L-Alanin, (±)-1-Methyl-3phenylpropylamin oder (±)-1-Aminoindan eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that in step 1 as an amine donor component from the group methylbenzylamine, benzylamine, isopropylamine, L-alanine, (±) -1-methyl-3phenylpropylamin or (±) -1-aminoindan is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt 1 bei einem pH Wert zwischen 6 bis 11 durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that step 1 is carried out at a pH value between 6 to 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt 2 bei einem pH Wert zwischen 6,5 bis 8,5 durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that step 2 is carried out at a pH value between 6.5 to 8.5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Puffer HEPES, Kaliumphosphat, MOPS, TEA oder IRIS-HCl eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that HEPES, potassium phosphate, MOPS, TEA or IRIS-HCl is used as the buffer. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei Schritt 1 Pyridoxal-5'-phosphat als Kofaktor eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that in step 1 pyridoxal-5'-phosphate is used as cofactor. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Pyridoxal-5'-phosphat in einer Konzentration zwischen 100–200 μM eingesetzt wird.A method according to claim 9, characterized in that pyridoxal-5'-phosphate is used in a concentration between 100-200 uM. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass bei Schritt 2 NADPH + H+ oder NADH + H+ als Kofaktor eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that at step 2 NADPH + H + or NADH + H + is used as cofactor. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zu Kofaktorregenerierung Formiatdehydrogenase mit Formiat als Kosubstrat, TbADH mit Ethanol oder Isopropanol als Kosubstrat oder Glucose-Dehydrogenase mit Glucose als Kostubstrat eingesetzt wird.A method according to claim 11, characterized in that is used for cofactor regeneration formate dehydrogenase with formate as cosubstrate, TbADH with ethanol or isopropanol as cosubstrate or glucose dehydrogenase with glucose as a food substrate. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die der Transaminase nach dem ersten Schritt und vor dem zweiten Schritt inaktiviert wird.Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that the transaminase is inactivated after the first step and before the second step. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Inaktivierung durch Zugabe einer Säure oder durch Abtrennung der Transaminase durch Ultrafiltration erfolgt.A method according to claim 13, characterized in that the inactivation is carried out by adding an acid or by separation of the transaminase by ultrafiltration. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und/oder der zweite Schritt in vivo durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that the first and / or the second step is carried out in vivo. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung durch die Transaminase und/oder Alkoholdehydrogenase in E. coli erfolgt.A method according to claim 15, characterized in that the reaction is carried out by the transaminase and / or alcohol dehydrogenase in E. coli. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene kodierend für die Transaminase und/oder Alkoholdehydrogenase in einen Vektor ligiert sind.Method according to one of claims 14 or 15, characterized in that the genes encoding the transaminase and / or alcohol dehydrogenase are ligated into a vector.
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