DE102012216378B4 - Immobilization matrix with tetraether lipid layer, process for its preparation and biosensor chip comprising this immobilization matrix - Google Patents
Immobilization matrix with tetraether lipid layer, process for its preparation and biosensor chip comprising this immobilization matrix Download PDFInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Immobilisierungsmatrix mit einer Tetraetherlipidschicht, an der Liganden (Fängermoleküle), die an ein Target binden können, kovalent immobilisierbar sind. Gegenstand der Erfindung sind auch das Verfahren zur Herstellung dieser Immobilisierungsmatrix, deren Verwendung zur Herstellung von Biosensorchips und Biosensorchips für Chip-basierte Analyseverfahren, die diese Matrix umfassen.The present invention relates to an immobilization matrix with a tetraether lipid layer on which ligands (capture molecules) which can bind to a target can be covalently immobilized. The invention also relates to the method for producing this immobilization matrix, its use for producing biosensor chips and biosensor chips for chip-based analysis methods which comprise this matrix.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Immobilisierungsmatrix mit einer Tetraetherlipidschicht, an der Liganden (Fängermoleküle), die an ein Target binden können, kovalent immobilisierbar sind. Gegenstand der Erfindung sind auch das Verfahren zur Herstellung dieser Immobilisierungsmatrix und das Verfahren zur Herstellung von Biosensorchips sowie Biosensorchips für Chip-basierte Analyseverfahren, die diese Matrix umfassen.The present invention relates to an immobilization matrix having a tetraether lipid layer on which ligands (capture molecules) which can bind to a target are covalently immobilizable. The invention also provides the process for producing this immobilization matrix and the process for producing biosensor chips and biosensor chips for chip-based analysis methods which comprise this matrix.
Das erfindungsgemäß verwendete Tetraetherlipid (TEL) ist ein archaebakterielles Lipid und erhaltbar aus einem der Sulfolobus acidocaldarius Archaeenstämme (ATCC: 33909 und 49426). Es handelt sich um das Hauptphospholipid (Main Phospholipid, MPL) von Sulfolobus acidocaldarius, das den Hauptbestandteil der Plasmamembran bildet und folgende Struktur aufweist: 
Es ist bekannt, dass sich Tetraetherlipide mit ihrer natürlichen Kopfgruppenstruktur nicht zur kovalenten Anbindung an Materialoberflächen eignen, sondern erst durch gezielte Aktivierung ihrer Kopfgruppen eine Lipidierung von Materialoberflächen unter bestimmten Bedingungen möglich ist. So beschreibt beispielsweise
Eine Lipidierung unter Benutzung organischer Lösungsmittel ist jedoch für eine breite industrielle Anwendung keine Option. Es hat sich gezeigt, dass im wässrigen Milieu mit Caldarchaeol und auch mit diaktiviertem Caldarchaeol keine Vesikel herstellbar waren und so Caldarchaeol für eine Lipidierung im wässrigen Medium nicht geeignet ist.However, lipidation using organic solvents is not an option for broad industrial application. It has been shown that no vesicles could be produced in the aqueous medium with caldarchaeol and also with diaktivated Caldarchaeol and so Caldarchaeol is not suitable for lipidation in aqueous medium.
In
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, gut handhabbare Tetraetherlipid-basierte Biosensorchips für Chip-basierte Analysenverfahren bereitzustellen. Daneben soll die zugrunde liegende Immobilisierungsmatrix mittels Lipidierung von Materialoberflächen im wässrigen Milieu durch Selbst-Assemblierung herstellbar sein. Die hergestellten Lipidschichten der Matrix sollen stabil sein und eine effiziente Ankopplung von Liganden, vorzugsweise Proteinen, ermöglichen. Die so hergestellten Biochips sollen hohe Sensitivitäten und geringe Anteile unspezifischer Bindungen aufweisen.It is the object of the present invention to provide easy-to-handle tetraether lipid-based biosensor chips for chip-based analytical methods. In addition, the underlying immobilization matrix should be producible by means of lipidation of material surfaces in aqueous medium by self-assembly. The prepared lipid layers of the matrix should be stable and allow efficient coupling of ligands, preferably proteins. The biochips produced in this way are said to have high sensitivities and low proportions of non-specific bonds.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gemäß den unabhängigen Ansprüchen 1, 5, 11 und 14 gelöst. Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausführungsformen dar.The object of the present invention is achieved according to the
Vorliegend wurde gefunden, dass mit dem durch den Cyanurchloridrest und/oder Thiolrest und/oder 1,2-Dithiolan-3-yl-Rest diaktivierten Hauptphospholipid (MPL) aus Sulfolobus acidocaldarius der allgemeinen Formel I 
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig voneinander 
in wässriger Lösung außerordentlich stabile, unilamellare Lipidvesikel hergestellt werden können, die an aminierten Oberflächen fester Substrate oder Gold-, Silber- oder Kupferoberflächen durch Aufspreiten eine monomolekulare Lipidschicht bilden. Die unilamellaren Lipidvesikel binden über den Cyanurchloridrest kovalent an die Aminogruppe der Oberfläche beziehungsweise über den Thiol- oder 1,2-Dithiolan-3-yl-Rest kovalent an eine Gold-, Silber- oder Kupferoberfläche, wobei die zweite Cyanurchlorid-, Thiol- oder 1,2-Dithiolan-3-yl-Gruppe an der Oberfläche des Substrats exponiert ist.In the present case, it has been found that with the main phospholipid (MPL) from Sulfolobus acidocaldarius of general formula I diactivated by the cyanuric chloride radical and / or thiol radical and / or 1,2-dithiolan-3-yl radical
R 1 and R 2 are the same or different and each independently
In aqueous solution, extraordinarily stable, unilamellar lipid vesicles can be prepared that form a monomolecular lipid layer on aminated surfaces of solid substrates or gold, silver or copper surfaces by spreading. The unilamellar lipid vesicles covalently bind via the cyanuric chloride residue to the amino group on the surface or via the thiol or 1,2-dithiolan-3-yl residue covalently to a gold, silver or copper surface, the second cyanuric chloride, thiol or 1,2-dithiolan-3-yl group is exposed at the surface of the substrate.
Die so hergestellten Immobilisierungsmatrices weisen eine dichte und stabile Lipidschicht mit einer Dicke von 3 bis 4 nm, vorzugsweise 3,5 nm, auf, an deren Cyanurchlorid-, Thiol- oder 1,2-Dithiolan-3-yl-Gruppe Liganden, die über mindestens eine freie Aminogruppe verfügen, effizient kovalent gebunden werden können.The Immobilisierungsmatrices thus prepared have a dense and stable lipid layer with a thickness of 3 to 4 nm, preferably 3.5 nm, at the cyanuric chloride, thiol or 1,2-dithiolan-3-yl group ligands, the above have at least one free amino group can be efficiently covalently bound.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Phospholipid MPL kann beispielsweise durch Soxhlet-Extraktion aus der Archaeentrockenmasse einer Sulfolobus acidocaldarius Spezies gewonnen werden. Die terminalen Hydroxylgruppen des MPL können durch Umsetzung mit Cyanurchlorid, einem hydroxylaktiven Thiol oder Liponsäure modifiziert werden. Diese chemischen Umsetzungen sind dem Fachmann prinzipell bekannt.The phospholipid MPL used according to the invention can be obtained, for example, by Soxhlet extraction from the dry arch mass of a Sulfolobus acidocaldarius species. The terminal hydroxyl groups of the MPL can be modified by reaction with cyanuric chloride, a hydroxyl-active thiol or lipoic acid. These chemical reactions are known in principle to the person skilled in the art.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen R1 und R2 im erfindungsgemäß eingesetzten Phospholipid zur Anbindung an aminierte Oberflächen einen Cyanurchloridrest auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist R1 oder R2 einen Cynanurchloridrest auf und die jeweils andere Gruppe stellt einen Thiol- oder 1,2-Dithiolan-3-yl-Rest dar. Derartig modifiziertes MPL ist sowohl zur Anbindung an aminierte Oberflächen als auch zur Anbindung an Gold-, Silber- oder Kupferoberflächen geeignet.In a preferred embodiment of the invention, R 1 and R 2 in the phospholipid used according to the invention for attachment to aminated surfaces have a cyanuric chloride radical. In a further preferred embodiment, R 1 or R 2 has a Cynanurchloridrest and the other group represents a thiol or 1,2-dithiolan-3-yl radical. Such modified MPL is both for attachment to aminated surfaces as well as to Connection to gold, silver or copper surfaces suitable.
Erfindungsgemäß ist die Immobilisierungsmatrix für Biosensorchips, die eine kovalent gebundene Schicht eines Tetraetherlipids aufweist, also dadurch gekennzeichnet, dass sie ein festes Substrat mit einer Oberfläche umfasst, die zumindest teilweise aminiert oder eine Gold-, Silber- oder Kupferoberfläche ist und an diese Oberfläche ein Tetraetherlipid der allgemeinen Formel I 
R1 und R2 gleich oder verschieden sind und jeweils unabhängig voneinander 
als monomolekulare Schicht kovalent gebunden ist.According to the invention, the immobilization matrix for biosensor chips, which has a covalently bonded layer of a tetraether lipid, is therefore characterized in that it comprises a solid substrate having a surface which at least partially amines or is a gold, silver or copper surface and to this surface a tetraether lipid the general formula I
R 1 and R 2 are the same or different and each independently
is covalently bonded as a monomolecular layer.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Terminus „festes Substrat” auf jedes Material, das zur Unterstützung und Anbindung der erfindungsgemäßen Lipidschicht geeignet ist. Daneben hängt das eingesetzte Substrat von der beabsichtigten Anwendung der Immobilisierungsmatrix bzw. des Biosensorchips, der diese Matrix enthält, ab.According to the present invention, the term "solid substrate" refers to any material that is suitable for supporting and binding the lipid layer of the invention. In addition, the substrate used depends on the intended use of the immobilization matrix or of the biosensor chip containing this matrix.
Das feste Substrat kann erfindungsgemäß zum Beispiel eine Oberfläche aus Glas oder Keramik auf Basis von Silikaten und Borsten aufweisen, eine Oberfläche aus Metallen oder Metalloxiden bzw. deren Legierungen oder formstabilen Mischungen (z. B. Titan, Edelstahl, Gold, Silber oder Kupfer), eine Oberfläche aus Silizium, Gallium oder deren Verbindungen, aus Kohlenstoff oder dessen Modifikationen oder aus Polymeren (z. B. Silikon, Polyurethan, Polytetrafluorethylen oder Polyetheretherketon). Das feste Substrat kann auch vollständig aus einem der genannten Materialien bestehen.The solid substrate according to the invention may, for example, have a surface of glass or ceramic based on silicates and bristles, a surface of metals or metal oxides or their alloys or dimensionally stable mixtures (eg titanium, stainless steel, gold, silver or copper), a surface of silicon, gallium or their compounds, of carbon or its modifications or of polymers (eg silicone, polyurethane, polytetrafluoroethylene or polyetheretherketone). The solid substrate can also consist entirely of one of the materials mentioned.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden als Substrate solche ausgewählt, die für biotechnologische Problemstellungen oder Analysen an sensorischen Funktionsflächen in Frage kommen, beispielsweise für die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS). Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß Gläser, z. B. Borsilikatgläser (z. B. Borofloat®33, Schott Jena AG, Deutschland) oder Gläser mit schichtweisem Aufbau aus Borofloat®33-Glas, Tantal(V)-oxid und SiOx (BIAffinity-Chips, LOS Jenoptik, Jena, Deutschland) eingesetzt.Preferred substrates according to the invention are those which are suitable for biotechnological problems or analyzes on sensory functional surfaces, for example for reflectometric interference spectroscopy (RIfS). Particular preference is given according to the invention glasses, z. B. borosilicate glasses (eg. As borofloat ® 33, Schott Jena AG, Germany) or glasses with layer by layer structure consisting borofloat ® 33 glass, tantalum (V) oxide and SiO x (BIAffinity chips LOS Jenoptik, Jena, Germany) used.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird die Immobilisierungsmatrix durch Inkontaktbringen des festen Substrats, das eine zumindest teilweise aminierte Oberfläche oder eine Gold-, Silber- oder Kupferoberfläche aufweist, mit einer wässrigen Suspension unilamellarer Lipidvesikel des Tetraetherlipids der allgemeinen Formel I hergestellt. Das Inkontaktbringen erfolgt vorzugsweise für 2 bis 15 Stunden, besonders bevorzugt 9 bis 15 Stunden, bei Umgebungstemperatur. Gemäß der Erfindung werden unter „Umgebungstemperatur” 15–29°C verstanden, vorzugsweise 18–25°C. Die Konzentration der wässrigen Suspension unilamellarer Vesikel beträgt vorzugsweise von 1 bis 10 mg/ml, besonders bevorzugt von 2 bis 4 mg/ml.According to the method of the invention, the immobilization matrix is prepared by contacting the solid substrate having an at least partially aminated surface or a gold, silver or copper surface with an aqueous suspension of unilamellar lipid vesicles of the tetraether lipid of general formula I. The contacting is preferably carried out for 2 to 15 hours, more preferably 9 to 15 hours, at ambient temperature. According to the invention, "ambient temperature" means 15-29 ° C, preferably 18-25 ° C. The concentration of the aqueous suspension of unilamellar vesicles is preferably from 1 to 10 mg / ml, more preferably from 2 to 4 mg / ml.
Erfindungsgemäß wird die so hergestellte Immobilisierungsmatrix anschließend getempert. Das Tempern kann beispielsweise bei 60 bis 80°C für ein bis drei Stunden vorgenommen werden, vorzugsweise bei 70°C für zwei Stunden.According to the invention, the immobilization matrix thus produced is subsequently tempered. The annealing may be carried out, for example, at 60 to 80 ° C for one to three hours, preferably at 70 ° C for two hours.
Die wässrige Suspension der unilamellaren Vesikel des Tetraetherlipids der allgemeinen Formel I wird durch mehrmalige Extrusion, vorzugsweise 11–21 malige Extrusion einer wässrigen Suspension multilamellarer Lipidvesikel dieses Tetraetherlipids durch eine Polycarbonatmembran mit gewünschter und definierter Porengröße hergestellt. Die Porengröße beträgt vorzugsweise zwischen 100 bis 1000 nm. Besonders bevorzugt wird eine Polycarbonatmembran von 100 nm eingesetzt, so dass Lipidvesikel mit einem definierten hydrodynamischen Durchmesser von 100 nm hergestellt werden können.The aqueous suspension of the unilamellar vesicles of the tetraether lipid of the general formula I is prepared by repeated extrusion, preferably 11-21 times, extrusion of an aqueous suspension of multilamellar lipid vesicles of this tetraether lipid through a polycarbonate membrane of desired and defined pore size. The pore size is preferably between 100 and 1000 nm. More preferably, a polycarbonate membrane of 100 nm is used so that lipid vesicles having a defined hydrodynamic diameter of 100 nm can be produced.
Stabilitätstests der erfindungsgemäß hergestellten unilamellaren Vesikel des Tetraetherlipids der Formel I zeigten eine außerordentliche Lagerstabilität über einen Zeitraum von mindestens einer Woche.Stability tests of the unilamellar vesicles of the tetraether lipid of the formula I prepared according to the invention showed an extraordinary storage stability over a period of at least one week.
Die Herstellung der wässrigen Suspension der multilamellaren Lipidvesikel des Tetraetherlipids der allgemeinen Formel 1 erfolgt durch Hydratation eines evaporierten Lipidfilms und anschließende Behandung im Ultraschallbad. Die Behandlung im Ultraschallbad kann bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 50 und 70°C, insbesondere bei ca. 60°C und bevorzugt für einen Zeitraum zwischen 10 und 20 Minuten, vorzugweise für 15 Minuten erfolgen. Die finale Lipidkonzentration der wässrigen Suspension beträgt vorzugsweise 1 bis 10 mg/ml, besonders bevorzugt 2 bis 4 mg/ml.The preparation of the aqueous suspension of the multilamellar lipid vesicles of the tetraether lipid of the
Gemäß der Erfindung muss außer der Gold-, Silber- oder Kupferoberfläche die eingesetzte Oberfläche des festen Substrats zumindest teilweise aminiert sein, um die zuverlässige Anbindung des Cyanurchloridrestes über die Aminogruppe zu gewährleisten. Verfahren zur Aminierung von Oberflächen sind bekannt. Die Aminierung der Oberfläche kann beispielsweise durch eine Plasmaaktivierung erreicht werden oder durch Inkubation mit einem aminofunktionellen Silan. Vorzugsweise kann ein Aminoalkylsilan angewendet werden, besonders bevorzugt kommen 3-Aminopropyldimethylethoxysilan, 3-Aminopropyltrimethoxysilan oder 3-Aminopropyltriethoxysilan in Frage.According to the invention, in addition to the gold, silver or copper surface, the surface of the solid substrate used must be at least partially aminated to ensure the reliable attachment of the Cyanurchloridrestes on the amino group. Methods for the amination of surfaces are known. The amination of the surface can be achieved for example by a plasma activation or by Incubation with an amino-functional silane. Preferably, an aminoalkylsilane can be used, with particular preference being given to 3-aminopropyldimethylethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane or 3-aminopropyltriethoxysilane.
Neben der mit dem Verfahren der Erfindung herstellbaren Immobilisierungsmatrix ist auch die Verwendung der Immobilisierungsmatrix des Anspruchs 1 und ihrer bevorzugten Ausführungsformen zur Herstellung eines Biosensorchips Gegenstand der vorliegenden Erfindung.In addition to the immobilization matrix which can be produced by the process of the invention, the use of the immobilization matrix of
Als Biosensorchips werden im Sinne der Erfindung Trägermaterialien bezeichnet, die die erfindungsgemäße Immobilisierungsmatrix umfassen, an welche Liganden, beispielsweise Proteine, gebunden sind. Die Liganden sind in der Lage an bestimmte Zielmoleküle (Targets) zu binden und die Zielmoleküle können auf diese Weise detektiert und/oder beeinflusst werden, so dass biochemische Nachweise oder markierungsfreie optische biomolekulare Interaktionsanalysen (RIfS, SPR) ermöglicht werden.In the context of the invention, biosensor chips are referred to as carrier materials which comprise the immobilization matrix according to the invention to which ligands, for example proteins, are bound. The ligands are able to bind to specific target molecules and the target molecules can thus be detected and / or influenced so that biochemical detections or label-free optical biomolecular interaction analyzes (RIfS, SPR) are made possible.
Insbesondere sind die Biosensorchips der vorliegenden Erfindung für die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) geeignet. Gegenüber den PEG- und Dextran-Trägern, die in der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie) verwendet werden, haben die Biochips der vorliegenden Erfindung den Vorteil, dass sie lager- und säurestabil sind, nicht quellen und somit keine Equilibierungszeit benötigen.In particular, the biosensor chips of the present invention are suitable for reflectometric interference spectroscopy (RIfS). Compared to the PEG and dextran supports used in surface plasmon resonance spectroscopy (SPR spectroscopy), the biochips of the present invention have the advantage that they are storage and acid stable, do not swell and thus do not require equilibration time.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung des Biosensorchips ein Ligand, vorzugsweise ein Protein, der über mindestens eine freie NH2-Gruppe verfügt, kovalent, gegebenenfalls über Spacer, an den Cyanurchlorid-, Thiol- oder 1,2-Dithiolan-3-yl-Rest der monomolekularen Tetraetherlipidschicht der Immobilisierungsmatrix gebunden. Vorzugsweise wird dazu die Immobilisierungmatrix mit einer Pufferlösung des Liganden inkubiert. Das kann beispielsweise so durchgeführt werden, dass ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom, vorzugsweise für 20 bis 40 Minuten, besonders bevorzugt 25 Minuten, über die Lipidmatrix geleitet wird. Die Flussrate sollte dabei im Bereich von 5 μl/min bis 10 μl/min betragen. Vorzugsweise kann dazu eine BIAffinity®-Flusszelle (Analytik Jena AG, Deutschland) zur Anwendung kommen.According to the present invention, for producing the biosensor chip, a ligand, preferably a protein having at least one free NH 2 group, is covalently, optionally via spacers, to the cyanuric chloride, thiol or 1,2-dithiolan-3-yl -Rest bound to the monomolecular tetraether lipid layer of Immobilisierungsmatrix. Preferably, the immobilization matrix is incubated with a buffer solution of the ligand. This can be carried out, for example, so that a continuous stream of liquid, preferably for 20 to 40 minutes, more preferably 25 minutes, is passed over the lipid matrix. The flow rate should be in the range of 5 μl / min to 10 μl / min. Preferably, this ® -Flusszelle (Analytik Jena AG, Germany) are used a BIAffinity.
Als Liganden können erfindungsgemäß bevorzugt Proteine angebunden werden. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt werden als Liganden Streptavidin, C-reaktives Protein, Protein G, Protein A, His-Tag oder GFP-Bindeprotein (GBP) gebunden und damit die entsprechenden Proteinchips hergestellt.As ligands according to the invention preferably proteins can be attached. According to the invention, streptavidin, C-reactive protein, protein G, protein A, his-tag or GFP binding protein (GBP) are bound as ligands and thus the corresponding protein chips are produced.
Erfindungsgemäß können nach Anbindung der Liganden die unspezifischen Bindungsstellen sehr gut mit BSA geblockt werden. Vorzugsweise wird eine BSA-Lösung mit einer Konzentration von 80–100 μg/ml BSA im jeweils verwendeten Puffer, der zur Anbindung der Liganden verwendet wurde (insbesondere PBS oder Acetat-Puffer) eingesetzt.According to the invention, after attachment of the ligands, the non-specific binding sites can be blocked very well with BSA. Preferably, a BSA solution with a concentration of 80-100 μg / ml BSA is used in the particular buffer used to bind the ligands (in particular PBS or acetate buffer).
Es hat sich gezeigt, dass die Biosensorchips der vorliegenden Erfindung hoch sensitiv sind und geringe Anteile unspezifischer Bindungsereignisse zeigen.It has been found that the biosensor chips of the present invention are highly sensitive and show low levels of non-specific binding events.
Nachfolgend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.The invention will be explained in more detail below with reference to embodiments, without limiting it thereto.
Ausführungsbeispieleembodiments
Alle Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, bei Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, gekauft und ohne weitere Aufreinigung verwendet.All chemicals were purchased from Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany, unless otherwise specified, and used without further purification.
Beispiel 1: Isolierung des Main Phospholipids (MPL) aus der Archaeentrockenmasse von Sulfolobus acidocaldarius und Aktivierung der Lipidkopfgruppen mit CyanurchloridExample 1 Isolation of the Main Phospholipid (MPL) from the Archea Dry Mass of Sulfolobus acidocaldarius and Activation of the Lipid Head Groups with Cyanuric Chloride
15 g lyophilisierte Trockenmasse wurden mit 400 ml einer Chloroform/Methanol 1:1 Extraktionslösung per Soxhlet-Extraktion innerhalb von 24 Stunden extrahiert. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung (Eluent: Benzinether/Chloroform 5/1) wurden 143,5 ± 8,5 mg SulfolobusMPL erhalten. Die terminalen Hydroxylgruppen des MPLs wurden mit Cyanurchlorid aktiviert. Hierfür wurde das Lipid in Chloroform gelöst und NaHCO3 (1,5 g pro 100 mg Lipid) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde unter Rückfluss gerührt. Anschließend wurden 5 eq. Cyanurchlorid hinzugeben und eine Woche unter Rückfluss erhitzt. Der Verlauf der Reaktion wurde per Dünnschichtchromatographie verfolgt, wobei Rf-Werte (Laufmittel: Petrolether/Diethylether/Eisessig 5/5/0,1) von 0,67 ± 0,0173 für das reine MPL und 0,75 ± 0,0624 für das aktivierte MPL gefunden wurden. Nach dem Abkühlen des Reaktiongemisches wurde es filtriert und das Produkt per Säulenchromatographie (Silicagel 60, Eluent: Benzinether/Chloroform 5/1) aufgereinigt. Das Produkt zeigte eine honigartige Konsistenz und Farbe. Zur komplementären chemischen Charakterisierung wurde für das aktivierte MPL folgendes FT-IR-Spektrum aufgenommen:15 g of lyophilized dry matter were extracted with 400 ml of a chloroform / methanol 1: 1 extraction solution by Soxhlet extraction within 24 hours. After purification by column chromatography (eluent: gasoline ether /
In
Die prominenten Schwingungsbanden sind in dem IR-Spektrum eindeutig vertreten und charakterisierten das isolierte Molekül als das Sulfolobus MPL:
3400 cm–1 (O-H), 2920 cm–1, 2870 cm–1 (CH3, CH2), 2780 cm–1 (Fermi-Resonanz C=O), 1700 cm–1 (C=O), 1460 cm–1, 1400 cm–1 (CHAlkyl), 1250 cm–1, 1217 cm–1 (OH), 1066 cm–1 (C-O), 1012 cm–1 (P-O-Alkyl), 926 cm–1 (P-O)The prominent vibrational bands are clearly represented in the IR spectrum and characterized the isolated molecule as the sulfolobus MPL:
3400 cm -1 (OH), 2920 cm -1 , 2870 cm -1 (CH 3 , CH 2 ), 2780 cm -1 (Fermi resonance C = O), 1700 cm -1 (C = O), 1460 cm -1 , 1400 cm -1 (CHalkyl), 1250 cm -1 , 1217 cm -1 (OH), 1066 cm -1 (CO), 1012 cm -1 (PO-alkyl), 926 cm -1 (PO)
Beispiel 2: LiposomenherstellungExample 2: Liposome Preparation
Es wurde eine definierte Masse des Lipids in Chloroform/Methanol gelöst, in einen Einhalsrundkolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der entstandene Lipidfilm wurde nun mit dem entsprechenden Volumen deion. Wasser hydratisiert um eine finale Lipidkonzentration von c = 2 mg/ml einzustellen. Die wässrige Liposomensuspension wurde im Ultraschallbad 15 min bei 60°C behandelt, wobei sich multilamellare Vesikel bilden, die eine breite Größenverteilung aufweisen (siehe Abbildung unten). Mit einem Liposomenextruder wurde die Suspension 21 mal durch eine Polycarbonatmembran mit definierter Porengröße 100 nm extrudiert und die jeweiligen Liposomensuspensionen vor und nach Extrusion per Dynamischer Lichtstreuexperimente analysiert: It was dissolved a defined mass of the lipid in chloroform / methanol, transferred to a one-necked round bottom flask and the solvent removed on a rotary evaporator. The resulting lipid film was now deionized with the appropriate volume. Water hydrated to adjust to a final lipid concentration of c = 2 mg / ml. The aqueous liposome suspension was treated in an ultrasonic bath for 15 min at 60 ° C to form multilamellar vesicles that have a broad size distribution (see figure below). Using a liposome extruder, the suspension was extruded 21 times through a polycarbonate membrane with a defined pore size of 100 nm and the respective liposome suspensions were analyzed before and after extrusion by dynamic light scattering experiments.
Beispiel 3: Aminierung von Glasoberflächen und LiposomenspreitungExample 3: Amination of glass surfaces and liposome spreading
Zur Aminierung wurden die Glassubstrate (Borofloat®33 oder BIAffinity-Chips) in einer speziell angefertigten PTFE-Kammer positioniert. In einem Becherglas wurde eine Chloroformlösung mit 1 Vol.% Aminopropyldimethylethoxysilan (APDMES) hergestellt. Die Kammer wurde vollständig mit der Silanlösung befüllt und mit einem Deckel verschlossen. Die Kammer wurde über Nacht bei 60°C in einem Trockenofen inkubiert. Danach wurde die Kammer aus dem Ofen genommen und nach dem Abkühlen wurden die Substrate aus der Kammer entfernt und für jeweils 10 min im Ultraschallbad nacheinander in Chloroform, Methanol und Wasser gespült. Die auf diese Weise silanisierten Glassubstrate wiesen Wasserkontaktwinkel von Θ ≈ 60° auf. Zur Lipidierung der mit APDMES aminosilanisierten Glasoberflächen wurden die Glassubstrate in einer frisch extrudierten Sulfolobus MPL Liposomensuspension (siehe Beispiel 2) über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss daran wurden die Substrate nochmals zwei Stunden bei 70°C gelagert bevor sie im Ultraschallbad in Chloroform gereinigt wurden. Die auf diese Art und Weise hergestellten Lipidsubstrate wiesen Wasserkontaktwinkel von Θ ≈ 75° auf.For the amination, the glass substrates (Borofloat ® 33 or BIAffinity chips) were placed in a specially made PTFE chamber. In a beaker, a chloroform solution containing 1% by volume of aminopropyldimethylethoxysilane (APDMES) was prepared. The chamber was completely filled with the silane solution and sealed with a lid. The chamber was incubated overnight at 60 ° C in a drying oven. Thereafter, the chamber was taken out of the oven, and after cooling, the substrates were removed from the chamber and rinsed successively in chloroform, methanol, and water for 10 minutes each in an ultrasonic bath. The silanized glass substrates had water contact angles of Θ ≈ 60 °. To lipidize the APMAES aminosilanized glass surfaces, the glass substrates were incubated in a freshly extruded Sulfolobus MPL liposome suspension (see Example 2) overnight at room temperature. Subsequently, the substrates were again stored for two hours at 70 ° C before they were cleaned in an ultrasonic bath in chloroform. The lipid substrates produced in this way had water contact angles of Θ≈75 °.
Beispiel 4: Chipherstellung und Funktionalitätsprüfung mittels RIfSExample 4: Chip Production and Functionality Testing by means of RIfS
Alle RifS-Analysen wurden mit einem BIAffinity System (Analytik Jena AG, Jena, Deutschland) durchgeführt. Bei der Funktionalitätsprüfung erfolgte die Detektion der komplementären Analyten mittels RifS, wobei das Verhältnis Unspezifität/Spezifität quantifiziert wurde. Zudem wurden die Chipmodifikationen im Hinblick auf Regenerierbarkeit getestet und die Zyklenstabilität der bindungsaktiven Oberfläche geprüft. Schließlich wurden die kinetischen Parameter, wie die Dissoziationskonstante KD ermittelt und mit den Literaturwerten verglichen.All RifS analyzes were performed with a BIAffinity system (Analytik Jena AG, Jena, Germany). In the functionality test, the detection of the complementary analytes was carried out by means of RifS, whereby the ratio nonspecificity / specificity was quantified. In addition, the chip modifications were tested for regenerability and the cycle stability of the bond-active surface was tested. Finally, the kinetic parameters such as the dissociation constant K D were determined and compared with the literature values.
Die Liganden (Fängermoleküle) Streptavidin (Biomol, Hamburg, Deutschland), GFP-Bindeprotein (Chromotek, München, Deutschland), Protein G und C-reaktives Protein (CRP) wurden in der Flusszelle (Dimension 6 mm × 1 mm × 125 μm) innerhalb des BIAffinity Systems auf den lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 immobilisiert. Alle Puffer für die Immobilisierungen und Messungen wurden entgast und filtriert.The ligands (catcher molecules) streptavidin (Biomol, Hamburg, Germany), GFP binding protein (Chromotek, Munich, Germany), protein G and C-reactive protein (CRP) were in the flow cell (dimension 6 mm × 1 mm × 125 microns) immobilized within the BIAffinity system on the lipidated glass transducers of Example 3. All buffers for immobilizations and measurements were degassed and filtered.
4.1 Streptavidin-Chip4.1 streptavidin chip
Zur Immobilisierung von Streptavidin auf den lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 wurden 200 μl einer Streptavidinlösung in PBS 7.4 mit c = 500 nM und einer Flussrate von 10 μl/min injiziert. Bei der Funktionalitätsprüfung wurden als komplementäre Analyten ein Anti-Streptavidin Antikörper und eine biotinylierte HRP (horseradish peroxidase) mittels RIfS detektiert. Die Unspezifität lag bei kleiner 20%, der Chip war für das System Streptavidin/Anti-Streptavidin Antikörper regenerierbar und die Dissoziationskonstante KD stimmte mit den Literaturwerten überein.To immobilize streptavidin on the lipidated glass transducers of Example 3, 200 μl of a streptavidin solution in PBS 7.4 at c = 500 nM and a flow rate of 10 μl / min were injected. In the functionality test, anti-streptavidin antibodies and a biotinylated HRP (horseradish peroxidase) were detected as complementary analytes by means of RIfS. The unspecificity was less than 20%, the chip was regenerable for the streptavidin / anti-streptavidin antibody system and the dissociation constant KD was consistent with the literature values.
4.2 CRP-Chip4.2 CRP chip
Zur Immobilisierung des CRPs auf lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 wurden 200 μl einer CRP-Lösung in PBS 7.4 mit c = 500 nM und einer Flussrate von 10 μl/min injiziert. Bei der Funktionalitätsprüfung wurde als komplementärer Analyt ein Anti-CRP Antikörper mittels RIfS detektiert. Die Unspezifität lag bei kleiner 30%, der Chip war regenerierbar und die Dissoziationskonstante KD stimmte mit den Literaturwerten überein.To immobilize the CRP on lipidated glass transducers of Example 3, 200 μl of a CRP solution in PBS 7.4 at c = 500 nM and a flow rate of 10 μl / min were injected. In the functionality test, an anti-CRP antibody was detected by means of RIfS as a complementary analyte. The unspecificity was less than 30%, the chip was regenerable and the dissociation constant K D was consistent with the literature values.
4.3 Protein G-Chip4.3 Protein G-Chip
Zur Immobilisierung des Protein G auf lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 wurden 200 μl einer Protein G-Lösung in PBS 7.4 mit c = 500 nM und einer Flussrate von 10 μl/min injiziert.To immobilize the protein G on lipidated glass transducers of Example 3, 200 μl of a protein G solution in PBS 7.4 were injected at c = 500 nM and a flow rate of 10 μl / min.
Bei der Funktionalitätsprüfung wurden als komplementäre Analyten ein Anti-GST und ein Anti-CRP Antikörper mittels RIfS detektiert. Die zwei Antikörper konnten gerichtet über die Fc-Region immobilisiert werden und jeweils konnten die finalen Analyten GST bzw. CRP nachgewiesen werden. Die Unspezifität AntiCRP/CRP lag bei kleiner 5%, AntiGST/GST bei ca. 10%. Der Chip war regenerierbar und die Dissoziationskonstante KD stimmte mit den Literaturwerten überein.In the functionality test, anti-GST and anti-CRP antibodies were detected as complementary analytes by means of RIfS. The two antibodies could be immobilized directed across the Fc region and in each case the final analytes GST or CRP could be detected. The non-specificity AntiCRP / CRP was less than 5%, AntiGST / GST about 10%. The chip was regenerable and the dissociation constant K D was consistent with the literature values.
4.4 GFP-Bindeprotein(GBP)-Chip4.4 GFP binding protein (GBP) chip
Zur Immobilisierung des GBPs auf lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 wurden 200 μl einer GBP-Lösung in Acetatpuffer 5.5 mit c = 500 nM und einer Flussrate von 10 μl/min injiziert. Bei der Funktionalitätsprüfung konnte als komplementärer Analyt GFP mittels RIfS detektiert werden. Der Chip war regenerierbar.To immobilize the GBP on lipidated glass transducers of Example 3, 200 μl of a GBP solution in acetate buffer 5.5 at c = 500 nM and a flow rate of 10 μl / min were injected. In the functionality test GFP could be detected as complementary analyte by means of RIfS. The chip was regenerable.
Claims (16)
Priority Applications (2)
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