DE102012107718B4

DE102012107718B4 - Kalibrierprobe auf DNA-Origami-Basis

Info

Publication number: DE102012107718B4
Application number: DE102012107718.5A
Authority: DE
Inventors: Philip Tinnefeld; Jürgen Schmied; Carsten Forthmann; Birka Lalkens
Original assignee: Technische Universitaet Braunschweig
Current assignee: Technische Universitaet Braunschweig De
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2020-04-02
Anticipated expiration: 2032-08-23
Also published as: DE102012107718A1

Abstract

Verwendung einer Kalibrierprobe von Strukturen auf Basis von DNA-Origami, die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen, und wobei die DNA-Origami immobilisiert vorliegen, wobei die Markermoleküle Fluorophore sind zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung.

Description

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Kalibrierproben zur Kalibrierung bzw. Funktionsüberprüfung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung und deren Verwendung nach Anspruch 1. Diese Kalibrierprobe weist dabei Strukturen auf Basis von DNA-Origami mit mindestens zwei Markermolekülen an vorbestimmten Positionen auf. Die mindestens zwei Markermoleküle sind dabei mit einem vorbestimmten Abstand voneinander beabstandet und die DNA-Origami liegen immobilisiert und fixiert in einem Einbettmedium, ggf. auf einem Träger, vor. Weiterhin wird ein Verfahren zur Kalibrierung zw. Funktionsüberprüfung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung beschrieben. Schließlich wird ein Kit zum Kalibrieren einer Messeinrichtung und entsprechender Computerprogramme mit Programmcodemitteln, insbesondere auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert, eingerichtet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wenn das Computerprogramm auf einer Rechnereinheit durchgeführt wird, bereitgestellt.
Stand der Technik
Eine Analyse von Proben, insbesondere der räumlichen Anordnung von Bestandteilen in dieser Probe, erfordert eine vorherige Kalibrierung bzw. Funktionsüberprüfung der Messeinrichtung, um eine zwei- und insbesondere eine dreidimensionale Auflösung zu erlauben. Eine Möglichkeit zur Kenntlichmachung der zu analysierenden Bestandteile umfasst eine Markierung der Bestandteile mit geeigneten Markermolekülen. Solche Markermoleküle umfassen sowohl solche, die optisch erkannt werden können, als auch solche, die mit anderen physikalischen Messverfahren bestimmt werden können, z. B. radioaktive Verbindungen etc.. Die Fluoreszenzmessung ist eine der Techniken, die sich gerade im Mikroskopiebereich sowohl im medizinischen als auch in biologischen Wissenschaften immer mehr in den Vordergrund schiebt. Dieses beruht unter anderem auf der Weiterentwicklung der Auflösung, z. B. durch superauflösende fluoreszenzmikroskopische Verfahren. Mit diesen superauflösenden Mikroskopietechniken ist eine Auflösung im Nanometerbereich möglich. Beispiel für solche Verfahren sind STED, (F)PALM, (d)STORM, Interferenzverfahren, SPIM, Mehrphotonenmikroskopie. Neben der hohen Auflösung erlauben solche Fluoreszenzmikroskope aber auch die Bestimmung anderer Parameter, um Informationen über die entsprechende Probe bereitzustellen. Hierzu gehört insbesondere auch die superaufgelöste räumliche Anordnung, insbesondere eine dreidimensionale Auflösung der zu analysierenden Probe.
Weiterhin sind zur Bestimmung des Auflösungsvermögens einer Messeinrichtung z. B. eines Fluoreszenzmikroskops, Proben erforderlich, die eine definierte Anordnung von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglichen. Im Falle der dreidimensionalen Mikroskopie wird dementsprechend eine Methode benötigt, die es ermöglicht, Fluoreszenzfarbstoffe in allen drei Raumrichtungen in genau definierter Weise anzuordnen. Um auch eine statistisch ausreichende Absicherung der Messungen zu erlauben, ist es notwendig, die Kalibrierung der Messeinrichtung durch Bereitstellung einer ausreichend hohen Zahl an Kalibrierproben zu erlauben. Insbesondere im superauflösenden Bereich, d. h. im Nanometerbereich, ist eine genaue Bestimmung der dreidimensionalen Auflösung erforderlich, um entsprechende Aussagen bezüglich der räumlichen Anordnung von Bestandteilen zu erlauben.
Derzeit werden zelluläre Strukturen zur Bestimmung des Auflösungsvermögens und der räumlichen Anordnung bzw. der räumlichen Parameter eingesetzt. Zelluläre Strukturen weisen aber den großen Nachteil auf, dass die Struktur nicht genau definiert ist. So wird derzeit zwar die Auflösungsgrenze dadurch bestimmt, dass die gesamte Struktur nach möglichst geringen Farbstoffabständen durchsucht wird, der kürzeste, noch auflösbare Abstand wird dann als Auflösungsgrenze definiert.
Allerdings ist dieses Vorgehen unsystematisch und aufgrund der nicht genauen Definierbarkeit der Struktur, nicht aussagekräftig und nicht reproduzierbar, insbesondere im superauflösenden Bereich. Tatsächlich werden heutzutage in den meisten Veröffentlichungen zum Thema Fluoreszenzmikroskopie¹, insbesondere im Rahmen der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in der Regel fluoreszenzmarkierte Strukturen eukaryotischer Zytoskelette, wie bspw. Mikrotubuli, Aktinfilamente oder auch Beads² verwendet, um das Auflösungsvermögen der jeweiligen Methode nachzuweisen. Alternativ kommen Strukturen zur Anwendung, bei denen solche mit gezielter Positionierung einzelner Farbstoffmoleküle mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops verwendet werden³.
Weiterhin gibt es die Möglichkeit dreidimensionale Strukturen vor allem fluoreszenzmarkierter Proben mit Hilfe verschiedener Techniken zu untersuchen. Dabei sind im Bereich der lokalisationsbasierten Methoden Biplane², Astigmatismus² und das Doppel-Helix Verfahren⁴ zu nennen. Alle Verfahren basieren auf einer Verzerrung der Punktspreizfunktion abhängig von der Position des Emitters in z-Richtung also in der dritten Dimension. Speziell im Fall der Astigmatismus Methode kommt dabei eine Zylinderlinse im Detektionsstrahlengang zum Einsatz, die die Punktspreizfunktion von einer symmetrisch runden Form in eine asymmetrische, elliptische Form transformiert. Abhängig von der Position des Emitters ändert sich Stärke und Richtung der Verzerrung, was nach vorhergehender Kalibrierung dazu benutzt werden kann, eben die Position in z-Richtung zu bestimmen.
US 2012/0166152 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Regulation der Eigenschaften von Nukleinsäurenanostrukturen.
WO 2012/058638 A2 betrifft Nukleinsäurenanostrukturen und deren Verwendung in Barcodeproben.
Vogelsang, J. et al., ChemPhysChem, 2010, 11, 2475-2490 beschreibt Proben für die superauflösende Mikroskopie.
Steinhauer et al., Ang. Chem., 2009, 48, 8870-8873 beschreibt DNA Origami als nanoskopische Lineale zur superauflösenden Mikroskopie.
Douglas, S.M., et al, Nature, 2009, 459, 414-418 betrifft die Selbstassemblierung von DNA in nanoskalige dreidimensionale Formen.
Liu, W. et al, Ang. Chem., 2011, 123, 278-281 beschreibt kristalline zweidimensionale DNA Origami Arrays.
Die Nachteile dieser Systeme sind aber bereits oben ausgeführt. Es besteht daher eine Notwendigkeit geeignete Proben und Systeme bereitzustellen, die einerseits geeignet sind, das Auflösungsvermögen der Messeinrichtung selbst zu bestimmen. Andererseits sollen diese Proben geeignet sein, die dreidimensionale Auflösung der Messeinrichtung zu kalibrieren.
Aufgabe ist die Bereitstellung von entsprechenden Kalibrierproben, um die dreidimensionale Auflösung einer Messeinrichtung zu überprüfen. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung von entsprechenden Verfahren, Kits und Computerprogrammen zur Durchführung der Kalibrierung und Bestimmung der Auflösung.
Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt ist die vorliegende Anmeldung auf die Verwendung einer Kalibrierprobe zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, mit Strukturen auf Basis von DNA-Origami die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen und wobei die DNA-Origami immobilisiert und optional fixiert in einem Einbettmedium, gegebenenfalls auf einem Träger, vorliegen nach Anspruch 1 gerichtet. Darüber hinaus wird eine Kalibrierprobe nach Anspruch 14 bereitgestellt.
Unter einer Struktur auf Basis eines DNA-Origami wird vorliegend ein DNA-Origami verstanden, gebildet aus einem Gerüst-DNA-Strang und kurzen DNA-Abschnitten, die eine vorbestimmte Struktur des Gerüststranges ausbilden. Die Struktur auf Basis eines DNA-Stranges kann weitere Komponenten umfassen, wie Farbstoffe, plasmonische Strukturen, biologische Moleküle wie Proteine, Enzyme, Nanoteilchen, und kleine Moleküle wie Biotin. Alternativ kann die Struktur auf Basis eines DNA-Origami auch lediglich aus kurzen DNA-Abschnitten aufgebaut sein⁵.
Unter dem Ausdruck „kurze DNA-Abschnitte“ wird vorliegend die als „staple strands“ bezeichneten Nukleotidmoleküle verstanden, die eine Sequenz komplementär zu einem Sequenzabschnitt des Gerüst-DNA-Strangs oder eines anderen kurzen DNA-Abschnitts aufweisen. Diese kurzen DNA-Abschnitte können weiterhin dazu dienen, dem langen DNA-Strang oder einem anderen kurzen DNA-Abschnitt die vorbestimmte Struktur zu verleihen. Die Staples hybridisieren definiert durch ihre Sequenz an vorherbestimmten Stellen des Gerüst DNA-Strangs oder anderer kurzer DNA-Abschnitte. Alternativ kann es sich bei den kurzen DNA-Abschnitten um solche handeln, die in vorbestimmten Bereichen mit dem DNA-Gerüst-Strang des DNA-Origami hybridisieren.
Erfindungsgemäß können dabei in der Kalibrierprobe mindestens zwei verschiedene DNA-Origami-Strukturen vorliegen. Diese mindestens zwei verschiedenen DNA-Origami-Strukturen unterscheiden sich darin, dass die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen in der DNA-Origami-Struktur unterschiedlich voneinander beabstandet sind.
Alternativ oder zusätzlich können sich diese mindestens zwei unterschiedlichen DNA-Origami-Strukturen darin unterscheiden, dass diese unterschiedliche Markermoleküle aufweisen.
So kann z.B. mindestens ein Paar von mindestens zwei Markermolekülen an vorbestimmten Positionen die voneinander beabstandet sind, Markermoleküle eines identischen Fluoreszenzfarbstoffes sein, während ein weiteres Paar von mindestens zwei Markermolekülen an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, durch vom ersten Markermolekül unterschiedlichen Farbstoffen ausgebildet sein, wobei diese voneinander einen anderen Abstand aufweisen als das erste Paar von Markermolekülen.
Vorliegend wurde überraschend festgestellt, dass die erfindungsgemäße Verwendung der Kalibrierproben geeignet ist zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, wenn diese auf Basis einer DNA-Origami-Struktur mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, wobei diese Markermoleküle voneinander mit einem vorbekannten Abstand beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen und diese DNA-Origami immobilisiert in der Kalibrierprobe vorliegen, um die dreidimensionale Auflösung der Messeinrichtung zu bestimmen.
Unter dem Ausdruck „dreidimensionale Auflösung“ wird einerseits das Auflösungsvermögen der Messeinrichtung selbst verstanden. Andererseits wird unter diesem Ausdruck die semi-quantitative insbesondere quantitative Bestimmung der Beabstandung zweier Markermoleküle in X-, Y- und Z-Richtung verstanden.
Es wurde vorliegend festgestellt, dass bei erfindungsgemäßer Verwendung der Kalibrierproben eine sehr genaue Bestimmung der dreidimensionalen Auflösung möglich ist. Insbesondere erlauben diese Kalibrierproben eine Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung im superauflösenden Bereich, wie sie bisher unter anderem und in weiter Verbreitung durch optische Astigmatismen erreicht werden konnten, wie die oben beschriebenen zylindrischen Linsentechniken oder biplanare Bildgebung. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Kalibrierproben, die in geeigneter Art und Weise immobilisiert sind und ggf. auf einem Träger vorliegen, ist es möglich, eine dreidimensionale Kalibrierung bzw. Überprüfung der Auflösung zu erreichen, die ein einfaches und genaues Kalibrieren bzw. Überprüfen der Messeinrichtung, ggf. zum Zeitpunkt der Messung der Probe, ermöglichen. Es ist dabei besonders bevorzugt, dass die zur Bindung der DNA-Origami-Struktur mit an vorbestimmten Positionen voneinander beabstandeten Markermolekülen Elemente zur Bindung an einen Träger bevorzugt an einem Ende der Struktur vorliegen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Biotinmoleküle oder andere, dem Fachmann bekannte Moleküle mit bekannten Bindungspartnern, die entsprechend auf dem Träger angeordnet sind. Durch das Vorliegen dieser Bindungspartner an einem Ende der DNA-Origami-Struktur, die z.B. in Form einer Helix oder eines Tetraeders vorliegen können, ist es möglich, die Kalibrierprobe in gewünschter Art und Weise zur Messung durch die Messeinrichtung vorzulegen. D.h. die Kalibrierproben können vertikal, horizontal oder in einem gewünschten Winkel immobilisiert werden. Ein entsprechendes DNA-Origami kann z.B. eines sein, das ein zentrales Bündel aus zwölf Helices mit einer Länge von rund 200 Nanometer aufweist und diese an einem Ende der Struktur mehrere Biotinmoleküle haben. An diese Struktur können dann entsprechende Markermoleküle an vorbestimmten Positionen mit bekanntem Abstand positioniert werden, so dass entsprechende Kalibrierproben mit beabstandeten Markermolekülen bekannten Abstands vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wie bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Kalibrierproben, weisen die DNA-Origami, die als Kalibrierprobe eingesetzt werden, Fluorophore als Markermoleküle auf. Diese Fluorophore zeigen dabei unterschiedliche Emissionsspektren. D.h., die DNA-Origami haben Fluorophore als Markermoleküle mit Fluorophoren und unterschiedlichen Emissionsspektren, die an vorbestimmten Positionen in einem bekannten Abstand positioniert sind.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Struktur auf Basis der DNA-Origami um eine tetraedrische Struktur. Dabei werden an allen vier Ecken des tetraedischen Origamis Farbstoffmoleküle angebracht, im einfachsten im Folgenden beschriebenem Fall jeweils 1 Farbstoffmolekül. Jeweils 3 dieser Farbstoffmoleküle liegen dabei in einer Ebene, der dadurch definierten x-y Ebene und liefern einen Auflösungsstandard in x-y-Richtung. Der jeweils vierte Farbstoff befindet sich in der x-y Projektion innerhalb des durch die ersten 3 Farbstoffe gebildeten Dreiecks und in einem definierten Abstand von der dadurch gebildeten Ebene in z-Richtung und liefert dadurch einen Auflösungsstandard in dieser Raumrichtung.
Die erfindungsgemäße Verwendung der Kalibrierproben mit Strukturen auf Basis von DNA-Origami besitzen mehrere Hunderte an möglichen Anbindungsstellen für Fluoreszenzfarbstoffe. Jede Anbindungsstelle kann individuell besetzt werden, sowohl was Anzahl als auch Art des Farbstoffs betrifft. Somit ist es erfindungsgemäß möglich, eine genau definierte dreidimensionale Verteilung von Punktlichtquellen bzw. Fluoreszenzfarbstoffen zu generieren. Diese erlauben dann eine entsprechende Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, wie z.B. eines superauflösenden Fluoreszenzmikroskops.
Diese DNA-Origami sind immobilisiert. Bevorzugt sind diese weiterhin in einem Einbettmedium fixiert wie bei der erfindungsgemäßen Kalibrierprobe nach Anspruch 14. Mögliche Einbettmedien sind übliche Einbettmedien, die mit der Fluoreszenz des Farbstoffes idealerweise nur fluoreszenzverstärkend interagieren Als geeignetes Einbettungsmedium kann z.B. ein Material aus Polyvinylalcohol und Glycerin eingesetzt werden. Alternativ kann die Kalibrierprobe einfach in Puffer oder in Zellkulturmedium vorliegen.
Weiterhin können die Kalibrierproben auf einem Träger angeordnet sein, insbesondere auf einem transparenten Träger, wie Glas. Dem Fachmann sind entsprechende geeignete Methoden zur Fixierung der DNA-Origami auf dem Träger bekannt. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine entsprechende Fixierung auf dem Träger mit Hilfe des Biotin/Avidin Systems, rein elektrostatisch oder anderen bekannten Systemen erfolgt.
Unter dem Ausdruck „DNA“, wie er vorliegend verwendet wird, werden nicht nur Stränge von Desoxynukleinsäure verstanden, sondern auch analoge Strukturen, wie Stränge von Ribonukleinsäuren, PNA, usw.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Kalibrierproben und der erfindungsgemäßen Kalibrierproben ist es möglich, eine definierte dreidimensionale Verteilung von Markermolekülen, insbesondere Farbstoffmolekülen, innerhalb eines beugungsbegrenzten Punktes bereitzustellen. Diese Anordnung ist im Wesentlichen nur mit Hilfe der DNA-Origami-Technik möglich. Ein weiterer Vorteil hiervon ist, dass durch parallelisierte Herstellung Millionen von Kalibrierproben hergestellt werden können. Diese Kalibrierproben eignen sich besonders als Standards für die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie, sind aber auch hervorragend im Bereich der beugungsbegrenzten Mikroskopie einsetzbar. Die Möglichkeit der definierten Anordnung der Farbstoffmoleküle bei gleichzeitig superparallelisierter Herstellung ist durch keine herkömmliche Technik gegeben. Bei erfindungsgemäßen Kalibrierproben ist zudem ein hoher Grad an Skalierbarkeit von sowohl der hergestellten Proben möglich als auch der Flexibilität was die Anzahl und Art der verwendeten Farbstoffe betrifft. Durch Bereitstellen von ggf. auf Trägern vorliegenden eingebetteten Kalibrierproben ist es möglich, diese über einen längeren Zeitraum zu lagern und zu versenden, d.h. die Kalibrierproben erfordern keine vor Ort Synthese durch den Anwender. Dadurch kann eine Fehlerquelle ausgeschaltet werden.
Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben sind insbesondere geeignet zur Verwendung bei der Kalibrierung oder Überprüfung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, insbesondere eines Fluoreszenzmikroskops, wie für superauflösende Fluoreszenzmikroskopie.
Die Kalibierproben können, wie oben beschrieben, in einem Einbettmedium und ggf. auf einen Träger fixiert vorliegen. Dabei können die Kalibrierproben als separate Proben vorliegen. Alternativ können die Kalibrierproben auch als interne Kalibrierproben in einer zu analysierenden Probe vorliegen. D.h., es ist erfindungsgemäß möglich, die Kalibrierproben immobilisiert in der zu analysierenden Probe vorzulegen um so zur internen Kalibrierung zu dienen.
Bei Einsatz der Kalibrierproben als interne Kalibrierproben in der zu analysierenden Probe kann ein bisher nicht bekannter Grad an Genauigkeit erreicht werden. Damit können die Dimensionen in der zu analysierenden Probe im Nanometerbreich genauer bestimmt und die Dimensionen der einzelnen Bestandteile genauer berechnet werden. Im Gegensatz zu den bisher eingesetzten Techniken, z.B. unter Markierung von Aktinfilamenten etc. kann nun eine höhere Genauigkeit der Größendimensionen erreicht werden.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer erfindungsgemäßen Kalibrierprobe zur Kalibrierung der Messeinrichtung zur dreidimensionalen Auflösung dieser Messeinrichtung um z.B. das Auflösungsvermögen der Messeinrichtung zu bestimmen oder die Dimensionen in X-, Y- und Z-Richtung zu kalibrieren.
Unter dem Ausdruck „Kalibrierung“ oder „Kalibrieren“ wird dabei vorliegend verstanden eine Messgröße anhand einer oder mehrerer Referenzproben zu quantifizieren oder die Eigenschaften wie die Sensitivität einer Apparatur zu bestimmen. Soweit nicht anders ausgeführt, wird hierunter auch verstanden, dass die Funktionsfähigkeit der Messeinrichtung überprüft wird, wie eine korrekte Justierung, Aberrationen, wie chromatische Aberrationen, etc, die entsprechend korrigiert werden können.
Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben und die erfindungsgemäße Verwendung von Kalibrierproben können aber auch in anderen Messbereichen eingesetzt werden, beziehungsweise erfolgen z.B. im Bereich der Absorptionsmessung oder im Bereich der Raman-Spektroskopie. Die Einsatzmöglichkeiten hängen auch von den ausgewählten Markermolekülen ab. Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben sind insbesondere als Standards für die Messeinrichtungen, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie, wie die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie geeignet. Im Gegensatz zu den bisher im Stand der Technik beschriebenen Techniken, wie die Markierung von eukaryotischen Zytoskeletten z.B. Tubulin oder Aktinfilamente ist gerade im superauflösenden Bereich, d.h. im Nanometerbereich, eine genaue Bestimmung des Auflösungsvermögens der Messeinrichtung selbst bzw. eine Kalibrierung der Messeinrichtung auf die Größendimensionen erfindungsgemäß möglich, um genaue Aussagen zu den Größen und Abständen sowie dem Auflösungsvermögen machen zu können.
Die Kalibrierproben haben zudem den Vorteil, dass sie sehr beständig und lagerfähig sind. Bei den Strukturen auf DNA-Origami-Basis als Kalibrierprobe ist die definierte und vorbestimmte Struktur eine, die besonders robust ist. Eine chemische Fixierung, wie sie z.B. bei Zytoskelettproben notwendig ist, ist bei DNA-Origami-Strukturen nicht erforderlich. Als weiterer Vorteil ergibt sich dadurch, dass die Langlebigkeit der Kalibrierproben verbessert ist.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zur Kalibrierung bzw. Überprüfung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung nach Anspruch 7. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung einer erfindungsgemäßen Kalibrierprobe. Dieses Verfahren wird insbesondere zur Kalibrierung eines Fluoreszenzmikroskops, insbesondere zur superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Eine entsprechende dreidimensionale Auflösung ist dabei < 200 nm, insbesondere < 100 nm. Die erfindungsgemäßen Kalibrierproben erlauben insbesondere Auflösungsvermögen in einem Bereich von < 50 nm, wie < 20 nm zu erzielen.
In einer Ausführungsform sind die Kalibrierproben zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren derart ausgebildet, dass die Markermoleküle, insbesondere Fluorophore aufweisen, die an vorbestimmten Positionen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren eines mit den Schritten: Bereitstellen einer Kalibrierprobe wie in den Ansprüchen definiert, Messen der Kalibrierprobe unter vorbestimmten Bedingungen, insbesondere Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit unter vorbestimmten Anregungsleistungen zur Anregung der Markermoleküle in Form von Fluorophoren unter Berücksichtigung der räumlichen Orientierung der Markermoleküle zueinander, mit geeigneten Sensoren, Kalibrieren der Messeinrichtung auf Basis der Messung der Kalibrierprobe unter vorbestimmten Bedingungen, insbesondere Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit mit einem Sensor, bevorzugt mit Hilfe einer Rechnereinheit.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere für die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie, d.h. für Auflösungsvermögen im Nanometerbereich. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Messung bei gegebener Anregungsleistung durch eine Lichtquelle im Stande ist, das Auflösungsvermögen der Messeinrichtung zu bestimmen bzw. einen hohen Grad an Genauigkeit der Dimensionierung zu erreichen, wie sie bisher nicht erreicht werden konnte oder nur unter hohem Aufwand.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in einer Ausführungsform bevorzugt eines, bei dem die Kalibrierprobe in einer zu analysierenden Probe als interne Kalibrierprobe vorliegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist wie ausgeführt zur Bestimmung des Auflösungsvermögens eines Fluoreszenzmikroskops geeignet. In einer Ausführungsform können dabei verschiedene Kalibrierproben unterschiedlicher Markierung eingesetzt werden. Dieses erlaubt eine einfache Bestimmung des Auflösungsvermögens aufgrund der Auflösbarkeit der farblich unterschiedlich markierten Kalibrierproben.
Weiterhin ist es möglich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die immobilisiert vorliegenden Kalibrierproben mit dem vorbestimmten Abstand derart gemessen werden, dass die dreidimensionalen Größen der Bestandteile in der zu analysierenden Probe bestimmt werden können.
Mit entsprechender Rechnerunterstützung kann dabei einfach eine Projektion der Kalibrierprobe und entsprechend der Bestandteil der zu analysierenden Probe in den entsprechenden XY-, XZ- und YZ-Ebenen erfolgen. Ggf. ist eine Korrektur der berechneten Werte in einer der Dimensionen, z.B. in der Z-Dimension notwendig. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt uns z.B. den entsprechenden Skalierfaktor Z zu bestimmen, der notwendig ist, um die Vergrößerung durch den Brechungsindexsprung z.B. an der Deckglas-Puffer-Grenze, zu korrigieren. Ein Beispiel hierfür wird unten ausgeführt.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den erfindungsgemäßen Kalibrierproben ist es möglich einfach sowohl Auflösungsvermögen der Messeinrichtung als auch die entsprechende Dimensionierung in XYZ-Richtung zu bestimmen, da die Länge der Kalibrierproben bekannt ist und diese Kalibrierproben weiterhin derart steif sind, dass ein Verbiegen nur um wenige Nanometer möglich ist. Somit kann einfach eine gute Bestimmung der Längen im dreidimensionalen Raum erfolgen.
Weiterhin beschreibt die Anmeldung ein Kit zur Kalibrierung einer Messeinrichtung, insbesondere einer Messeinrichtung zur Messung von Fluoreszenz, umfassend eine erfindungsgemäße Kalibrierprobe.
Schließlich stellt die vorliegende Anmeldung ein Computerprogramm mit Programmcodemitteln, insbesondere auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert, eingerichtet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wenn das Computerprogramm auf einer Rechnereinheit durchgeführt wird, bereit.
Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele erläutert, ohne dass sie auf diese beschränkt ist.
Beispiele:
Die verwendete DNA-Origami Struktur besteht aus einem zentralen 12-Helix Bundle und einer Basis bestehend aus drei kürzeren 6 Helix-Bundle Strukturen. Die Länge des zentralen 12-Helix-Bundle beträgt etwa 200nm und die 3 sechs-Helix-Bundle besitzen eine Länge von etwa 20nm. Die nicht modifizierten und modifizierten kurzen DNA Abschnitte (staple strands) wurden von MWG (München, Deutschland) oder IBA (Göttingen, Deutschland) in Konzentration von 100µM erhalten und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Die DNA Origami Strukturen wurden hergestellt unter Verwendung eines Verhältnis von 1:30 zwischen viralem Gerüst-DNA Strang und unmodifizierten Staples sowie einem entsprechendem Verhältnis von 1:100 zu den mit z.B. Farbstoffmolekülen markierten Staples. Zur Herstellung der Gerüst-Stränge aus viraler DNA wurden E. coli Stamm K91 mit den entsprechenden M13MP18 Phagen infiziert und nach Amplifikation wurden die Phagen-Partikel abgetrennt aufgereinigt und die Einzel-Strang-DNA extrahiert⁶. Die Konzentration wurde entsprechend auf 100 nmol eingestellt. Die Strukturen wurden in einem Thermocycler auf etwa 95°C erhitzt und innerhalb von 3 Tagen auf 20°C abgekühlt. Der Faltungspuffer enthält 12,5 mM MgCl₂ genauso wie 5 mM Tris und 1 mM EDTA (pH 7.9 bei 20°C). In der 1a ist schematisch eine entsprechende Rocket DNA-Origami dargestellt. Die fertig „gefalteten“ Strukturen wurde von den überschüssigen Staples und den unvollständig gefalteten DNA Origami Strukturen durch Gel-Elektrophorese aufgereinigt und anschließend mit „Squeeze and Freeze“ (Biorad) Zentrifungenfiltern von den Gelrückständen getrennt.
Die DNA-Origami wurden optional auf den Trägern durch ein Polymer eingedeckt, hergestellt unter Verwendung von 10 g „Mowiol 488“ (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland), 25 g Glycerin und 100 ml 0,1 Tris (pH 7,2 gepuffert). Als Träger wurden verwendet: Standard Objektträger und Deckgläser für Fluoreszenzmikroskope. Als Markermoleküle wurden verwendet: Alexa647. Die Bindung der Markermoleküle an die entsprechenden kurzen DNA-Abschnitte erfolgte gemäß bekannten Verfahren.
DNA-Origami Immobilisierung
Zur Immobilisierung der DNA-Origami wurden verschiedene Verfahren eingesetzt. Eine chemische Immobilisierung erfolgte mittels BSA-Biotin/BSA Neutravidin Oberflächen⁷. Alternativ erfolgte eine Elektrostatische Immobilisierung entweder durch Beschichtung der Oberfläche mit PLL (Biochrom, Berlin, Deutschland) oder durch Zugabe von MgCl₂ zu der Lösung.
Superauflösende Bildgebung in mehreren Farben
Die superauflösende Mehrfarbenmikroskopie wurde auf einem inversen Olympus IX-71 Stativ durchgeführt mit TIRF (Total internal reflection) Anregung. Als Objektiv wurde ein UPlanSApo 100x NA=1,4 von Olympus verwendet. Zur Anregung wurden drei verschiedene Laser verwendet: Sapphire 488 (λ = 488 nm, Coherent, Dieburg, Deutschland), Sapphire 568 (λ = 568 nm, Coherent) and ibeam smart (λ = 639nm, Toptica Photonics, München, Deutschland). Die Lasernlinien wurden über einen triple-band Strahlenteiler (Chroma z476-488/568/647, AHF Analysentechnik) für blaue und rote Anregung und über einen single-band Strahlenteiler (Semrock, Laser BS z561, AHF) eingekoppelt. Abhängig von der Anregungswellenlänge wurde die Fluoreszenz mit einem der folgenden Filtern gefiltert: Semrock BrightLine Exciter 531/40 (blau), Semrock BrightLine HC 609/54 (gelb), Semrock RazorEdge LP 488 RS, Semrock RazorEdge LP 647 RS (beide rot, alle AHF Analysentechnik). Die Fluoreszenz wurde mit einer EMCCD Kamera (Ixon DU-897, Andor Technology, Belfast, Nordirland) mit einer Integrationszeit von 8.6 ms aufgzeichnet. Die effektive Pixelgröße betrug 100 nm. Die Messungen wurden auf einer BSA-Biotin-neutravidin Oberfläche und einem Umgebungspuffer bestehend aus 50 mM TRIS pH 8.0, 10 mM NaCI, 12,5 mM MgCI2, 1% w/w Glukose, 10 % v/v enzymatisches Sauerstoffentzugssystem und 140 mM 2-mercaptoethanol.
Standards für die Ultrahochauflösungsbildgebung
Die ultrahochauflösende Mikroskopie wurde durch schrittweises Fotobleichen und Rekonstruktion der Punktspreizfunktionen der jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe durchgeführt. Dazu wurde der rote Kanal des Versuchsaufbaus wie im Abschnitt „Superauflösende Bildgebung in mehreren Farben“ verwendet. Die Integrationszeit der Kamera betrug hier 50 ms. Der verwendete Farbstoff war Atto647N in 1xPBS, darin enthalten 12,5 mM MgCI2, 1 % w/w Glukose, 10 % enzymatisches Sauerstoffentzugssystem, 2 mM Methylviologen und 2 mM Ascorbinsäure.
Beispiel 1 Standard für 3D-superauflösende Bildgebung
Zwei- und dreidimensionale superauflösende Bildgebung wurde durchgeführt auf einem Olympus IX-71 Stativ mit TIRF Beleuchtung unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv (Olympus UPlanSApo N 100x, NA = 1.40). Zur Beleuchtung wurde ein Single-mode Diodenlaser (λ = 644 nm, ibeam smart, Toptica Photonics, München, Deutschland) verwendet. Zusätzlich wurde ein Single-mode Diodenlaser (λ = 532 nm, MPB Communications, Montreal, Canada) oder (λ = 488 nm, ibeam smart, Toptica Photonics, München) zur Reaktivierung der Farbstoffe verwendet⁸. Der rote Laser wurde durch einen Clean-up Filter spektral aufgereinigt (Brightline HC 650/13, AHF Analysentechnik, Tübingen, Deutschalnd) und in das Mikroskop über einen Dual-Band Beamsplitter (z532/658 rpc, AHF Analysentechnik) eingekoppelt. Das Fluoreszenzlicht wurde spektral gefiltert durch einen Emissionsfilter (HQ 700/75 M, AHF Analysentechnik) und von einer EMCCD Kamera (Ixon DU-897, Andor Technology, Belfast, Nordirland) detektiert. Die effektive Pixelgröße auf der Kamera war 100 nm. Für dreidimensionale Aufnahmen wurde eine Zylinderlinse (Thorlabs, Newton, USA) mit einer fokalen Länge von einem Meter in den Detektionsstrahlengang eingebracht¹. Die Proben wurden für die Messungen auf einer BSA-Biotin-Neutravidin Oberfläche immobilisiert. Die Puffer während der Messung bestand aus PBS mit 500 mM MgCl₂, 10% w/w Glucose, 10% v/v enzymatischer Sauerstoffentzug, 140 mM 2-Mercaptoethanol.
Zur Kalibrierung der 3D-Lokalisierung wurde ein Deckgläschen mit immobilisierten Beads (Fluospheres Invitrogen) verwendet. Die Kalibrierung wurde durchgeführt durch Bewegen des Objektivs in Schritten von 50 nm in Z-Richtung mit Hilfe eines Pifoc (Physikinstrumente, Karlsruhe, Deutschland). In jeder Position wurden die Beads mittels einer zweidimensionalen elliptischen Gauss-Funktion gefittet und daraus die Breite W_x in x-Richtung W_y in y-Richtung der PSF ebenso wie die Höhe h, der Hintergrund b und die Koordinaten des Mittelpunkts xo und yo (Figure 2a). $F (x, y) = h * e x p (- \frac{{(x - x_{0})}^{2}}{2 * W_{x}^{2}} - \frac{(y - y_{0}^{2})}{2 * W_{y}^{2}}) + b$
Die Differenz zwischen W_x und W_y wurde gegen die Position in z aufgetragen und mit einer polynomialen Funktion gefittet (2b).
Diese Funktion wurde zur Berechnung der Z-Positionen aus den gemessenen PSF herangezogen. Die Kalibrierung wurde dann getestet durch Lokalisieren eines einzelnen Beads während das Objektiv in 50 Nanometer Schritten in Z-Richtung bewegt wurde (2c).
2a zeigt die gemessenen Breiten der PSF in X- und Y-Richtung, erhalten mittels eines Beads in Abhängigkeit von der Z-Position des Objektivs. B zeigt die Differenz von W_x und W_y angepasst mittels polynomialer Funktion. 2c zeigt den Test zur Lokalisierung unter Verwendung eines Fluoreszenzbeads wobei in regulären Schritten von 50 Nanometer in Z-Richtung jeweils 30 Frames genommen wurden.
Die Analyse der 3D-Daten erfolgt mittels Spot-Finding Algorithmus. Die Spots wurden mit Hilfe einer elliptischen Gaussfunktion gefittet, wie oben beschrieben, dies ergibt die Koordinaten in X und Y genauso wie die Peakhöhe (h). Die Z-Koordinate wurde unter Verwendung der Breiten der PSF in X- und Y-Richtung genauso wie mit Hilfe der Kalibrierungskurve für (W_x - W_y) berechnet (siehe 2). Der Z-Wert für den W_x - W_y der Kalibrierungskurve gleich ist mit W_x - W_y des Spots, ergibt die Koordinate in Z.
Zur objektiven und schnellen Auswertung der Daten aus der Messungen, also zur Bestimmung der Distanz zwischen den Markermolekülen angebracht am 3D DNA-Origami (Rocket DNA-Origami) wurde ein Algorithmus entwickelt der automatisch potentielle DNA-Origami Strukturen identifiziert und den entsprechenden Abstand zwischen den Markermolekülen bestimmt.
Dieser Algorithmus arbeitet dabei wie folgt: Um die erhaltenen Lokalisierungen jeweils dem entsprechenden Origami zu zuordnen, wurden die erzeugten superaufgelösten Bilder zunächst durch Faltung mit einer Gauß-Funktion geglättet. In diesen Bildern konnten die einzelnen Origami-Strukturen dann per Spoterkennungsalgorithmus detektiert werden. Für jeden detektierten Spot wurden alle Lokalisierungen, die in einem definierten Bereich um die Mitte des Spots lagen, einem Cluster zugeordnet. Das größere Problem bestand nun in der darauffolgende Zuordnung der Lokalisierungen zu den beiden Teilclustern, die je einem Farbstoffmolekül entsprechen. Dafür wurde zunächst diejenige Gerade g bestimmt, welche den Parameter $ε = \frac{(| ξ_{i} - (ξ_{i}) |)}{\sqrt{{(ξ_{i} - (ξ_{i}))}^{2}}}$
maximiert, wobei ξ_i die Projektion der i-ten Lokalisierung auf die Gerade g bezeichnet. Um die ε-maximierende Gerade g zu finden, wurde der Richtungsvektor zunächst in 10°- und dann in 1°-Schritten in Θ und φ variiert. Die Gerade g konnte nun als gute Näherung an die Verbindungslinie zwischen den beiden Subclustern betrachtet werden. Die dieser Geraden zugehörigen ξ_i wurden histogrammiert und anschließend mit zwei Gauß-Funktionen gefittet, woraus die beiden Peakpositionen ξ_max,1 und ξ_max,2 erhalten wurden. Um nun die Lokalisierungen zu trennen, wurde einen Ebene E so definiert, dass sie zum einen senkrecht auf g liegt und zum anderen den Punkt M enthält, welcher auf g an der Stelle $ξ_{S c h n i t t} = \frac{ξ_{max,1} + ξ_{max,2}}{2}$
liegt. Der Punkt M approximiert die Mitte zwischen den beiden Teilclustern, sodass E das Cluster in seine beiden Teilcluster auftrennt. Im Idealfall enthielt nun jedes Teilcluster alle Lokalisierungen von je einem Farbstoffmolekül. Der Abstand der Farbstoffmoleküle wurde nun aus dem Abstand der Schwerpunkte der beiden Teilcluster bestimmt.
Ergebnis
Die Rocket DNA-Origami Alex A 647 Farbstoff ist schematisch in der 1a dargestellt. In den 1b bis d sind die Punktwolken für die Lokalisierung der Farbstoffe am oberen und unteren Ende der Rocket sowie ihre Projektion in XY-, XZ- und YZ-Ebene dargestellt. Einige der Rocket DNA-Origami waren im Wesentlichen vertikal während andere horizontal oder in einem Winkel zwischen 0 und 90° angeordnet waren. Um die Orientierung und die Länge der DNA-Origami zu berechnen wurde die Z-Komponente dahingehend korrigiert, dass der Berechnungsindex korrigiert wurde, der sich aus dem Unterschied zwischen dem Deckglas und dem Puffer ergibt. Dieser wurde experimentell mit 0,61 bestimmt (s. 2). Die Rocket DNA-Origami Strukturen zeigten eine Längenverteilung mit einer durchschnittlichen Länge von 180 +/- 12 Nanometer. Der vorbestimmte Abstand zwischen den beiden Farbstoffen lag bei 200 Nanometer. Es gab auch keinen Unterschied in den Abständen zwischen stehenden und liegenden Rocket DNA-Origami was die Lokalisierungsgenauigkeit, Photonenzahl und Anzahl der Lokalisierungen betrifft. Die Verteilung der räumlichen Orientierung der einzelnen DNA-Origamis sind in der 1f dargestellt.
Deutlich ist aus der 1e die Eignung der erfindungsgemäßen Kalibrierproben zur Kalibrierung von Messeinrichtungen zu erkennen. Dieses wird insbesondere auch aus den 1b, 1c und 1d deutlich, die darlegen, dass in allen drei Richtungen auf allen drei Ebenen eine entsprechende Bestimmung erfolgen kann. Somit wird deutlich, dass die vorliegenden Kalibrierproben eine einfache Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung erlaubt.

1. Huang, B., Wang, W., Bates, M. & Zhuang, X. Three-dimensional superresolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science 319, 810-813 (2008).
2. Juette, M.F. et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature methods 5, 527-529 (2008).
3. Cordes, T. et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano letters 10, 645-651 (2010).
4. Thompson, M.A., Casolari, J.M., Badieirostami, M., Brown, P.O. & Moerner, W.E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 17864-17871 (2010).
5. Wei, B., Dai, M. & Yin, P. Complex shapes self-assembled from singlestranded DNA tiles. Nature 485, 623-626 (2012).
6. Castro, C.E. et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature methods 8, 221-229 (2011).
7. Piestert, O. et al. A Single-Molecule Sensitive DNA Hairpin System Based on Intramolecular Electron Transfer. Nano letters 3, 979-982 (2003).
8. Heilemann, M., Margeat, E., Kasper, R., Sauer, M. & Tinnefeld, P. Carbocyanine Dyes as Efficient Reversible Single-Molecule Optical Switch. Journal of the American Chemical Society 127, 3801-3806 (2005).

Claims

Verwendung einer Kalibrierprobe von Strukturen auf Basis von DNA-Origami, die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen, und wobei die DNA-Origami immobilisiert vorliegen, wobei die Markermoleküle Fluorophore sind zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung.
Verwendung einer Kalibrierprobe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Origami weiterhin Elemente zur Bindung dieser DNA-Origami an einem Träger aufweisen, bevorzugt angeordnet an nur einem Ende der Struktur, wobei diese Elemente zur Bindung an einem Träger bevorzugt Biotin sind.
Verwendung einer Kalibrierprobe nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Origami Fluorophore als Markermoleküle mit unterschiedlichen Emissionsspektren an vorbestimmten Positionen aufweisen.
Verwendung einer Kalibrierprobe nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Strukturen auf Basis von DNA-Origami eine dreidimensionale Struktur ist, bevorzugteine Tetraeder-Struktur oder eine Struktur mit zentraler Helix-Bundle und einer Basis mit kürzeren Helix-Bundle Strukturen.
Verwendung einer Kalibrierprobe nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung eines Fluoreszenzmikroskops für die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie.
Verwendung einer Kalibrierprobe nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese als interne Kalibrierproben in einer zu analysierenden Probe vorliegt.
Verfahren zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kalibrierung eine Kalibrierprobe definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7 zur Kalibrierung eines Fluoreszenzmikroskops, insbesondere zur superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei die dreidimensionale Auflösung < 200 nm, insbesondere < 100 nm ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluorophore in der Kalibrierungsprobe an den vorbestimmten Positionen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10 mit den Schritten: - Bereitstellen einer Kalibrierprobe definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4, - Messen der Kalibrierprobe unter vorbestimmten Bedingungen, insbesondere Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit unter vorbestimmten Anregungsleistungen zur Anregung der Markermoleküle in Form von Fluorophoren unter Berücksichtigung der räumlichen Orientierung der Markermoleküle zueinander, mit geeigneten Sensoren, - Kalibrieren der Messeinrichtung auf Basis der Messung der Kalibrierprobe unter vorbestimmten Bedingungen, insbesondere Messung der emittierten Photonen pro Zeiteinheit mit einem Sensor, bevorzugt mit Hilfe einer Rechnereinheit.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 7 bis 11, wobei die Kalibrierprobe in einer analysierenden Probe als interne Kalibrierprobe vorliegt.
Computerprogramm mit Programmcodemitteln eingerichtet zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wenn das Computerprogramm auf einer Rechnereinheit durchgeführt wird.
Kalibrierprobe zur Kalibrierung der dreidimensionalen Auflösung einer Messeinrich- tung mit Strukturen auf Basis von DNA-Origami, die mindestens zwei Markermoleküle an vorbestimmten Positionen, die voneinander beabstandet sind, in dem DNA-Origami aufweisen, und wobei die Markermoleküle Fluorophore sind und wobei die DNA-Origami immobilisiert und in einem Einbettmedium fixiert vorliegen.
Kalibrierprobe nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Markermoleküle Fluorophore sind, wobei die Fluorophore als Markermoleküle mit unterschiedlichen Emissionsspektren an vorbestimmten Positionen vorliegen.