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Stand der Technik
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Makromoleküle von therapeutischem Interesse sind in ihrer oralen Bioverfügbarkeit stark limitiert. Neben Peptiden und Proteinen betrifft dies auch eine Reihe von Polysacchariden und Nukleinsäuresequenzen. Aufgrund ihrer Molekülgröße und starken anionischen Ladung werden diese sehr schlecht resorbiert.
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Um dieses Problem zu lösen sind verschiedene Arzneistoffträger vorgeschlagen worden. Dabei kommt bisher der Anwesenheit eines kationischen Hilfsstoffes eine sehr große Bedeutung zu. Dieser erlaubt dem Stand der Technik folgend die Komplexierung des polyanionischen Wirkstoffes, wie Polysaccharide oder Nukleinsäuren, und führt zu einer Verringerung der anionischen Gesamtladung des Systems nach außen hin. Außerdem kann das so komplexierte Molekül kleiner im Gesamtdurchmesser werden als seine freie Form. Häufig haben solche kationischen Hilfsstoffe aber ein hohes toxisches Potential, z. B. die weit verbreiteten Moleküle Poly-lysin und Poly-ethylenimin, und sind zur dauerhaften Verwendung am Menschen nicht geeignet. Chitosan, ein häufig vorgeschlagenes polykationischen Polymer in diesem Zusammenhang birgt den großen Nachteil, dass es nicht permanent positiv geladen ist und im Laufe der Gastrointestinalpassage vom polyanionischen Wirkstoff dissoziiert, sodass die Anwendung kaum besser ist als die Wirkstofflösung allein.
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Alternativen sind sogenannte ”self-micro emulsifying drug delivery systems (SMEDDS)”, die für die orale Gabe von schwer bioverfügbar Arzneistoffen verwendet werden, vor allem, wenn sie lipophile Eigenschaften besitzen, wie z. B. in
WO 1995/008983 und
US 6309665 beschrieben. Allerdings haben diese den Nachteil, dass eine ausgesprochen hohe Emulgator-Konzentration (30–60%) enthalten ist, was ebenfalls ein hohes toxisches Potenzial birgt und eine langfristige Anwendung ausschließt. Darüber hinaus sind sie chemisch instabil, womit eine längere Lagerzeit und damit eine kommerzielle Vermarktung ausgeschlossen werden kann.
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Außerdem werden die kommerziell für Retardarzneiformen verwendeten Poly-aminomethacrylate erwähnt. Diese Polymergruppe, teilweise kommerzialisiert unter dem Namen Eudragit® (RS/RL) zeigt besondere Eigenschaften in Hinblick auf Bioadhesion an der gastrointestinalen Mukosa und ist daher besonders geeignet, um die orale Bioverfügbarkeit von Makromolekülen zu verbessern [Lamprecht et al., Nanotechnology 17 (2006) 3673–3680].
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WO 02/03960A1 beschreibt die Verkapselung von Heparinen in Mikro- und Nanopartikel mittels einer multiplen Emulsionsmethode unter Verwendung von oben genanntem Eudragit in Kombination mit mindestens einem weiteren bioabbaubaren Polymer in organischen Lösungsmittels, insbesondere Dichlormethan und Ethylacetat. Die verwendeten Lösungsmittel sind toxikologisch bedenklich und müssen daher nach der Herstellung aufwendig aus der Formulierung entfernt werden. Außerdem zeigt diese vorgenannte Formulierung eine Instabilität bei der Lagerung, wobei Desulfatisierung des Heparins durch die Kombination Polymer und Restlösungsmittel postuliert wird.
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Die Aufgabe der Erfindung ist also die Arzneizubereitung von Polysacchariden, insbesondere Heparin und Heparinderivaten, in einer Arzneiformulierung, dass eine orale Bioverfügbarkeit dieser Polysaccharide ermöglicht. Dabei muss eine ausreichende Stabilität des Polysaccharids gewährleistet sein, so dass die Verwendung von typischen pharmazeutischen organischen Lösungsmitteln vermieden werden muss.
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Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft Formulierungen, die mittels untoxischer Lösungsmittel, insbesondere Polyethylenglykolen oder seine Derivate hergestellt werden.
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Polyethylenglykole werden dabei im Sinne des allgemein gültigen chemischen Begriffes verstanden und sind im Sinne der Erfindung auf die Verbindungen eingegrenzt, die rein oder als Mischung bei 50°C oder darunter flüssig vorliegen.
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Als Polysaccharide werden Substanzen im Sinne des allgemein gültigen chemischen Begriffes verstanden, die hier zur Erzielung einer pharmakologischen Wirkung, eingesetzt werden. Ein sehr bekanntes Beispiel sind hierfür die Heparine.
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Die Formulierung umfasst mindestens einen Hilfsstoff, der bevorzugterweise ein polykationisches Polymer ist und der mit dem Polysaccharid eine Formeinheit bildet. Dabei kann sich je nach Wahl der Parameter im Herstellungsverfahren ein festes partikuläres System oder eine Hydrogel-Struktur bilden. Insbesondere zeichnet sich die Erfindung dadurch aus, dass keine innere wäßrige Phase notwendig ist, die mittels einer Emulsion die Einarbeitung des Wirkstoffes erlaubt. Der Größenbereich betrifft Formulierungen von 1 nm bis 1000 μm. Desweiteren können Tenside zum Einsatz kommen, um die Partikelgröße besser kontrollieren zu können. Außerdem können weitere Hilfsstoffe in der Formulierung zur Anwendung kommen, beispielsweise Absorptionsverbesserer, Stabilisatoren und andere pharmazeutische Hilfsstoffe, die erhöhte Wirkstoffstabilität in der Matrix oder verbesserte Bioverfügbarkeit zum Ziel haben.
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Diese Formulierungen erzielen nach oraler Gabe eine Erhöhung der relativen Bioverfügbarkeit. Die relative Bioverfügbarkeit hängt von den Wirkstoffeigenschaften ab und liegt bei niedermolekularen Heparinen (NMH) zwischen 0,1 und 30%, vorzugsweise zwischen 0,2 und 10% im Vergleich zur subkutanen Gabe der Heparin-Lösung.
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Die Herstellung der vorgenannten Formulierungen basiert auf der Verwendung von mindestens einem Polyethylenglykol oder einem Derivat von Polyethylenglykol, wobei sich insbesondere Glykofurol als vorteilhaft erwiesen hat.
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Es wurde gefunden, dass die Verwendung eines toxischen Lösungsmittels für die Herstellung von Arzneistoffträgern in Mikro- und Nanometerbereich nicht weiter nötig ist, da Polyethylenglykole und ihre Derivate, insbesondere Glykofurol, als untoxisch einzustufen sind und somit nicht vor Anwendung aus der Formulierung entfernt werden müssen, sondern in der Formulierung enthalten bleiben können.
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In der Literatur werden zurzeit nur organische Lösungsmittel als Polymer-Lösungsmittel erwähnt, wie Aceton, Tetrahydrofuran oder Ethanol. Bisher beschriebene Lösungsmittel für die Partikelherstellung werden in Klasse 2 (nur begrenzt verwendbar) oder Klasse 3 (geringes toxisches Potential) der ICH (International Conference of Harmonisation) Toxizitätsskala für Lösungsmittel eingestuft und müssen vor Anwendung aus der Formulierung entfernt werden.
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Des Weiteren hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass Polyethylenglykole und ihre Derivate, vorzugsweise Glykofurol, auch Polymer lösende Eigenschaften besitzen, besonders von polykationischen Polymeren wie Poly-amino methacrylaten (wie z. B. Eudragit® RS und RL) und Polymilchsäuren (PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid)). Ein weiterer Vorteil dieser Lösungsmittel stellt ihre Mischbarkeit mit Wasser dar, was die Diffusion innerhalb von physiologischem Milieu erleichtert.
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Ein Merkmal der Herstellungsmethode der Arzneiformulierung ist die Mischbarkeit des Polymer-Lösungsmittels mit einer äußeren wäßrigen Phase. Die Partikelbildung erfolgt hier durch den Marangoni-Effekt, der an der Grenzfläche zwischen Polymer-Lösungsmittel und wässriger Phase auftritt und für eine schnelle Löslichlichkeitsverminderung des Polymers sorgt, wodurch partikuläre Arzneistoffträger entstehen.
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Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung partikuläre Arzneistoffträger, die durch Desolvatisierung der Mischung aus Polysaccharid-Wirkstoff und Hilfsstoffes hergestellt wurden. Durch den Gebrauch von Polyethylenglykolen oder ihren Derivaten, wie besonders Glykofurol, Lösungsmittel wird der ansonsten mindestens zweistufige Prozess zu einer Einschrittmethode optimiert, da die genannten Lösungsmittel als untoxisch eingestuft werden und in der Formulierung erhalten bleiben können. Diese Einschrittmethode benötigt zur Herstellung von Nanopartikeln lediglich einen Rührschritt, ohne den Gebrauch von Wärme oder Vakuum-Rotationsverdampfung. Vorteilhaft gemäß der Erfindung ist die hohe Beladungsrate. Im Gegensatz zu den aus der Literatur bekannten Verkapselungsmethoden, wo je 30 bis 50% des eingesetzten Wirkstoffs bei der Herstellung verloren gehen, kann bei dieser Formulierung deutlich mehr als 70% des eingesetzten Wirkstoffs eingearbeitet werden, vorzugsweise über 90%.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich gezeigt, dass die Optimierung des Prozesses zu einer Einschrittmethode, diesen besonders geeignet macht für die Formulierung von instabilen Arzneistoffen, da der Gebrauch von organischen, toxischen Lösungsmitteln, sowie Wärme und/oder Vakkum-Rotationsverdampfung zur Inaktivierung dieser Arzneistoffe führen kann.
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Zur Herstellung der vorliegenden Erfindung wird das kationische Polymer, beispielsweise Eudragit® RS oder RL, in dem untoxischen Lösungsmittel, wie Polyethylenglykol gelöst. Der Wirkstoff wird anschließend mit der Polymerphase unter Rühren gemischt. Die Methode eignet sich für therapeutische Polysaccharide, insbesondere Heparine, für Nukleinsäuresequenzen und deren Derivate, aber auch andere natürliche und synthetische mehrfach anionisch geladene Wirkstoffe, besipielsweise Biphosphonate. Die Menge an eingesetztem Wirkstoff wird entsprechend der therapeutisch relevanten Dosis gewählt. Für die hier verwendeten NMHs waren der Dosisbereich von 100 lU/kg bis 1200 lU/kg vorteilhaft. Der gelösten Polymerphase wird eine wässrige, äußere Phase zugesetzt. Auch die Zugabe der Polymerphase in die wäßrige Phase führt zu einer einsetzbaren Formulierung. Der äußeren Phase kann ein Emulgator zugesetzt werden, wobei alle pharmazeutisch relevanten Emulgatoren verwendet werden können. Vorzugsweise sind Polysorbate zu erwähnen, insbesondere Polysorbat 20 und 80. Üblicherweise werden diese in niedrigen Konzentrationen verwendet, insbesondere im Bereich von 0,001% bis 0,1%. Die entsprechende wässrige Phase wird mittels einer HPLC-Pumpe der gelösten Polymerphase tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Als weitere Zuführungsarten können auch andere Methoden gewählt werden, insbesondere sind die Verwendung von Spritze, Pipette oder Bürette geeignet. Auch die Verwendung eines Mikromischers oder andere Arten von statischen Mischern sind hierfür einsetzbar.
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Erfindungsgemäß kann auch die Polymerphase, also Wirkstoff, Polymer und Lösungsmittel so formuliert werden, dass diese in-vitro oder in-vivo einer Wasserzufuhr unterliegt und dadurch in die oben beschriebene Formulierung überführt wird. Ein Einsatz von weiteren Hilfsstoffen führt hierbei zur notwendigen Dispersität der Formulierung.
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Als alternative Ausführungsart der Erfindung kann auch der Wirkstoff separat vor der Hilfsstoffformulierung appliziert werden. Dabei übt die wirkstofffreie Formulierung einen absorptionsverbessernden Effekt aus, wodurch der danach applizierte freie Wirkstoff ebenfalls ausreichend oral bioverfügbar wird. Wichtig dabei ist die geringe Größe der Hilfsstoffformulierung, die im Mikrometerbereich liegen muss oder darunter.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
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Beispiel 1–4
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Die Herstellung der Formulierung wird mit den verschiedenen flüssigen Polyethylenglykolen PEG 200, PEG 300, PEG 400 und Glykofurol durchgeführt. In diesen wird Eudragit® RL (ERL) gelöst (Tabelle 1). Heparin, vorzugsweise, wird unter Rühren (300 UpM) der gelösten Polymerphase hinzugegeben und 0,01% Polysorbat 20 als wässrige Phase mittels einer HPLC-Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min zugetropft. Danach ist die Formulierung applizierbar.
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Beispiel 1 enthält Glycofurol als Lösungsmittel.
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Beispiel 2 enthält PEG200 als Lösungsmittel.
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Beispiel 3 enthält PEG300 als Lösungsmittel.
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Beispiel 4 enthält PEG400 als Lösungsmittel. Tabelle 1: Zusammensetzung der Hilfsstoffe bei der Herstellung der Formulierung am Beispiel des Wirkstoffs Heparin
| Substanz | Gehalt |
| Eudragit® RL oder
Eudragit® RS | 100 mg |
| PEG 200,
PEG 300,
PEG 400,
Glykofurol | 1 ml |
| Heparin-Lösung
(10.000 lU/ml) | 1 ml |
| 0,01% Polysorbat 20 | 4 ml |
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Die entstandenen Formulierungen wurden auf Partikelgröße und auf Verkapselungsrate analysiert (Tabelle 2). Tabelle 2: Partikelgröße (d 50) und Verkapselungsrate der Formulierung hergestellt mit wahlweise PEG oder Glykofurol und Eudragit
® RL (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3)
| Formulierung | Partikelgröße
(d 50)
[μm] | Verkapselungsrate
[%] |
| ERL/Glycofurol | 35,3 ± 0,4 | 99,6 ± 5,4 |
| ERL/PEG200 | 38,9 ± 0,3 | 95,7 ± 3,3 |
| ERL/PEG300 | 35,6 ± 1,3 | 100,2 ± 1,3 |
| ERL/PEG400 | 41,1 ± 1,2 | 99,4 ± 4,4 |
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Die Freisetzung der vier verschiedenen Heparin-Formulierungen wurde bei pH 7,4 im Wasserschüttelbad bei 75 UpM durchgeführt. Hierbei wurden jeweils 50 μl der Heparin-Formulierung in einen Erlenmeyerkolben mit 50 ml Phosphatpuffer (nach USP 32) überführt. Zu vorgebebenen Zeiten wurden je 1 ml Proben entnommen und das entnommene Volumen wurde mit frischem Puffer wieder aufgefüllt. Die Proben wurden 10 Minuten bei 18.000 g zentrifugiert und der klare Überstand nephelometrisch auf den Heparingehalt analysiert. Bereits nach 30 Minuten wurde eine 100%ige Freisetzung aller Formulierungen erreicht. (Tabelle 3) Tabelle 3: Prozentuale Freisetzung von Heparin nach 0,25; 0,5 und 2 h hergestellt mit wahlweise Glykofurol oder PEG hergestellten Eudragit
® RL Formulierungen (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3)
| Formulierung | Zeit
[h] | Freisetzung
[%] |
| ERL/Glycofurol | 0,25
0,5
2 | 79,2 ± 1,6
100,8 ± 5,0
100,7 ± 1,3 |
| ERL/PEG200 | 0,25
0,5
2 | 79,2 ± 8,3
100,5 ± 1,3
100,1 ± 1,0 |
| ERL/PEG300 | 0,25
0,5
2 | 71.3 ± 3,4
100,0 ± 1,4
100,7 ± 1,6 |
| ERL/PEG400 | 0,25
0,5
2 | 78,9 ± 3,0
100,1 ± 1,6
100,4 ± 0,6 |
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Beispiel 5–8
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Die Herstellung der Formulierung wird mit den verschiedenen flüssigen Polyethylenglykolen PEG 200, PEG 300, PEG 400 und Glykofurol durchgeführt. In diesen wird Eudragit® RS (ERS) gelöst (Tabelle 1). Heparin, vorzugsweise, wird unter Rühren (300 UpM) der gelösten Polymerphase hinzugegeben und 0,01% Polysorbat 20 als wässrige Phase mittels einer HPLC-Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min zugetropft. Danach ist die Formulierung applizierbar.
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Beispiel 5 enthält Glykofurol als Lösungsmittel.
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Beispiel 6 enthält PEG200 als Lösungsmittel.
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Beispiel 7 enthält PEG300 als Lösungsmittel.
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Beispiel 8 enthält PEG400 als Lösungsmittel.
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Die entstandenen Formulierungen wurden auf Partikelgröße und auf Verkapselungsrate analysiert (Tabelle 4). Tabelle 4: Partikelgröße (d 50) und Verkapselungsrate der Formulierung hergestellt mit wahlweise PEG oder Glykofurol und Eudragit
® RS; (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3)
| Formulierung | Partikelgröße
(d 50)
[μm] | Verkapselungsrate
[%] |
| ERS/Glycofurol | 37,8 ± 0,4 | 98,7 ± 3,1 |
| ERS/PEG200 | 34,8 ± 0,7 | 99,5 ± 1,1 |
| ERS/PEG300 | 43,7 ± 1,2 | 98,7 ± 4,1 |
| ERS/PEG400 | 39,4 ± 0,7 | 95,1 ± 4,4 |
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Die Freisetzung der vier verschiedenen Formulierungen wurde bei pH 7,4 im Wasserschüttelbad bei 75 UpM durchgeführt. Hierbei wurden jeweils 50 μl der Heparin-Formulierung in einen Erlenmeyerkolben mit 50 ml Phosphatpuffer (nach USP 32) überführt. Zu vorgebebenen Zeiten wurden je 1 ml Proben entnommen und das entnommene Volumen wurde mit frischem Puffer wieder aufgefüllt. Die Proben wurden 10 Minuten bei 18.000 g zentrifugiert und der klare Überstand nephelometrisch analysiert. Bereits nach 30 Minuten wurde eine 100%ige Freisetzung aller Formulierungen erreicht. (Tabelle 5) Tabelle 5: Prozentuale Freisetzung von Heparin nach 0,25; 0,5 und 2 h hergestellt mit wahlweise Glykofurol oder PEG hergestellten Eudragit
® RS Formulierungen (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3)
| Formulierung | Zeit
[h] | Freisetzung
[%] |
| ERS/Glycofurol | 0,25
0,5
2 | 72,1 ± 5,5
100,4 ± 2,2
100,5 ± 4,8 |
| ERS/PEG200 | 0,25
0,5
2 | 74,2 ± 4,3
100,3 ± 1,8
99,5 ± 3,4 |
| ERS/PEG300 | 0,25
0,5
2 | 74,2 ± 5,8
101,2 ± 0,8
101,4 ± 0,6 |
| ERS/PEG400 | 0,25
0,5
2 | 68,7 ± 3,7
99,6 ± 1,6
100,8 ± 2,9 |
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Beispiel 9
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Alle acht verschiedenen Formulierungen, die bereits in den oberen Kapiteln beschrieben wurden, wurden in vivo getestet. Zur Überprüfung der oralen Bioverfügbarkeit des Wirkstoffes in Beispiel 1 bis 8, wurden die Formulierungen weißen Neuseeländer Kaninchen (3,7–5,2 kg) verabreicht. Jede Formulierung wurde an einer Gruppe, die aus vier Kaninchen bestand, getestet. Die orale Verabreichung der Formulierung wurde mittels einer Sonde durchgeführt und zu den vorgegebenen Zeiten wurden Blutproben aus der Ohrvene entnommen. Die systemische Verfügbarkeit von Heparin wurde anhand der Faktor 10a-Aktivität im Plasma bestimmt.
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Alle acht Formulierungen zeigten einen Effekt eine Stunde nach Verabreichung ( + ). Die ERL/Glycofurol-Formulierung ( ) als auch die ERS/PEG200-Formulierung ( ) wiesen die höchsten oralen Bioverfügbarkeiten auf (Tabelle 6).
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Die ERL/Glycofurol-Formulierung als auch die ERS/PEG200-Formulierung wurden daraufhin auf Lagerstabilität analysiert. Beide Formulierungen wurden nach Herstellung einen Monat gelagert und verabreicht. Beide Formulierungen zeigten vergleichbare Heparin-Blutkonzentration zu den frisch hergestellten Formulierungen. Heparin bleibt demnach auch ein Monat nach Lagerung stabil und es findet kein Zersetzungsprozess statt (Tabelle 7). Tabelle 6: AUCs und Bioverfügbarkeiten der verschiedenen acht Formulierungen (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 4)
| Formulierung | NMH Dosis
[lU/kg] | AUC
(0–6 h)
[mg·h/l] | F
(0–6 h)
[%] |
| ERL/Glycofurol | 600 | 0,37 ± 0,08 | 7,6 ± 1,5 |
| ERL/PEG200 | 600 | 0,01 ± 0,05 | 0,3 ± 1,1 |
| ERL/PEG300 | 600 | 0,13 ± 0,17 | 2,7 ± 3,4 |
| ERL/PEG400 | 600 | 0,03 ± 0,09 | 0,6 ± 1,8 |
| ERS/Glycofurol | 600 | 0,11 ± 0,16 | 2,3 ± 3,2 |
| ERS/PEG200 | 600 | 0,35 ± 0,15 | 7,3 ± 3,1 |
| ERS/PEG300 | 600 | 0,10 ± 0,18 | 2,0 ± 3,7 |
| ERS/PEG400 | 600 | 0,04 ± 0,08 | 0,9 ± 1,6 |
Tabelle 7: AUCs und Bioverfügbarkeiten der Stabilitätsuntersuchungen mit ERL/Glycofurol und ERS/PEG200-Formulierungen (Mittelwert ± Standardabweichung)
| Formulierung | NMH Dosis
[lU/kg] | AUC
(0–6 h)
[mg·h/l] | F
(0–6 h)
[%] |
| ERL/Glyco MPs | 600 | 0,37 ± 0,08 | 7,6 ± 1,5 |
| ERL/Glyco MPs stability 1 month | 600 | 0,27 ± 0,07 | 5,6 ± 1,5 |
| | | | |
| ERS/P200 MPs | 600 | 0,35 ± 0,15 | 7,3 ± 3,1 |
| ERS/P200 MPs stability 1 month | 600 | 0,40 ± 0,31 | 8,3 ± 6,4 |
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 1995/008983 [0003]
- US 6309665 [0003]
- WO 02/03960 A1 [0005]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Lamprecht et al., Nanotechnology 17 (2006) 3673–3680 [0004]
