DE102012004736A1

DE102012004736A1 - 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate und deren Verwendung als antivirale Wirkstoffe

Info

Publication number: DE102012004736A1
Application number: DE201210004736
Authority: DE
Inventors: Peter Wutzler; Michaela Schmidtke; Vadim Makarov
Original assignee: Dritte Patentportfolio Beteiligungs GmbH and Co KG
Current assignee: Dritte Patentportfolio Beteiligungs GmbH and Co KG
Priority date: 2011-10-20
Filing date: 2012-03-08
Publication date: 2013-04-25

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate der allgemeinen Formel Ioder pharmazeutisch akzeptable Salze oder Propharmaka davon, wobei mindestens ein Wasserstoffatom in zumindest einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten RH ersetzt ist, der eine Hammet-Konstante σp von > 0,23 aufweist. Für solche Verbindungen konnte eine überraschend hohe Aktivität gegen ein breites Spektrum von Picorna-Viren, wie insbesondere Rhinoviren und Coxsackieviren, festgestellt werden. Zudem eignen sich die Verbindungen durch den zusätzlichen Vorteil ihrer geringen Toxizität vorteilhaft für die Behandlung entsprechender Virusinfektionen. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zur Herstellung solcher Derivate sowie Verfahren zur Herstellung von für diese Derivate wichtigen Zwischenprodukten.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate und deren Verwendung als antivirale Wirkstoffe, vorzugsweise zur Behandlung von Picornavirusinfektionen.
Picornaviren, insbesondere Entero- und Rhinoviren, sind für ein breites Spektrum von Erkrankungen beim Menschen verantwortlich. Zu den Enteroviren gehören mehr als 60 verschiedene humanpathogene Serotypen (Melnick J in: Fields B et al., editors. Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers; 1996, 655–712). Enterovirus-, Echovirus-, Coxsackievirus A- und B-Infektionen verlaufen oftmals mit unspezifischem Fieber und rufen Erkrankungen des oberen Respirationstraktes hervor, die sich häufig nicht von Rhinovirusinfektionen unterscheiden lassen. Zu den schwereren Krankheitsbildern, die auch epidemisch auftreten können, gehören die hämorrhagische Konjunktivitis, Herpangina, Hand-Fuß-Mund-Krankheit, aseptische Meningitis, Enzephalitis und akute Myokarditis. Dabei können verschiedene Virustypen gleiche Symptome bzw. ein Virustyp ganz unterschiedliche Krankheitsbilder herbeiführen. Mit der Einführung moderner und sensitiver Methoden in die Virusdiagnostik gelang der Nachweis persistierender enteroviraler RNA sowie von Virusproteinen im Zusammenhang mit chronischen Erkrankungen wie z. B. dem Typ II Diabetes, Poliomyositis und vor allem der chronischen Myokarditis. Persistierende Enterovirusinfektionen kommen auch bei Patienten mit Agammaglobulinämie vor und äußern sich hierbei als persistierende Enterovirus-Meningoenzephalitis. Als Begleiterscheinungen traten häufig eine Dermatomyositis oder Polymyositis auf. Zu den Rhinoviren gehören ca. 100 Serotypen. Rhinovirusinfektionen verursachen mehr als die Hälfte aller respiratorischen Erkrankungen des oberen Respirationstraktes beim Menschen (Couch RB in: Fields BM et al., editors: Fields Virology, 3rd edition. Lippincott-Raven, Philadelphia, 1996, 713–35). Bei einer mittleren Krankheitsdauer von ca. 10 Tagen führen diese meist harmlos verlaufenden Erkältungen jährlich zu millionenfachen Arztbesuchen, Arbeits- und Schulausfällen. Als Komplikationen können eine Otitis media, Sinusitis, Exazerbation von Asthma und zystischer Fibrose sowie Infekte des unteren Respirationstraktes vor allem bei Kleinkindern, älteren Patienten und immunsupprimierten Patienten auftreten. Auf Grund der Typenvielfalt ist eine Impfprophylaxe zurzeit nicht möglich. Bedingt durch die mit diesen Erkrankungen verbundenen Arbeitsausfälle, Arztbesuche und Medikamente verursachen Rhino- und Enteroviren jährlich enorme Kosten. Die Behandlung dieser Virusinfektionen erfolgt bisher symptombezogen, da keine virusspezifischen Therapeutika zur Verfügung stehen (Rotbart HA: Antiviral Res 2002, 53(2), 83–98). Zudem werden häufig unnütz Antibiotika verordnet. Die Entwicklung von neuen Virustatika ist deshalb unbedingt notwendig.
Die Ergebnisse der intensiven Suche nach Behandlungsmöglichkeiten von Enterovirus- und Rhinovirus-Infektionen wurden von Rotbart 2002 in einem Übersichtsartikel zusammengefasst (Rotbart HA: Antiviral Res 2002, 53(2), 83–98). Beispielsweise hemmt Ribavirin ein Wirtszellenzym, die Inosin 5'-Monophosphat(IMP)-Dehydrogenase. Durch die Ausschaltung dieses Schlüsselenzymes für die Synthese von Purinnukleotiden, lässt sich die Replikation von Picornaviren in vitro und in vivo hemmen. Ribavirin soll außerdem direkt in das Genom von Polioviren eingebaut werden und dadurch zusätzlich als Mutagen für RNA-Viren wirken (Crotty S et al.: Nat Med, 2000, 6(12),1375–9). Wegen starker Nebenwirkungen werden diese Verbindungen nicht zur Behandlung von Rhino- und Enterovirusinfektionen eingesetzt. Spezifische Targets zur Hemmung der viralen RNA-Synthese stellen das Genom an sich, die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase sowie weitere für den Replikationskomplex notwendige virale Proteine dar. Guanidine, Thiosemicarbazone, Benzimidazole, Dipyridamole und Flavone sind seit langem als Inhibitoren der Polymerasen von verschiedenen Picornaviren in der Zellkultur bekannt. Sehr unterschiedliche Erfolge wurden damit in vivo erzielt. Ale aussichtsreichster Kandidat mit breiter anti-Enterovirus- und anti-Rhinovirus-Aktivität gelten Enviroximderivate.
Enviroxim verhindert die Synthese von Plusstrang RNA durch Bindung an das Virusprotein 3A, welches zur Bildung von RNA- Intermediaten bei der Virusvermehrung notwendig ist (Heinz BA und Vance LM: J Virol, 1995, 69(7), 4189–97). In klinischen Studien wurden moderate oder keine therapeutische Wirkungen, eine schlechte Pharmakokinetik und unerwünschte Nebenwirkungen festgestellt (Miller FD et al.: Antimicrob Agents Chemother, 1985, 27(1), 102–6). Von neueren Derivaten mit besserer Bioverfügbarkeit und Verträglichkeit liegen bisher keine klinischen Daten vor.
Basierend auf dem Wissen der Feinstruktur und Funktion der viralen Protease 2C wurde der Proteaseinhibitor AG 7088 entwickelt. AG 7088 wirkt in der Zellkultur im nanomolaren Konzentrationsbereich gegen 48 Rhinovirustypen sowie Coxsackievirus A21, 63, Enterovirus 70 und Echovirus 11 (Pattick AK et al.: Antimicrobila Agents Chemother, 1999, 43(10), 2444–50). Bisher sind die abschließenden Daten der klinischen Studien nicht bekannt.
Mit der Aufklärung der molekularen Struktur der viralen Kapside wurden die Voraussetzungen für ein zielgerichtetes Design von Kapsidblockern, den ”WIN-Substanzen”, geschaffen (Diana GD: Curr Med Chem 2003, 2, 1–12). Sie verhindern die Adsorption und/oder das Uncoating von Rhino- und Enteroviren. Einige der WIN-Substanzen wirken hochspezifisch nur gegen einzelne Gattungen oder Virustypen der Picornaviren. Andere Derivate hemmen die Vermehrung von Rhino- als auch Enteroviren. Zu den WIN-Substanzen gehören z. B. Arildone, Disoxaril und Pirodavir. Diese Verbindungen zeigten sehr gute antivirale Wirkungen in der Zellkultur. Eine schlechte Löslichkeit (Arildone), niedrige Bioverfügbarkeit (Arildone und Disoxaril), schnelle Metabolisierung und Ausscheidung (Disoxaril und WIN 54954) sowie Nebenwirkungen, wie beispielsweise Hautausschlag (WIN 54954), machten eine klinische Anwendung unmöglich. Große Hoffnungen wurden auf Pleconaril, einen weiteren Kapsidblocker, gesetzt. Pleconaril besitzt eine sehr gute orale Bioverfügbarkeit und hemmt nach seiner Bindung in die hydrophobe Tasche im Viruskapsid die Penetration von Rhino-, Echo- und Coxsackieviren (Pevear DC et al.: Antimicrob Agents Chemother 1999, 43(9), 2109–15; McKinlay MA et al.: Annu Rev Microbiol 1992, 46, 635–54). Dadurch ist es potenziell wirksam gegen ein breites Spektrum von Viruserkrankungen, von der gewöhnlichen Erkältung bis hin zur viralen Meningitis oder Myokarditis. Resistenzen wurden bei Rhinoviren, Enterovirus 71 und Coxsackievirus B3 beobachtet (Ledford RM et al.: J Virol 2004, 78(7), 3663–74; Groarke JM et al.: J Infect Dis 1999, 179(6), 1538–41). Klinische Studien bei Kindern und Erwachsenen mit einer Enterovirusmeningitis (Abzug MJ et al.: Pediatr Infect Dis J, 2003, 22, 335–41) sowie Rhinovirus-verursachten respiratorischen Infektionen (Hayden FG et al.: Antivir Ther, 2002, 7, 53–65; Hayden FG et al.: Clin Infect Dis, 2003, 36, 1523–32) verliefen positiv. Die nachgewiesene therapeutische Wirkung reichte jedoch nicht für die Zulassung von Pleconaril (Picovir, Viropharma, USA) zur Behandlung von Rhinovirusinfektionen in den USA. Im März 2002 wurde ein entsprechender Antrag von der Nahrungs- und Arzneimittel-Behörde (Fond and Drug Administration: FDA) wegen einer ungünstigen Nutzen-Risiko-Bewertung abgelehnt.
Es sind auch Pyrazolopyrimidine als CRF-Antagonisten (Corticotropin-Releasing Factor Antagonisten) beschrieben (z. B. EP 674 642 und EP 691 128 ), welche beispielsweise die Adenosinkinase ( EP 496 617 oder US 4,904,666 ), die Xanthinoxigenase (J. Heterocyc. Chem. 19, 1565, 1982) oder andere Enzymsysteme ( US 2,965,643 und US 3,600,389 ) hemmen.
Somit besteht weiterhin als eine dringliche Aufgabe der antiviralen Forschung die Entwicklung hocheffektiver Virustatika zur Behandlung von Rhino- und Enteroviruserkrankungen. Die neuen Verbindungen sollten gut verträglich sein und existierende Resistenzen, z. B. gegenüber Pleconaril, überwinden.
WO 00/43394 A offenbart substituierte Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate und deren Verwendung als antivirale Wirkstoffe.
Auch EP 2 049 540 offenbart 4-Amino-3-arylamino-6-arylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Deriuate und deren Verwendung als antivirale Wirkstoffe.
Aufgabe der Erfindung ist es, weitere Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate sowie deren Herstellung und Verwendung anzugeben, welche als antivirale Wirkstoffe gegenüber Enteroviren und Rhinoviren einsetzbar sind sowie die angegebenen Nachteile des Standes der Technik zum Beispiel hinsichtlich Stabilität und Bioverfügbarkeit der Substanzen vermeiden.
Gelöst wird diese Aufgabe durch spezifisch substituierte 4-Amino-3-phenylami-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate der allgemeinen Formel I, einschließlich ihrer pharmazeutisch verträglichen Salzverbindungen und ihrer Pro-Pharmaka,
wobei zumindest ein Wasserstoffatom in zumindest einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten R^H ersetzt ist, der eine Hammett-Konstante σ_p größer als 0,23 aufweist,
wobei jedes weitere Wasserstoffatom in jeder der Phenylgruppen A und B unabhängig voneinander ersetzt sein kann durch einen Rest R¹, wobei

– jedes R¹ unabhängig ein Halogen, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1–7 Kettengliedern, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes alkanoles Radikal mit 1–8 Kettengliedern, NO₂, CN, CONR² ₂, COR², COOR², OR², SR², NR² ₂, SO₂NR² ₂, CX₃, CR²X₂, OCX₃, OCR²X₂, oder Phenyl sein kann;
– jedes R² unabhängig Wasserstoff, ein gesättigtes oder ungesättigtes, halogeniertes oder nicht halogeniertes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1–7 Kettengliedern, Benzyl, Phenyl oder Naphtyl, ein gesättigter oder ungesättigter, Mono- oder Polyheterozyklus mit den Heteroatomen N, S oder O ist, wobei jede der vorstehenden genannten Gruppen unabhängig mit Fluor, Chlor, Brom, Trifluormethyl, Alkyl, Alkoxy, Cyano, Nitro, Amino, Aminoalkyl, C(O)-Alkyl, C(O)O-Alkyl, Benzyl, Phenyl oder Naphtyl substituiert sein kann; und
– X unabhängig F, Cl, Br, oder I ist.

In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausführungen der spezifisch substituierten 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate sowie Anwendungsmöglichkeiten ausgeführt, ohne die Erfindung jeweils darauf zu beschränken.
Vorteilhaft sind 4-Amino-3-phenylamino-6-phenytpyrazol[3,4-d]pyrimidin-Derivate der allgemeinen Formel I, wobei zumindest ein Wasserstoffatom in zumindest einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten R^H ersetzt ist, ausgewählt aus NO₂, CN, CF₃, CCl₃, CBr₃, OCF₃, OCCl₃, OCBr₃, CHF₂, CHCl₂, CHBr₂, OCHCl₂, CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe oder COOEt, bevorzugt CF₃ oder OCF₃. Vorteilhaft sind in einer oder beiden Phenylgruppen A und B ein, zwei oder drei Wasserstoffatome durch einen Substituenten R^H ersetzt. In einer speziellen Ausführungsform ist genau ein Wasserstoffatom in einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten R^H ersetzt. Der Substituent R^H kann sich in para-Position des Phenylrings A oder B befinden.
Zusätzlich zu R^H kann jede der Phenylgruppen A und B unabhängig voneinander weitere Reste R¹ tragen. Vorzugsweise tragen die Phenylgruppen A und B unabhängig voneinander keinen, einen, zwei oder drei weitere Reste R¹, bevorzugt keinen oder einen weiteren Rest R¹
Als Alkyle kommen im Zusammenhang mit der Erfindung insbesondere lineare oder verzweigte C_1-7-Alkyle, zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl und Butyl infrage. Entsprechendes gilt für Alkanole, Alkylamine und Alkylamide im Zusammenhang mit der Erfindung.
Umfasst sind von der Erfindung insbesondere 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate der allgemeinen Formel II
wobei jeder Substituent R^A, R^B unabhängig Wasserstoff, ein Halogen, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1–7 Kettengliedern, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes alkanoles Radikal mit 1–8 Kettengliedern, NO₂, CN, CONR² ₂, COR², COOR², OR², SR², NR² ₂, SO₂NR² ₂, CX₃, CR²X₂, OCX₃, OCR²X₂, oder Phenyl sein kann; und R² und X wie oben definiert sind; wobei zumindest einer der Substituenten R^A, R^B eine Hammett-Konstante σ_p größer 0,23 aufweist.
Die Erfindung umfasst insbesondere 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate der allgemeinen Formel IIa
wobei R^H ausgewählt ist aus NO₂, CN, CF₃, CCl₃, CBr₃, OCF₃, OCCl₃, OCBr₃, CHF₂, CHCl₂, CHBr₂, OCHCl₂, CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe oder COOEt ist, bevorzugt CF₃ oder OCF₃.
Ebenfalls umfasst sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivat gemäß der allgemeinen Formeln I, II, IIa oder IIb enthalten. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können weitere Substanzen enthalten, beispielsweise pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe und Träger. In einem besonderen Aspekt können die pharmazeutischen Zusammensetzungen weitere Wirkstoffe umfassen, insbesondere antivirale Wirkstoffe, vor allem Wirkstoffe gegen Picorniaviren.
Es hat sich überraschend gezeigt, dass die erfindungsgemäßen 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate über eine deutlich verbesserte Stabilität in Lebermikrosomen gegenüber den Substanzen des Standes der Technik verfügen. Darüber hinaus haben Untersuchungen zur Pharmakokinetik in der Maus ergeben, dass die erfindungsgemäßen 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit aufweisen als Substanzen des Standes der Technik. Gleichzeitig zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine starke antivirale Aktivität gegenüber Picornaviren, insbesondere Entero- und Rhinoviren im nano- bzw. mikromolaren Konzentrationsbereich.
Daher sind die pharmazeutischen Zubereitungen, die eine Verbindung der Formeln I, II, IIa oder IIb enthalten, besonders geeignet für die Behandlung von respiratorischen Infekten, der aseptischen Meningitis, der Enzephalitis, Herpangina usw. bei Mensch und Tier, die von Picornaviren insbesondere Entero- und Rhinoviren hervorgerufen werden können.
Die 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate zeichnen sich dadurch aus, dass sie an einer oder an beiden Phenylgruppen mindestens einen Substituenten R^H tragen, der eine Hammett-Konstante σ_p größer als 0,23 aufweist. Dieser Wert 0,23 entspricht der Hammett-Konstante σ_p des Broms, das unter den Halogenen die höchste Hammett-Konstante für die para-Position zeigt.
Die Bestimmung der Hammett-Konstanten für verschiedene Substituenten basiert auf den Ionisierungskonstanten der Benzoesäure gemäß der Hammett-Gleichung σ_x = logK_X – logK_H wobei K_H die Ionisierungskonstante für Benzoesäure in Wasser bei 25°C ist und K_X die korrespondierende Konstante für eine meta- oder para-substituierte Benzoesäure ist. Ein Verfahren zur Bestimmung der Hammett-Konstante für verschiedene Substituenten in meta- (σ_m) und para-Position (σ_p) sowie bereits ermittelte Werte einer Vielzahl von Substituenten können der Veröffentlichung von Hansch et al., „A Survey of Hammett Substituent Constants and Resonance and Field Parameters", in Chem. Rev. 1991. 97, 165–195, entnommen werden, die hierin in ihrer Gesamtheit eingearbeitet ist. Für die vorliegende Erfindung von Bedeutung ist dabei jeweils ausschließlich der Wert σ für die para-Position (σ_p), unabhängig davon, an welcher Position sich der zumindest eine Substituent R^H letztlich befindet.
Beispiele der Erfindung sind Verbindungen der Tabelle 1, einschließlich ihrer pharmazeutisch verträglichen Salzverbindungen.
Ebenfalls umfasst sind Pro-Pharmaka (Prodrugs) der Verbindungen, insbesondere jene, die sich durch einen Substituenten am Pyrazol-Heteroatom in Position 1 auszeichnen. Es hat sich gezeigt, dass derartige Verbindungen in vivo zur 1H Pyrazol-Verbindung umgesetzt werden. Beispielhalber erwähnt seien Verbindungen, bei denen das Pyrazol-Heteroatom in Position 1 durch einen Imino(phenyl)methyl-Substituenten substituiert ist, wie beispielsweise 1-[imino(phenyl)methyl]-4-amino-3-(4-trifluormethyl-phenyl)amino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin, auch bezeichnet mit dem IUPAC Namen 1-Benzylcarboximidoyl-6-phenyl-3-N-[4-(trifluormethyl)phenyl]-1H-pyrazolo[3,4-d]-pyrimidin-3,4-diamin. Hierbei handelt es sich um ein Nebenprodukt bei der Herstellung der oben bezeichneten Verbindung CRCV-340, das aus der Reaktion der Verbindung CRCV-340 mit einem Überschuss an Benzamidin in der Reaktionsmischung resultiert und folgende Formel aufweist:
CRCV-340-Prodrug
Es wurde gefunden, dass diese Verbindungen (z. B. CRCV-340-Prodrug) in vivo sehr leicht zur Zielverbindung umgesetzt werden, derart dass im Serum im Wesentlichen nur noch der letztendliche Wirkstoff (z. B. CRCV-340) nachgewiesen werden kann.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Syntheseverfahren, speziellen 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivaten der allgemeinen Formel (I) sowie deren Wirkung und Anwendung gegen Picornavirusinfektionen näher erläutert werden.
zeigt ein allgemeines Schema zur Synthese von Pyrazolo[3,4-d]Pyrimidin 1 und schließt im ersten Schritt die Kondensation von [Bis(methylthio)methylen]malononitril 2 mit Phenylaminen 3 in Alkohol zu Phenylderivaten 4 ein. Letztere können jeweils isoliert und für weitere Reaktionen aufgereinigt werden oder direkt ohne Aufreinigung für nachfolgende Reaktion verwendet werden (”one-pot” Reaktion). Der darauf folgende Schritt besteht in der Wechselwirkung des Phenylderivats 4 mit Hydrazin oder Hydrazinderivaten. Die Reaktion verläuft unter Kochen über 1 bis 4 Stunden und führt zu einer hohen Ausbeute an Pyrazol 5. Der abschließende Schritt der Synthese von Pyrazolo [3,4-d]Pyrimidin 1 besteht in der Kondensation des Pyrazol 5 mit Phenylamidinen 6 in Gegenwart von Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Natriumacetat.
Die Verbindungen können vorteilhaft dadurch erhalten werden, dass das Pyrazol (5) im letzten Syntheseschritt mit korrespondierendem Benzamidinhydrochlorid in der Anwesenheit eines Überschusses an Natriumacetat bei 200–220°C in Abwesenheit von Lösungsmittel umgesetzt wird.
Alternativ können die Verbindungen dadurch erhalten werden, dass das Pyrazol (5) im letzten Syntheseschritt mit korrespondierendem Benzonitril (in großem Überschuss) unter Mikrowellenbestrahlung und unter Anwesenheit von Kalium-tert-butylat umgesetzt wird.
Eine alternative Synthesemethode beruht auf der ”one-pot” Reaktion von Malononitril mit Arylisothiocyanaten in Anwesenheit einer Base, insbesondere von Natriumhydrid, und einer nachfolgenden Behandlung des Reaktionsgemisches mit einem Alkylierungsmittel wie Jodmethyl oder Dimethylsulfat. Dabei werden große Mengen eines Enamins gebildet, das mit Hydrazin zu 4-Cyano-3,5-diamino-pyrazol-Verbindungen umgesetzt werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere auch ein Verfahren für die Herstellung von 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazola[3,4-d]pyrimidin-derivaten der allgemeinen Formel (I), umfassend

a) die Reaktion eines Phenylamins mit Dimethylthiocarbamoylchlorid unter Bildung eines Isothiocyanats,
b) die Reaktion des organischen Isothiocyanats mit Malonitril und einer Base unter Bildung eines Enamin-Zwischenprodukts und anschließende Alkylierung des Enamins,
c) die Reaktion des Produkts aus Schritt b) mit Hydrazin unter Bildung einer 4-Cyano-3,5-dimethylamino-pyrazol-Verbindung und
d) die Reaktion des Produkts aus Schritt c) mit einem Benzamidin unter Bildung des 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivats.

Das beschriebene Verfahren ist unter Auslassung des Schritts d) auch zur Herstellung von 4-Cyano-3,5-diamino-pyrazol-Verbindungen geeignet, wobei das Verfahren die Schritte

a) Reaktion eines Phenylamins mit Dimethylthiocarbamoylchlorid unter Bildung eines Isothiocyanats,
b) Reaktion des Isothiocyanats mit Malonitril und einer Base unter Bildung eines Enamin-Zwischenprodukts und anschließende Alkylierung des Enamins und
c) Reaktion des Produkts aus Schritt b) mit Hydrazin unter Bildung der 4-Cyano-3,5-diamino-pyrazol-Verbindung umfasst.

Die beiden vorgenannten Verfahren können vorteilhaft ausgestaltet werden, indem das Isothiocyanat vor der Umsetzung im Schritt b) isoliert wird. Es hat sich gezeigt, dass eine Reaktion ohne vorherige Isolierung des Isocyanats durchführbar ist, dass jedoch die Ausbeute des Produkts im folgenden Schritt b) von 70 bis 80% auf 30 bis 40% absinkt. Es hat sich weiterhin als zweckmäßig herausgestellt, wenn das Isothiocyanat durch Vakuumdestillation isoliert wird. Da das erhaltene Produkt relativ leicht kristallisiert, sollten bei einer industriellen Reinigungsapparatur verwendete Transferleitungen daher zweckmäßig erhitzt werden, um ein Auskristallisieren in diesen zu verhindern.
Das Verfahren kann weiterhin dadurch vorteilhaft ausgestaltet werden, indem das alkylierte Enamin, das im Schritt b) erhalten wird, durch Kristallisation isoliert wird. Dabei hat es sich gezeigt, dass das Enamin durch Kristallisieren aus Wasser und anschließendes Umkristallisieren aus Ethanol vorteilhaft gereinigt werden kann, wobei die Ausbeute des Produkts nicht unter 70% absinkt. Eine solche Aufreinigung ist daher im Rahmen des beschriebenen Verfahrens bevorzugt. Bei dem Alkylierungsschritt des erhaltenen Enamin-Zwischenprodukts hat sich die Verwendung von Basen wie Natriumhydrid, Triethylamin, Kaliumcarbonat oder Kaliumtertbutylat als besonders vorteilhaft herausgestellt. Insbesondere bei Ansätzen im Labormaßstab stellt Natriumhydrid eine geeignete Base dar, da die Nebenprodukte der Alkylierung relativ leicht abgetrennt werden können. Nachteilig an Natriumhydrid ist jedoch, dass seine Verwendung in größeren Maßstäben problematisch ist, da bei seiner Umsetzung mit protischen Substanzen Wasserstoff freigesetzt wird und das entstehende Gas sicher gehandhabt werden muss. Aus diesem Grund sind Basen, deren Reaktion mit dem Enamin nicht zur Entstehung von Wasserstoff führt, im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Die Alkylierung des Enamins kann mit Hilfe eines Alkylamids, wie insbesondere eines Alkyliodids oder Alkylbromids oder mit Hilfe eines Alkylsulfats durchgeführt werden. Dabei ist die Verwendung von Alkylsulfaten gegenüber Alkylhaliden, wie insbesondere Alkyliodiden, bevorzugt, da diese in der Regel teurer als die entsprechenden Sulfate sind und zudem der hohe Dampfdruck beispielsweise von Methyliodid in Kombinationen mit dessen Giftigkeit problematisch ist.
Das Verfahren kann weiterhin dadurch vorteilhaft ausgestaltet werden, dass das Hydrazin in Schritt c) in einer Menge von 4 bis 1 Äqualenten, vorzugsweise 1,2 bis 1 Äqualenten, bezogen auf das Produkt aus Schritt b) verwendet wird. Ein niedriger Überschuss von Hydrazin gegenüber dem Produkt aus Schritt b) hat den Vorteil, dass der Resthydrazingehalt im erhaltenen Produkt wesentlich geringer ist und auf etwa 10 ppm oder weniger eingestellt werden kann. Dies ist wichtig für die spätere Verwendung als medizinisches Produkt, da Hydrazinderivate in der Regel eine hohe Giftigkeit aufweisen und daher möglichst vollständig aus dem Produkt entfernt werden müssen.
Bei der Herstellung des 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyridinderivats als Endprodukt reagiert das Benzamidin in der Regel in Form der freien Base. Diese kann zweckmäßig in situ aus einem Salzvorläufer hergestellt werden, indem dem Salz eine geeignete Base zugegeben wird. Als Basen können Natriumacetat, DBU, Ammoniumacetat der Lithiumamid eingesetzt werden, sowie weitere Basen, die einen für die Deprotonierung des Benzamidinsalzes geeigneten pKa-Wert aufweisen.
Es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn ein freies Amidin verwendet wird. Unter einem freien Amidin wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Amidin verstanden, das nicht in Form eines Salzes vorliegt. Weiterhin hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn das Amidin in einer Menge von 1,9 bis 1,0 Äqualenten, bezogen auf das 4-Cyano-3,5-diaminopyrazolvorprodukt, verwendet wird. Bei Verwendung größerer Überschüsse von Benzamidin nimmt die Menge an unerwünschten Nebenprodukten, die sich zudem in folgendem Aufreinigungsschritten nur schwer aus dem gewünschten Produkt entfernen lassen, signifikant zu. Beträgt die Äqualentmenge an Benzamidin weniger als 1,0, so lassen sich diese Verunreinigungen zwar signifikant reduzieren, die Umsetzung kann jedoch nicht mehr bis zur Vollständigkeit geführt werden, so dass sich die Gesamtausbeute in diesen Fällen ebenfalls signifikant vermindert.
Weiterhin hat es sich gezeigt, dass die Menge an Lösungsmittel, das für die Umsetzung verwendet wird, die Ausbeute an gewünschtem Produkt beeinflusst. Als besonders vorteilhaft hat es sich herausgestellt, wenn im Schritt d) ein Lösungsmittel in einer Menge von 1 bis 3 Anteilen, insbesondere etwa 2 Anteilen, eingesetzt wird (hier ist noch die Bezugsgröße einzusetzen). Hinsichtlich des Lösungsmittels unterliegt die vorliegende Erfindung keinen relevanten Beschränkungen. Es hat sich jedoch gezeigt, das die Verwendung von Ethanol, DMSO, Diphenylether, DMF oder Butanol hinsichtlich der zu erzielenden Ausbeute mit Vorteilen verbunden sind, insbesondere Diphenylether und Butanol, von denen Butanol am meisten bevorzugt ist, da es sich mit weniger Aufwand aus dem Produkt entfernen lässt.
Darüber hinaus spielt die Reaktionstemperatur bei der Umsetzung in Schritt d) eine wichtige Rolle. Es hat sich gezeigt, dass eine Reaktionstemperatur im Schritt d) zwischen 70 und 130°C, insbesondere zwischen 80 und 100°C, mit besonders günstigen Ausbeuten verbunden ist. Wird eine unter 70°C liegende Reaktionstemperatur gewählt, so kann die Reaktion nicht bis zur Vollständigkeit geführt werden bzw. die Reaktionszeiten bis zur Vollständigkeit verlängern sich sehr stark. Bei Reaktionstemperaturen von mehr als 130°C nimmt hingegen die Menge an unerwünschten Nebenprodukten zu.
Weiterhin hat es sich gezeigt, dass die Reaktionszeit im Schritt d) zweckmäßig zwischen 12 und 24 Stunden, insbesondere zwischen 16 und 20 Stunden, betragen sollte. Bei Reaktionszeiten von unter 12 Stunden läuft die Reaktion in der Regel nicht vollständig ab, während sich bei Reaktionszeiten von mehr als 24 Stunden die Kosten des Verfahrens unverhältnismäßig erhöhen, ohne dass noch ein signifikant verbesserter Umsatz zu beobachten wäre.
Das erhaltene Endprodukt kann anschließend durch Umkristallisieren gereinigt werden. Für das Umkristallisieren kann jedes für diesen Zweck geeignete Lösungsmittel verwendet werden, solange es in heißer Form eine ausreichende, in kalter Form hingegen eine nur geringe Löslichkeit für das Produkt aufweist. Beispielhaft als Lösungsmittel seien an dieser Stelle 1-Butanol, Toluol, Ethanol, Dichlormethan und Ethylacetat genannt. Für das Umkristallisieren hat sich insbesondere eine Mischung von THF und Toluol als Lösungsmittel als besonders zweckmäßig erwiesen, da dieses Gemisch in der Lage ist, durch eine einzige Umkristallisation das Produkt in Reinheiten von > 99% und Ausbeuten von 60 bis 70% zu liefern.
Das oben beschriebene Verfahren kann alternativ auch durch die Kondensation des aus Schritt c) gewonnenen Pyrazols mit Benzamidinen in Gegenwart von Säure, wie Essigsäure oder Trichloressigsäure, bzw. deren Salzen in Acetat im abschließenden Syntheseschritt d) zur Herstellung von Pyrazolo[3,4-]pyrimidinderivaten(1) umgesetzt werden.
In den folgenden Beispielen sind spezielle Verbindungen der allgemeinen Formel (I) aufgelistet, welche bevorzugt für Anwendungen gegen Picornavirusinfektionen geeignet sind, wobei die Verbindungen in einer Lösung oder einer Suspension in einem pharmazeutisch akzeptablen wässrigen, organischen oder wässrig-organischen Medium für die lokale oder parenterale Anwendung durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion oder für die intranasale Verabreichung zubereitbar ist, oder sie sind in Form einer Tablette, Kapsel bzw. wässrigen Suspension mit konventionellem Träger für die orale Verabreichung oder als Suppositorium ausgebildet.
Die vorgestellten Verbindungen der Formel (I) können dabei in Dosierungen von 0,1 bis 1000 mg/kg Körpergewicht verwendet werden.
Herstellung und Analyse der 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate
Die Strukturaufklärung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgte durch die Art der Synthese, Elementaranalysen, NMR- und Massenspektroskopie.
Ausgangsmaterialien:
Die 5-Amino-4-cyano-3-phenylaminopyrazole wurden gemäß dem in dargestellten Verfahren sowie nach der Beschreibung von Tominaga Y et al. (J. Heterocycl. Chem., 1990, 27, 775–779), synthetisiert. Arylamidine werden gemäß dem bekannten Stand der Technik aus den entsprechenden Cyan-Ausgangsverbindungen synthetisiert (Boere, RT et al.: J. Organomet. Chem., 1987, 331, 161–167; Garigipati RS: Tetrahedron Lett., 1990, 31, 1969–1978; Dann O et al.: Justus Liebigs Ann. Chem., 1982, 1836–1839).
Referenzbeispiel 1: 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin
(3-N,6-diphenyl-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-3,4-diamin)
Unter Rühren werden zu 2,3 g (11,5 mmol) 5-Amino-4-cyano-3-phenylaminopyrazol 3,0 g (17,24 mmol) Benzamidin Hydrochlorid Hydrat und 2,2 g (23,0 mmol) Natriumacetat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 30 min bei 220°C erhitzt. Das resultierende Material wird mit 50 ml Wasser behandelt, gefiltert und mit 20 ml kaltem Methanol sowie 20 ml kaltem Ester gewaschen. Das Produkt wird mittels Kristallisation aus DMF/Wasser gereinigt.
Hellgelber, fester kristalliner Stoff. Ausbeute 57%. mp 253–5°C. R_f(Chloroform – Methanol; 10/1) – 0.8 (Silikagel 60). MS m/z 302 (M⁺).
Referenzbeispiel 2: 4-Amino-3-(4-chlorphenyl)amino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin
(3-N-(4-chlorphenyl)-6-phenyl-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-3,4-diamin)
Referenzbeispiel 3: 4-Amino-3-(3,4-difluorphenyl)amino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (3-N-(3,4-difluorphenyl)-6-phenyl-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-3,4-diamin)
Beispiel 1: 4-Amino-3-(4-trifluormethyl-phenyl)amino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (CRCV-340)
(6-phenyl-3-N-[4-(trifluormethyl)phenyl]-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-3,4-diamin)
Die Herstellung erfolgte wie im Referenzbeispiel 1 beschrieben, unter Verwendung der entsprechend substituierten Vorläuferverbindungen.
Beispiel 2: 4-Amino-3-phenylamino-6-[4-(trifluormethoxy)-phenyl]pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (MS-112)
(3-N-phenyl-6-[4-(trifluormethoxy)phenyl]-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-3,4-diamin)
Die Herstellung erfolgte wie im Referenzbeispiel 1 beschrieben, unter Verwendung der entsprechend substituierten Vorläuferverbindungen.
Herstellung von CRCV-340 ”one pot-Reaktion” von Malonitril mit Arylisothiocyanaten in Anwesenheit einer Base
In einem Gefäß wurden 4-Trifluoromethylanilin und Dimethylthiocarbamoylchlorid in Toluol umgesetzt. Nach vollständiger Umsetzung wurde das gebildete Salz (Dimethylammoniumchlorid) abfiltriert und die Reaktionslösung wurde bis zur Trockenheit eingedampft. Schließlich wurde das erhaltene Produkt durch Vakuumdestillation gereinigt. Als Produkt wurde ein bei Raumtemperatur kristallisierendes Material erhalten.
Im nächsten Schritt wurde Malonitril durch Zugabe von Natriumhydrid (60%) in DMF-Lösung deprotoniert. Zu dieser Lösung wurde 4-Trifluoromethylphenylisothiocyanat gelöst in DMF bei Raumtemperatur gegeben. Das erhaltene Enamin-Zwischenprodukt wurde anschließend durch Zugabe von Methyliodid zum gewünschten Enamin umgesetzt. Die Isolierung wurde durch Kristallisation des Enamins aus Wasser unter Zugabe von Saatkristallen sowie durch zweifaches Umkristallisieren aus Ethanol erzielt. Die Ausbeute betrug 70 bis 80%.
Das erhaltene Enamin wurde in Ethanol gelöst und durch Zugabe von unterschiedlichen Mengen Hydrazinhydrats und anschließendes Refluxieren der Reaktionsmischung umgesetzt. Anschließend wurde das erhaltene Produkt durch Zugabe von Wasser kristallisiert und aus Mischungen von Wasser und Ethanol umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 60%.
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse von Umsetzungen mit unterschiedlichen Mengen Hydrazin dargestellt, wobei die Restmengen an Hydrazin im erhaltenen umkristallierten Produkt angegeben sind. Dabei zeigt es sich, dass die Verwendung einer Äqualentmenge an Hydrazins von 1.05, bezogen auf das Ausgangsprodukt mit einer hohen Ausbeute bei gleichzeitig hoher Reinheit und geringem Restgehalt an Hydrazin von nur 1 ppm erhalten werden kann. Tabelle 2: Hydrazinequivalente für die Synthese der 3. Stufe von CRCV 340

Eintrag Equivalentmenge Hydrazin Reinheit [%-a/a] Ausbeute [%] Resthydrazin [ppm]

1 4,00 > 99,95 93,6 22

2 1,05 > 99,95 92,6 1

Im abschließenden Schritt wurde das erhaltene Pyrazol mit Benzamidinhydrochlorid unter Bildung des Pyrazolo[3,4-d]-pyrimidins umgesetzt. Die Umsetzungen wurden bei verschiedenen Temperaturen im Bereich von 140°C bis 170°C und Überdruck in Diphenylether und 1-Butanol und mit verschiedenen Basen durchgeführt, wobei Reinheiten im Bereich von bis zu etwa 79% erzielt werden konnten (siehe Tabelle 3). Tabelle 3: Screening von Unterschiedlichen Basen zur Deprotonierung

Eintrag	Lösungsmittel	Base	Temperatur [°C]	Umsatz [%-a/a]	Reinheit [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 1,31 [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 0,64 [%-a/a]
1	Diphenyl ether	Natrium acetat	140	31,6	19,7	1,6	< 0,05
2	Diphenyl ether	DBU	140	89,7	74,8	0,7	1,0
3	Diphenyl ether	NH₄OAc	140	38,1	7,9	2,5	< 0,05
4	Diphenyl ether	LiNH₂	140	91,5	49,1	12,4	5,6
5	Diphenyl ether	Natrium acetat	170	81,0	60,0	1,7	0,7
6	Diphenyl ether	DBU	170	95,2	79,0	0,3	4,4
7	Diphenyl ether	NH₄OAc	170	81,8	60,0	1,0	1,0
8	Diphenyl ether	LiNH₂	170	98,3	39,4	2,0	34,8
9	Butanol	Natrium acetat	140	42,6	29,6	0,4	< 0,05
10	Butanol	DBU	140	87,2	72,6	0,6	1,0
11	Butanol	NH₄OAc	140	24,7	15,2	0,04	< 0,05
12	Butanol	LiNH₂	140	79,6	52,2	0,4	9,1
13	Butanol	Natrium acetat	170	74,9	61,6	0,5	0,7
14	Butanol	DBU	170	88,2	73,9	0,6	3,0
15	Butanol	NH₄OAc	170	66,7	53,3	0,4	0,4
16	Bitanol	LiNH₂	170	88,9	52,2	0,4	18,5

Die Hauptverunreinigungen wurden mit Hilfe von RP-HPLC bestimmt. Die Verunreinigung bei RRT (relative Retentionzeit bezogen auf CRCV 340) 1,31 weist eine Masse von 473 auf.

In einem anschließenden Experiment wird der Einfluss der Lösungsmittelmenge auf die Reaktion untersucht, wobei 1-Butanol als Lösungsmittel verwendet und das Benzamidin als Hydrochlorid in einer Äquivalantmenge von 2 bis 2,5 bezogen auf die 4-Cyano-3,5-diamino-pyrazol-Verbindung eingesetzt wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle 4: Screening von unterschiedlichen Lösungsmittelmengen.

Eintrag	Lösungmittelmenge [Volumen]	Temperatur [°C]	Umsatz [%-a/a]	Reinheit [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 1,31 [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 0,64 [%-a/a]
1	2	90	82.9	79,5	1,00	< 0,05
2	4	90	76.9	72,7	1,40	0,12
3	6	90	81.4	74,9	2,40	0,26

In einem weiteren Experiment wurde der Einfluss der Äquivalentmenge an Benzamidin Hydrochlorid auf die Reaktion untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5: Screening von unterschiedlichen Benzamidinäquivalentmengen.

Lösungsmittel	Equivalente Benzamidin	Temperatur [°C]	Umsatz [%-a/a]	Reinheit [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 1,31 [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 0,64 [%-a/a]
Butanol	1,00	90	76,90	72,70	1,40	0,12
Butanol	1,25	90	89,80	80,70	2,90	0,27
Butanol	1,50	90	94,90	81,50	4,40	0,35
Butanol	2,00	90	97,60	83,00	3,90	0,44

In diesen Untersuchungen hat es sich gezeigt, dass eine Äqualentmenge von Benzamidin im Bereich von 1 bis 1,25 einen Umsatz im Bereich von etwa 90% liefert, wobei gleichzeitig der Gehalt an Verunreinigungen relativ gering ist.

In einem abschließenden Experiment wurden die optimierten Reaktionsbedingungen mit 1-Butanol als Lösungsmittel getestet. Dazu wurde das Benzamidin als freie Base eingesetzt. Nach Abkühlen der Reaktionsmischung der Umsetzung mit Benzamidin auf 0–5°C wurde das erhaltene Rohprodukt mit 2 Volumeneinheiten Butanol gewaschen und bei 60°C/50 mbar getrocknet. Die Ausbeute betrug 55 bis 65% bei einer Reinheit von mehr als 95%. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 6 dargestellt: Tabelle 6: Reaktion bei optimierten Reaktionsbedingungen

Lösungsmittelmenge	Equivalente Benzamidin	Temperatur [1°C]	Reinheit [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 1,31 [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 0,64 [%-a/a]
2	1,05	90	97,4	1,22	< 0,05
2	1,05	90	95,17	1,78	< 0,05
2	1,10	90	96,87	1,88	< 0,05
2	1,15	90	95,89	2,54	< 0,05

Unter diesen optimierten Reaktionsbedingungen zeigt es sich, dass eine Menge von 1,05 bis 1,15 Äqualenten an Benzamidin (im Verhältnis zu CRCV-340), zwei Einheiten Butanol als Lösungsmittel, einer Reaktionstemperatur von 90°C und eine Reaktionszeit von 18 Stunden einen Gehalt an Verunreinigungen bei 1,31 RRT bzw. 0,64 RRT von ≤ 1,5% bzw. < 0,05% liefern. Die anschließende Umkristallisation der erhaltenen Produkte in einem Gemisch von 6 Einheiten THF und 7 Einheiten Toluol lieferte das Produkt mit einer Reinheit im Bereich von mehr als 99% und einem Gehalt der Verunreinigungen bei RRT = 1,31 sowie RRT = 0,64 von < 0,37 bzw. < 0,05 (Tabelle 7). Tabelle 7: Reinheit vor und nach Umkristallisation des erhaltenen Produkts.

Lösungsmittel	Reiheit Rohprodukt [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 1,31 [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 0,64 [%-a/a]	Reiheit Endprodukt [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 1,31 [%-a/a]	Verunreinigung bei RRT = 0,64 [%-a/a]
THF/Toluol 6:7	97,49	1,65	< 0,05	99,62	0,37	< 0,05
THF/Taluol 6:7	95,17	1,17	< 0,05	99,48	0,32	< 0,05

ADMET-Studien zum Metabolismus von OBR 5-340 in vitro
Ziel: Überprüfung der Aufnahme (Absorption), Verteilung (Distribution), des biochemischen Um- bzw. Abbaus (Metabolismus), der Ausscheidung (Exkretion) sowie Toxizität (abgekürzt: ADMET) von OBR 5-340 in vitro, sowie In vitro-Untersuchungen zur Plasmaproteinbindung und zur Stabilität im Plasma und in Lebermikrosomen.

Untersuchungen: Die durchgeführten In vitro-Tests mit CRCV-340 sowie die erhaltenen Daten sind im Vergleich zu Ref-2 in Tabelle 8 zusammengefasst. Tabelle 8: Zusammenfassung der Ergebnisse aus den ADMET-Studien für CRCV-340 im Vergleich zu Ref-2.

Untersuchungsparameter	Ref-2	CRCV-340
Bindung an Plasmaprotein	99,5%	96,7%
Freisetzung von Plasmaprotein	61,0%	122,3%
Plasmastabilität	117,0%	100,0%
Stabilität in Lebermikrosomen	32,0%	112,0%

Zusammenfassung: Die Substanz CRCV-340 zeichnete sich durch eine bessere Stabilität in Lebermikrosomen sowie eine stärkere Freisetzung von Plasmaprotein im Vergleich zu Ref-2 aus.
Untersuchung der Pharmakokinetik von CRCV-340 in der Maus
Ziel: Erhebung pharmakokinetischer Daten zu CRCV-340.
Untersuchungen: Substanz und Referenzsubstanz wurden jeweils einmalig in einer Konzentration von 100 mg/kg KG, in 0,5 ml einer 10%igen Cremophorlösung per os den Mäusen appliziert. Nach 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 h wurde das Serum gewonnen und mittels HPLC-Analyse die Konzentrationen von CRCV-340, Ref-2 und Ref-3 im Plasma der Mäuse bestimmt.

Anhand der mittels HPLC-festgestellten Substanzkonzentrationen im Blutplasma wurden die pharmakokinetischen Parameter der Substanzen mit dem Computerprogramm ESTRIP berechnet (Tabelle 9). Tabelle 9: Pharmakokinetische Daten nach einmaliger, intragastraler Applikation von 100 mg/kg CRCV-340, Ref-2 und Ref-3 in Mäuse.

Substanz	C_max	T_max	MRT	T_1/2	K_el	CL	V_d	AUC_0-t	AUC_0-∞	C_max/AUC_0-t
Substanz	(ng/ml)	(h)	(h)	(h)	(h^–1)	(ml × h/kg)	(ml/kg)	(ng × ml/h)	(ng × ml /h)	(h^–1)
Ref-2	1295,4	1,0	2,14	2,96	0,23	36,6	156,7	2354,5	2732,1	0,55
Ref-3	424,5	0,5	2,44	1,47	0,55	91,8	168,1	1085,7	1089,4	0,39
CRCV-340	1254,4	3,0	3,54	3,54	0,18	10,4	52,7	6418,3	9598,5	0,20

C_max Maximalkonzentration im Blut
T_max Zeit bis zum Erreichen der Maximalkonzentration im Blut
MRT Mittlere Verweilzeit im Blut (mean residence time)
T_1/2 Halbwertszeit
K_el Eliminationskonstante
CL Beseitigung (clearance)
V_d Verteilungsvolumen (volume of distribution)
AUC Fläche unter der Kurve (area under curve)
C_max/AUC Absorptionsgeschwindigkeit von Magen zum Blut

Ergebnis: Die Untersuchungen zur Pharmakokinetik in der Maus ergaben für CRCV-340 eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit als für Ref-2 und Ref-3.
Untersuchungen zur akuten Toxizität von CRCV-340 in der Maus
Ziel: Bestimmung der 50% letalen Dosis von CRCV-340

Untersuchungen: Die akute Toxizität der Substanz CRCV-340 wurde in 19,5–20,5 g schweren Mäusen überprüft, denen per os 40, 60, 80 bzw. 120 mg Substanz/Maus (je 5 Mäuse pro Substanz und Konzentration) verabreicht wurden. Dies entspricht einer Dosis von ca. 2g, 3g, 4g bzw. 6g pro Kilogramm Körpergewicht. Die im Ergebnis beobachteten toxischen Effekte korrelierten mit der applizierten Substanzdosis. Bei den 40 und 60 mg/Maus-Dosierungen wurden bis zu 3 h nach Substanzgabe Koordinationsstörungen und Hyperaktivität als Nebenwirkungen beobachtet. Nach Applikation der zwei höheren Dosierungen kamen Atembeschwerden, aggressives Verhalten und Hyperkinesie dazu. Für CRCV-340 wurde eine LD₅₀ von 3120 mg/kg bestimmt (Tabelle 10). Tabelle 10: Ergebnisse der Untersuchungen zur akuten Toxizität der Substanz CRCV-340 nach einmaliger peroraler Applikation in der Maus

Dosis	Tote/Überlebende 72 h nach Applikation von
Dosis	Ref-2	CRCV-340
40 mg/Maus	0/5	1/5
60 mg/Maus	1/5	1/5
80 mg/Maus	3/5	3/5
120 mg/Maus	4/5	5/5
LD₅₀	78,6 mg/Maus (3930 mg/kg)	62,4 mg/Maus (3120 mg/kg)

Ergebnis: Die erhaltenen Daten zur Überlebensrate belegen eine sehr gute Verträglichkeit beider Testsubstanzen.
Langzeituntersuchungen zur Toxizität in der Maus
Ziel: Feststellung der subakuten Toxizität in der Maus, um mögliche Nebenwirkungen z. B. auf das Allgemeinbefinden, Gewicht, die inneren Organe und den Stoffwechsel, die bei einer subakuten Gabe von CRCV-340 über 28 Tage auftreten könnten, aufzudecken.
Untersuchungen: Dazu erhielten ca. 20 g schwere männlich und weibliche Mäuse 12,5, 50 oder 200 mg/kg der Substanz CRCV-340 in einer Cremophorformulierung bzw. die Kontrollgruppe Cremophor einmal täglich über 28 Tage intragastral über eine Sonde verabreicht. Im gesamten Versuchszeitraum wurde der Zustand des Fells und der Schleimhäute, der Exkrete und das Allgemeinbefinden bewertet. Die Protokollierung des Gewichts erfolgte an den Tagen 7, 14, 21 und 28. Ca. 24 h nach der letzten Substanzgabe wurde das Orientierungsvermögen der Tiere untersucht. Im Serum wurden folgende biochemische Parameter analysiert: Proteingehalt, Harnstoff, Creatinin, die Serumaktivität von Aspartataminotransferase, Alaninaminotransferase und alkalischer Phosphatase. Die Hämoglobinkonzentration, Hämatokrit, die Anzahl der roten und weißen Blutzellen sowie der Blutblättchen wurde im Blutausstrich bestimmt. Zum Versuchsende wurden die Mäuse unter Narkose getötet und seziert, der Zustand der inneren Organe makroskopisch eingeschätzt, das Organgewicht bestimmt und Proben für nachfolgende histologische Untersuchungen in Formalin eingelegt.
Ergebniszusammenfassung: Die Ergebnisse belegen eine sehr gute Verträglichkeit der untersuchten Substanzkonzentrationen. Weder das Allgemeinbefinden der Tiere, ihr Fell, die Exkrete noch das Orientierungsvermögen bzw. die Beweglichkeit veränderten sich infolge der Substanzgabe. Auch in Bezug auf die Körpergewichtsdynamik unterschieden sich die CRCV-340-behandelten Tiere nicht von der Kontrollgruppe. Es ließen sich keine Unterschiede zwischen den substanzbehandelten und vehikelbehandelten Versuchsgruppen im Blutausstrich, bei den biochemischen Blutparametern feststellen. Gleiches gilt für die makroskopische Begutachtung der inneren Organe (Leber, Niere, Herz, Lunge, Milz, Pankreas und Hoden), die Organgewichte sowie die Ergebnisse der histologischen Untersuchungen von Herz-, Lungen-, Leber-, Milz-, Thymus-, Pankreas-, Nieren-, Drüsen-, Hoden-, Magen- und Darmgewebsproben (Ergebnisse nicht dargestellt).
Bestimmung des antiviralen Spektrums gegen Rhinoviren
Ziel: Bestimmung des antiviralen Wirkspektrums von CRCV-340 gegenüber 50 verschiedenen humanen Rhinovirus-Serotypen und CVB3-Patientenisolaten.

Untersuchungen: Die 50 HRV-Serotypen und 20 klinischen CVB3-Isolate wurden in HeLa-, HeLa Wis- und/oder LF-Zellen vermehrt, ihr Titer bestimmt und mittels Sequenzierung der Serotyp überprüft. Danach wurden zpE(zytopathischer Effekt)-Hemmteste mit den HRV bzw. Plaque-Reduktions-Teste mit den CVB3 Isolaten etabliert. In den entsprechenden antiviralen Tests erfolgten Dosis-Wirkungs-Untersuchungen mit Ref-3 sowie CRCV-340. Eine Übersicht zu den ermittelten mittleren 50%-Hemmkonzentrationen geben die Tabellen 11 und 12. Tabelle 11: Übersicht zum Wirkspektrum von Ref-3 und CRCV-340 gegenüber HRV. Zusammengefasst wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen für alle 50 untersuchten Serotypen sowie für die 45 Pleconaril-sensitiven und 5 Pleconaril-resistenten Serotypen getrennt.

Substanz	IC₅₀ [μM] alle HRV (n = 50)		IC₅₀ [μM] Pleconaril-sensitive HRV (n = 45)		IC₅₀ [μM] Pleconaril-resistente HRV (n = 5)		Anzahl der sensitiven HRV
Substanz	mean	S. D.	mean	S. D	mean	S. D.
Ref-3	16,11	11,94	18,52	10,88	0,07	0,01	23
CRCV-340	25,73	21,49	26,09	18,98	22,62	40,69	49

Tabelle 12: Übersicht zum Wirkspektrum von Ref-3 und CRCV-340 gegenüber den klinischen CVB3-Isolaten. Zusammengefasst wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen für alle 20 untersuchten Isolate sowie für die 19 Pleconaril-sensitiven Isolate und das eine Pleconaril-resistente Serotypen getrennt.

Substanz	IC₅₀ [μM] alle CVB3 (n = 20)		IC₅₀ [μM] Pleconaril-sensitive CVB3 (n = 19)		IC₅₀ [μM] Pleconaril-resistente CVB3 (n = 1)		Anzahl der sensitiven CVB3
Substanz	mean	S. D.	mean	S. D	mean	S. D.
Ref-3	0,68	0,90	0,71	0,91	0,13		20
CRCV-340	4,97	4,05	5,16	4,10	1,39		18*

* maximal getestete Konzentration 13,5 μM

Ergebniszusammenfassung: Das Wirkspektrum von CRCV-340 gegenüber HRV fiel im Vergleich zu Ref-3 deutlich breiter aus.
Untersuchungen zur antiviralen Wirkung in vivo im Mausmodell der CVB3-induzierten chronischen Myokarditis
Ziel: Bestätigung der antiviralen Wirkung von CRCV-340 im Mausmodell
Untersuchungen: Die Wirkung des CRCV-340 wurde im Modell der CVB 3-induzierten Myokarditis in 8-Wochen-alten männlichen NMRI Mäusen untersucht. Dazu erhielten CVB3 31-1-93 bzw. CVB3 H3-infizierte Tiere ein- oder zweimal täglich 100 mg/kg der Substanz in 50% oder 20% PEG-400 in 1% CMC in Wasser (Placebo) über 7 Tage verabreicht. Parameter zur Bewertung des therapeutischen Effekts schlossen Veränderungen im Körpergewicht, Allgemeinbefinden, Virustiter in Herz- und Pankreasgewebe sowie histopatholgische Veränderungen im Herz und Pankreas ein. Scheininfizierte, Placebo-behandelte bzw. CRCV-340-behandelte Tiere dienten als Negativkontrolle und infizierte, Placebo- bzw. Pleconaril-behandelte Tiere als Positivkontrolle im Infektionsverlauf.
Ergebniszusammenfassung: Im Gegensatz zu Placebo und Pleconaril wirkte CRCV-340 im Modell der CVB3 31-1-93-induzierten chronischen Myokarditis in NMRI-Mäusen. Dabei waren klinisch und statistisch signifikante Effekte für alle untersuchten Parameter (Körpergewicht, Allgemeinbefinden, die Virustiter im Herz- und Pankreasgewebe am Tag 7 p. i, die Histopathologie im Herz- und Pankreas am Tag 7 und 21 p. i.) zu beobachten.
Studien zur in vivo-Wirksamkeit von CRCV-340 im letalen Mausmodell im Vergleich zur Referenzsubstanz Pleconaril
Ziel: Verifizierung der antiviralen Wirkung von CRCV-340 im letalen Mausmodell
Untersuchungen: Die Wirkung des Entwicklungskandidaten CRCV-340 wurde nach Austestung der Infektionsdosis im Modell der CVB 3-induzierten Myokarditis in 6–7 Wochen-alten männlichen BALB/c Mäusen untersucht. Dazu erhielten CVB3 31-1-93 bzw. CVB3 H3-infizierte Tiere zweimal täglich 100 mg/kg der Substanz in 20% PEG-400 in 1% CMC in Wasser (Placebo) über 7 Tage verabreicht. Veränderungen im Körpergewicht, Allgemeinbefinden und die über den Surrogatmarker 25% Körpergewichtsverlust definierte Letalität dienten als Parameter zur Bewertung des therapeutischen Effekts. Scheininfizierte, Placebo-behandelte bzw. CRCV-340-behandelte Tiere stellten die Negativkontrolle und infizierte, Placebo- bzw. Pleconaril-behandelte Tiere die Positivkontrolle im Infektionsverlauf dar.
Ergebniszusammenfassung: Im Gegensatz zu Placebo und Pleconaril wirkte CRCV-340 im letalen BALB/c-Mausmodell nach Infektion mit CVB3 31-1-93. Dabei waren klinisch und statistisch signifikante Effekte für alle untersuchten Parameter (Körpergewicht, Allgemeinbefinden sowie die Letalität) zu beobachten.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate der allgemeinen Formel I
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Pro-Pharmakon davon, wobei zumindest ein Wasserstoffatom in zumindest einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten R^H ersetzt ist, der eine Hammett-Konstante σ_p größer als 0,23 aufweist, wobei jedes weitere Wasserstoffatom in jeder der Phenylgruppen A und B unabhängig voneinander ersetzt sein kann durch einen Rest R¹, wobei jedes R¹ unabhängig ein Halogen, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1–7 Kettengliedern, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes alkanoles Radikal mit 1–8 Kettengliedern, NO₂, CN, CONR² ₂, COR², COOR², OR², SR², NR² ₂, SO₂NR² ₂, CX₃, CR²X₂, OCX₃, OCR²X₂, oder Phenyl sein kann; jedes R² unabhängig Wasserstoff, ein gesättigtes oder ungesättigtes, halogeniertes oder nicht halogeniertes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1–7 Kettengliedern, Benzyl, Phenyl oder Naphtyl, ein gesättigter oder ungesättigter, Mono- oder Polyheterozyklus mit den Heteroatomen N, S oder O ist, wobei jede der vorstehenden genannten Gruppen unabhängig mit Fluor, Chlor, Brom, Trifluormethyl, Alkyl, Alkoxy, Cyano, Nitro, Amino, Aminoalkyl, C(O)-Alkyl, C(O)O-Alkyl, Benzyl, Phenyl oder Naphtyl substituiert sein kann; und X unabhängig F, Cl, Br, oder I ist.
4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zumindest eine Substituent R^H unabhängig NO₂, CN, CF₃, CCl₃, CBr₃, OCF₃, OCCl₃, OCBr₃, CHF₂, CHCl₂, CHBr₂, OCHCl₂, CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe, oder COOEt ist, bevorzugt CF₃ oder OCF3.
4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel II
wobei jeder Substituent R^A, R^B unabhängig Wasserstoff, ein Halogen, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1–7 Kettengliedern, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes alkanoles Radikal mit 1–8 Kettengliedern, NO₂, CN, CONR² ₂, COR², COOR², OR², SR², NR² ₂, SO₂NR² ₂, CX₃, CR²X₂, OCX₃, OCR²X₂, oder Phenyl sein kann; wobei R² und X wie in Anspruch 1 definiert sind; dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der Substituenten R^A, R^B eine Hammett-Konstante σ_p größer als 0,23 aufweist.
4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate nach einem der Ansprüche 1 oder 2 der allgemeinen Formel IIa
dadurch gekennzeichnet, dass R^H NO₂, CN, CF₃, CCl₃, CBr₃, OCF₃, OCCl₃, OCBr₃, CHF₂, CHCl₂, CHBr₂, OCHCl₂, CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe oder COOEt ist, bevorzugt CF₃ oder OCF₃.
4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate nach Anspruch 4 der Formel
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo]3,4-d]pyrimidin-Derivat nach einem der vorherigen Ansprüche.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, ferner enthaltend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, ferner enthaltend einen oder mehrere weitere Wirkstoffe.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei der eine oder die mehreren weiteren Wirkstoffe antivirale Wirkstoffe sind, bevorzugt Wirkstoffe gegen Picornaviren.
Verfahren zur Herstellung eines 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend a) Reaktion eines Phenylamins mit Dimethylthiocarbamoylchlorid unter Bildung eines Isothiocyanats, b) Reaktion des organischen Isothiocyanats mit Malonitril und einer Base unter Bildung eines Enamin-Zwischenprodukts und anschließende Alkylierung des Enamins, c) Reaktion des Produkts aus Schritt b) mit Hydrazin unter Bildung einer 4-Cyano-3,5-diamino-pyrazol-Verbindung und d) Reaktion des Produkts aus Schritt c) mit einem Benzamidin unter Bildung des Pyrazolo[3,4-d]-pyrimidins, wobei zumindest ein Wasserstoffatom in zumindest einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten R^a ersetzt ist, der eine Hemmet-Konstante σP von > 0,23 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines 4-Cyano-3-Phenylamino,5amino-pyrazol-Verbindung, umfassend a) Reaktion eines organischen primären Amins mit Dimethylthiocarbamoylchlorid unter Bildung eines Isothiocyanats, b) Reaktion des Isothiocyanats mit Malonitril und einer Base unter Bildung eines Enamin-Zwischenprodukts und anschließende Alkylierung des Enamins und c) Reaktion des Produkts aus Schritt b) mit Hydrazin unter Bildung der 4-Cyano-3,5-diamino-pyrazol-Verbindung.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend Formulieren eines 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivats nach einem der Ansprüche 1–5 mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate nach einem der Ansprüche 1–5 zur Verwendung als Medikament.
4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate nach einem der Ansprüche 1–5 zur Verwendung bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Virusinfektionen.
4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusinfektionen Picornavirusinfektionen sind.