DE102011118024A1 - New procaspase 1 expression inhibitor, useful for preventing and/or treating inflammatory diseases, which are autoinflammatory diseases - Google Patents

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Abstract

Procaspase 1 expression inhibitor, is new. Independent claims are included for: (1) a small hairpin RNA (shRNA), which is processable to a small interfering RNA (siRNA); (2) a vector, which contains a nucleic acid sequence, which is encoded for the inhibitor or shRNA; (3) a host cell comprising the inhibitor, shRNA and/or the vector; and (4) inhibiting the expression of the procaspase 1 comprising introducing the inhibitor into a cell, which contains an expressionable gene coded for the procaspase 1. ACTIVITY : Antiinflammatory. MECHANISM OF ACTION : Procaspase 1 expression inhibitor.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Inhibitor der Expression der Pro-Caspase 1 sowie ein Verfahren zur Inhibition der Expression der Pro-Caspase 1. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die medizinische Verwendung des Inhibitors zur Prävention und/oder Therapie einer inflammatorischen Erkrankung. Zudem stellt die vorliegende Erfindung eine shRNA, also eine Varläuferform eines Nukleinsäure-Inhibitors der Pro-Caspase 1, einen Vektor, der die Expression eines Nukleinsäure-Inhibitors der Pro-Caspase 1 oder der genannten shRNA vermittelt, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Nukleinsäure-Inhibitor der Pro-Caspase 1 und/oder die genannte shRNA und/oder den beschriebenen Vektor zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, bereit.The present invention relates to an inhibitor of the expression of pro-caspase 1 and a method for inhibiting the expression of pro-caspase 1. Another object of the present invention relates to the medical use of the inhibitor for the prevention and / or treatment of an inflammatory disease. In addition, the present invention provides a shRNA, ie a variant form of a nucleic acid inhibitor of pro-caspase 1, a vector which mediates the expression of a nucleic acid inhibitor of pro-caspase 1 or said shRNA, and a pharmaceutical composition containing the nucleic acid Inhibitor of pro-caspase 1 and / or said shRNA and / or the described vector, together with at least one pharmaceutically acceptable carrier.

Autoinflammatorische Krankheiten werden durch eine Deregulation des angeborenen Immunsystems verursacht. Im Gegensatz zur Autoimmunität sind hierbei keinerlei Autoantikörper oder autoreaktive T-Zellen vorhanden ( Masters et al. (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. (6) 428–433 ). Bei erblichen Fiebersyndromen treten die Fieberschübe häufig grundlos auf, werden aber manchmal auch durch banale Infektionen, Veränderungen des Hormonspiegels, körperliche Belastung oder aber Emotionen ausgelöst. Wiederkehrendes Fieber wird häufig begleitet von Symptomen wie Abdominalschmerzen, Gelenkschmerzen und -entzündungen, sowie Muskelschmerzen und verschiedenen, für die jeweilige Erkrankung spezifischen Anzeichen. Die Unterschiede in den Auswirkungen sind bei verschiedenen Individuen, auch wenn sie dieselben Mutationen aufweisen, sehr groß, sogar innerhalb einer Familie. Fieber kann dabei unregelmäßig, selten oder auch niemals auftreten, trotz Anwesenheit anderer schwerer Entzündungssymptome ( Kallinich et al. (2006) Ann. Rheum. Dis. (65) 958–960 , Touitou et al. (2007) Arthritis Rheum. (56) 1706–1712 ). Die Amyloidose, eine Ablagerung von fibrillärem Protein (Amyloid), die eine eingeschränkte Funktionsfähigkeit oder auch den Funktionsverlust des betroffenen Organs zur Folge haben kann, ist eine der möglichen Komplikationen dieser Erkrankungen.Autoinflammatory diseases are caused by a deregulation of the innate immune system. In contrast to autoimmunity, no autoantibodies or autoreactive T cells are present ( Masters et al. (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. (6) 428-433 ). In hereditary fever syndromes, the fever episodes often occur for no reason, but are sometimes triggered by banal infections, changes in hormone levels, exercise or emotions. Recurring fever is often accompanied by symptoms such as abdominal pain, joint pain and inflammation, as well as muscle aches and various signs specific to the condition. The differences in the effects are very large in different individuals, even if they have the same mutations, even within a family. Fever can be irregular, rare or never occur despite the presence of other severe inflammatory symptoms ( Kallinich et al. (2006) Ann. Rheum. Dis. (65) 958-960 . Touitou et al. (2007) Arthritis Rheum. (56) 1706-1712 ). Amyloidosis, a deposit of fibrillar protein (amyloid), which may result in impaired function or loss of function of the affected organ, is one of the potential complications of these diseases.

Die Caspase 1 (Interleukin-1 converting enzyme, ICE) ist ein proinflammatorisches Enzym, das im Rahmen inflammatorischer Zustände und bei periodischen Fiebersyndromen eine zentrale Rolle einnimmt. Die klassische inflammatorische Reaktion wird dabei durch die enzymatische Aktivierung von Interleukin-1β(IL-1β) und Interleukin-18(IL-18) vermittelt. Um die volle enzymatische Funktion zu erlangen, muss die als Zymogen exprimierte Caspase 1 durch Autoproteolyse in die aktive Form überführt werden. Diese besteht aus einem Heterotetramer aus zwei p10- und zwei p20-Einheiten. Jeweils ein p10/p20-Dimer bildet direkte Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen sowie hydrophobe Wechselwirkungen zu seinem Nachbarmolekül aus.Caspase 1 (interleukin-1 converting enzyme, ICE) is a proinflammatory enzyme that plays a central role in inflammatory conditions and periodic fever syndromes. The classic inflammatory response is mediated by the enzymatic activation of interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-18 (IL-18). To achieve full enzymatic function, the caspase 1 expressed as zymogen must be converted into the active form by autoproteolysis. This consists of a heterotetramer of two p10 and two p20 units. One p10 / p20 dimer forms direct bonds, hydrogen bonds and hydrophobic interactions to its neighboring molecule.

Die bisherigen Untersuchungen fokussierten im Wesentlichen auf die enzymatische Aktivität der Caspase 1. Allerdings gibt es Hinweise, dass auch die Pro-Caspase 1 eine wichtige regulatorische Funktion während der Inflammation hat. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur die mature Caspase 1, sondern auch die Pro-Caspase 1 mit RIP 2 (Receptor-interacting serine/threonine-Protein kinase 2) interagiert ( Sarkar et al. (2006) J. Immunol. (176) 4979–4986 ). Durch eine RIP 2-abhängige Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB und der Signaltransduktion über MAPK p38 wird schließlich eine proinflammatorische Antwort ausgelöst. Offensichtlich ist die NFκB-Aktivierung allerdings unabhängig von der enzymatischen Aktivität der Caspase 1 ( Lamkanfi et al. (2004) J Biol. Chem. (279) 24785–24793 ).The investigations so far focused mainly on the enzymatic activity of caspase 1. However, there is evidence that pro-caspase 1 also has an important regulatory function during inflammation. It could be shown that not only the mature caspase 1 but also the pro-caspase 1 interacts with RIP 2 (receptor-interacting serine / threonine protein kinase 2) ( Sarkar et al. (2006) J. Immunol. (176) 4979-4986 ). By a RIP 2-dependent activation of the transcription factor NFκB and the signal transduction via MAPK p38 finally a proinflammatory response is triggered. Obviously, NFκB activation is independent of the enzymatic activity of caspase 1 (FIG. Lamkanfi et al. (2004) J. Biol. Chem. (279) 24785-24793 ).

Bislang zielten therapeutische Ansätze im Rahmen inflammatorischer Erkrankungen auf eine Hemmung der Caspase 1-Enzymaktivität mittels chemischer Inhibitoren und konsekutiv verminderter Prozessierung von IL-1β und IL-18 ab. Dabei wird jedoch die oben beschriebene Aktivierung von NFκB nicht beeinflusst.So far, therapeutic approaches in the context of inflammatory diseases aimed at inhibiting caspase 1 enzyme activity by means of chemical inhibitors and consecutively reduced processing of IL-1β and IL-18. However, the above-described activation of NFκB is not affected.

Die US 2007/0111934 A1 beschreibt ein Verfahren und ein Mittel zur Inhibition der Oligomerisierung der Pro-Caspase 1, ein Verfahren und ein Mittel zur Inhibition der Aktivierung der Pro-Caspase 1, ein Verfahren und ein Mittel zur Inhibition der Produktion der Caspase 1, und ein Verfahren sowie ein Mittel zur Prävention und/oder Therapie von inflammatorischen Erkrankungen. Der dabei zu Grunde liegende Mechanismus ist jeweils die Inhibition der Bindung von NOD2 an die Pro-Caspase 1. Die Menge der vorhandenen Pro-Caspase 1 wird dabei nicht beeinflusst.The US 2007/0111934 A1 describes a method and an agent for inhibiting the oligomerization of pro-caspase 1, a method and an agent for inhibiting the activation of pro-caspase 1, a method and an agent for inhibiting the production of caspase 1, and a method and agent for the prevention and / or treatment of inflammatory diseases. The underlying mechanism is in each case the inhibition of the binding of NOD2 to the pro-caspase 1. The amount of the existing pro-caspase 1 is not affected.

Die DE 10313636 A1 betrifft die Verwendung zumindest eines Caspase-Inhibitors, insbesondere eines Caspase 3-Inhibitors, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer viralen Infektion, insbesondere einer Infektion mit einem RNA-Negativstrang-Virus, vorzugsweise einer Influenza-Infektion, sowie ein Testsystem zur Identifizierung geeigneter Wirkstoffe. Die in dieser Druckschrift wiedergegebenen Lehren beziehen sich jedoch spezifisch auf eine Inhibition der Caspase 3.The DE 10313636 A1 relates to the use of at least one caspase inhibitor, in particular a caspase 3 inhibitor, for the preparation of a pharmaceutical composition for the prophylaxis and / or treatment of a viral infection, in particular an infection with an RNA negative strand virus, preferably an influenza infection, as well as a Test system for the identification of suitable active substances. However, the teachings given in this document relate specifically to an inhibition of caspase 3.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Hemmung proinflammatorischer Prozesse bereitzustellen. The present invention has for its object to provide a new system for inhibiting proinflammatory processes.

Diese Aufgabe wird durch die in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.This object is achieved by the embodiments of the present invention characterized in the present description and in the claims.

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen Inhibitor der Expression der Pro-Caspase 1 bereit. Durch diesen Inhibitor wird spezifisch die Transkription des Pro-Caspase 1-Gens und/oder die Translation der Pro Caspase 1-mRNA gehemmt.In particular, the present invention provides an inhibitor of the expression of pro-caspase 1. This inhibitor specifically inhibits the transcription of the pro-caspase 1 gene and / or the translation of the pro caspase 1 mRNA.

Überraschenderweise konnte durch Forschungsarbeiten im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass eine CARD-CARD Caspase activation and recruitment domain)-vermittelte Interaktion zwischen der Pro-Caspase 1 und RIP 2 die Aktivierung von NFκB verursacht (siehe Beispiel 1). Dieser Effekt wird durch eine Hemmung der Enzymaktivität der Caspase 1 sogar verstärkt. Beispielsweise wird die NFκB-Aktivierung durch Zugabe des Caspase 1-Inhibitors zYVAD-fmk deutlich erhöht.Surprisingly, it has been shown by research in the present invention that a CARD-CARD caspase activation and recruitment domain) -mediated interaction between the pro-caspase 1 and RIP 2 causes the activation of NFκB (see Example 1). This effect is even enhanced by an inhibition of the enzyme activity of caspase 1. For example, NFκB activation is markedly increased by the addition of the caspase 1 inhibitor zYVAD-fmk.

Weiterhin konnte durch diese Forschungsarbeiten gezeigt werden, dass mutierte Formen der Caspase 1, bei denen aufgrund von Punktmutationen einzelne Aminosäuren ausgetauscht wurden, eine im Vergleich zum Wildtyp reduzierte enzymatische Aktivität aufweisen und gleichzeitig eine signifikant erhöhte Ausschüttung von NFκB zur Folge haben. Es konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass innerhalb einer Gruppe von Patienten, die unter regelmäßig auftretenden Fieberschüben und Anthralgie leiden, die Anzahl an Missense-Mutationen im Caspase 1-Gen erhöht ist. Der Großteil der Patienten mit mutierter Caspase 1 ist heterozygot in Bezug auf die entsprechende Mutation.Furthermore, it could be shown by this research that mutated forms of caspase 1, in which single amino acids were exchanged due to point mutations, have a reduced enzymatic activity compared to the wild type and at the same time result in a significantly increased release of NFκB. According to the invention, it has been shown that the number of missense mutations in the caspase-1 gene is increased within a group of patients suffering from recurrent episodes of fever and anthralgia. The majority of patients with mutated caspase 1 are heterozygous for the corresponding mutation.

Darüber hinaus scheint die Caspase 1 offensichtlich an atypischer Proteinsekretion beteiligt zu sein. In diesem Zusammenhang haben sich erfindungsgemäß Hinwiese dafür ergeben, dass die Caspase 1 unabhängig von ihrer enzymatischen Aktivität an der Sekretion von IL-1β, aber auch von IL-1α beteiligt ist. Zudem ist anzunehmen, dass auch eine enzymatisch inaktive Caspase 1 als Gerüstprotein innerhalb des Inflammasoms fungieren könnte und somit auch ohne enzymatische Aktivität eine pro-inflammatorische Wirkung entfaltet. Deshalb ist erfindungsgemäß das Angriffsziel eines geeigneten Therapieansatzes nicht die Aktivität der Caspase-1, sondern die Menge an vorhandenem Caspase 1- bzw. Pro-Caspase-1-Protein, unabhängig von deren enzymatischer Aktivität.In addition, caspase 1 appears to be involved in atypical protein secretion. In this connection, according to the invention, there have been indications that caspase 1, irrespective of its enzymatic activity, is involved in the secretion of IL-1β, but also of IL-1α. In addition, it can be assumed that an enzymatically inactive caspase 1 could also function as a scaffold protein within the inflammasome and thus develop a pro-inflammatory effect even without enzymatic activity. Therefore, according to the invention, the target of a suitable therapeutic approach is not the activity of caspase-1 but the amount of caspase 1 or pro-caspase-1 protein present, regardless of their enzymatic activity.

Somit birgt die vorliegende Erfindung einen wichtigen Vorteil im Vergleich zur im Stand der Technik beschriebenen Hemmung der Caspase 1-Enzymaktivität mittels chemischer Inhibitoren. Die im Stand der Technik bekannten Methoden führen nicht zu einer Reduktion der Proteinmenge der Pro-Caspase 1 bzw. Caspase 1 und können deshalb die von der Pro-Caspase 1 vermittelte NFκB-Aktivierung bzw. die unabhängig von ihrer enzymatischen Aktivität vorhandene pro-inflammatorische Wirkung der Pro-Caspase 1 bzw. Caspase 1 nicht beeinflussen. Im Gegenteil resultiert die reduzierte Enzymaktivität der Caspase 1 in einer verminderten Autoproteolyse, wodurch die Proteinmenge der Pro-Caspase 1 erhöht und die von ihr vermittelte Inflammationsantwort verstärkt wird.Thus, the present invention has an important advantage over the inhibition of caspase 1 enzyme activity by chemical inhibitors described in the prior art. The methods known in the prior art do not lead to a reduction in the protein amount of pro-caspase 1 or caspase 1 and can therefore mediate the pro-caspase 1 mediated NFκB activation or the pro-inflammatory effect independent of its enzymatic activity the pro-caspase 1 or caspase 1 not affect. On the contrary, the reduced enzyme activity of caspase 1 results in a decreased autoproteolysis, which increases the protein amount of pro-caspase 1 and enhances the inflammation response it mediates.

Ein geeigneter Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete Nukleinsäure. Derartige Nukleinsäuren binden üblicherweise Sequenz-spezifisch an eine für die Pro-Caspase 1 codierende mRNA und führen ggf. zu deren Abbau und/oder verhindern in anderer Weise eine effiziente Translation der mRNA in das Protein.A suitable inhibitor according to the present invention is, for example, a nucleic acid directed against the pro-caspase 1 mRNA. Such nucleic acids usually bind sequence-specifically to an mRNA coding for the pro-caspase 1 and possibly lead to their degradation and / or otherwise prevent an efficient translation of the mRNA into the protein.

Bevorzugt ist diese Nukleinsäure eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete siRNA oder eine gegen die Pro-Caspase 1 gerichtete miRNA, pri- oder pre-miRNA oder ein gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtetes Antisense-Oligonukleotid.This nucleic acid is preferably an siRNA directed against the pro-caspase 1 mRNA or a miRNA directed against the pro-caspase 1, pri- or pre-miRNA or an antisense oligonucleotide directed against the pro-caspase 1 mRNA.

siRNAs (short interfering RNAs) sind kurze Ribonukleinsäure-Moleküle, die zur RNA-Interferenz (RNAi) führen. Der Begriff RNA-Interferenz wurde geprägt durch die Entdeckung, dass die Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) bei dem Nematoden C. elegans zur spezifischen Abschattung von Genen führt, wobei die Gen-Sequenzen große Homologien zur Sequenz der eingebrachten RNA aufweisen ( Fire et al. (1998) Nature (6669) 806–811 ). Schließlich wurde auch die erfolgreiche Anwendung der RNA-Interferenz in humanen Zellen demonstriert ( Eibashir et al. (2001) Nature (411) 494–498 ). Die durch dsRNA-Moleküle vermittelte RNA-Interferenz ist als Technik zur gezielten Abschattung von Genen sowohl in vitro als auch in vivo inzwischen gut etabliert ( Kim et al. (2007) Nat. Rev. Gen. (8) 173–184 und darin zitierte Referenzen ). Die siRNAs sind dabei gegen komplementäre RNAs gerichtet und führen durch Spaltung und Abbau der RNA zur post-transkriptionellen Abschaltung der Ziel-Gene, auch bekannt als „post-transcriptional gene silencing” (PTGS).siRNAs (short interfering RNAs) are short ribonucleic acid molecules that lead to RNA interference (RNAi). The term RNA interference was characterized by the discovery that the injection of double-stranded RNA (dsRNA) in the nematode C. elegans leads to the specific shadowing of genes, wherein the gene sequences have large homologies to the sequence of the introduced RNA ( Fire et al. (1998) Nature (6669) 806-811 ). Finally, the successful application of RNA interference in human cells has also been demonstrated ( Eibashir et al. (2001) Nature (411) 494-498 ). RNA interference mediated by dsRNA molecules has become well established as a technique for targeted shadowing of genes both in vitro and in vivo ( Kim et al. (2007) Nat. Rev. Gen. (8) 173-184 and references cited therein ). The siRNAs are included directed against complementary RNAs and lead by cleavage and degradation of RNA for post-transcriptional shutdown of the target genes, also known as "post-transcriptional gene silencing" (PTGS).

miRNAs (micro RNAs) sind nicht-codierende doppelsträngige Ribonukleinsäuren mit einer Länge Von ca. 10 bis 30 Nukleotiden und gehören zu den am häufigsten vorkommenden kleinen RNA-Molekülen in Tieren. Sie sind an der Genregulation beteiligt, auch sie lösen RNA-Interferenz aus. Die für miRNAs codierenden Sequenzen befinden sich an verschiedenen Stellen des Genoms. Die Transkription dieser Sequenzen durch die RNA-Polymerase II, seltener durch die RNA-Polymerase III liefert ein primäres Transkript, eine so genannte pri-miRNA, mit 5'-Cap und Poly-A-Schwanz. Die Prozessierung dieses Primärtranskripts durch eine nukleare RNAse III (Drosha) führt zur so genannten pre-miRNA, einer Haarnadelstruktur mit ca. 60 bis 80 Nukleotiden, die ins Cytoplasma exportiert und dort weiter prozessiert wird, wobei eine doppelsträngige Spezies aus dem Stamm der Haarnadelstruktur durch eine cytoplasmatische, Doppelstrang-spezifische RNase III (Dicer) ausgeschnitten wird. In weiteren Schritten binden die entstandenen RNA-Moleküle entweder an den 3'-untranslatierten Bereich der mRNA der zu regulierenden Gene und bewirken so eine Translations-Repression oder sie werden in den RISC-Komplex eingebaut und lösen Letztendlich eine Abschaltung der entsprechenden Gene über den siRNA-Pathway (siehe oben) aus. Demgemäß könnte eine Inhibition der Pro-Caspase 1 im Sinne der vorliegenden Erfindung auch durch ein miRNA-Molekül bewerkstelligt werden. Die Mechanismen der Genregulation durch miRNAs sind dem Fachmann bekannt und können ausführlich der Publikation Felekkis et al. (2010, Hippokratia (14,4) 236–240) entnommen werden. miRNAs sind in verschiedenen Tierzellen zu finden, werden inzwischen aber auch synthetisch hergestellt und könnten zur Genregulation in Zellen mit Hilfe von RNA-Interferenz benutzt werden.miRNAs (micro RNAs) are non-coding double-stranded ribonucleic acids with a length of about 10 to 30 nucleotides and are among the most abundant small RNA molecules in animals. They are involved in gene regulation, they also trigger RNA interference. The sequences coding for miRNAs are located at different parts of the genome. The transcription of these sequences by the RNA polymerase II, more rarely by the RNA polymerase III provides a primary transcript, a so-called pri-miRNA, with 5'-cap and poly-A tail. The processing of this primary transcript by a nuclear RNAse III (Drosha) leads to the so-called pre-miRNA, a hairpin structure of about 60 to 80 nucleotides, which is exported to the cytoplasm and further processed there, with a double-stranded species from the stem of the hairpin through a cytoplasmic, double strand-specific RNase III (Dicer) is excised. In further steps, the resulting RNA molecules either bind to the 3'-untranslated region of the mRNA of the genes to be regulated and thus cause a translation repression or they are incorporated into the RISC complex and ultimately trigger a shutdown of the corresponding genes via the siRNA -Pathway (see above). Accordingly, inhibition of pro-caspase 1 in the sense of the present invention could also be accomplished by a miRNA molecule. The mechanisms of gene regulation by miRNAs are known in the art and can be read in detail in the publication Felekkis et al. (2010, Hippokratia (14,4) 236-240) be removed. miRNAs can be found in different animal cells, but are now also synthetically produced and could be used for gene regulation in cells by means of RNA interference.

Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird somit durch einen siRNA- oder miRNA-Ansatz ein Knock-Down der Pro-Caspase 1 auf mRNA-Ebene erzeugt. Dies führt zur verminderten Expression von Pro-Caspase 1 und maturer Caspase 1. Somit kann zusätzlich zur bislang angewandten Hemmung der enzymatischen Aktivität der Caspase 1 nun auch die von der Pro-Caspase 1 ausgehende proinflammatorische Wirkung ausgeschaltet oder mindestens herabgesetzt werden.According to this embodiment of the present invention, a knock-down of the pro-caspase 1 on the mRNA level is thus produced by an siRNA or miRNA approach. This leads to the reduced expression of pro-caspase 1 and mature caspase 1. Thus, in addition to the hitherto used inhibition of the enzymatic activity of caspase 1, the pro-inflammatory action emanating from the pro-caspase 1 can now be eliminated or at least reduced.

Die für die Auslösung von RNA-Interferenz verantwortlichen dsRNA-Moleküle enthalten einen Strang, der der Nukleotid-Sequenz der Ziel-RNA entspricht (d. h. der mRNA der Pro-Caspase 1). Dieser Strang wird als „Sense”- oder auch „Passenger”-Strang bezeichnet. Der zweite Strang ist in seiner Sequenz revers und komplementär zum „Sense”- oder „Passenger”-Strang sowie zur Ziel-RNA. Dieser Strang wird „Antisense”- oder „Guide”-Strang genannt und bildet mit dem „Sense”- oder „Passenger”-Strang ein Duplex-Molekül. Während der post-transkriptionellen Abschaltung von Genen mit Hilfe von siRNA-Molekülen wird nur der „Antisense”- oder „Guide”-Strang in den so genannten RISC-Komplex geladen. (Wird der „Passenger”-Strang in den RISC-Komplex geladen, wird die Ziel-RNA nicht erkannt, und es findet keine RNA-Interferenz statt) Die ersten zehn Nukleotide am 5'-Ende des „Guide”-Strangs enthalten die so genannte „Seed”-Region, die als zentrale Region für die Erkennung der mRNA im RISC-Komplex gilt. Deshalb sollte die Sequenz innerhalb der „Seed”-Region des „Guide”-Strangs im besten Fall zu 100% der Sequenz der Ziel-RNA, hier also einem entsprechenden Sequenzanteil der Pro-Caspase 1-mRNA, entsprechen.The dsRNA molecules responsible for inducing RNA interference contain a strand that corresponds to the nucleotide sequence of the target RNA (i.e., the mRNA of pro-caspase 1). This strand is called a "sense" or "Passenger" strand. The second strand is reverse in its sequence and complementary to the "sense" or "Passenger" strand as well as the target RNA. This strand is called "antisense" or "guide" strand and forms a duplex molecule with the "sense" or "passenger" strand. During post-transcriptional shedding of genes using siRNA molecules, only the "antisense" or "guide" strand is loaded into the so-called RISC complex. (When the "Passenger" strand is loaded into the RISC complex, the target RNA is not recognized and there is no RNA interference.) The first ten nucleotides at the 5 'end of the "Guide" strand contain the so called "seed" region, which is considered the central region for the recognition of mRNA in the RISC complex. Therefore, the sequence within the "seed" region of the "guide" strand should correspond at best to 100% of the sequence of the target RNA, in this case a corresponding sequence portion of the pro-caspase 1 mRNA.

Zumindest eine Vorauswahl geeigneter siRNA-Zielsequenzen der Pro-Caspase-1-mRNA bzw. von siRNA-Doppelsträngen, die gegen die Pro-Caspase-1-mRNA gerichtet sind, lässt sich durch im Stand der Technik bekannte Algorithmen wie bspw. dem Whitehead Institute siRNA Selection Web Server ( http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA ; vgl. Yuan et al. (2004) Nucl. Acids Res. 32, Web Server Ausgabe, W130–W134 ) treffen.At least a pre-selection of suitable siRNA target sequences of the pro-caspase-1 mRNA or of siRNA double strands directed against the pro-caspase-1 mRNA can be determined by algorithms known in the art, such as, for example, the Whitehead Institute siRNA Selection Web Server ( http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA ; see. Yuan et al. (2004) Nucl. Acids Res. 32, Web Server Edition, W130-W134 ) to meet.

Im Stand der Technik sind unterschiedliche siRNA-Ausführungsformen beschrieben worden. So beschreibt die US 2004/259247 A1 die RNA-Interferenz mit Hilfe von dsRNA, wobei die Moleküle eine Länge von 19–23 Nukleotiden aufweisen und mindestens einer der Stränge am 3'-Ende einen Überhang von 1–5 Nukleotiden hat. Selbstverständlich können siRNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung das in der US 2004/259247 A1 beschriebene Design aufweisen. Besonders bevorzugte siRNA-Spezies der vorliegenden Erfindung mit einer wie in der US 2004/259247 A1 beschriebenen Ausgestaltung weisen an einem oder beiden Strängen an dem 3'-Ende einen Überhang von ein oder zwei U-, mehr bevorzugt ein oder zwei T-Nukleotiden auf.Different siRNA embodiments have been described in the prior art. That's how it describes US 2004/259247 A1 the RNA interference by means of dsRNA, wherein the molecules have a length of 19-23 nucleotides and at least one of the strands at the 3 'end has an overhang of 1-5 nucleotides. Of course, siRNA molecules of the present invention can be used in the US 2004/259247 A1 have described design. Particularly preferred siRNA species of the present invention having a structure as in US 2004/259247 A1 described embodiment have on one or both strands at the 3 'end an overhang of one or two U, more preferably one or two T-nucleotides.

In einer anderen Ausführungsform können siRNAs der vorliegenden Erfindung gemäß WO 2010/0997414 ausgestaltet sein. Diese beschreibt dsRNA-Moleküle mit einer Länge von 10 bis 26 Nukleotiden und zusätzlich 3 bis 10 G/C-Hasenpaaren am 5'-Ende des Sense- und am 3'-Ende des Antisense-Strangs. Zudem können derartige dsRNA-Moleküle einen 3'-Überhang von 1 bis 5 Nukleotiden am Sense-Strang aufweisen.In another embodiment, siRNAs of the present invention may be prepared according to WO 2010/0997414 be designed. This describes dsRNA molecules with a length of 10 to 26 nucleotides and additionally 3 to 10 G / C rabbit pairs at the 5 'end of the sense and at the 3' end of the antisense strand. In addition, such dsRNA molecules can have a 3 'overhang of 1 to 5 nucleotides on the sense strand.

Die dsRNA-Moleküle zur Inhibition der Pro-Caspase 1-Expression gemäß der vorliegenden Erfindung können demgemäß eine gesamte Länge von beispielsweise 19–30 Nukleotiden, bevorzugt von 21–25 Nukleotiden haben. The dsRNA molecules for inhibiting pro-caspase 1 expression according to the present invention may accordingly have a total length of, for example, 19-30 nucleotides, preferably 21-25 nucleotides.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorläuferform der oben dargestellten siRNA, eine entsprechende shRNA (short hairpin RNA). Die für die shRNA codierende Sequenz wird üblicherweise in einen Expressionsvektor kloniert, um nach Einbringen des Vektors in die Zelle so die Expression der shRNA, deren nachfolgende Prozessierung zur siRNA und dadurch die RNA-Interferenz auszulösen. Der bevorzugte Aufbau der üblicherweise ca. 50–60 Nukleotide langen shRNA ist dabei wie folgt: eine Nukleotidsequenz mit einer Länge von 19–29 Nukleotiden, entsprechend der Sequenz des Ziel-Gens, gefolgt von einer so genannten „Spacer-Region von 4–15 Nukleotiden und einer Sequenz, die revers und komplementär zur ersten Sequenz ist. Bei dieser Ausführungsform kann die für die shRNA codierende Sequenz zunächst beispielsweise über einen lentiviralen Vektor als DNA-Molekül in das Genom der Zelle integriert werden. Wird diese lineare Matrize durch die RNA-Polymerase III transkribiert, kommt es aufgrund der intramolekularen Komplementarität des Moleküls zur spontanen Ausbildung einer Haarnadel-Struktur, sodass sich Sense- und Antisense-Strang aneinanderlagern. Nach Export der shRNA aus dem Nukleus wird diese im Cytoplasma durch das Protein Dicer erkannt und prozessiert, sodass ein reifes siRNA-Molekül, ein Duplexmolekül mit einer Länge von 21–23 Nukleotiden und 2–3 Nukleotiden Überhang am 3'-Ende der jeweiligen Stränge, entsteht. Die oben angegebene erste Sequenz stellt dabei den Sense-Strang, die letzte den Antisense-Strang der siRNA dar. Die hier dargestellten Vorgänge sind dem Fachmann bekannt und des Weiteren beispielsweise in Sliva et al. (2010, Vir. J. (7) 248–258) und Paddison et al. (2002, Genes Dev. (16) 948–958) wiedergegeben. Die Möglichkeit, RNA-Interferenz, wie hier beschrieben, mit Hilfe von shRNA in einem lentiviralen Expressionsvektor auszulösen, birgt den Vorteil der stabilen Integration der shRNA im Genom der transduzierten Zelle, und somit einer permanenten Expression der siRNA, wodurch eine kontinuierliche Suppression des Ziel-Gens über einen längeren Zeitraum erreicht werden kann.Another object of the present invention is a precursor form of the siRNA shown above, a corresponding shRNA (short hairpin RNA). The sequence coding for the shRNA sequence is usually cloned into an expression vector to trigger the expression of the shRNA after insertion of the vector into the cell, their subsequent processing to siRNA and thereby the RNA interference. The preferred structure of the usually about 50-60 nucleotides long shRNA is as follows: a nucleotide sequence with a length of 19-29 nucleotides, corresponding to the sequence of the target gene, followed by a so-called "spacer region of 4-15 Nucleotides and a sequence that is reverse and complementary to the first sequence. In this embodiment, the sequence coding for the shRNA can first be integrated, for example, via a lentiviral vector as a DNA molecule into the genome of the cell. When this linear template is transcribed by RNA polymerase III, the intramolecular complementarity of the molecule leads to the spontaneous formation of a hairpin structure, with the result that the sense and antisense strands adhere to one another. After export of shRNA from the nucleus, it is recognized and processed in the cytoplasm by the Dicer protein, thus producing a mature siRNA molecule, a duplex molecule 21-23 nucleotides in length, and 2-3 nucleotides overhang at the 3 'end of the respective strands , arises. The above-mentioned first sequence represents the sense strand, the last the antisense strand of the siRNA. The processes illustrated here are known to the person skilled in the art and furthermore, for example, in US Pat Sliva et al. (2010, Vir. J. (7) 248-258) and Paddison et al. (2002, Genes Dev. (16) 948-958) played. The possibility of inducing RNA interference, as described here, by means of shRNA in a lentiviral expression vector has the advantage of stable integration of the shRNA in the genome of the transduced cell, and thus of permanent expression of the siRNA, whereby a continuous suppression of the target Gene can be achieved over a longer period of time.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Nukleinsäure-Inhibitior wie beispielsweise die siRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid gegen alle Isoformen der Pro-Caspase 1 gerichtet. Hierzu sind die siRNA und/oder die miRNA und/oder die pri-miRNA und/oder die pre-miRNA und/oder die shRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid beispielsweise Sequenzspezifisch gegen den 3'-untranslatierten Bereich der Pro-Caspase 1-mRNA gerichtet.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid inhibitor such as, for example, the siRNA and / or the antisense oligonucleotide is directed against all isoforms of the pro-caspase 1. For this purpose, the siRNA and / or the miRNA and / or the pri-miRNA and / or the pre-miRNA and / or the shRNA and / or the antisense oligonucleotide are, for example, sequence-specific against the 3'-untranslated region of the pro-caspase 1. directed mRNA.

In weiteren Ausführungsformen können die siRNA und/oder die miRNA und/oder die pri-miRNA und/oder die pre-miRNA und/oder die shRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid gegen die CARD-Domäne oder die p20-Domäne der Pro-Caspase 1-mRNA gerichtet sein.In further embodiments, the siRNA and / or the miRNA and / or the pri-miRNA and / or the pre-miRNA and / or the shRNA and / or the antisense oligonucleotide may be directed against the CARD domain or the p20 domain of the protein. Be directed to caspase 1 mRNA.

In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die sRNA und/oder die miRNA und/oder die pri-miRNA und/oder die pre-miRNA und/oder die shRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid in einem Bereich der Pro-Caspase 1-mRNA binden, in dem sich beispielsweise bei Patienten mit autoinflammatorischen Krankheiten häufig Punktmutationen befinden. Besonders bevorzugt sind dabei die folgenden Mutationen der Caspase 1 (es wird der 1-Buchstabencode für Aminosäuren verwendet; der erste Buchstabe bezeichnet die Aminosäure im Wildtyp, die Zahl die Aminosäureposition in der Sequenz der Pro-Caspase-1 und der zweite Buchstabe die Aminosäure in der Mutante): R221 C, R240Q, N263S, L265S, T267I, K319R, A329T. Diesen Mutationen auf Proteinebene entsprechen auf mRNA-Ebene folgende Mutationen in der Zielsequenz für den erfindungsgemäßen Inhibitor: C661T, G719A, A788G, T149C, C900T, A956G bzw. G958A (die Ziffern beziehen sich auf die Konsensuscodierungssequenz (d. h. Start- bis Stopp-Codon) innerhalb der mRNA; vgl. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi?REQU EST=CCDS&GO=MainBrowse&DATA=CCDS8330.1 ). Dabei ist es besonders bevorzugt, dass sich die der Punktmutation entsprechende Sequenz im Bereich der Seed-Region des Guide-Strangs befindet, um eine im Vergleich zur Wildtyp-mRNA (also der nicht-mutierten Form) effizientere Bindung des Inhibitors an die mRNA von mutierten Pro-Caspase 1-Varianten und somit deren Degradation zu ermöglichen.In further embodiments of the present invention, it is preferred that the sRNA and / or the miRNA and / or the pri-miRNA and / or the pre-miRNA and / or the shRNA and / or the antisense oligonucleotide in a range of Pro Caspase 1 mRNA bind in which, for example, in patients with autoinflammatory diseases are often point mutations. Particularly preferred are the following mutations of caspase 1 (the 1-letter code for amino acids is used, the first letter denotes the amino acid in the wild type, the number the amino acid position in the sequence of the pro-caspase-1 and the second letter the amino acid in the mutant): R221C, R240Q, N263S, L265S, T267I, K319R, A329T. These mutations at the protein level correspond at mRNA level to the following mutations in the target sequence for the inhibitor according to the invention: C661T, G719A, A788G, T149C, C900T, A956G and G958A (the numbers refer to the consensus coding sequence (ie start to stop codon) within the mRNA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi?REQU EST = CCDS & GO = MainBrowse & DATA = CCDS8330.1 ). It is particularly preferred that the sequence corresponding to the point mutation is in the region of the seed region of the guide strand in order to bind the inhibitor to the mutant mRNA more efficiently than the wild-type mRNA (ie the non-mutated form) Pro caspase 1 variants and thus to allow their degradation.

Der Vorteil dieser Ausführungsform liegt darin, dass dadurch gezielt die Expression der mutierten Caspase 1 bzw. Pro-Caspase 1 inhibiert wird, während die Expression der Wildtyp-Caspase 1 bzw. der Wildtyp-Pro-Caspase 1 weniger stark unterdrückt wird. Somit ist es – bei Patienten mit autoinflammatorischen Krankheiten, die heterozygot in Bezug auf die entsprechende Punktmutation sind – möglich, eine potentiell durch einen Caspase 1-Knock-Down vermittelte Immunsuppression zu verhindern und dennoch die durch die mutierte Pro-Caspase 1 bzw. mutierte Caspase 1 vermittelte proinflammatorische Anwort herabzuregulieren.The advantage of this embodiment is that it specifically inhibits the expression of the mutated caspase 1 or pro-caspase 1, while the expression of the wild-type caspase 1 or the wild-type pro-caspase 1 is less strongly suppressed. Thus, in patients with autoinflammatory diseases who are heterozygous for the corresponding point mutation, it is possible to prevent potential caspase 1 knock-down mediated immunosuppression and yet those by mutant pro-caspase 1 and mutated caspase, respectively 1 down-regulated proinflammatory response.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entspricht die Zielsequenz der bevorzugten Nukleinsäure-Inhibitoren, insbesondere der siRNA einer der folgenden Sequenzen:

Figure 00100001
In a particularly preferred embodiment of the present invention, the target sequence of the preferred nucleic acid inhibitors, in particular the siRNA, corresponds to one of the following sequences:
Figure 00100001

In dieser Darstellung sind die mutierten Codons der mRNA der (Pro-)Caspase 1-Varianten fett gedruckt.In this representation, the mutated codons of the mRNA of the (pro-) caspase 1 variants are printed in bold.

Besonders bevorzugt sind die folgenden siRNAs:

Figure 00100002
Figure 00110001
In dieser Darstellung sind in der oberen Zeile jeweils die Sequenzen der Sense-(= Passenger-) Stränge angegeben. Die entsprechenden, in der zweiten Zeile dargestellten, Antisense-(= Guide-) Stränge können schließlich an die mRNA binden und die RNA-Interferenz induzieren.Particularly preferred are the following siRNAs:
Figure 00100002
Figure 00110001
In this representation, the sequences of the sense (= passenger) strands are indicated in the upper line. The corresponding antisense (= guide) strands shown in the second line can eventually bind to the mRNA and induce RNA interference.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die obigen siRNAs gemäß der Erfindung am 3'-Ende mindestens eines Stranges (d. h., des Passenger- und/oder des Guide-Stranges) einen Überhang, beispielsweise aus 1, 2 oder 3 Nukleotiden aufweisen, z. B. Überhange aus Ribonukleotiden, beispielsweise U-Überhänge. Weiterhin bevorzugt sind Überhänge aus Desoxyribonukleotiden, beispielsweise T-Überhänge.In a further preferred embodiment, the above siRNAs according to the invention may have an overhang at the 3 'end of at least one strand (ie, the Passenger and / or the Guide strand), for example, from 1, 2 or 3 nucleotides, for. B. Overhangs of ribonucleotides, such as U-overhangs. Also preferred are overhangs of deoxyribonucleotides, for example T overhangs.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen weisen die obigen erfindungsgemäßen siRNAs mindestens 3 GC-Paare am 5'-Ende des Passenger-Stranges und am 3'-Ende des Guide-Stranges auf, wie in der WO 2010097414 (A1) dargestellt.In further preferred embodiments, the above siRNAs according to the invention have at least 3 GC pairs at the 5 'end of the Passenger strand and at the 3' end of the guide strand, as in WO 2010097414 (A1) shown.

Die Stabilität von RNA-Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen erhöht werden:
Falls vorhanden, kann der 3'-Überhang am Passenger-Strang einer erfindungsgemäßen siRNA durch die Auswahl eines Purin-Nukleotids, insbesondere eines Adenosin- oder Guanin-Nukleotids an dieser Stelle erhöht werden. Alternativ kann ein Pyrimidin-Nukleotid am 3'-Überhang durch ein modifiziertes Analogon ersetzt werden, im Fall von Uridin z. B. durch 2'-Deoxythymidin.The stability of RNA molecules according to the present invention can be increased by one or more of the following measures:
If present, the 3'-overhang on the Passenger strand of an siRNA according to the invention can be increased by the selection of a purine nucleotide, in particular an adenosine or guanine nucleotide at this point. Alternatively, a pyrimidine nucleotide on the 3'-overhang may be replaced by a modified analog, in the case of uridine, for example. B. by 2'-deoxythymidine.

Zudem kann das RNA-Molekül mindestens ein modifiziertes Nukleotid-Analogon enthalten, insbesondere innerhalb der Region, die die dsRNA ausbildet.In addition, the RNA molecule may contain at least one modified nucleotide analog, especially within the region that forms the dsRNA.

Die chemische Modifikation der Nukleotid-Analoga kann an den Ribose-, Phosphatund/oder Basen-Resten erfolgen. Zur Produktion von Molekülen mit erhöhter Stabilität, insbesondere im Bezug auf RNA-abbauende Enzyme, sind Modifikationen am Rückgrat, also an den Ribose- und/oder Phosphat-Resten bevorzugt.The chemical modification of the nucleotide analogs may be at the ribose, phosphate and / or base residues. For the production of molecules with increased stability, in particular with respect to RNA-degrading enzymes, modifications to the backbone, ie at the ribose and / or phosphate residues are preferred.

Bevorzugte Beispiele der Ribonukleotide mit modifizierten Ribose-Resten sind Analoga, bei denen die 2'-OH-Gruppe durch eine der folgenden Gruppen ersetzt wird: H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 oder CN, wobei R ein C1-C6-Alkyl, -Alkenyl oder -Alkylyl und halo F, Cl, Br oder I ist. Für den Fachmann steht es außer Frage, dass der Begriff „modifizierte Ribonukleotide” hier auch 2'-Deoxyderivate enthält, die in einigen Fällen auch als „Deoxynukleotide” bezeichnet werden. Diese 2'-O-modifizierten Analoga wie z. B. 2'-Methyl-Analoga können auch in der Seed-Region enthalten sein, beispielsweise an Position 2 des Guide-Strangs (vom 5'-Ende aus), um so genannte „off target”-, also unspezifische Effekte zu minimieren.Preferred examples of the modified ribose ribonucleotides are analogs in which the 2'-OH group is replaced by one of the following groups: H, OR, R, halo, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 or CN where R is a C 1 -C 6 -alkyl, -alkenyl or -alkylyl and halo is F, Cl, Br or I. It is beyond doubt for a person skilled in the art that the term "modified ribonucleotides" also includes 2'-deoxy derivatives, which in some cases are also referred to as "deoxynucleotides". These 2'-O-modified analogs such. B. 2'-methyl analogs may also be included in the seed region, for example, at position 2 of the guide strand (from the 5'-end) in order to minimize so-called "off target", ie unspecific effects.

Wie bereits erwähnt, können modifizierte Ribonukleotide auch Analoga mit chemischen Modifikationen des Basen-Restes sein. Beispiele derartiger Analoga wären 5-Aminaallyl-Uridin, 6-Aza-Uridin, 8-Aza-Adenosin, 5-Bromo-Uridin, 7-Deaza-Adenosin, 7-Deaza-Guanin, N6-Methyl-Adenosin, 5-Methyl-Cytidin, Pseudo-Uridin und 4-Thio-Uridin. Dabei ist die Auswahl der möglichen Analoga nicht auf die hier angegebenen Bespiele begrenzt.As already mentioned, modified ribonucleotides may also be analogues with chemical modifications of the base moiety. Examples of such analogs would be 5-aminoallyl-uridine, 6-aza-uridine, 8-aza-adenosine, 5-bromo-uridine, 7-deaza-adenosine, 7-deaza-guanine, N 6 -methyl-adenosine, 5-methyl Cytidine, pseudo-uridine and 4-thio-uridine. The choice of possible analogues is not limited to the examples given here.

Beispiele für Rückgrat-modifizierte Ribonukleotide, bei denen die Phosphoester-Gruppe zwischen benachbarten Ribonukleotiden modifiziert ist, wären Phosphothioat-Gruppen.Examples of backbone-modified ribonucleotides in which the phosphoester group is modified between adjacent ribonucleotides would be phosphothioate groups.

Durch die vorliegende Erfindung wird außerdem ein Vektor bereitgestellt, der für einen Nukleinsäure-Inhibitor der Pro-Caspase 1 gemäß den obigen Darstellungen oder für die oben beschriebene shRNA codiert. In bevorzugten Ausführungsformen vermittelt der Vektor die Expression des Nukleinsäure-Inhibitors und/oder der shRNA. Zur Herstellung eines derartigen Vektors eignet sich beispielsweise der pLKO.1 TRC Cloning Vector der Firma addgene.The present invention also provides a vector coding for a nucleic acid inhibitor of pro-caspase 1 as shown above or for the shRNA described above. In preferred embodiments, the vector mediates the expression of the nucleic acid inhibitor and / or the shRNA. For the production of such a vector, for example, the pLKO.1 TRC Cloning Vector of the company addgene is suitable.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die einen Nukleinsäure-Inhibitor der Pro-Caspase 1 und/oder eine shRNA und/oder einen Vektor, jeweils gemäß den Darstellungen dieser Beschreibung, enthält. Mögliche Wirtszellen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Wirtszellen, die zur Propagierung von Vektoren benutzt werden, die für einen Nukleinsäure-Inhibitor und/oder eine shRNA codieren, sind bevorzugt prokaryotische Zellen, besonders bevorzugt Bakterien, wie z. B. Escherichia coli-Zellen. Wirtszellen, die Vektoren enthalten, die die Expression des Nukleinsäure-Inhibitors oder der shRNA vermitteln, sind bevorzugt eukaryotische Zellen, noch mehr bevorzugt Säugetier-Zellen, besonders bevorzugt humane Zellen.A further subject of the present invention is a host cell which contains a nucleic acid inhibitor of the pro-caspase 1 and / or a shRNA and / or a vector, in each case according to the representations of this description. Possible host cells for the purposes of the present invention are, for example, prokaryotic or eukaryotic cells. Host cells used to propagate vectors encoding a nucleic acid inhibitor and / or shRNA are preferably prokaryotic cells, more preferably bacteria, such as e.g. B. Escherichia coli cells. Host cells containing vectors that mediate expression of the nucleic acid inhibitor or shRNA are preferably eukaryotic cells, more preferably mammalian cells, more preferably human cells.

Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Inhibition der Expression der Pro-Caspase 1, bei dem mindestens ein erfindungsgemäßer Inhibitor in eine Zelle eingebracht wird, die ein expressionsfähiges, für die Pro-Caspase 1 codierendes Gen enthält. Vorzugsweise wird der Inhibitor in eine humane Zelle eingebracht.Furthermore, the present invention describes a method for inhibiting the expression of the pro-caspase 1, in which at least one inhibitor according to the invention is introduced into a cell which contains an expressible gene coding for the pro-caspase 1 gene. Preferably, the inhibitor is introduced into a human cell.

Eine Möglichkeit zur Einbringung des Inhibitors in die Zelle stellt beispielsweise die Infektion der Zelle mit einem viralen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung dar, auch als virale Transduktion bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein lentiviraler Transfer vorgenommen. Weitere Vektoren der vorliegenden Erfindung sind Retroviren, Adeno- und Adeno-assoziierte Viren, Baculoviren und replizierende Viren. Alternative Einbringungsmethoden wären Elektroporation der Zelle oder die Transfektion mit Hilfe von Liposomen oder synthetischen, kationischen Polymer-Nanopartikeln als Trägersubstanz oder nach der Bindung des Inhibitors an eine hydrophobe Gruppe wie Cholesterol. Diese und weitere Einbringungsmöglichkeiten genetischer Vehikel oder allgemein von Nukleinsäuren in Zellen sind einem Fachmann bekannt und können der neuesten Ausgabe von Asubel et al. (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA entnommen werden.One way to introduce the inhibitor into the cell, for example, is to infect the cell with a viral vector according to the present invention, also known as viral transduction. In a preferred embodiment, a lentiviral transfer is made. Further vectors of the present invention are retroviruses, adeno and adeno-associated viruses, baculoviruses and replicating viruses. Alternative methods of introduction would be electroporation of the cell or transfection using liposomes or synthetic cationic polymer nanoparticles as a carrier or after binding of the inhibitor to a hydrophobic group such as cholesterol. These and other ways of introducing genetic vehicles or, more generally, nucleic acids into cells are known to a person skilled in the art and can be found in the latest edition of Asubel et al. (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA be removed.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Zelle mit einem Vektor transfiziert, der die Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Inhibitors der Pro-Caspase 1 oder, besonders bevorzugt, der erfindungsgemäßen shRNA vermittelt. Die verwendete Expressionskassette enthält vorzugsweise eine Antibiotika-Resistenz, besonders bevorzugt eine Puromycin-Resistenz, sodass positive Zellen durch Zugabe von Puromycin selektioniert werden können.In a preferred embodiment of the present invention, the cell is transfected with a vector which mediates the expression of a nucleic acid inhibitor according to the invention of the pro-caspase 1 or, more preferably, of the shRNA according to the invention. The expression cassette used preferably contains an antibiotic resistance, more preferably a puromycin resistance, so that positive cells can be selected by addition of puromycin.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung des Nukleinsäure-Inhibitors und/oder der shRNA und/oder des Vektors und/oder der Wirtszelle, jeweils entsprechend den obigen Ausführungen, als Medikament bereit, wobei dieses bevorzugt zur Prävention und/oder Therapie einer inflammatorischen, besonders bevorzugt einer autoinflammatorischen Erkrankung eingesetzt wird.The present invention further provides the use of the nucleic acid inhibitor and / or the shRNA and / or the vector and / or the host cell, each according to the above, as a medicament, which is preferably for the prevention and / or treatment of an inflammatory, especially preferably an autoinflammatory disease is used.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Inhibitor und/oder eine erfindungsgemäße shRNA und/oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält. Mögliche pharmazeutisch verträgliche Träger sind beispielsweise Wasser oder eine isotonische Kochsalzlösung. Diese und weitere Trägersubstanzen sowie andere üblicherweise in pharmazeutischen Formulierungen verwendete Hilfs- und Zusatzstoffe sind dem Fachmann bekannt und können z. B. der neuesten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, USA) entnommen werden.A further subject of the present invention is a pharmaceutical composition comprising an inhibitor according to the invention and / or a shRNA according to the invention and / or a vector according to the present invention together with at least one pharmaceutically acceptable carrier. Possible pharmaceutically acceptable carriers are, for example, water or an isotonic saline solution. These and other excipients as well as other auxiliaries and additives commonly used in pharmaceutical formulations are known in the art and may, for. From the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA).

Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise einer inflammatorischen, besonders bevorzugt einer autoinflammatorischen Erkrankung, bereit, wobei eine wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise einem Säugetier, besonders bevorzugt einem humanen Patienten verabreicht wird. Dabei ist beispielsweise lokale oder systemische Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung möglich, wie unter anderem in Vaishnaw et al. (2010, Silence (1) 14–26) beschrieben wird.The present invention further provides a method of treating a disease, preferably an inflammatory, more preferably an autoinflammatory disease, wherein an effective amount of the pharmaceutical composition according to the present invention is preferably administered to a mammal, more preferably a human patient. In this case, for example, local or systemic administration of the pharmaceutical composition is possible, as inter alia in Vaishnav et al. (2010, Silence (1) 14-26) is described.

In einer bevorzugten Ausführungsform der pharmazeutischen/medizinischen Aspekte der vorliegenden Erfindung, insbesondere im Falle einer partiellen Herabregulierung der Pro-Caspase 1, ist es vorgesehen, den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Inhibitor und/oder die erfindungsgemäße shRNA und/oder der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit beispielsweise einem Inhibitor der Caspase 1, vorzugsweise einem der bekannten chemischen Inhibitoren, oder einem Inhibitor gemäß US 2007/0111934 A1 einzusetzen.In a preferred embodiment of the pharmaceutical / medical aspects of the present invention, in particular in the case of a partial down-regulation of the pro-caspase 1, it is provided that the nucleic acid inhibitor according to the invention and / or the shRNA according to the invention and / or the vector according to the present invention in Combination with, for example, an inhibitor of caspase 1, preferably one of the known chemical inhibitors, or an inhibitor according to US 2007/0111934 A1 use.

Die Figuren zeigen:The figures show:

1A zeigt eine schematische Darstellung des Aufbaus der Pro-Caspase 1 aus CARD, p20- und p10-Domäne sowie die Prozessierung der Pro-Caspase 1 durch Autoproteolyse zu reifer, aus einem Hetrotetramer aus zwei p10- und zwei p20-Einheiten aufgebauter Caspase-1. 1A shows a schematic representation of the structure of the pro-caspase 1 from CARD, p20 and p10 domain and the processing of pro-caspase 1 by autoproteolysis to mature, from a hetrotetramer of two p10 and two p20 units built caspase-1.

1B zeigt eine schematische Darstellung der inflammatorischen Wirkung von Pro-Caspase 1 und Caspase 1 sowie die potentiellen therapeutischen Ansätze der RNAi und von chemischen Inhibitoren der Caspase 1-Enzymaktivität. 1B shows a schematic representation of the inflammatory effect of pro-caspase 1 and caspase 1 and the potential therapeutic approaches of RNAi and chemical inhibitors of caspase 1 enzyme activity.

2A zeigt ein Diagramm, in dem die NFκB-Aktivierung von 293T-Zellen, die mit verschiedenen Varianten der Pro-Caspase 1 transfiziert wurden, dargestellt ist. Erkennbar ist eine verstärkte NFκB-Aktivierung verursacht durch mutierte Formen der Pro-Caspase 1. 2A shows a diagram in which the NFκB activation of 293T cells transfected with different variants of the pro-caspase 1, is shown. Recognizable is an increased NFκB activation caused by mutated forms of pro-caspase 1.

2B zeigt ein Diagramm, in dem die NFκB-Aktivierung von 293T-Zellen, die mit verschiedenen Varianten der Pro-Caspase 1 und einem RIP-CARD-Plasmid (das für die CARD-Domäne von RIP 2 codiert) transfiziert wurden, dargestellt ist. Es wird eine kompetitive Hemmung der NFκB-Aktwierung durch die CARD-Domänen festgestellt. Besonders deutlich ist diese Hemmung bei den mutierten Formen der Pro-Caspase 1 erkennbar. 2 B Figure 9 is a graph showing NFκB activation of 293T cells transfected with various variants of pro-caspase 1 and a RIP-CARD plasmid (encoded for the CARD domain of RIP 2). A competitive inhibition of NFκB Aktwierung by the CARD Domains detected. This inhibition is particularly evident in the mutated forms of pro-caspase 1.

2C zeigt ein Diagramm, in dem die NFκB-Aktivierung von 293T-Zellen, die mit verschiedenen Varianten der Pro-Caspase 1 und Anti-RIP 2 shRNA transfiziert wurden. Erkennbar ist eine Abnahme der NFκB-Aktivierung durch den Knock-Down von RIP 2, der durch die Anti-RIP 2-shRNA verursacht wurde. Diese Abnahme wird besonders deutlich für die mutierten Formen der Pro-Caspase 1. 2C Figure 1 shows a diagram in which NFκB activation of 293T cells transfected with different variants of pro-caspase 1 and anti-RIP 2 shRNA. Recognizable is a decrease in NFκB activation by the knock-down of RIP 2, which was caused by the anti-RIP 2 shRNA. This decrease is particularly evident for the mutant forms of pro-caspase 1.

2D zeigt Abbildungen einer Western-Blut-Analyse, in der die Protein-Expressionsmuster von 293T-Zellen untersucht wurden, die mit verschiedenen Varianten der Pro-Caspase 1 und Anti-RIP-2 shRNA transfiziert wurden. 2D Figure 3 shows images of a Western blood analysis examining protein expression patterns of 293T cells transfected with different variants of pro-caspase 1 and anti-RIP-2 shRNA.

3 zeigt Abbildungen einer Western-Blot-Analyse zur Kontrolle der Knock-Down-Effizienz auf die Pro-Caspase 1-Expression durch siRNA in THP-1-Zellen jeweils 24, 48 und 72 Stunden nach Transfektion. Erkennbar ist eine Abnahme der Proteinmenge der Pro-Caspase 1, vermittelt durch siRNAs jeweils 48 bzw. 72 Stunden nach Transfektion. 3 Figure 9 shows images of Western blot analysis for controlling knock-down efficiency on pro-caspase 1 expression by siRNA in THP-1 cells at 24, 48, and 72 hours post-transfection, respectively. Recognizable is a decrease in the protein amount of pro-caspase 1, mediated by siRNAs 48 and 72 hours after transfection, respectively.

4A zeigt Abbildungen einer Western-Blot-Analyse zur Kontrolle der Knock-Down-Effzienz auf die Pro-Caspase 1-Expression durch shRNA in THP-1-Zellen jeweils fünf bis sieben Tage nach Transduktion. Dabei ist deutlich eine erhebliche Reduktion der Proteinmenge bzw. die vollständige Eliminierung der Pro-Caspase 1, vermittelt durch shRNA 1, shRNA 2, shRNA 4 und shRNA 5, zu erkennen. 4A Figure 4 shows images of Western blot analysis for controlling knock-down efficacy on shRNA-sequestrated pro-caspase 1 expression in THP-1 cells five to seven days after transduction, respectively. Significantly, a significant reduction in the amount of protein or complete elimination of pro-caspase 1 mediated by shRNA 1, shRNA 2, shRNA 4 and shRNA 5 can be seen.

4B zeigt das Ergebnis einer Messung der IL-1β-Sekretion der mit shRNA 5 bzw. einer unspezifischen Kontroll-shRNA (shRNA 6) transfizierten TIP-1-Zellen nach Stimulation mit 1 μg LPS/ml für vier Stunden. in der Abbildung ist die relative IL-1β-Sekretion der Zellen dargestellt. Diese funktionelle Untersuchung belegt den erfolgreichen, durch shRNA 5 vermittelten Caspase-1-Knock-Down. Im Vergleich zu den Kontrollzellen (Expression des Kontrollkonstrukts shRNA 6) ist die IL-1β-Sekretion in Zellen, welche die erfindungsgemäße shRNA exprimieren, um ca. 90% vermindert. 4B shows the result of a measurement of IL-1β secretion of shRNA 5 or a non-specific control shRNA (shRNA 6) transfected TIP-1 cells after stimulation with 1 μg LPS / ml for four hours. The figure shows the relative IL-1β secretion of the cells. This functional study confirms the successful, shRNA 5-mediated caspase-1 knock-down. In comparison to the control cells (expression of the control construct shRNA 6), IL-1β secretion in cells expressing the shRNA according to the invention is reduced by about 90%.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden nicht-einschränkenden Beispiele näher erläutert.The present invention is further illustrated by the following non-limiting examples.

BEISPIELEEXAMPLES

Beispiel 1: Verstärkte Aktivierung des NFκB-Signalweges durch mutierte Pro-Caspasen 1, vermittelt durch CARD-CARD-Interaktionen mit RIP 2.Example 1: Increased activation of the NFκB signaling pathway by mutated pro-caspases 1 mediated by CARD-CARD interactions with RIP 2.

1.1: Verstärkte Aktivierung des NFκB-Signalweges durch mutierte Varianten der Pro-Caspase 11.1: Increased activation of the NFκB signaling pathway by mutated variants of the pro-caspase 1

293T-Zellen wurden in Kulturschalen mit sechs Vertiefungen mit einer Dichte von 0,16 × 106 Zellen/cm ausplattiert und 24 Stunden später mit den in 2A angegebenen Plasmiden, die verschiedene, mutierte Varianten der Pro-Caspase 1 enthielten, transfiziert. Gleichzeitig wurden die Zellen mit einem Leuchtkäfer-Luciferase-Reporter-Konstrukt (pGL3), das einen NFκB-Promotor enthält, transfiziert. Zur Transfektion wurden 6,75 μg/ml PEI statt Calcium-Phosphat eingesetzt. 24 Stunden nach der Transfektion wurde die Luciferase-Aktivität als Maßstab für die NFκB-Aktivierung gemessen. Dazu wurde ein Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Mannheim) eingesetzt. Die Zellen wurden in dem enthaltenen Lysepuffer lysiert und anschließend die Luciferase-Aktivität entsprechend den Anweisungen des Herstellers gemessen. Der in der 2A dargestellte Anstieg der NFκB-Aktivierung ist proportional zur Vervielfachung der Luciferase-Aktivität in den Ansätzen mit mutierten Varianten der Pro-Caspase 1 im Vergleich zum Ansatz mit der Wildtyp-Pro-Caspase 1, deren Wert gleich 1 gesetzt wurde.293T cells were plated in six-well culture dishes at a density of 0.16 x 10 6 cells / cm and mixed 24 hours later with in 2A plasmids containing various mutated variants of pro-caspase 1 were transfected. Simultaneously, the cells were transfected with a firefly luciferase reporter construct (pGL3) containing a NFκB promoter. For transfection, 6.75 μg / ml PEI was used instead of calcium phosphate. Twenty four hours after transfection, luciferase activity was measured as a measure of NFκB activation. For this purpose, a dual-luciferase reporter assay system (Promega, Mannheim) was used. The cells were lysed in the lysis buffer contained and then the luciferase activity was measured according to the manufacturer's instructions. The Indian 2A The increase in NFκB activation shown is proportional to the multiplication of luciferase activity in the mutant variants of the pro-caspase 1 as compared to the approach with the wild-type pro-caspase 1, the value of which was set to 1.

1.2: Abhängigkeit der NFκB-Aktivierung von der Interaktion der CARD-Domänen von Pro-Caspase 1 und RIP 2.1.2: Dependence of NFκB activation on the interaction of the CARD domains of pro-caspase 1 and RIP 2.

Zusätzlich zu dem unter 1.1 angegebenen Verfahren wurde jeweils 1 Ansatz in jedem parallelen Experiment mit einem RIP-CARD-Plasmid, das für die CARD-Domäne von RIP 2 codiert, co-transfiziert. Zur Messung der NFκB--Aktivierung wurde wie unter 1.1 angegeben verfahren. Dabei kannte, wie in 2B dargestellt ist, ein kompetitiver Effekt der zugegebenen RIP 2-CARD-Domäne und eine resultierende Suppression der Aktivierung von NFκB, abhängig von der zusätzlichen RIP 2-CARD-Domäne festgestellt werden.In addition to the procedure described under 1.1, 1 assay was co-transfected into each parallel experiment with a RIP-CARD plasmid encoding the CARD domain of RIP 2. For measuring the NFκB activation, the procedure was as described under 1.1. It knew, as in 2 B shown a competitive effect of the added RIP 2 CARD domain and a resulting suppression of the activation of NFκB, depending on the additional RIP 2 CARD domain.

1.3: Rückgang der NFκB-Aktivierung nach Knock-Down von RIP 2 1.3: Decrease in NFκB activation after knock-down of RIP 2

293T-Zellen wurden mit lentiviralen Anti-RIP 2-shRNA-Partikeln (sc-37389-V, Santa Cruz, USA) sowie lentiviralen Kontroll-shRNA-Partikeln (sc-108080, Santa Cruz, USA) transduziert und mittels Zugabe von Puromycin selektioniert. Anschließend wurde, wie unter 1.1 beschrieben, verfahren, wobei festgestellt wurde, dass ein RIP 2 Knock-Down zum Rückgang der NFκB-Aktivierung führt. Dieser Effekt ist in einem Diagramm in 2C dargestellt.293T cells were transduced with lentiviral anti-RIP 2 shRNA particles (sc-37389-V, Santa Cruz, USA) and control lentiviral shRNA particles (sc-108080, Santa Cruz, USA) and selected by adding puromycin , The procedure was then as described under 1.1, wherein it was determined that a RIP 2 knock-down leads to a decrease in NFκB activation. This effect is in a diagram in 2C shown.

1.4: Erfolgreiche Expression der transfizierten Pro-Caspase 1-Varianten und erfolgreicher Knock-Down von RIP 21.4: Successful expression of the transfected pro-caspase 1 variants and successful knock-down of RIP 2

Nach Transfektion der Zellen, wie unter 1.1 bzw. 1.3 beschrieben, wurden die Protein-Expressionsmuster mit Hilfe von Western-Blot-Analysen untersucht. Als Ladekontrolle diente das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. Das Ergebnis der Western-Blot-Analyse ist in der Abbildung in 2D zu sehen.After transfection of the cells, as described under 1.1 or 1.3, the protein expression patterns were examined by means of Western Blot analyzes. As a charge control enzyme served the Glycerinaldehyd-3-phosphate dehydrogenase. The result of the Western Blot analysis is shown in the figure 2D to see.

Beispiel 2: Hemmung der Pro-Caspase 1-Expression durch siRNA in THP-1-ZellenExample 2: Inhibition of Pro-Caspase 1 Expression by siRNA in THP-1 Cells

THP-1-Zellen wurden mit siRNA-Oligonukleotiden transfiziert. Es wurden zwei siRNA-Oligonukleotide verwendet, deren Zielsequenzen sich im 3'-untranslatierten Bereich der Pro-Caspase 1-mRNA befinden, sowie ein unspezifisches Kontroll-Oligonukleotid (Control). Die jeweiligen Sense-(= Passenger-) Stränge der dsRNA-Oligonukleotide wiesen die folgenden Sequenzen auf:

Figure 00180001
THP-1 cells were transfected with siRNA oligonucleotides. Two siRNA oligonucleotides were used whose target sequences are located in the 3 'untranslated region of the pro-caspase 1 mRNA and a nonspecific control oligonucleotide (Control). The respective sense (= passenger) strands of the dsRNA oligonucleotides had the following sequences:
Figure 00180001

Nach Inkubation der Zellen für die Zeiträume 24, 48 und 72 Stunden wurden Proteinextrakte angefertigt und eine Western-Blot-Analyse mit einem spezifischen, gegen die p20-Untereinheit der Caspase 1 gerichteten Antikörper durchgeführt. Als Ladekontrolle diente das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. Der durch die siRNAs verursachte Knock-Down ist in 3 gezeigt.After incubation of the cells for periods of 24, 48 and 72 hours, protein extracts were prepared and a Western blot analysis was carried out with a specific antibody directed against the caspase 1 p20 subunit. As a charge control enzyme served the Glycerinaldehyd-3-phosphate dehydrogenase. The knock-down caused by the siRNAs is in 3 shown.

Beispiel 3: Hemmung der Pro-Caspase 1-Expression durch lentivirale Expression von shRNA in THP-1-ZellenExample 3: Inhibition of Pro-Caspase 1 Expression by Lentiviral Expression of shRNA in THP-1 Cells

Hier wurde zunächst eine shRNA-Expressionskassette mittels lentiviralem Gentransfer in die Zellen eingebracht. Dabei wurden 4 verschiedene shRNAs (shRNA 1, shRNA 2, shRNA 4, shrNA 5) verwendet, deren Zielsequenzen sich innerhalb der CARD- oder p20-Domäne oder im untranslatierten Bereich der Pro-Caspase 1-mRNA befinden. Entsprechend wurden durch die eingesetzten shRNAs verschiedene Isoformen der Pro-Caspase 1 herabreguliert. Zusätzlich wurde eine unspezifische shRNA (shRNA 6) eingesetzt und ein unbehandelter Ansatz verwendet (Kontrolle). Die jeweiligen shRNAs waren gegen die folgenden Zielsequenzen der Pro-Caspase 1-mRNA gerichtet (in Klammern sind die Lage der Zielsequenz sowie die herabregulierten Caspase-1-Isoformen angegeben):

Figure 00190001
Here, a shRNA expression cassette was first introduced into the cells by means of lentiviral gene transfer. Four different shRNAs (shRNA 1, shRNA 2, shRNA 4, shrNA 5) were used, whose target sequences are located within the CARD or p20 domain or in the untranslated region of the pro-caspase 1 mRNA. Accordingly, various isoforms of pro-caspase 1 were down-regulated by the shRNAs used. In addition, a non-specific shRNA (shRNA 6) was used and an untreated batch was used (control). The respective shRNAs were directed against the following target sequences of the pro-caspase 1 mRNA (the position of the target sequence as well as the down-regulated caspase-1 isoforms are indicated in brackets):
Figure 00190001

Die verwendete Expressionskassette vermittelt eine Puromycin-Resistenz, sodass positive Zellen durch Zugabe von Puromycin selektioniert werden konnten.The expression cassette used mediates puromycin resistance so that positive cells could be selected by adding puromycin.

Nach Selektion der Zellen mittels Puromycin wurden fünf bis sieben Tage nach der Transduktion mit dem shRNA-Lentivirus Proteinextrakte angefertigt und eine Western-Blot-Analyse mit einem spezifischen, gegen die p20-Untereinheit der Caspase 1 gerichteten Antikörper durchgeführt. Als Ladekontrolle diente das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. Die Ergebnisse sind in 4A dargestellt.After selection of the cells by puromycin, protein extracts were prepared five to seven days after transduction with the shRNA lentivirus and Western blot analysis was performed with a specific antibody directed against the caspase 1 p20 subunit. As a charge control enzyme served the Glycerinaldehyd-3-phosphate dehydrogenase. The results are in 4A shown.

Beispiel 4: Erfolgreicher Knock-Down der Caspase 1 und daraus folgende Inhibition der IL-1β-Sekretion Example 4: Successful knock-down of caspase 1 and consequent inhibition of IL-1β secretion

In diesem Ausführungsbeispiel wurde, wie in Beispiel 3 angegeben, eine shRNA-Expressionskassette in die Zellen eingebracht. Nach Stimulation der Zellen mit 1 μg LPS 1 ml für vier Stunden wurde die Konzentration von IL-1β im Zellkulturüberstand mit Hilfe von eines IL-1β-spezifischen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen. Die Ergebnisse sind in 4B grafisch dargestellt.In this embodiment, as indicated in Example 3, a shRNA expression cassette was introduced into the cells. After stimulation of the cells with 1 μg LPS 1 ml for four hours, the concentration of IL-1β in the cell culture supernatant was measured by means of an IL-1β-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results are in 4B shown graphically.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.This is followed by a sequence protocol according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can be downloaded from the official publication platform of the DPMA.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Claims (20)

Inhibitor der Expression der Pro-Caspase 1.Inhibitor of the expression of pro-caspase 1. Inhibitor nach Anspruch 1, der eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete Nukleinsäure ist.An inhibitor according to claim 1, which is a nucleic acid directed against the pro-caspase 1 mRNA. Inhibitor nach Anspruch 2, wobei die Nukleinsäure eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete siRNA oder eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete miRNA, pri- oder pre-miRNA oder ein gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtetes Antisense-Oligonukleotid ist.Inhibitor according to claim 2, wherein the nucleic acid directed against the pro-caspase 1 mRNA siRNA or directed against the pro-caspase 1 mRNA miRNA, pri- or pre-miRNA or directed against the pro-caspase 1 mRNA antisense Oligonucleotide. Inhibitor nach Anspruch 3, wobei die siRNA und/oder die miRNA, pri- oder pre-miRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid Sequenz-spezifisch gegen den 3'-untranslatierten Bereich, die CARD-Domäne oder die p20-Domäne der Pro-Caspase 1-mRNA gerichtet ist/sind.An inhibitor according to claim 3, wherein the siRNA and / or the miRNA, pri- or pre-miRNA and / or the antisense oligonucleotide sequence-specifically against the 3'-untranslated region, the CARD domain or the p20 domain of the Pro Caspase 1 mRNA is / are directed. Inhibitor nach Anspruch 4, wobei die Zielsequenz der sRNA einer der folgenden Sequenzen entspricht:
Figure 00210001
An inhibitor according to claim 4, wherein the target sequence of the sRNA corresponds to one of the following sequences:
Figure 00210001
 Inhibitor nach Anspruch 3, wobei die sRNA und/oder die miRNA, pri- oder pre-miRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid Sequenz-spezifisch gegen einen Bereich der mRNA einer mutierten Pro-Caspase 1 gerichtet ist, der die Mutation enthält.Inhibitor according to claim 3, wherein the sRNA and / or the miRNA, pri- or pre-miRNA and / or the antisense oligonucleotide is sequence-specifically directed against a region of the mRNA of a mutated pro-caspase 1 containing the mutation. Inhibitor nach Anspruch 6, der gegen eine mRNA gerichtet ist, die für eine mutierte Pro-Caspase 1 codiert, die aus der Gruppe, bestehend aus den Mutanten R221C, R2400, N263S, L265S, T2671, K319R und A329T, ausgewählt ist.An inhibitor according to claim 6 which is directed against an mRNA encoding a mutated pro-caspase 1 selected from the group consisting of mutants R221C, R2400, N263S, L265S, T2671, K319R and A329T. Inhibitor nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Zielsequenz der siRNA einer der folgenden Sequenzen entspricht:
Figure 00220001
An inhibitor according to claim 6 or 7, wherein the target sequence of the siRNA corresponds to one of the following sequences:
Figure 00220001
 shRNA, welche zu einer siRNA nach einem der Ansprüche 3 bis 8 prozessierbar ist.shRNA which is processable into a siRNA according to any one of claims 3 to 8. Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für einen Nukleinsäure-Inhibitor nach einem der Ansprüche 2 bis 8 oder eine shRNA nach Anspruch 9 codiert.A vector containing a nucleic acid sequence coding for a nucleic acid inhibitor according to any one of claims 2 to 8 or a shRNA according to claim 9. Vektor nach Anspruch 10, der die Expression eines Nukleinsäure-Inhibitors nach einem der Ansprüche 2 bis 8 oder einer shRNA nach Anspruch 9 vermittelt.A vector according to claim 10, which mediates the expression of a nucleic acid inhibitor according to any one of claims 2 to 8 or a shRNA according to claim 9. Wirtszelle, enthaltend einen Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder eine shRNA nach Anspruch 9 und/oder einen Vektor nach Anspruch 10 oder 11.A host cell containing an inhibitor according to any one of claims 1 to 8 and / or a shRNA according to claim 9 and / or a vector according to claim 10 or 11. Verfahren zur Inhibition der Expression der Pro-Caspase 1, umfassend den Schritt der Einbringung des Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in eine Zelle, die ein expressionsfähiges, für die Pro-Caspase 1 codierendes Gen enthält.A method of inhibiting the expression of pro-caspase 1 comprising the step of introducing the inhibitor of any one of claims 1 to 8 into a cell containing an expressive gene encoding pro-caspase 1. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zelle eine humane Zelle ist. The method of claim 13, wherein the cell is a human cell. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Zelle mit einem Vektor nach Anspruch 10 oder 11 transfiziert wird.The method of claim 13 or 14, wherein the cell is transfected with a vector according to claim 10 or 11. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Vektor die Expression einer shRNA nach Anspruch 9 vermittelt.The method of claim 15, wherein the vector mediates the expression of a shRNA according to claim 9. Verwendung eines Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder einer shRNA nach Anspruch 9 und/oder eines Vektors nach Anspruch 10 oder 11 als Medikament.Use of an inhibitor according to any one of claims 1 to 8 and / or a shRNA according to claim 9 and / or a vector according to claim 10 or 11 as a medicament. Verwendung eines Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder einer shRNA nach Anspruch 9 und/oder eines Vektors nach Anspruch 10 oder 11 zur Prävention und/oder Therapie einer inflammatorischen Erkrankung.Use of an inhibitor according to any one of claims 1 to 8 and / or a shRNA according to claim 9 and / or a vector according to claim 10 or 11 for the prevention and / or treatment of an inflammatory disease. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die inflammatorische Erkrankung autoinflammatorisch ist.Use according to claim 18, wherein the inflammatory disease is autoinflammatory. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder eine shRNA nach Anspruch 9 und/oder einen Vektor nach Anspruch 10 oder 11 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.A pharmaceutical composition comprising an inhibitor according to any one of claims 1 to 8 and / or a shRNA according to claim 9 and / or a vector according to claim 10 or 11 in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
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