DE102011080405A1 - New substituted 3-biphenyl-3-yl-8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro(4.5)dec-3-en-2-one derivatives useful for prophylaxis or therapy of tumor diseases comprising breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer or non-small cell lung cancer - Google Patents

New substituted 3-biphenyl-3-yl-8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro(4.5)dec-3-en-2-one derivatives useful for prophylaxis or therapy of tumor diseases comprising breast cancer, prostate cancer, colorectal cancer or non-small cell lung cancer Download PDF

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Abstract

Substituted 3-biphenyl-3-yl-8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-one derivatives (I) are new. Substituted 3-biphenyl-3-yl-8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-one derivatives of formula (I) and their salts are new. R1 : CH 3or Cl; R2 : H or CH 3; R3 : H or F; and R4 : Cl or F. ACTIVITY : Cytostatic; Herbicide; Fungicide. MECHANISM OF ACTION : Acetyl-CoA carboxylase 1 inhibitor. The ability of (I) to inhibit the acetyl-CoA carboxylase 1 was tested using in-vitro enzyme assay. The result showed that 3-(4'-chloro-3'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluoro-4-hydroxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-one exhibited an IC50 value of 0.053 mu mol/l.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft substituierte 3-(Biphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-one zu therapeutischen Zwecken, pharmazeutische Mittel enthaltend die erfindungsgemäßen Verbindungen und deren Verwendung in der Therapie, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. The present invention relates to substituted 3- (biphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-ones for therapeutic purposes, pharmaceutical compositions containing the compounds of the invention and their use in therapy, in particular for the prophylaxis and / or therapy of tumor diseases.

Acetyl-CoA Carboxylasen (ACCs) spielen eine Schlüsselrolle in der zellulären Fettsäure-Homöostase. ACCs sind Biotin-enthaltende Enzyme, die die Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA in einer ATPabhängigen Weise katalysieren ( Kim, 1997; Harwood, 2005; Tong, 2005 ). Diese Reaktion, die als zwei halbe Reaktionen abläuft, eine Biotin-Carboxylase (BC) Reaktion und eine Carboxyltransferase (CT) Reaktion, ist der erste einleitende Schritt in der Fettsäurebiosynthese und ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für den Pathway. Es sind zwei humane ACC-Isoformen bekannt, ACC1 und ACC2, die von zwei unterschiedlichen Genen codiert werden ( LuTFI ABU-ELHEIGA et al, 1995, Jane WIDMER, et al. 1996 ). ACC1 ist in lipogenem Gewebe exprimiert (Leber, Fettgewebe), im Zytosol lokalisiert, und füllt den Malonyl-CoA Pool, der als C2-Einheiten Donor für die de novo Synthese von langkettigen Fettsäuren durch FASN und anschließende Kettenverlängerung dient. ACC2 ist vor allem in oxidativen Geweben exprimiert (Leber, Herz, Skelettmuskel) ( Bianchi et al., 1990; Kim, 1997 ), mit den Mitochondrien assoziiert, und reguliert einen zweiten Pool von Malonyl-CoA. Dieser steuert die Fettsäureoxidation durch die Hemmung der Carnitinpalmityltransferase I, dem Enzym das den Eintritt langkettiger Fettsäuren in die Mitochondrien für die β-Oxidation erleichtert ( Milgraum LZ, et al.,1997, Widmer J. et al., 1996 ). Beide Enzyme zeigen eine sehr große Sequenzhomologie und sind ähnlich reguliert durch eine Kombination von transkriptionellen, translationellen und prosttranslationellen Mechanismen. In Menschen als auch in Tieren ist die ACC-Aktivität streng durch eine Reihe von diätätischen, hormonellen und anderen physiologischen Mechanismen kontrolliert wie beispielsweise über eine vorwärts allosterische Aktivierung durch Citrat, eine Feedback-Inhibition durch langkettige Fettsäuren, reversible Phosphorylierung und/oder Inaktivierung bzw. Modulation der Enzymproduktion durch veränderte Genexpression. Acetyl-CoA carboxylases (ACCs) play a key role in cellular fatty acid homeostasis. ACCs are biotin-containing enzymes that catalyze the carboxylation of acetyl-CoA to malonyl-CoA in an ATP-dependent manner ( Kim, 1997; Harwood, 2005; Tong, 2005 ). This reaction, which runs as two half reactions, a biotin carboxylase (BC) reaction and a carboxyl transferase (CT) reaction, is the first preliminary step in fatty acid biosynthesis and is the rate-limiting step for the pathway. Two human ACC isoforms are known, ACC1 and ACC2, which are encoded by two different genes ( LuTFI ABU-ELHEIGA et al, 1995, Jane WIDMER, et al. 1996 ). ACC1 is expressed in lipogenic tissue (liver, adipose tissue), located in the cytosol, and fills the malonyl-CoA pool, which serves as a C2 unit donor for the de novo synthesis of long-chain fatty acids by FASN and subsequent chain extension. ACC2 is mainly expressed in oxidative tissues (liver, heart, skeletal muscle) ( Bianchi et al., 1990; Kim, 1997 ), associated with the mitochondria, and regulates a second pool of malonyl-CoA. It controls fatty acid oxidation by inhibiting carnitine palmityltransferase I, the enzyme that facilitates the entry of long-chain fatty acids into the mitochondria for β-oxidation ( Milgraum LZ, et al., 1997, Widmer J. et al., 1996 ). Both enzymes show a very large sequence homology and are similarly regulated by a combination of transcriptional, translational and prosttranslational mechanisms. In humans as well as in animals, ACC activity is tightly controlled by a variety of dietary, hormonal and other physiological mechanisms, such as forward allosteric citrate activation, long chain fatty acid feedback inhibition, reversible phosphorylation and / or inactivation and / or inactivation. Modulation of enzyme production by altered gene expression.

ACC1 Knockout-Mäuse sind embryonal letal ( Swinnen, et al., 2006, Abu-Elheiga, et al. 2005 ). ACC2 Knockout-Mäuse zeigen reduzierte Malonyl-CoA-Spiegel in Skelett und Herzmuskel, erhöhte Fettsäureoxidation im Muskel, erniedrigte Leberfettlevel, erniedrigte Mengen an Gesamtkörperfett, erhöhte Level von UCP3 im Skelettmuskel (als Zeichen einer erhöhten Energieaufwendung), ein erniedrigtes Körpergewicht, erniedrigte Spiegel von freien Fettsäuren im Plasma, erniedrigte Plasma-Glucose-Spiegel, erniedrigte Mengen an Glycogen im Gewebe, und sie sind geschützt vor Nahrungs-induziertem Diabetes und Fettleibigkeit ( Abu-Elheiga et al., 2001, 2003; Oh et al., 2005 ). ACC1 knockout mice are embryonic lethal ( Swinnen, et al., 2006, Abu-Elheiga, et al. 2005 ). ACC2 knockout mice show reduced malonyl-CoA levels in skeletal and cardiac muscle, increased fatty acid oxidation in muscle, decreased liver fat levels, decreased levels of total body fat, increased levels of UCP3 in skeletal muscle (as a sign of increased energy expenditure), decreased body weight, decreased levels of plasma free fatty acids, decreased plasma glucose levels, decreased levels of glycogen in tissues, and are protected from diet-induced diabetes and obesity ( Abu-Elheiga et al., 2001, 2003; Oh et al., 2005 ).

Zusätzlich zur Beteiligung an der Fettsäuresynthese in lipogenen Geweben und der Fettsäureoxidation in oxidativen Geweben, wurde eine Hochregulation von ACC und gesteigerte Lipogenese in vielen Tumorzellen beobachtet ( Swinnen, et al., 2004 , Heemers, et al., 2000 , Swinnen, et al., 2002 , Rossi, et al., 2003 , Milgraum, et al., 1997 , Yahagi, et al., 2005 ). Dieser Phenotyp trägt sehr wahrscheinlich zur Entwicklung und Progression von Tumoren bei, die regulatorischen Mechanismen hierfür müssen jedoch noch geklärt werden. In addition to involvement in fatty acid synthesis in lipogenic tissues and fatty acid oxidation in oxidative tissues, up-regulation of ACC and increased lipogenesis has been observed in many tumor cells ( Swinnen, et al., 2004 . Heemers, et al., 2000 . Swinnen, et al., 2002 . Rossi, et al., 2003 . Milgraum, et al., 1997 . Yahagi, et al., 2005 ). This phenotype most likely contributes to the development and progression of tumors, but the regulatory mechanisms for this have yet to be clarified.

EP0454782 und US5759837 schützen die Verwendung von Fettsäuresyntheseinhibitoren zur Inhibierung von Tumorzellwachstum. Zyklische Ketoenole sind nicht offenbart. EP0454782 and US5759837 protect the use of fatty acid synthesis inhibitors to inhibit tumor cell growth. Cyclic ketoenols are not revealed.

Es wurde eine Reihe von Substanzen entdeckt, die in der Lage sind, Pflanzen und/oder Insekten-ACC zu inhibieren. A number of substances have been discovered that are capable of inhibiting plants and / or insect ACC.

Die PCT Patent Applikation PCT/EP99/01787 , publiziert als WO 99/48869 , die dem europäischen Patent EP 1 066 258 B1 entspricht, bezieht sich auf neue Arylphenyl-substituierte zyklische Ketoenole, zu einer Mehrheit der Prozesse für ihre Herstellung und ihre Nutzung als Pestizide und Herbizide. The PCT patent application PCT / EP99 / 01787 , published as WO 99/48869 that the European patent EP 1 066 258 B1 refers to new arylphenyl-substituted cyclic ketoenols, to a majority of the processes for their preparation and their use as pesticides and herbicides.

Von 3-Acyl-pyrrolidin-2,4-dionen sind pharmazeutische Eigenschaften vorbeschrieben ( S. Suzuki et al. Chem. Pharm. Bull. 15 1120 (1967) ). Weiterhin wurden N-Phenylpyrrolidin-2,4-dione von R. Schmierer und H. Mildenberger ( Liebigs Ann. Chem. 1985, 1095 ) synthetisiert. Eine biologische Wirksamkeit dieser Verbindungen wurde nicht beschrieben. In EP-A-0 262 399 und GB-A-2 266 888 werden ähnlich strukturierte Verbindungen (3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dione) offenbart, von denen jedoch keine herbizide, insektizide oder akarizide Wirkung bekannt geworden ist. Bekannt mit herbizider, insektizider oder akarizider Wirkung sind unsubstituierte, bicyclische 3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate ( EP-A-355 599 , EP-A-415 211 und JP-A-12-053 670 ) sowie substituierte monocyclische 3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate ( EP-A-377 893 und EP-A-442 077 ). Of 3-acyl-pyrrolidine-2,4-diones pharmaceutical properties are described above ( Suzuki, S. et al. Chem. Pharm. Bull. 15 1120 (1967) ). Furthermore, N-phenylpyrrolidine-2,4-diones of R. Schmierer and H. Mildenberger ( Liebigs Ann Chem. 1985, 1095 ). Biological activity of these compounds has not been described. In EP-A-0 262 399 and GB-A-2 266 888 similarly structured compounds (3-aryl-pyrrolidine-2,4-diones) are disclosed, but of which no herbicidal, insecticidal or acaricidal activity has become known. Are known herbicidal, insecticidal or acaricidal action unsubstituted, bicyclic 3-aryl-pyrrolidine-2,4-dione derivatives ( EP-A-355 599 . EP-A-415 211 and JP-A-12-053 670 ) and substituted monocyclic 3-arylpyrrolidine-2,4-dione derivatives ( EP-A-377 893 and EP-A-442,077 ).

Weiterhin bekannt sind polycyclische 3-Arylpyrrolidin-2,4-dion-Derivate ( EP-A-442 073 ) sowie 1H-Arylpyrrolidin-dion-Derivate ( EP-A-456 063 , EP-A-521 334 , EP-A-596 298 , EP-A-613 884 , EP-A-613 885 , WO 95/01 971 , WO 95/26 954 , WO 95/20 572 , EP-A-0 668 267 , WO 96/25 395 , WO 96/35 664 , WO 97/01 535 , WO 97/02 243 , WO 97/36 868 , WO 97/43275 , WO 98/05638 , WO 98/06721 , WO 98/25928 , WO 99/24437 , WO 99/43649 , WO 99/48869 , WO 99/55673 , WO 01/17972 , WO 01/23354 , WO 01/74770 , WO 03/013249 , WO 03/062244 , WO 2004/007448 , WO 2004/024 688 , WO 04/065366 , WO 04/080962 , WO 04/111042 , WO 05/044791 , WO 05/044796 , WO 05/048710 , WO 05/049569 , WO 05/066125 , WO 05/092897 , WO 06/000355 , WO 06/029799 , WO 06/056281 , WO 06/056282 , WO 06/089633 , WO 07/048545 , DEA 10 2005 059 892 , WO 07/073856 , WO 07/096058 , WO 07/121868 , WO 07/140881 , WO 08/067873 , WO 08/067910 , WO 08/067911 , WO 08/138551 , WO 09/015801 , WO 09/039975 , WO 09/049851 , WO 09/115262 , WO10/052161 , WO 10/063378 , WO 10/063670 , WO10/063380 , WO10/066780 , WO10/102758 , WO2010/135914 , WO2011/067131 , WO2011/067135 , WO2011/067203 und WO2011/067240. Also known are polycyclic 3-arylpyrrolidine-2,4-dione derivatives ( EP-A-442 073 ) and 1H-arylpyrrolidinone-dione derivatives ( EP-A-456 063 . EP-A-521 334 . EP-A-596 298 . EP-A-613,884 . EP-A-613,885 . WO 95/01 971 . WO 95/26954 . WO 95/20 572 . EP-A-0 668 267 . WO 96/25 395 . WO 96/35 664 . WO 97/01 535 . WO 97/02 243 . WO 97/36868 . WO 97/43275 . WO 98/05638 . WO 98/06721 . WO 98/25928 . WO 99/24437 . WO 99/43649 . WO 99/48869 . WO 99/55673 . WO 01/17972 . WO 01/23354 . WO 01/74770 . WO 03/013249 . WO 03/062244 . WO 2004/007448 . WO 2004/024 688 . WO 04/065366 . WO 04/080962 . WO 04/111042 . WO 05/044791 . WO 05/044796 . WO 05/048710 . WO 05/049569 . WO 05/066125 . WO 05/092897 . WO 06/000355 . WO 06/029799 . WO 06/056281 . WO 06/056282 . WO 06/089633 . WO 07/048545 . DEA 10 2005 059 892 . WO 07/073856 . WO 07/096058 . WO 07/121868 . WO 07/140881 . WO 08/067873 . WO 08/067910 . WO 08/067911 . WO 08/138551 . WO 09/015801 . WO 09/039975 . WO 09/049851 . WO 09/115262 . WO10 / 052161 . WO 10/063378 . WO 10/063670 . WO10 / 063380 . WO10 / 066780 . WO10 / 102758 . WO2010 / 135914 . WO2011 / 067131 . WO2011 / 067135 . WO2011 / 067203 and WO2011 / 067,240th

Außerdem sind ketalsubstituierte 1-H-Arylpyrrolidin-2,4-dione aus WO 99/16748 und (spiro)-ketalsubstituierte N-Alkoxy-alkoxy-substituierte Aryl-pyrrolidindione aus JP-A-14 205 984 und Ito M. et al. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 67, 1230-1238, (2003) bekannt. Außerdem sind aus WO 06/024411 herbizide Mittel enthaltend Ketoenole bekannt. In addition, ketal-substituted 1-H-arylpyrrolidine-2,4-diones are made WO 99/16748 and (spiro) ketalsubstituted N-alkoxy-alkoxy-substituted aryl-pyrrolidinediones JP-A-14 205 984 and Ito M. et al. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 67, 1230-1238, (2003) known. Besides, are off WO 06/024411 Herbicidal agents containing ketoenols known.

4´-Biphenyl-substituierte Tetronsäurederivate werden in WO 2008/022725 für die Therapie viraler Erkrankungen offenbart. 4'-biphenyl-substituted tetronic acid derivatives are disclosed in WO 2008/022725 for the therapy of viral diseases.

WO 2005/089118 und WO2007/039286 offenbaren generisch stickstoffhaltige bizyklische Strukturen für die Therapie, wobei 5´-Biphenyl-substituierte zyklische Ketoenole nicht spezifisch genannt sind. WO 2005/089118 and WO2007 / 039286 disclose generic nitrogen-containing bicyclic structures for therapy, with 5'-biphenyl-substituted cyclic ketoenols not being specifically named.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass eine spezielle Untergruppe der im Stand der Technik beschriebenen arylsubstituierten zyklischen Ketoenole auch humane ACC inhibieren und für die Therapie von Erkrankungen geeignet sind. It has now surprisingly been found that a specific subgroup of the aryl-substituted cyclic ketoenols described in the prior art also inhibit human ACC and are suitable for the therapy of diseases.

Dabei war nicht vorhersehbar, ob und welche der als Insektizide oder Herbizide bekannten Strukturen die erfindungsgemäße Aufgabe lösen, nämlich Strukturen darstellen, die bei der Therapie von menschlichen Erkrankungen eingesetzt werden können. It was unpredictable whether and which of the structures known as insecticides or herbicides would achieve the object according to the invention, namely structures which can be used in the therapy of human diseases.

Der Anmelderin ist nicht bekannt, dass im Stand der Technik 3-(Biphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-one gemäß der vorliegenden Erfindung zur Therapie von Erkrankungen beschrieben sind, insbesondere nicht zur Therapie von Tumorerkrankungen. The Applicant is not aware that in the prior art 3- (biphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-ones according to the present invention are described for the treatment of diseases, in particular not for the treatment of tumor diseases.

Ausgehend von diesem Stand der Technik, ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Strukturen für die Therapie von Erkrankungen zur Verfügung zu stellen. Based on this prior art, the object of the present invention is to provide structures for the therapy of diseases.

Insbesondere sollen die erfindungsgemäßen Strukturen zur Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen geeignet sein und Vorteile gegenüber im Stand der Technik bekannten Strukturen aufweisen. In particular, the structures according to the invention should be suitable for the prophylaxis and therapy of tumor diseases and have advantages over structures known in the prior art.

Besonders interessant sind dabei Verbindungen, die eine Selektivität gegen humanes ACC2 besitzen, d.h. humanes ACC1 stärker inhibieren als humanes ACC2. Particularly interesting are compounds which have a selectivity against human ACC2, i. inhibit human ACC1 more strongly than human ACC2.

Dabei sollen vor allem Strukturen für die Therapie von Erkrankungen zur Verfügung gestellt werden, die humanes ACC1 stark inhibieren. Die gesuchten Strukturen sollen dabei humanes ACC1 stärker inhibieren als humanes ACC2, d.h. eine Selektivität gegen humanes ACC2 besitzen. In particular, structures for the therapy of diseases which strongly inhibit human ACC1 should be made available. The sought structures are said to inhibit human ACC1 more than human ACC2, i. have a selectivity against human ACC2.

Vorzugsweise sollen Strukturen für die Therapie von Erkrankungen zur Verfügung gestellt werden, die zusätzlich auch eine, besser mehrere oder am besten sogar alle der folgenden Eigenschaften besitzen:

  • – sie inhibieren humanes ACC1 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen mit einem IC50 von weniger als 300 nM, besser von weniger als 200 nM, noch besser von weniger als 100 nM im beschriebenen Assay,
  • – sie inhibieren humanes ACC2 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen mit einem IC50 von mehr als 0.5 µM, besser von mehr als 1.5 µM, noch besser von mehr als 2 µM im beschriebenen Assay,
  • – das Verhältnis des IC50 für die Inhibition von humanem ACC2 zum IC50 für die Inhibition von humanem ACC1 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen beträgt mindestens einen Faktor 8, besser mindestens einen Faktor 15, noch besser mindestens einen Faktor 20,
  • – sie inhibieren die Tumorzellproliferation von MCF7-Zelllinien nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen mit einem IC50 von weniger als 250 nM, besser weniger als 100 nM, noch besser weniger als 50 nM im beschriebenen Assay,
  • – sie besitzen einen logP/D-Wert von kleiner 3, besser kleiner 2.5 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen im beschriebenen Assay,
  • – sie besitzen einen logMA-Wert von kleiner 3, besser kleiner 2.5, noch besser kleiner 2 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen im beschriebenen Assay,
  • – sie besitzen eine Proteinbindungskonstante an HSA von größer 1 µmol/l nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen im beschriebenen Assay,
  • – sie haben bezüglich der Bindung an humanes Plasmaprotein eine freie Fraktion von mehr als 0.1%, besser von mehr als 0.2% nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen im beschriebenen Assay,
  • – sie haben ein Verhältnis der freien Fraktionen bezüglich der Bindung an Mäuseplasmaprotein und humanes Plasmaprotein von einem Faktor von weniger als 15, besser weniger als 10 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen,
  • – sie haben ein Verhältnis der freien Fraktionen bezüglich der Bindung an das Plasmaprotein verschiedener Spezies, welches zu einer akzeptablen, abgeschätzten Humandosis führt,
  • – sie haben pharmakokinetische Parameter, welche zu einer akzeptablen, abgeschätzten Humandosis führen und die Verabreichung als Medikament erlauben.
  • – sie haben eine niedrige Clearance.
  • – sie habeen eine hohe Bioverfügbarkeit,
  • – sie haben ein moderates bis hohes Verteilungsvolumen,
  • – sie haben eine akzeptable relative Bioverfügbarkeit, welche zu einer akzeptablen, abgeschätzten Humandosis führt und die Verabreichung als Medikament erlaubt,
  • – sie haben eine abgeschätzte humane Halbwertzeit von nicht mehr als zwei Wochen,
  • – sie haben eine in vivo Wirkung im PC3-Xenograft-Maus-Modell,
  • – sie haben eine Wirkung im PC3-Xenograft-Maus-Modell mit Plasmaspiegeln, die zu einer akzeptablen, abgeschätzten Humandosis führen,.
  • – die für sie abgeschätzte menschliche Tagesdosis liegt unter 2 g, besser unter 1 g pro Patient.
It is preferable to provide structures for the treatment of diseases which additionally also have one, more preferably several or even all of the following properties:
  • They inhibit human ACC1 after single measurement or better in the mean of several measurements with an IC50 of less than 300 nM, better of less than 200 nM, even better of less than 100 nM in the described assay,
  • They inhibit human ACC2 after single measurement or better in the mean of several measurements with an IC50 of more than 0.5 μM, better of more than 1.5 μM, even better of more than 2 μM in the described assay,
  • The ratio of the IC50 for the inhibition of human ACC2 to the IC50 for the inhibition of human ACC1 after single measurement or better in the mean of several measurements is at least a factor 8, better at least a factor 15, even better at least a factor 20,
  • They inhibit tumor cell proliferation of MCF7 cell lines after single measurement or better in the mean of several measurements with an IC50 of less than 250 nM, better less than 100 nM, even better less than 50 nM in the described assay,
  • They have a logP / D value of less than 3, better than 2.5 after single measurement or better in the mean of several measurements in the described assay,
  • They have a logMA value of less than 3, better still less than 2.5, even better less than 2 after single measurement or better in the mean of several measurements in the described assay,
  • They have a protein binding constant at HSA greater than 1 μmol / l after a single measurement or better in the mean of several measurements in the described assay,
  • They have a free fraction of more than 0.1%, more preferably more than 0.2%, after single measurement or better, on average, from several measurements in the described assay with respect to binding to human plasma protein,
  • They have a ratio of the free fractions with respect to the binding to mouse plasma protein and human plasma protein of a factor of less than 15, better less than 10 after single measurement or better in the mean of several measurements,
  • They have a ratio of the free fractions with respect to the binding to the plasma protein of different species, which leads to an acceptable, estimated human dose,
  • - They have pharmacokinetic parameters which lead to an acceptable, estimated human dose and allow administration as a drug.
  • - they have a low clearance.
  • - they have a high bioavailability,
  • - they have a moderate to high volume of distribution,
  • They have an acceptable relative bioavailability, which results in an acceptable, estimated human dose and allows administration as a drug,
  • - they have an estimated human half-life of not more than two weeks,
  • They have an in vivo effect in the PC3 xenograft mouse model,
  • They have an effect in the PC3 xenograft mouse model with plasma levels leading to an acceptable, estimated human dose.
  • - the estimated daily human dose is below 2 g, better below 1 g per patient.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Verbindungen der Formel (I)

Figure 00060001
wobei
R1 für eine Methylgruppe oder ein Chloratom und
R2 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und
R3 für ein Wasserstoff- oder ein Fluoratom und
R4 für ein Chlor- oder Fluoratom stehen,
sowie deren Salze
besonders gut für die Therapie von Erkrankungen geeignet sind und die erfindungsgemäße Aufgabe lösen. It has now surprisingly been found that compounds of the formula (I)
Figure 00060001
in which
R 1 represents a methyl group or a chlorine atom and
R 2 represents a hydrogen atom or a methyl group and
R 3 is a hydrogen or a fluorine atom and
R 4 is a chlorine or fluorine atom,
and their salts
are particularly well suited for the therapy of diseases and solve the task of the invention.

Dabei war nicht vorhersehbar, ob und welches der als Insektizide oder Herbizide bekannten Strukturen die erfindungsgemäße Aufgabe löst, nämlich eine Struktur darstellt, die bei der Therapie von menschlichen Erkrankungen eingesetzt werden kann. It was unpredictable whether and which of the structures known as insecticides or herbicides achieves the object according to the invention, namely a structure which can be used in the therapy of human diseases.

Umso weniger war es vorhersehbar, ob und welches der als Insektizide oder Herbizide bekannten Strukturen humanes ACC inhibiert, geschweige denn ob und welches eine Selektivität gegen eine der humanen Isoformen aufweist. It was all the less predictable whether and which of the structures known as insecticides or herbicides inhibited human ACC, let alone whether and which has selectivity against any of the human isoforms.

Aus der großen Gruppe der als Insektizide, Fungizide oder Herbizide bekannten zyklischen Ketoenole haben sich die Verbindungen der Formel (I) überraschenderweise durch eine gute Enzyminhibition des humanen ACC´s hervorgehoben. Dabei weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine erhöhte Selektivität gegen ACC2 auf und inhibieren vor allem ACC1. Diese Eigenschaft war nicht vorhersehbar und qualifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen für eine Therapie mit verringerten Nebenwirkungen. Unerwünschte Nebenwirkungen haben wahrscheinlich ihre Ursache in der gleichzeitigen Inhibition des humanen ACC2´s, während die Wirkungen vor allem auf der Inhibition des humanen ACC1´s beruhen. From the large group of known as insecticides, fungicides or herbicides cyclic ketoenols, the compounds of formula (I) have surprisingly highlighted by a good enzyme inhibition of the human ACC's. In this case, the compounds according to the invention have an increased selectivity against ACC2 and in particular inhibit ACC1. This property was unpredictable and qualifies the compounds of the invention for therapy with reduced side effects. Undesirable side effects are probably due to the simultaneous inhibition of human ACC2s, while the effects are mainly due to the inhibition of human ACC1s.

Ebenfalls als von der vorliegenden Erfindung als erfasst anzusehen ist die Verwendung der physiologisch verträglichen Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen. Also to be regarded as covered by the present invention is the use of the physiologically acceptable salts of the compounds of the invention.

Ebenfalls als von der vorliegenden Erfindung als erfasst anzusehen ist die Verwendung der tautomeren Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I), z.B.

Figure 00070001
Also to be regarded as encompassed by the present invention is the use of the tautomeric forms of the compounds of the formula (I) according to the invention, for example
Figure 00070001

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclo-hexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin. Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention also include salts of customary bases, such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts) and ammonium salts derived from ammonia or organic amines having from 1 to 16 carbon atoms, as exemplified and preferably ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, N-methylmorpholine, arginine, lysine, ethylenediamine and N-methylpiperidine.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel enthaltend die erfindungsgemäßen Verbindungen und mindestens einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Another object of the present invention are pharmaceutical compositions containing the compounds of the invention and at least one or more other active ingredients, in particular for the prophylaxis and / or therapy of tumor diseases.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent. The compounds according to the invention can act systemically and / or locally. For this purpose, it may be applied in a suitable manner, e.g. oral, parenteral, pulmonary, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otic or as an implant or stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden. For these administration routes, the compounds according to the invention can be administered in suitable administration forms.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophilisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen. Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern. Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents. For oral administration are according to the prior art functioning rapidly and / or modified compounds of the invention donating application forms containing the compounds of the invention in crystalline and / or amorphous and / or dissolved form, such as tablets (uncoated or coated tablets, for example with enteric or delayed-dissolving or insoluble coatings controlling the release of the compound of the invention), rapidly disintegrating tablets or films / wafers, films / lyophilisates, capsules (eg hard or soft gelatin capsules), dragees, granules, pellets, powders , Emulsions, suspensions, aerosols or solutions. The parenteral administration can be done bypassing a resorption step (eg, intravenous, intraarterial, intracardiac, intraspinal, or intralumbar) or with involvement of resorption (eg, intramuscular, subcutaneous, intracutaneous, percutaneous, or intraperitoneal). For parenteral administration, suitable application forms include injection and infusion preparations in the form of solutions, suspensions, emulsions, lyophilisates or sterile powders. For other routes of administration are, for example, inhalant medicines (including powder inhalers, nebulizers), nasal drops, solutions, sprays; lingual, sublingual or buccal tablets, films / wafers or capsules, suppositories, ear or ophthalmic preparations, vaginal capsules, aqueous suspensions (lotions, shake mixtures), lipophilic suspensions, ointments, creams, transdermal therapeutic systems (such as patches), milk, Pastes, foams, scattering powders, implants or stents.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien. The compounds according to the invention can be converted into the stated administration forms. This can be done in a conventional manner by mixing with inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients. These adjuvants include, among others. Carriers (for example microcrystalline cellulose, lactose, mannitol), solvents (eg liquid polyethylene glycols), emulsifiers and dispersing or wetting agents (for example sodium dodecyl sulfate, polyoxysorbitanoleate), binders (for example polyvinylpyrrolidone), synthetic and natural polymers (for example albumin), stabilizers (eg antioxidants such as ascorbic acid), dyes (eg, inorganic pigments such as iron oxides), and flavor and / or odor remedies.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die die erfindungsgemäßen Verbindungen, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken. Another object of the present invention are pharmaceutical compositions containing the compounds of the invention, usually together with one or more inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients, and their use for the purposes mentioned above.

Die Formulierung der erfindungsgemäßen Verbindungen zu pharmazeutischen Präparaten erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man den oder die Wirkstoffe mit den in der Galenik gebräuchlichen Hilfsstoffen in die gewünschte Applikationsform überführt. The formulation of the compounds according to the invention into pharmaceutical preparations is carried out in a manner known per se by converting the active substance (s) into the desired administration form with the auxiliaries customary in galenicals.

Als Hilfsstoffe können dabei beispielsweise Trägersubstanzen, Füllstoffe, Sprengmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Gleitmittel, Ab- und Adsorptionsmittel, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Cosolventien, Emulgatoren, Lösungsvermittler, Geschmackskorrigentien, Färbemittel, Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer zum Einsatz kommen. Dabei ist auf Remington´s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen. As auxiliaries may, for example, vehicles, fillers, disintegrants, binders, humectants, lubricants, adsorbents and agents, diluents, solvents, cosolvents, emulsifiers, solubilizers, flavoring agents, colorants, preservatives, stabilizers, wetting agents, salts for changing the osmotic pressure or buffers are used. Attention is drawn to Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980).

Die pharmazeutischen Formulierungen können
in fester Form, zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Pillen, Suppositorien, Kapseln, transdermale Systeme oder
in halbfester Form, zum Beispiel als Salben, Cremes, Gele, Suppositorien, Emulsionen oder
in flüssiger Form, zum Beispiel als Lösungen, Tinkturen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. The pharmaceutical formulations can
in solid form, for example as tablets, dragees, pills, suppositories, capsules, transdermal systems or
in semi-solid form, for example as ointments, creams, gels, suppositories, emulsions or
in liquid form, for example as solutions, tinctures, suspensions or emulsions.

Hilfsstoffe im Sinne der Erfindung können beispielsweise Salze, Saccharide (Mono-, Di-, Tri-, Oligo-, und/oder Polysaccharide), Proteine, Aminosäuren, Peptide, Fette, Wachse, Öle, Kohlenwasserstoffe sowie deren Derivate sein, wobei die Hilfsstoffe natürlichen Ursprungs sein können oder synthetisch bzw. partial synthetisch gewonnen werden können. Auxiliaries for the purposes of the invention may be, for example, salts, saccharides (mono-, di-, tri-, oligo-, and / or polysaccharides), proteins, amino acids, peptides, fats, waxes, oils, hydrocarbons and derivatives thereof, the auxiliaries may be of natural origin or synthetically or partially synthetically obtained.

Für die orale oder perorale Applikation kommen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulate, Pastillen, Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen in Frage. Für die parenterale Applikation kommen insbesondere Suspensionen, Emulsionen und vor allem Lösungen in Frage. For oral or oral administration, in particular tablets, dragees, capsules, pills, powders, granules, lozenges, suspensions, emulsions or solutions come into question. For parenteral administration in particular suspensions, emulsions and above all solutions in question.

Die vorliegende Erfindung betrifft die erfindungsgemäßen Verbindungen. Sie können für die Prophylaxe und Therapie von menschlichen Erkrankungen eingesetzt werden, insbesondere von Tumorerkrankungen. The present invention relates to the compounds of the invention. They can be used for the prophylaxis and treatment of human diseases, in particular tumors.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können insbesondere verwendet werden, um die Zellproliferation und/oder die Zellteilung zu inhibieren oder zu reduzieren und/oder Apoptosis zu induzieren. In particular, the compounds of the invention may be used to inhibit or reduce cell proliferation and / or cell division and / or induce apoptosis.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von hyper-proliferativen Erkrankungen wie beispielsweise

  • – Psoriasis,
  • – Keloide und andere Hyperplasien, die die Haut betreffen,
  • – gutartige Prostathyperplasien (BPH),
  • – solide Tumore und
  • – hämatologische Tumore.
The compounds of the invention are particularly suitable for the prophylaxis and / or treatment of hyper-proliferative diseases such as
  • - psoriasis,
  • - keloids and other skin-related hyperplasias
  • - benign prostate hyperplasia (BPH),
  • - solid tumors and
  • - hematological tumors.

Als solide Tumore sind erfindungsgemäß beispielsweise Tumore behandelbar der Brust, des Respirationstraktes, des Gehirns, der Fortpflanzungsorgane, des Magen-Darmtraktes, des Urogenitaltraktes, des Auges, der Leber, der Haut, des Kopfes und des Halses, der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Knochen sowie des Bindegewebes und Metastasen dieser Tumore. As solid tumors according to the invention, for example, tumors of the breast, the respiratory tract, the brain, the reproductive organs, the gastrointestinal tract, the genitourinary tract, the Eye, liver, skin, head and neck, thyroid, parathyroid gland, bone, connective tissue, and metastases of these tumors.

Als hämatologische Tumore sind beispielsweise behandelbar

  • – multiple Myelome,
  • – Lymphome oder
  • – Leukämien.
For example, hematological tumors are treatable
  • - multiple myeloma,
  • - Lymphomas or
  • - leukemia.

Als Brusttumore sind beispielsweise behandelbar:

  • – Mammakarzinome mit positivem Hormonrezeptorstatus
  • – Mammakarzinome mit negativem Hormonrezeptorstatus
  • – Her-2 positive Mammakarzinome
  • – Hormonrezeptor- und Her-2 negative Mammakarzinome
  • – BRCA-assoziierte Mammakarzinome
  • – entzündliches Mammakarzinom.
For example, treatable as breast tumors are:
  • - Breast cancer with positive hormone receptor status
  • - Breast cancer with negative hormone receptor status
  • - Her-2 positive breast cancers
  • - Hormone receptor and Her-2 negative breast cancers
  • - BRCA-associated breast cancer
  • - inflammatory breast cancer.

Als Tumore des Respirationstraktes sind beispielsweise behandelbar

  • – nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome und
  • – kleinzellige Bronchialkarzinome.
For example, tumors of the respiratory tract are treatable
  • - non-small cell lung carcinomas and
  • - small cell bronchial carcinomas.

Als Tumore des Gehirns sind beispielsweise behandelbar

  • – Gliome,
  • – Glioblastome,
  • – Astrozytome,
  • – Meningiome und
  • – Medulloblastome.
For example, tumors of the brain are treatable
  • - glioma,
  • - glioblastomas,
  • - astrocytomas,
  • - Meningiomas and
  • - Medulloblastomas.

Als Tumore der männlichen Fortpflanzungsorgane sind beispielsweise behandelbar:

  • – Prostatakarzinome,
  • – Maligne Hodentumore und
  • – Peniskarzinome.
For example, tumors of the male reproductive organs are treatable:
  • - prostate carcinomas,
  • - Malignant testicular tumors and
  • - Penile carcinomas.

Als Tumore der weiblichen Fortpflanzungsorgane sind beispielsweise behandelbar:

  • – Endometriumkarzinome
  • – Zervixkarzinome
  • – Ovarialkarzinome
  • – Vaginalkarzimome
  • – Vulvarkarzinome
For example, tumors of the female reproductive organs are treatable:
  • - endometrial carcinomas
  • - cervical carcinomas
  • - ovarian carcinomas
  • - vaginal carcinomas
  • - Vulvar carcinomas

Als Tumore des Magen-Darm-Traktes sind beispielsweise behandelbar:

  • – Kolorektale Karzinome
  • – Analkarzinome
  • – Magenkarzinome
  • – Pankreaskarzinome
  • – Ösophagukarzinome
  • – Gallenblasenkarzinome
  • – Dünndarmkarzinome
  • – Speicheldrüsenkarzinome
  • – Neuroendokrine Tumore
  • – Gastrointestinale Stromatumore
For example, tumors of the gastrointestinal tract are treatable:
  • - Colorectal carcinomas
  • - Anal carcinomas
  • - gastric carcinoma
  • - Pancreatic carcinomas
  • - esophageal carcinomas
  • - Gallbladder carcinomas
  • - Small intestinal carcinomas
  • - Salivary gland carcinomas
  • - Neuroendocrine tumors
  • - Gastrointestinal stromal tumors

Als Tumore des Urogenital-Traktes sind beispielsweise behandelbar:

  • – Harnblasenkarzinome
  • – Nierenzellkarzinome
  • – Karzinome des Nierenbeckens und der ableitenden Harnwege
For example, tumors of the urogenital tract are treatable:
  • - bladder carcinomas
  • - renal cell carcinomas
  • - carcinomas of the renal pelvis and the urinary tract

Als Tumore des Auges sind beispielsweise behandelbar:

  • – Retinoblastome
  • – Intraokulare Melanome
For example, tumors of the eye are treatable:
  • - Retinoblastomas
  • - Intraocular melanomas

Als Tumore der Leber sind beispielsweise behandelbar:

  • – Hepatozelluläre Karzinome
  • – Cholangiozelluläre Karzinome
For example, tumors of the liver are treatable:
  • - Hepatocellular carcinomas
  • - Cholangiocellular carcinomas

Als Tumore der Haut sind beispielsweise behandelbar:

  • – Maligne Melanome
  • – Basaliome
  • – Spinaliome
  • – Kaposi-Sarkome
  • – Merkelzellkarzinome
For example, tumors of the skin are treatable:
  • - Malignant melanomas
  • - basaliomas
  • - Spinaliomas
  • - Kaposi's sarcoma
  • - Merkel cell carcinomas

Als Tumore des Kopfes und Halses sind beispielsweise behandelbar:

  • – Larynxkarzinome
  • – Karzinome des Pharynx und der Mundhöhle
For example, tumors of the head and neck are treatable:
  • - Laryngeal carcinomas
  • - Carcinoma of the pharynx and oral cavity

Als Sarkome sind beispielsweise behandelbar:

  • – Weichteilsarkome
  • – Osteosarkome
For example, sarcomas are treatable:
  • - soft tissue sarcoma
  • - Osteosarcomas

Als Lymphome sind beispielsweise behandelbar:

  • – Non-Hodgkin-Lymphome
  • – Hodgkin-Lymphome
  • – Kutane Lymphome
  • – Lymphome des zentralen Nervensystems
  • – AIDS-assoziierte Lymphome
For example, lymphomas are treatable:
  • - Non-Hodgkin's lymphoma
  • - Hodgkin lymphoma
  • - cutaneous lymphomas
  • - Lymphomas of the central nervous system
  • - AIDS-associated lymphomas

Als Leukämien sind beispielsweise behandelbar:

  • – Akute myeloische Leukämien
  • – Chronische myeloische Leukämien
  • – Akute lymphatische Leukämien
  • – Chronische lymphatische Leukämien
  • – Haarzellleukämien
Treatable as leukemias, for example:
  • - Acute myeloid leukemias
  • - Chronic myeloid leukemia
  • - Acute lymphocytic leukemia
  • - Chronic lymphocytic leukemia
  • - hair cell leukemia

Vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden zur Prophylaxe und/oder Therapie von:
Mammakarzinomen, insbesondere von Hormonrezeptor-negativen, Hormonrezeptor-positiven oder BRCA–assoziierten Mammakarzinomen, sowie
Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinom, Kolorektalen Karzinomen und Prostatakarzinomen. Advantageously, the compounds according to the invention can be used for the prophylaxis and / or therapy of:
Breast cancer, in particular of hormone receptor negative, hormone receptor positive or BRCA-associated breast carcinoma, as well as
Pancreatic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma and other skin tumors, non-small cell lung carcinoma, endometrial carcinoma, colorectal carcinoma and prostate carcinoma.

Besonders vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. The compounds according to the invention can be used particularly advantageously for the prophylaxis and / or therapy of breast cancers, in particular hormone receptor-positive breast carcinomas, colorectal carcinomas, prostate carcinomas, in particular androgen receptor-negative prostate carcinomas or non-small cell lung carcinomas.

Diese Erkrankungen sind gut charakterisiert im Menschen, existieren aber auch bei anderen Säugetieren. These diseases are well characterized in humans but also exist in other mammals.

Ein Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formel (I), insbesondere die Verbindungen:

  • – 3-(3',4'-Difluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on,
  • – 3-(4'-Chlor-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on,
  • – 3-(4,4'-Dichlorbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on,
  • – 8,8-Difluor-3-(4'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on,
  • – 3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on,
  • – 3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on.
An object of the present application are the compounds of the formula (I) according to the invention, in particular the compounds:
  • 3- (3 ', 4'-difluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one,
  • 3- (4'-chloro-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one,
  • 3- (4,4'-dichlorobiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one,
  • 8,8-Difluoro-3- (4'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one,
  • 3- (4'-chloro-4-methyl-biphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one,
  • - 3- (4'-chloro-3'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Another object of the present application are the compounds of the invention for use as medicaments, in particular for the prophylaxis and / or therapy of tumor diseases.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen. The present invention further relates to the compounds according to the invention for the prophylaxis and / or therapy of breast cancers, pancreatic carcinomas, renal cell carcinomas, hepatocellular carcinomas, malignant melanomas and other skin tumors, non-small cell bronchial carcinomas, endometrial carcinomas, colorectal carcinomas or prostate carcinomas.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. The present invention further relates to the compounds according to the invention for the prophylaxis and / or therapy of breast cancers, in particular hormone receptor-positive breast carcinomas, colorectal carcinomas, prostate carcinomas, in particular androgen receptor-negative prostate carcinomas or non-small cell lung carcinomas.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels. Another object of the invention is the use of the compounds of the invention for the manufacture of a medicament.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Another object of the present application is the use of the compounds of the invention for the manufacture of a medicament for the prophylaxis and / or therapy of tumor diseases.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen. Another object of the present application is the use of the compounds of the invention for the manufacture of a medicament for the prophylaxis and / or therapy of breast, pancreatic, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma and other skin tumors, non-small cell lung carcinoma, endometrial carcinoma, colorectal carcinoma or prostate cancer.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. Another object of the present application is the use of the compounds of the invention for the manufacture of a medicament for the prophylaxis and / or treatment of breast cancers, in particular hormone receptor-positive breast carcinomas, colorectal carcinomas, prostate carcinomas, especially androgen receptor-negative prostate carcinomas or non-small cell bronchial carcinomas.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Another object of the present application is the use of the compound for the prophylaxis and / or therapy of tumor diseases.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen. Another object of the present application is the use of the compounds of the invention for the prophylaxis and / or treatment of breast, pancreatic, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma and other skin tumors, non-small cell bronchial carcinoma, endometrial carcinoma, colorectal carcinoma or prostate cancer.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. The present application further relates to the use of the compounds according to the invention for the prophylaxis and / or therapy of breast cancers, in particular hormone receptor-positive breast carcinomas, colorectal carcinomas, prostate carcinomas, in particular androgen receptor-negative prostate carcinomas or non-small cell bronchial carcinomas.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische Formulierungen in Form von Tabletten enthaltend eine der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen. Another object of the present application are pharmaceutical formulations in the form of tablets containing one of the compounds of the invention for the prophylaxis and / or treatment of breast cancer, pancreatic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma and other skin tumors, non-small cell bronchial carcinoma, endometrial carcinoma, colorectal carcinoma or prostate cancer.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische Formulierungen in Form von Tabletten enthaltend eine der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. Another object of the present application are pharmaceutical formulations in the form of tablets containing one of the compounds of the invention for the prophylaxis and / or treatment of breast cancer, especially hormone receptor-positive breast carcinoma, colorectal carcinoma, prostate cancer, especially androgen receptor-negative prostate cancer or non-small cell lung carcinoma.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen, die mit proliferativen Prozessen einhergehen. Another object of the invention is the use of the compounds of the invention for the treatment of diseases associated with proliferative processes.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie der zuvor genannten Erkrankungen. The compounds according to the invention can be used alone or as needed in combination with one or more other pharmacologically active substances, as long as this combination does not lead to undesired and unacceptable side effects. Another subject of the present The invention therefore relates to medicaments comprising a compound according to the invention and one or more further active compounds, in particular for the prophylaxis and / or therapy of the abovementioned disorders.

Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit bekannten anti-hyperproliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Die Kombination der erfindungsgemäßen Verbindungen mit anderen für die Krebstherapie gebräuchlichen Substanzen oder auch mit der Strahlentherapie ist besonders angezeigt. For example, the compounds according to the invention can be combined with known anti-hyperproliferative, cytostatic or cytotoxic substances for the treatment of cancers. The combination of the compounds according to the invention with other substances commonly used for cancer therapy or also with radiotherapy is particularly indicated.

Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
Afinitor, Aldesleukin, Alendronsäure, Alfaferon, Alitretinoin, Allopurinol, Aloprim, Aloxi, Altretamin, Aminoglutethimid, Amifostin, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Anzmet, Aranesp, Arglabin, Arsentrioxid, Aromasin, 5-Azacytidin, Azathioprin, BCG oder tice-BCG, Bestatin, Betamethason-Acetat, Betamethason-Natriumphosphat, Bexaroten, Bleomycin-Sulfat, Broxuridin, Bortezomib, Busulfan, Calcitonin, Campath, Capecitabin, Carboplatin, Casodex, Cefeson, Celmoleukin, Cerubidin, Chlorambucil, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, DaunoXome, Decadron, Decadron-Phosphat, Delestrogen, Denileukin Diftitox, Depomedrol, Deslorelin, Dexrazoxan, Diethylstilbestrol, Diflucan, Docetaxel, Doxifluridin, Doxorubicin, Dronabinol, DW-166HC, Eligard, Elitek, Ellence, Emend, Epirubicin, Epoetin-alfa, Epogen, Eptaplatin, Ergamisol, Estrace, Estradiol, Estramustin-Natriumphosphat, Ethinylestradiol, Ethyol, Etidronsäure, Etopophos, Etoposid, Fadrozol, Farston, Filgrastim, Finasterid, Fligrastim, Floxuridin, Fluconazol, Fludarabin, 5-Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5-Fluoruracil (5-FU), Fluoxymesteron, Flutamid, Formestan, Fosteabin, Fotemustin, Fulvestrant, Gammagard, Gemcitabin, Gemtuzumab, Gleevec, Gliadel, Goserelin, Granisetron-Hydrochlorid, Histrelin, Hycamtin, Hydrocorton, erythro-Hydroxynonyladenin, Hydroxyharnstoff, Ibritumomab Tiuxetan, Idarubicin, Ifosfamid, Interferon-alpha, Interferon-alpha-2, Interferon-alpha-2α, Interferon-alpha-2β, Interferon-alpha-n1, Interferon-alpha-n3, Interferon-beta, Interferon-gamma-1α, Interleukin-2, Intron A, Iressa, Irinotecan, Kytril, Lapatinib, Lentinan-Sulfat, Letrozol, Leucovorin, Leuprolid, Leuprolid-Acetat, Levamisol, Levofolinsäure-Calciumsalz, Levothroid, Levoxyl, Lomustin, Lonidamin, Marinol, Mechlorethamin, Mecobalamin, Medroxyprogesteron-Acetat, Megestrol-Acetat, Melphalan, Menest, 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Metvix, Miltefosin, Minocyclin, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Modrenal, Myocet, Nedaplatin, Neulasta, Neumega, Neupogen, Nilutamid, Nolvadex, NSC-631570, OCT-43, Octreotid, Ondansetron-Hydrochlorid, Orapred, Oxaliplatin, Paclitaxel, Pediapred, Pegaspargase, Pegasys, Pentostatin, Picibanil, Pilocarpin-Hydrochlorid, Pirarubicin, Plicamycin, Porfimer-Natrium, Prednimustin, Prednisolon, Prednison, Premarin, Procarbazin, Procrit, Raltitrexed, RDEA119, Rebif, Rhenium-186-Etidronat, Rituximab, Roferon-A, Romurtid, Salagen, Sandostatin, Sargramostim, Semustin, Sizofiran, Sobuzoxan, Solu-Medrol, Streptozocin, Strontium-89-chlorid, Synthroid, Tamoxifen, Tamsulosin, Tasonermin, Tastolacton, Taxoter, Teceleukin, Temozolomid, Teniposid, Testosteron-Propionat, Testred, Thioguanin, Thiotepa, Thyrotropin, Tiludronsäure, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Tastuzumab, Teosulfan, Tretinoin, Trexall, Trimethylmelamin, Trimetrexat, Triptorelin-Acetat, Triptorelin-Pamoat, UFT, Uridin, Valrubicin, Vesnarinon, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinorelbin, Virulizin, Zinecard, Zinostatin-Stimalamer, Zofran; ABI-007, Acolbifen, Actimmun, Affinitak, Aminopterin, Arzoxifen, Asoprisnil, Atamestan, Atrasentan, BAY 43-9006 (Sorafenib), Avastin, CCI-779, CDC-501, Celebrex, Cetuximab, Crisnatol, Cyproteron-Acetat, Decitabin, DN-101, Doxorubicin-MTC, dSLIM, Dutasterid, Edotecarin, Eflornithin, Exatecan, Fenretinid, Histamin-Dihydrochlorid, Histrelin-Hydrogel-Implant, Holmium-166-DOTMP, Ibandronsäure, Interferon-gamma, Intron-PEG, Ixabepilon, Keyhole Limpet-Hemocyanin, L-651582, Lanreotid, Lasofoxifen, Libra, Lonafarnib, Miproxifen, Minodronat, MS-209, liposomales MTP-PE, MX-6, Nafarelin, Nemorubicin, Neovastat, Nolatrexed, Oblimersen, Onko-TCS, Osidem, Paclitaxel-Polyglutamat, Pamidronat-Dinatrium, PN-401 , QS-21, Quazepam, R-1549, Raloxifen, Ranpirnas, 13-cis-Retinsäure, Satraplatin, Seocalcitol, T-138067, Tarceva, Taxoprexin, Thymosin-alpha-1, Tiazofurin, Tipifarnib, Tirapazamin, TLK-286, Toremifen, TransMID-107R, Valspodar, Vapreotid, Vatalanib, Verteporfin, Vinflunin, Z-100, Zoledronsäure, sowie Kombinationen hiervon. Examples of suitable combination active ingredients are:
Afinitor, aldesleukin, alendronic acid, alfaferone, alitretinoin, allopurinol, aloprim, aloxi, altretamine, aminoglutethimide, amifostine, amrubicin, amsacrine, anastrozole, anzmet, aranesp, arglabine, arsenic trioxide, aromasine, 5-azacytidine, azathioprine, BCG or tice-BCG, Bestatin, betamethasone acetate, betamethasone sodium phosphate, bexarotene, bleomycin sulfate, broxuridine, bortezomib, busulfan, calcitonin, campath, capecitabine, carboplatin, casodex, cefesone, celmoleukin, cerubidine, chlorambucil, cisplatin, cladribine, clodronic acid, cyclophosphamide, cytarabine, Dacarbazine, Dactinomycin, DaunoXome, Decadron, Decadron Phosphate, Delestrogen, Denileukin Diftitox, Depomedrol, Deslorelin, Dexrazoxane, Diethylstilbestrol, Diflucan, Docetaxel, Doxifluridine, Doxorubicin, Dronabinol, DW-166HC, Eligard, Elitek, Ellence, Emend, Epirubicin, Epoetin -alfa, Epogen, Eptaplatin, Ergamisole, Estrace, Estradiol, Estramustine Sodium Phosphate, Ethinylestradiol, Ethyol, Etidronic Acid, Etopophos, Etoposide, Fadrozole, Farston , Filgrastim, Finasteride, Fligrastim, Floxuridine, Fluconazole, Fludarabine, 5-Fluorodeoxyuridine Monophosphate, 5-Fluorouracil (5-FU), Fluoxymesterone, Flutamide, Formestane, Fosteabin, Fotemustine, Fulvestrant, Gammagard, Gemcitabine, Gemtuzumab, Gleevec, Gliadel, Goserelin, granisetron hydrochloride, histrelin, hycamtin, hydrocorton, erythro-hydroxynonyladenine, hydroxyurea, ibritumomab tiuxetan, idarubicin, ifosfamide, interferon-alpha, interferon-alpha-2, interferon-alpha-2α, interferon-alpha-2β, interferon-alpha -n1, interferon-alpha-n3, interferon-beta, interferon-gamma-1α, interleukin-2, intron A, Iressa, irinotecan, cytril, lapatinib, lentinan sulfate, letrozole, leucovorin, leuprolide, leuprolide acetate, levamisole, Levofolic Acid Calcium Salt, Levothroid, Levoxyl, Lomustine, Lonidamine, Marinol, Mechlorethamine, Mecobalamin, Medroxyprogesterone Acetate, Megestrol Acetate, Melphalan, Menest, 6-Mercaptopurine, Mesna, Methotrexate, Metvix, Miltefosine, Minocycline, Mitomycin C, Mitotane, Mitoxantrone . Modrenal, Myocet, Nedaplatin, Neulasta, Neumega, Neupogen, Nilutamide, Nolvadex, NSC-631570, OCT-43, Octreotide, Ondansetron hydrochloride, Orapred, Oxaliplatin, Paclitaxel, Pediapred, Pegaspargase, Pegasys, Pentostatin, Picibanil, Pilocarpine hydrochloride, Pirarubicin, Plicamycin, Porfimer Sodium, Prednimustine, Prednisolone, Prednisone, Premarin, Procarbazine, Procrit, Raltitrexed, RDEA119, Rebif, Rhenium-186 Etidronate, Rituximab, Roferon-A, Romurtide, Salagen, Sandostatin, Sargramostim, Semustin, Sizofiran, Sobuzoxan, solu-medrol, streptozocin, strontium-89-chloride, synthroid, tamoxifen, tamsulosin, tasonermine, tastolactone, taxoter, teceleukin, temozolomide, teniposide, testosterone propionate, testred, thioguanine, thiotepa, thyrotrophin, tiludronic acid, topotecan, toremifene, Tositumomab, Tastuzumab, Teosulfan, Tretinoin, Trexall, Trimethylmelamine, Trimetrexate, Triptorelin Acetate, Triptorelin Pamoate, UFT, Uridine, Valrubicin, Vesnarinone, Vinblastine, Vincristine, Vindesine, Vinorelbine, Virulizine, Zi necardi, Zinostatin Stimalamer, Zofran; ABI-007, Acolbifen, Actimmun, Affinitak, Aminopterin, Arzoxifen, Asoprisnil, Atamestan, Atrasentan, BAY 43-9006 (Sorafenib), Avastin, CCI-779, CDC-501, Celebrex, Cetuximab, Crisnatol, cyproterone acetate, decitabine, DN-101, doxorubicin MTC, dSLIM, dutasteride, edotecarin, eflornithine, exatecan, fenretinide, histamine dihydrochloride, histrelin hydrogel implant, holmium-166-DOTMP, ibandronic acid, interferon-gamma, intron-PEG, ixabepilone, keyhole limpet Hemocyanin, L-651582, Lanreotide, Lasofoxifen, Libra, Lonafarnib, Miproxifen, Minodronate, MS-209, Liposomal MTP-PE, MX-6, Nafarelin, Nemorubicin, Neovastat, Nolatrexed, Oblimersen, Onko-TCS, Osidem, Paclitaxel Polyglutamate, pamidronate disodium, PN-401 , QS-21, Quazepam, R-1549, Raloxifene, Ranpirnas, 13-cis-Retinoic Acid, Satraplatin, Seocalcitol, T-138067, Tarceva, Taxoprexin, Thymosin-alpha-1, Tiazofurin, Tipifarnib, Tirapazamine, TLK-286, Toremifene , TransMID-107R, valspodar, vapreotide, vatalanib, verteporfin, vinflunine, Z-100, zoledronic acid, and combinations thereof.

In einer bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit antihyperproliferativen Agentien kombiniert werden, welche beispielhaft – ohne dass diese Aufzählung abschließend wäre – sein können:
Aminoglutethimid, L-Asparaginase, Azathioprin, 5-Azacytidin, Bleomycin, Busulfan, Carboplatin, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Colaspase, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubicin, Diethylstilbestrol, 2',2'-Difluordeoxycytidin, Docetaxel, Doxorubicin (Adriamycin), Epirubicin, Epothilon und seine Derivate, erythro-Hydroxynonyladenin, Ethinylestradiol, Etoposid, Fludarabin-Phosphat, 5-Fluordeoxyuridin, 5-Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5-Fluoruracil, Fluoxymesteron, Flutamid, Hexamethylmelamin, Hydroxyharnstoff, Hydroxyprogesteron-Caproat, Idarubicin, Ifosfamid, Interferon, Irinotecan, Leucovorin, Lomustin, Mechlorethamin, Medroxyprogesteron-Acetat, Megestrol-Acetat, Melphalan, 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Paclitaxel, Pentostatin, N-Phosphonoacetyl-L-aspartat (PALA), Plicamycin, Prednisolon, Prednison, Procarbazin, Raloxifen, Semustin, Streptozocin, Tamoxifen, Teniposid, Testosteron-Propionat, Thioguanin, Thiotepa, Topotecan, Trimethylmelamin, Uridin, Vinblastin, Vincristin, Vindesin und Vinorelbin. In a preferred embodiment, the compounds according to the invention can be combined with antihyperproliferative agents, which may be by way of example-without this enumeration being conclusive:
Aminoglutethimide, L-asparaginase, azathioprine, 5-azacytidine, bleomycin, busulfan, carboplatin, carmustine, chlorambucil, cisplatin, colaspase, cyclophosphamide, cytarabine, dacarbazine, dactinomycin, daunorubicin, diethylstilbestrol, 2 ', 2'-difluorodoxycytidine, docetaxel, doxorubicin ( Adriamycin), epirubicin, epothilone and its derivatives, erythro-hydroxynonyladenine, ethinyl estradiol, etoposide, fludarabine phosphate, 5-fluorodeoxyuridine, 5-fluorodeoxyuridine monophosphate, 5-fluorouracil, fluoxymesterone, flutamide, hexamethylmelamine, hydroxyurea, hydroxyprogesterone caproate, idarubicin, Ifosfamide, interferon, irinotecan, leucovorin, lomustine, mechlorethamine, medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, melphalan, 6-mercaptopurine, mesna, methotrexate, mitomycin C, mitotane, mitoxantrone, paclitaxel, pentostatin, N-phosphonoacetyl-L-aspartate (PALA ) Plicamycin, prednisolone, prednisone, procarbazine, raloxifene, semustine, streptozocin, tamoxifen, teniposide, testosterone propionate, thioguanine, thiotepa, topotecan, trimethylmelamine, uridine, vinblastine, vincristine, vindesine and vinorelbine.

In viel versprechender Weise lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen auch mit biologischen Therapeutika wie Antikörpern (z.B. Avastin, Rituxan, Erbitux, Herceptin) und rekombinanten Proteinen kombinieren. Promisingly, the compounds of the invention may also be combined with biological therapeutics such as antibodies (e.g., Avastin, Rituxan, Erbitux, Herceptin) and recombinant proteins.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Kombination mit anderen, gegen die Angiogenese gerichteten Therapien positive Effekte erzielen, wie zum Beispiel mit Avastin, Axitinib, Regorafenib, Recentin, Sorafenib oder Sunitinib. Kombinationen mit Inhibitoren des Proteasoms und von mTOR sowie Antihormone und steroidale metabolische Enzyminhibitoren sind wegen ihres günstigen Nebenwirkungsprofils besonders geeignet. The compounds according to the invention can also achieve positive effects in combination with other anti-angiogenic therapies, for example with avastin, axitinib, regorafenib, recentin, sorafenib or sunitinib. Combinations with proteasome and mTOR inhibitors as well as antihormones and steroidal metabolic enzyme inhibitors are particularly suitable because of their favorable side effect profile.

Generell können mit der Kombination der erfindungsgemäßen Verbindungen mit anderen, zytostatisch oder zytotoxisch wirksamen Agentien folgende Ziele verfolgt werden:

  • • eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff;
  • • die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;
  • • die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe;
  • • die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;
  • • das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie;
  • • eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.
In general, the following objectives can be pursued with the combination of the compounds according to the invention with other cytostatic or cytotoxic agents:
  • • improved efficacy in slowing down the growth of a tumor, reducing its size or even eliminating it completely compared to treatment with a single drug;
  • • the possibility of using the chemotherapeutic agents used in lower doses than in monotherapy;
  • • the possibility of a more tolerable therapy with fewer side effects compared to a single dose;
  • • the ability to treat a wider range of tumors;
  • • achieving a higher response rate to therapy;
  • • longer patient survival compared to today's standard therapy.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Verbindung mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden. In addition, the compounds of the invention may also be used in conjunction with radiotherapy and / or surgical intervention.

1. Syntheserouten für Verbindungen gemäß Formel (I) 1. Synthesis Routes for Compounds According to Formula (I)

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden mit den Syntheserouten A und/oder B. The compounds of the formula (I) according to the invention can be prepared with the synthesis routes A and / or B.

Syntheseroute A Synthesis route A

Das Arylbromid-Derivat der Formel (II)

Figure 00180001
in welcher R1 und R2 die oben genannten Bedeutungen haben, wird in einer Suzuki-Kupplung umgesetzt mit Verbindungen der Formel (III)
Figure 00180002
in welcher R3 und R4 die oben genannten Bedeutungen haben und
A für -B(OH)2, einen Boronsäure-Ester, bevorzugt Boronsäurepinakolester, oder -BF3 –K+ steht. The arylbromide derivative of the formula (II)
Figure 00180001
in which R 1 and R 2 have the abovementioned meanings, is reacted in a Suzuki coupling with compounds of the formula (III)
Figure 00180002
in which R 3 and R 4 have the abovementioned meanings and
A is -B (OH) 2 , a boronic acid ester, preferably boronic acid pinacol ester, or -BF 3 - K + .

Die Suzuki-Kupplungen erfolgen im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Katalysators, gegebenenfalls in Gegenwart eines Zusatzreagenzes, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 130 °C bei Normaldruck. Die Reaktionen können auch in einem geschlossenen Gefäß unter Erhitzen in der Mikrowelle durchgeführt werden. Katalysatoren sind beispielsweise für Suzuki-Reaktionsbedingungen übliche Palladium-Katalysatoren, bevorzugt sind Katalysatoren wie z.B. Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium, Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0), Palladium auf Kohle, Palladium(II)acetat, Palladium(II)acetat/Triscyclohexylphosphin, Palladium(II)acetoacetonat/Tri-tert-butylphosphoniumtetrafluoroborat, Dichlor[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium-Dichlormethan-Komplex oder Palladium(II)acetat mit einem Liganden wie Dicyclohexyl[2',4',6'-tri(propan-2-yl)biphenyl-2-yl]phosphan. Zusatzreagenzien sind beispielsweise Kalium- oder Cäsiumacetat, Cäsium-, Kalium- oder Natrium-carbonat, Kalium-tert-butylat, Cäsiumfluorid, Kaliumphosphat oder Natrium- oder Kaliumhydroxid, bevorzugt sind Zusatzreagenzien wie z.B. Cäsiumcarbonat und/oder wässrige Natriumhydroxid-Lösung. Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder Toluol, oder Carbonsäureamide wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N-Methylpyrrolidon, oder Alkylsulfoxide wie Dimethylsulfoxid, oder Gemische der Lösungsmittel mit Alkoholen wie Methanol oder Ethanol und/oder Wasser, bevorzugt ist 1,2-Dimethoxyethan. The Suzuki couplings are generally carried out in inert solvents, in the presence of a catalyst, optionally in the presence of an additional reagent, preferably in a temperature range from room temperature to 130 ° C at atmospheric pressure. The reactions can also be carried out in a closed vessel with heating in the microwave. For example, catalysts are conventional palladium catalysts for Suzuki reaction conditions, preferably catalysts such as e.g. Dichlorobis (triphenylphosphine) palladium, tetrakistriphenylphosphinepalladium (0), palladium on carbon, palladium (II) acetate, palladium (II) acetate / triscyclohexylphosphine, palladium (II) acetoacetonate / tri-tert-butylphosphonium tetrafluoroborate, dichloro [1,1'-bis ( diphenylphosphino) ferrocene] palladium dichloromethane complex or palladium (II) acetate with a ligand such as dicyclohexyl [2 ', 4', 6'-tri (propan-2-yl) biphenyl-2-yl] phosphine. Additional reagents are, for example, potassium or cesium acetate, cesium, potassium or sodium carbonate, potassium tert-butylate, cesium fluoride, potassium phosphate or sodium or potassium hydroxide, preference is given to additional reagents, such as, for example, Cesium carbonate and / or aqueous sodium hydroxide solution. Inert solvents are, for example, ethers, such as dioxane, tetrahydrofuran or 1,2-dimethoxyethane, hydrocarbons, such as benzene, xylene or toluene, or carboxamides, such as dimethylformamide, dimethylacetamide or N-methylpyrrolidone, or alkyl sulfoxides, such as dimethyl sulfoxide, or mixtures of the solvents with alcohols, such as methanol or ethanol and / or water, preferred is 1,2-dimethoxyethane.

Die Verbindung der Formel (II) kann hergestellt werden, indem man die Verbindungen der Formel (IV)

Figure 00190001
in welcher R1 und R2 die oben genannten Bedeutungen haben und
B für C1-C6-Alkyl, bevorzugt Ethyl oder Methyl, steht,
unter Dieckmann-Kondensations-Bedingungen umsetzt. The compound of the formula (II) can be prepared by reacting the compounds of the formula (IV)
Figure 00190001
in which R 1 and R 2 have the abovementioned meanings and
B is C 1 -C 6 -alkyl, preferably ethyl or methyl,
under Dieckmann condensation conditions.

Die Dieckmann-Kondensationen erfolgen im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 130 °C bei Normaldruck. Basen sind beispielsweise Alkali- oder Erdalkalialkoholate wie Natrium- oder Kalium-tert-butylat, Natriummethanolat oder -ethanolat, bevorzugt ist Kalium-tert-butylat. Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder Toluol, oder Carbonsäureamide wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N-Methylpyrrolidon, oder Alkylsulfoxide wie Dimethylsulfoxid, oder Alkohole wie Methanol oder Ethanol, bevorzugt ist Dimethylformamid. The Dieckmann condensations are generally carried out in inert solvents in the presence of a base, preferably in a temperature range from room temperature to 130 ° C at atmospheric pressure. Examples of bases are alkali metal or alkaline earth metal alkoxides, such as sodium or potassium tert-butoxide, sodium methoxide or ethoxide, potassium tert-butoxide being preferred. Inert solvents are for example ethers such as dioxane, tetrahydrofuran or 1,2-dimethoxyethane, hydrocarbons such as benzene, xylene or toluene, or carboxamides such as dimethylformamide, dimethylacetamide or N-methylpyrrolidone, or alkyl sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, or alcohols such as methanol or ethanol, dimethylformamide being preferred ,

Die Verbindungen der Formel (IV) können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (V) oder ein Salz von Verbindungen der Formel (V)

Figure 00190002
in welcher B die oben angegebenen Bedeutungen hat, mit Verbindungen der Formel (VI)
Figure 00200001
in welcher R1 und R2 die oben genannten Bedeutungen haben, unter Amid-Kupplungs-Bedingungen umsetzt. The compounds of the formula (IV) can be prepared by reacting compounds of the formula (V) or a salt of compounds of the formula (V)
Figure 00190002
in which B has the meanings given above, with compounds of the formula (VI)
Figure 00200001
in which R 1 and R 2 have the abovementioned meanings, reacted under amide coupling conditions.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, indem die Verbindungen der Formel (VI) zunächst mit Thionylchlorid oder einem dem Fachmann bekannten äquivalenten Reagenz und in der zweiten Stufe mit Verbindungen der Formel (V) oder einem Salz der Verbindungen der Formel (V) in Gegenwart einer Base wie z. B. Triethylamin oder Kaliumcarbonat umgesetzt werden. The reaction is generally carried out in inert solvents by reacting the compounds of the formula (VI) first with thionyl chloride or an equivalent reagent known to the expert and in the second stage with compounds of the formula (V) or a salt of the compounds of the formula (V) in Presence of a base such. B. triethylamine or potassium carbonate are reacted.

In einem alternativen Verfahren kann die Umsetzung in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –30 °C bis 50 °C bei Normaldruck erfolgen. In an alternative method, the reaction in inert solvents, in the presence of a dehydrating reagent, optionally in the presence of a base, preferably in a temperature range of -30 ° C to 50 ° C at atmospheric pressure.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol oder Toluol, Nitromethan, Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt sind Acetonitril, Dichlormethan, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Toluol. Inert solvents are, for example, halogenated hydrocarbons such as dichloromethane or trichloromethane, hydrocarbons such as benzene or toluene, nitromethane, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide or acetonitrile. It is likewise possible to use mixtures of the solvents. Particularly preferred are acetonitrile, dichloromethane, dimethylformamide, tetrahydrofuran or toluene.

Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat oder -hydrogencarbonat oder organische Basen wie Trialkylamine, z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin. Bases are, for example, alkali carbonates, e.g. Sodium or potassium carbonate or bicarbonate or organic bases such as trialkylamines, e.g. Triethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpiperidine, 4-dimethylaminopyridine or diisopropylethylamine.

Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N,N'-Diethyl-, N,N,'-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminoisopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N‘-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid, oder O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-1-(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)-phosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen. Vorzugsweise wird die Kondensation mit PyBOP, TBTU oder mit EDC in Gegenwart von HOBt durchgeführt. Das zuvor beschriebene Verfahren wird durch das folgende Syntheseschema veranschaulicht:

Figure 00210001

  • a): 1. SOCl2, 80 °C, 2. Triethylamin, Dichlormethan, Raumtemperatur;
  • b): KOtBu, DMF, 80 °C;
  • c): cat. Dichlor[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium-Dichlormethan-Komplex, Cs2CO3, 1,2-Dimethoxyethan/Wasser, Rückfluss.
Examples of suitable dehydrating reagents include carbodiimides such as N, N'-diethyl, N, N, '- dipropyl, N, N'-diisopropyl, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, N- (3-dimethylaminoisopropyl) -N '-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), N-cyclohexylcarbodiimide-N'-propyloxymethyl-polystyrene (PS-carbodiimide) or carbonyl compounds such as carbonyldiimidazole, or 1,2-oxazolium compounds such as 2-ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium 3-sulfate or 2-tert-butyl-5-methyl-isoxazolium perchlorate, or acylamino compounds such as 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, or propanephosphonic anhydride, or isobutylchloroformate, or bis (2-oxo-3 -oxazolidinyl) -phosphoryl chloride, or O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2- (2-oxo-1- (2H) -pyridyl) -1, 1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TPTU) or O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HATU), or 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), or benzotriazole -1-yloxytris (dimethylamino) -p phosphonium hexafluorophosphate (BOP), or benzotriazol-1-yloxytris (pyrrolidino) phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), or N-hydroxysuccinimide, or mixtures thereof, with bases. Preferably, the condensation is carried out with PyBOP, TBTU or with EDC in the presence of HOBt. The method described above is illustrated by the following synthesis scheme:
Figure 00210001
  • a): 1. SOCl 2 , 80 ° C, 2. triethylamine, dichloromethane, room temperature;
  • b): KOtBu, DMF, 80 ° C;
  • c): cat. Dichloro [1,1'-bis (diphenylphosphino) ferrocene] palladium dichloromethane complex, Cs 2 CO 3 , 1,2-dimethoxyethane / water, reflux.

Syntheseroute B Synthesis route B

Alternativ können die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) hergestellt werden, indem man eine Verbindung der Formel (VII)

Figure 00220001
in welcher R1, R2, R3, R4 und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, unter den oben angegebenen Bedingungen in einer Dieckmann-Kondensation umsetzt. Alternatively, the compounds of the formula (I) according to the invention can be prepared by reacting a compound of the formula (VII)
Figure 00220001
in which R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and B have the meanings given above, under the above conditions in a Dieckmann condensation reaction.

Die Verbindungen der Formel (VII) können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (V) oder ein Salz von Verbindungen der Formel (V), in welcher B die oben angegebene Bedeutung hat, mit Verbindungen der Formel (VIII)

Figure 00220002
in welcher R1, R2, R3 und R4 die oben angegebenen Bedeutungen haben, unter den oben angegebenen Amid-Kupplungs-Bedingungen umsetzt. The compounds of the formula (VII) can be prepared by reacting compounds of the formula (V) or a salt of compounds of the formula (V) in which B has the abovementioned meaning, with compounds of the formula (VIII)
Figure 00220002
in which R 1 , R 2 , R 3 and R 4 have the meanings given above, under the abovementioned amide coupling conditions.

Die Verbindungen der Formel (VIII) können hergestellt werden, indem man die Verbindungen der Formel (VI), in welcher R1 und R2 die oben genannten Bedeutungen haben, in einer Suzuki-Reaktion unter den oben angegebenen Bedingungen mit Verbindungen der Formel (III), in welcher R3, R4 und A die oben angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt. The compounds of the formula (VIII) can be prepared by reacting the compounds of the formula (VI) in which R 1 and R 2 have the abovementioned meanings in a Suzuki reaction under the abovementioned conditions with compounds of the formula (III ), in which R 3 , R 4 and A have the meanings given above, is reacted.

Das zuvor beschriebene Verfahren wird durch das folgende Syntheseschema veranschaulicht:

Figure 00230001

  • a): cat. Palladium(II)acetylacetonat, cat. Tri-tert-butylphosphoniumtetrafluoroborat, NaOH, THF/Wasser;
  • b): 1. SOCl2, 80 °C, 2. K2CO3, Acetonitril, Raumtemperatur;
  • c): KOtBu, DMF, Raumtemperatur.
The method described above is illustrated by the following synthesis scheme:
Figure 00230001
  • a): cat. Palladium (II) acetylacetonate, cat. Tri-tert-butylphosphonium tetrafluoroborate, NaOH, THF / water;
  • b): 1. SOCl 2 , 80 ° C, 2. K 2 CO 3 , acetonitrile, room temperature;
  • c): KOtBu, DMF, room temperature.

Die für Syntheseroute A und B benötigten Verbindungen der Formel (V) oder Salze von Verbindungen der Formel (V), in welcher B die oben angegebene Bedeutung hat, können hergestellt werden, indem man die Verbindung der Formel (IX) oder ein Salz der Verbindung der Formel (IX)

Figure 00230002
nach bekannten Verfahren verestert, z.B. analog zu WO2002/02532 oder WO2010/063378 . The compounds of the formula (V) required for synthesis route A and B or salts of compounds of the formula (V) in which B has the abovementioned meaning can be prepared by reacting the compound of the formula (IX) or a salt of the compound of the formula (IX)
Figure 00230002
esterified by known methods, for example analogously to WO2002 / 02532 or WO2010 / 063378 ,

Die Verbindung der Formel (IX) oder Salze der Verbindung der Formel (IX) können hergestellt werden, indem man die Verbindung der Formel (X)

Figure 00240001
nach bekannten Verfahren spaltet, z.B. analog zu WO2002/02532 oder WO2010/063378 . The compound of the formula (IX) or salts of the compound of the formula (IX) can be prepared by reacting the compound of the formula (X)
Figure 00240001
cleaves according to known methods, for example analogously WO2002 / 02532 or WO2010 / 063378 ,

Die Verbindung der Formel (X) kann hergestellt werden, indem man die Verbindung der Formel (XI)

Figure 00240002
nach bekannten Verfahren in einer Bucherer-Bergs-Reaktion umsetzt, z.B. analog zu WO2002/02532 oder WO2010/063378 .The compound of the formula (X) can be prepared by reacting the compound of the formula (XI)
Figure 00240002
by known methods in a Bucherer-Bergs reaction, for example analogously to WO2002 / 02532 or WO2010 / 063378 ,

Alternativ lässt sich mit Hilfe der Strecker-Synthese nach bekannten Verfahren aus dem Keton der Formel (XI) ein Aminonitril herstellen, welches zu der Aminosäure der Formel (IX) nach bekannten Verfahren hydrolysiert werden kann. Alternatively, with the aid of the Strecker synthesis, it is possible by known processes to prepare from the ketone of the formula (XI) an aminonitrile which can be hydrolyzed to the amino acid of the formula (IX) by known processes.

Das zuvor beschriebene Verfahren wird durch das folgende Syntheseschema veranschaulicht:

Figure 00240003

  • a): NaCN, (NH4)2CO3, Wasser/Ethanol, 60 °C;
  • b): KOH oder NaOH, Wasser, Rückfluss;
  • c): SOCl2, z.B. Methanol, 40 °C bis Rückfluss.
The method described above is illustrated by the following synthesis scheme:
Figure 00240003
  • a): NaCN, (NH 4 ) 2 CO 3 , water / ethanol, 60 ° C;
  • b): KOH or NaOH, water, reflux;
  • c): SOCl 2 , eg methanol, 40 ° C to reflux.

Abkürzungen und Akronyme: Abbreviations and acronyms:

  • ca.approximately
    circacirca
    DMADMA
    Dimethylacetamiddimethylacetamide
    DMFDMF
    Dimethylformamiddimethylformamide
    DMSODMSO
    Dimethylsulfoxiddimethyl sulfoxide
    d.d.
    Th. der Theorie (bei Ausbeute)Th. Of theory (at yield)
    ELSDELSD
    LichtstreudetektorLight scattering detector
    ESIIT I
    Elektrospray-Ionisation (bei MS)Electrospray ionization (in MS)
    Fp.Mp.
    Festpunktbenchmark
    hH
    Stunde(n)Hour (s)
    HPLCHPLC
    Hochdruck-, HochleistungsflüssigchromatographieHigh pressure, high performance liquid chromatography
    LC-MSLC-MS
    Flüssigchromatographie-gekoppelte MassenspektrometrieLiquid chromatography-coupled mass spectrometry
    minmin
    Minute(n)Minute (s)
    MSMS
    MassenspektrometrieMass spectrometry
    negneg
    negativnegative
    NMRNMR
    Kernresonanzspektrometrienuclear magnetic resonance spectrometry
    pospos
    positivpositive
    RPRP
    Reversed-Phase (bei Chromatographie)Reversed phase (in chromatography)
    RTRT
    Raumtemperaturroom temperature
    Rt R t
    Retentionszeit (bei HPLC)Retention time (by HPLC)
    terttert
    tertiärtertiary
    THFTHF
    Tetrahydrofurantetrahydrofuran
    UPLCUPLC
    Ultra Performance Liquid ChromatographyUltra Performance Liquid Chromatography

LC-MS- und HPLC-Methoden: LC-MS and HPLC methods:

Methode 1 (UPLC-MS): Method 1 (UPLC-MS):

Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1mm; Eluent A: Wasser + 0.1% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0–1.6 min 1–99% B, 1.6–2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60 °C; Injektion: 2 µl; DAD scan: 210–400 nM; ELSD. Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001; Column: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1mm; Eluent A: water + 0.1% formic acid, eluent B: acetonitrile; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1.6-2.0 min 99% B; Flow 0.8 ml / min; Temperature: 60 ° C; Injection: 2 μl; DAD scan: 210-400 nM; ELSD.

Methode 2 (UPLC-MS): Method 2 (UPLC-MS):

Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1mm; Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril + 0.05% Ameisensäure; Gradient: 0–1.6 min 1–99% B, 1.6–2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60 °C; Injektion: 2 µl; DAD scan: 210–400 nm; ELSD. Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD; Column: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1mm; Eluent A: water + 0.05% formic acid, eluent B: acetonitrile + 0.05% formic acid; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1.6-2.0 min 99% B; Flow 0.8 ml / min; Temperature: 60 ° C; Injection: 2 μl; DAD scan: 210-400 nm; ELSD.

2. Herstellung der Vergleichs- und Ausführungsbeispiele 2. Preparation of the comparative and exemplary embodiments

Ausgangsverbindungen und Intermediate: Starting compounds and intermediates:

Beispiel 1A Example 1A

(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure

Figure 00260001
(4'-chloro-3'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetic acid
Figure 00260001

Zu einer Lösung von 40.0 g (175 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure ( EP 1791816 und WO 2006/29799 ) in einer Mischung aus 437 ml (437 mmol) entgaster 1N wässriger Natriumhydroxid-Lösung, 160 ml entgastem Wasser und 160 ml entgastem Tetrahydrofuran wurden unter Argon 33.5 g (192 mmol) (4-Chlor-3-fluorphenyl)boronsäure gegeben. Man rührte 10 Minuten, versetzte mit 507 mg (1.75 mmol) Tri-tert-butylphosphoniumtetrafluoroborat und 532 mg (1.75 mmol) Palladium(II)acetylacetonat und rührte 20 h bei Raumtemperatur. Anschließend gab man Toluol und Wasser hinzu, stellte mit konzentrierter, wässriger Hydrogenchlorid-Lösung einen pH-Wert von 1–2 ein, rührte 10 Minuten, trennte die Phasen, extrahierte zweimal mit Toluol, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Der Rückstand wurde in 300 ml einer 6/1-Mischung aus n-Hexan/tert-Butyl-methylether 30 Minuten gerührt, abgesaugt, mit n-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 38.0 g (78% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 2.27 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 7.27 (d, 1H), 7.49–7.59 (m, 3H), 7.61–7.75 (m, 2H), 12.4 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.31 min; MS (ESIneg): m/z = 277 [M – H]–. To a solution of 40.0 g (175 mmol) of (5-bromo-2-methylphenyl) acetic acid ( EP 1791816 and WO 2006/29799 ) in a mixture of 437 ml (437 mmol) of degassed 1N aqueous sodium hydroxide solution, 160 ml of degassed water and 160 ml of degassed tetrahydrofuran were added under argon 33.5 g (192 mmol) of (4-chloro-3-fluorophenyl) boronic acid. The mixture was stirred for 10 minutes, treated with 507 mg (1.75 mmol) of tri-tert-butylphosphonium tetrafluoroborate and 532 mg (1.75 mmol) of palladium (II) acetylacetonate and stirred for 20 h Room temperature. Then toluene and water were added, adjusted to pH 1-2 with concentrated aqueous hydrogen chloride solution, stirred for 10 minutes, the phases separated, extracted twice with toluene, the combined organic phases dried over sodium sulfate, filtered and concentrated one. The residue was stirred in 300 ml of a 6/1 mixture of n-hexane / tert-butyl methyl ether for 30 minutes, filtered off with suction, washed with n-hexane and dried in vacuo. 38.0 g (78% of theory) of the title compound were obtained.
1 H-NMR (300MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 2.27 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 7.27 (d, 1H), 7.49-7.59 (m, 3H), 7.61- 7.75 (m, 2H), 12.4 (s, 1H).
LC-MS (method 1): R t = 1.31 min; MS (ES Ineg): m / z = 277 [M - H] - .

Beispiel 2A Example 2A

8,8-Difluor-1,3-diazaspiro[4.5]decan-2,4-dion

Figure 00260002
8,8-difluoro-1,3-diazaspiro [4.5] decane-2,4-dione
Figure 00260002

In 100 ml Wasser wurden 33.0 g Ammoniumcarbonat und 3.50 g Natriumcyanid vorgelegt. Bei Raumtemperatur beginnend wurden 7.70 g 4,4´-Difluorcyclohexanon zugetropft und die Reaktionsmischung über 24 Stunden bei 55 °C bis 60 °C gerührt, dann bei 0 bis 5 °C zwei Stunden gerührt, der Niederschlag abgesaugt und mit wenig Eiswasser nachgewaschen und getrocknet. Man erhielt 10.1 g (88 % d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400MHz, CD3OD): δ [ppm] = 1.77–1.84 (m, 2H), 1.93–2.09 (m, 4H), 2.17–2.28 (m, 2H). In 100 ml of water were placed 33.0 g of ammonium carbonate and 3.50 g of sodium cyanide. Starting at room temperature, 7.70 g of 4,4'-difluorocyclohexanone were added dropwise and the reaction mixture stirred for 24 hours at 55 ° C to 60 ° C, then stirred at 0 to 5 ° C for two hours, the precipitate was filtered off with suction and washed with a little ice water and dried , 10.1 g (88% of theory) of the title compound were obtained.
1 H-NMR (400 MHz, CD 3 OD): δ [ppm] = 1.77-1.84 (m, 2H), 1.93-2.09 (m, 4H), 2.17-2.28 (m, 2H).

Beispiel 3A Example 3A

1-Amino-4,4-difluorcyclohexancarbonsäure

Figure 00270001
1-amino-4,4-Difluoro-cyclohexanecarboxylic acid
Figure 00270001

Es wurden 4.10 g der Verbindung aus Beispiel 2A in 100 ml 30%iger wässriger Kaliumhydroxid-Lösung unter Stickstoffgas suspendiert und am Rückfluss über Nacht gerührt. Es wurde auf ca. 25% des Volumens eingeengt und bei 0–10 °C mit konzentrierter wässriger Hydrogenchlorid-Lösung auf pH 5.5 gestellt. Die Lösung wurde eingeengt und getrocknet. Der Rückstand (4.30 g) wurde direkt in die Veresterung eingesetzt. 4.10 g of the compound from Example 2A were suspended in 100 ml of 30% aqueous potassium hydroxide solution under nitrogen gas and stirred at reflux overnight. It was concentrated to about 25% of the volume and at 0-10 ° C with concentrated aqueous hydrogen chloride solution to pH 5.5. The solution was concentrated and dried. The residue (4.30 g) was used directly in the esterification.

Beispiel 4A Example 4A

Methyl-1-amino-4,4-difluorcyclohexancarboxylathydrochlorid

Figure 00270002
Methyl-1-amino-4,4-difluorcyclohexancarboxylathydrochlorid
Figure 00270002

4.30 g der Verbindung aus Beispiel 3A wurden unter Argon in 100 ml Methanol bei 0 bis 5 °C vorgelegt. Es wurde 10 ml Thionylchlorid zugetropft und 30 Minuten bei 0 °C gerührt und 24 h bei 70 °C. Anschließend kühlte man auf 5 °C und saugte den Niederschlag ab. Die Lösung wurde einrotiert und der Rückstand mit Methyl-tert-butylether zur Kristallisation gebracht. Man erhielt 5.20 g (quantitativ, enthält noch Salze) der Titelverbindung.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.97–2.33 (m, 6H), 2.14–2.17 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 9.00 (s, 3H). 4.30 g of the compound from Example 3A were initially charged under argon in 100 ml of methanol at 0 to 5 ° C. 10 ml of thionyl chloride were added dropwise and the mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes and at 70 ° C. for 24 hours. It was then cooled to 5 ° C and sucked the precipitate. The solution was concentrated by rotary evaporation and the residue was crystallized with methyl tert-butyl ether. This gave 5.20 g (quantitative, still contains salts) of the title compound.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.97-2.33 (m, 6H), 2.14-2.17 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 9.00 (s, 3H).

Beispiel 5A Example 5A

Methyl-1-{[(4'-chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4,4-difluorcyclohexancarboxylat

Figure 00280001
Methyl 1 - {[(4'-chloro-3'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetyl] amino} -4,4-difluorcyclohexancarboxylat
Figure 00280001

6.06 g (21.7 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1A wurden in 7.5 ml (103 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 80 °C gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde in 30 ml Acetonitril gelöst. 5.00 g (21.8 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A wurden mit Essigsäureethylester und gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung versetzt. Man trennte die Phasen, extrahierte die wässrige Phase mehrfach mit Essigsäureethylester, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Der Rückstand wurde in 140 ml Acetonitril mit 8.76 g (63.4 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man die Lösung des Säurechlorids hinzu und rührte über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend gab man auf Eiswasser, extrahierte mehrfach mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mehrfach mit 1N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 8.22 g (83% d. Th.) der Titelverbindung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurden.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.85–2.06 (m, 6H), 2.08–2.18 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 3.55 (s, 3H), 3.60 (s, 2H), 7.25 (d, 1H), 7.48–7.54 (m, 2H), 7.58 (d, 1H), 7.62–7.73 (m, 2H), 8.50 (s, 1H).
LC-MS (Methode 2): Rt = 1.42 min; MS (ESIpos): m/z = 454 [M + H]+. 6.06 g (21.7 mmol) of the compound from Example 1A were dissolved in 7.5 ml (103 mmol) of thionyl chloride. The reaction mixture was stirred for 1 h at 80 ° C and then concentrated. The residue was dissolved in 30 ml of acetonitrile. 5.00 g (21.8 mmol) of the compound from Example 4A were admixed with ethyl acetate and saturated aqueous sodium bicarbonate solution. The phases were separated, the aqueous phase extracted several times with ethyl acetate, the combined organic phases were dried over sodium sulfate, filtered and concentrated. The residue was admixed in 140 ml of acetonitrile with 8.76 g (63.4 mmol) of potassium carbonate. Under ice-cooling, the solution of the acid chloride was added dropwise and stirred overnight at room temperature. It was then added to ice-water, extracted several times with dichloromethane, the combined organic phases were washed several times with 1N aqueous hydrogen chloride solution and saturated aqueous sodium bicarbonate solution, dried over sodium sulfate, filtered and concentrated. This gave 8.22 g (83% of theory) of the title compound, which were reacted without further purification.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.85-2.06 (m, 6H), 2.08-2.18 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 3.55 (s, 3H), 3.60 (s, 2H), 7.25 (d, 1H), 7.48-7.54 (m, 2H), 7.58 (d, 1H), 7.62-7.73 (m, 2H), 8.50 (s, 1H).
LC-MS (Method 2): R t = 1.42 min; MS (ESIpos): m / z = 454 [M + H] + .

Beispiel 6A Example 6A

Methyl-1-{[(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4,4-difluorcyclohexancarboxylat

Figure 00290001
Methyl 1 - {[(4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetyl] amino} -4,4-difluorcyclohexancarboxylat
Figure 00290001

2.53 g (11 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A wurden in 50 ml absolutem Tetrahydrofuran (THF) vorgelegt. Bei 20 °C wurden 3.07 ml Triethylamin zugetropft, 5 min nachgerührt, 2.61 g (10 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure ( EP 2029531 A1 und US 2009/298828 A1 ) zugegeben. Nach 15 min wurden weitere 2.3 ml Triethylamin zugegeben und sofort danach 0.58 ml (6.2 mmol) Phosphoroxychlorid zugetropft und 30 min unter Rückfluss nachgerührt. Der Ansatz wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand durch Flashchromatographie an Kieselgel mit n-Hexan/Essigester 1:1 als Laufmittel gereinigt. Man erhielt 3.6 g (73% d. Th.) der Titelverbindung vom Schmelzpunkt 186 °C.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.87–2.07 (m, 6H), 2.11–2.15 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 3.55 (s, 3H), 3.60 (s, 2H), 7.23–7.25 (d, 1H), 7.43–7.45 (dd, 1H), 7.49–7.52 (m, 3H), 7.63–7.66 (m, 2H), 8.49 (s, 1H). 2.53 g (11 mmol) of the compound from Example 4A were initially charged in 50 ml of absolute tetrahydrofuran (THF). 3.07 ml of triethylamine were added dropwise at 20 ° C., and stirring was continued for 5 minutes, 2.61 g (10 mmol) of (4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetic acid ( EP 2029531 A1 and US 2009/298828 A1 ) was added. After 15 minutes, a further 2.3 ml of triethylamine were added, followed immediately by the dropwise addition of 0.58 ml (6.2 mmol) of phosphorus oxychloride and stirring under reflux for 30 min. The batch was evaporated in vacuo and the residue was purified by flash chromatography on silica gel with n-hexane / ethyl acetate 1: 1 as eluent. This gave 3.6 g (73% of theory) of the title compound of melting point 186 ° C.
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.87-2.07 (m, 6H), 2.11-2.15 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 3.55 (s, 3H) , 3.60 (s, 2H), 7.23-7.25 (d, 1H), 7.43-7.45 (dd, 1H), 7.49-7.52 (m, 3H), 7.63-7.66 (m, 2H), 8.49 (s, 1H) ,

Beispiel 7A Example 7A

Methyl-4,4-difluor-1-{[(4'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}cyclohexancarboxylat

Figure 00290002
Methyl 4,4-difluoro-1 - {[(4'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetyl] amino} cyclohexanecarboxylate
Figure 00290002

2.53 g (11 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A wurden in 50 ml absolutem Tetrahydrofuran (THF) vorgelegt. Bei 20 °C wurden 3.07 ml Triethylamin zugetropft, 5 min nachgerührt, 2.44 g (10 mmol) (4'-Fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure zugegeben. Nach 15 min wurden weitere 2.3 ml Triethylamin zugegeben und sofort danach 0.58 ml (6.2 mmol) Phosphoroxychlorid zugetropft und 30 min unter Rückfluss nachgerührt. Der Ansatz wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand durch Flashchromatographie an Kieselgel mit n-Hexan/Essigester 1:1 als Laufmittel gereinigt. Man erhielt 2.84 g (60% d. Th.) der Titelverbindung vom Schmelzpunkt 187 °C.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.88–2.14 (m, 8H), 2.27 (s, 3H), 3.54 (s, 3H), 3.59 (s, 2H), 7.22–7.29 (m, 3H), 7.40–7.42 (m, 1H), 7.48–7.49 (m, 1H), 7.63–7.66 (m, 2H), 8.48 (s, 1H). 2.53 g (11 mmol) of the compound from Example 4A were initially charged in 50 ml of absolute tetrahydrofuran (THF). At 20 ° C 3.07 ml of triethylamine were added dropwise, stirred for 5 min, 2.44 g (10 mmol) of (4'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetic acid added. After 15 minutes, a further 2.3 ml of triethylamine were added, followed immediately by the dropwise addition of 0.58 ml (6.2 mmol) of phosphorus oxychloride and stirring under reflux for 30 min. The batch was evaporated in vacuo and the residue was purified by flash chromatography on silica gel with n-hexane / ethyl acetate 1: 1 as eluent. This gave 2.84 g (60% of theory) of the title compound of melting point 187 ° C.
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.88-2.14 (m, 8H), 2.27 (s, 3H), 3.54 (s, 3H), 3.59 (s, 2H), 7.22 -7.29 (m, 3H), 7.40-7.42 (m, 1H), 7.48-7.49 (m, 1H), 7.63-7.66 (m, 2H), 8.48 (s, 1H).

Beispiel 8A Example 8A

Methyl-1-{[(4,4'-dichlorbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4,4-difluorcyclohexancarboxylat

Figure 00300001
Methyl 1 - {[(4,4'-dichlorobiphenyl-3-yl) acetyl] amino} -4,4-difluorcyclohexancarboxylat
Figure 00300001

2.53 g (11 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A wurden in 50 ml absolutem Tetrahydrofuran (THF) vorgelegt. Bei 20 °C wurden 3.07 ml Triethylamin zugetropft, 5 min nachgerührt 2.81 g (10 mmol) (4,4'-Dichlorbiphenyl-3-yl)essigsäure ( EP 1943218 A2 und US 2009/215624 A1 ) zugegeben. Nach 15 min wurden weitere 2.3 ml Triethylamin zugegeben und sofort danach 0.58 ml (6.2 mmol) Phosphoroxychlorid zugetropft und 30 min unter Rückfluss nachgerührt. Der Ansatz wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand durch Flashchromatographie an Kieselgel mit n-Hexan/Essigester 1:1 als Laufmittel gereinigt. Man erhielt 3.3 g (59% d. Th.) der Titelverbindung vom Schmelzpunkt 146–147 °C.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.89–2.17 (m, 8H), 3.56 (s, 3H), 3.74 (s, 2H), 7.49–7.59 (m, 4H), 7.67–7.71 (m, 3H), 8.56 (s, 1H). 2.53 g (11 mmol) of the compound from Example 4A were initially charged in 50 ml of absolute tetrahydrofuran (THF). 3.07 ml of triethylamine were added dropwise at 20 ° C. and the mixture was stirred for another 5 minutes. 2.81 g (10 mmol) of (4,4'-dichlorobiphenyl-3-yl) acetic acid ( EP 1943218 A2 and US 2009/215624 A1 ) was added. After 15 minutes, a further 2.3 ml of triethylamine were added, followed immediately by the dropwise addition of 0.58 ml (6.2 mmol) of phosphorus oxychloride and stirring under reflux for 30 min. The batch was evaporated in vacuo and the residue was purified by flash chromatography on silica gel with n-hexane / ethyl acetate 1: 1 as eluent. This gave 3.3 g (59% of theory) of the title compound of melting point 146-147 ° C.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.89-2.17 (m, 8H), 3.56 (s, 3H), 3.74 (s, 2H), 7.49-7.59 (m, 4H), 7.67-7.71 (m, 3H), 8.56 (s, 1H).

Beispiel 9A Example 9A

Methyl-1-{[(4'-chlor-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4,4-difluorcyclohexancarboxylat

Figure 00310001
Methyl 1 - {[(4'-chloro-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl) acetyl] amino} -4,4-difluorcyclohexancarboxylat
Figure 00310001

2.53 g (11 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A wurden in 50 ml absolutem Tetrahydrofuran (THF) vorgelegt. Bei 20 °C wurden 3.07 ml Triethylamin zugetropft, 5 min nachgerührt, 2.75 g (10 mmol) (4'-Chlor-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl)essigsäure zugegeben. Nach 15 min wurden weitere 2.3 ml Triethylamin zugegeben und sofort danach 0.58 ml (6.2 mmol) Phosphoroxychlorid zugetropft und 30 min unter Rückfluss nachgerührt. Der Ansatz wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand durch Flashchromatographie an Kieselgel mit n-Hexan/Essigester 1:1 als Laufmittel gereinigt. Man erhielt 2.59 g (53% d. Th.) der Titelverbindung vom Schmelzpunkt 179–183 °C.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.89–2.15 (m, 8H), 2.11 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 3.55 (s, 3H), 3.68 (s, 2H), 6.94–6.96 (d, 1H), 7.05–7.07 (d, 1H), 7.26–7.28 (m, 2H), 7.46–7.48 (m, 2H), 8.46 (s, 1H). 2.53 g (11 mmol) of the compound from Example 4A were initially charged in 50 ml of absolute tetrahydrofuran (THF). At 20 ° C 3.07 ml of triethylamine were added dropwise, stirred for 5 min, 2.75 g (10 mmol) of (4'-chloro-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl) acetic acid added. After 15 minutes, a further 2.3 ml of triethylamine were added, followed immediately by the dropwise addition of 0.58 ml (6.2 mmol) of phosphorus oxychloride and stirring under reflux for 30 min. The batch was evaporated in vacuo and the residue was purified by flash chromatography on silica gel with n-hexane / ethyl acetate 1: 1 as eluent. This gave 2.59 g (53% of theory) of the title compound of melting point 179-183 ° C.
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.89-2.15 (m, 8H), 2.11 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 3.55 (s, 3H), 3.68 (s, 2H), 6.94-6.96 (d, 1H), 7.05-7.07 (d, 1H), 7.26-7.28 (m, 2H), 7.46-7.48 (m, 2H), 8.46 (s, 1H).

Beispiel 10A Example 10A

Methyl-1-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-4,4-difluorcyclohexancarboxylat

Figure 00310002
Methyl 1 - {[(5-bromo-2-methylphenyl) acetyl] amino} -4,4-difluorcyclohexancarboxylat
Figure 00310002

22.91 g (100 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure ( EP 1791816 A1 und WO 2006/29799 A1 ) wurden mit 36.5 ml (500 mmol) Thionylchlorid versetzt und bei 80 °C gerührt bis die Gasentwicklung beendet war und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst (Lösung A). 25.3 g (110 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A wurden in 308 ml THF vorgelegt, bei 20 °C 21.3 ml Triethylamin zugetropft, danach Lösung A unter Kühlung zugetropft und bei Raumtemperatur bis zum vollständigem Umsatz weitergerührt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit THF nachgewaschen, das Filtrat im Vakuum eingedampft und der Rückstand aus Methyl-tert-butylether umkristallisiert. Man erhielt 33.6 g (83% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.91–2.02 (m, 6H), 2.09–2.13 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 3.54 (s, 2H), 3.58 (s, 3H), 7.11–7.13 (d, 1H), 7.31–7.33 (dd, 1H), 7.39–7.40 (d, 1H), 8.54 (s, 1H). 22.91 g (100 mmol) of (5-bromo-2-methylphenyl) acetic acid ( EP 1791816 A1 and WO 2006/29799 A1 ) were mixed with 36.5 ml (500 mmol) of thionyl chloride and stirred at 80 ° C until the evolution of gas was complete and then concentrated. The residue was dissolved in 100 ml of tetrahydrofuran (THF) (solution A). 25.3 g (110 mmol) of the compound from Example 4A were initially charged in 308 ml of THF, added dropwise at 20 ° C 21.3 ml of triethylamine, then solution A was added dropwise with cooling and stirring at room temperature until complete conversion. The precipitate is filtered off, washed with THF, the filtrate evaporated in vacuo and the residue recrystallized from methyl tert-butyl ether. 33.6 g (83% of theory) of the title compound were obtained.
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.91-2.02 (m, 6H), 2.09-2.13 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 3.54 (s, 2H) , 3.58 (s, 3H), 7.11-7.13 (d, 1H), 7.31-7.33 (dd, 1H), 7.39-7.40 (d, 1H), 8.54 (s, 1H).

Beispiel 11A Example 11A

3-(5-Brom-2-methylphenyl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00320001
3- (5-bromo-2-methylphenyl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00320001

11.0 g (27.2 mmol) der Verbindung aus Beispiel 10A wurden in einer Lösung von 22 ml DMA (N,N-Dimethylacetamid) vorgelegt und eine Lösung von 10 ml DMA und 3.54 g (1.1 eq.) Kalium-tert-butylat bei 20–30 ° C zugetropft und für 1 h bei 30 °C weiter gerührt. Man goss auf 200 ml Wasser und stellte den Ansatz mit wässriger 1N Salzsäure auf pH 2 ein, saugte den erhaltenen Rückstand ab, wusch mit Wasser nach und trocknete im Vakuumtrockenschrank bei 50 °C. Das Produkt wurde mit heißem Methyl-tert-butylether aufgeschlämmt, mit n-Hexan versetzt, abgesaugt und getrocknet. Man erhielt 11.0 g (97% d. Th.) der Titelverbindung in einer Reinheit von 89%.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.53–1.56 (m, 2H), 1.92–2.23 (m, 6H), 2.11 (s, 3H), 7.17–7.19 (d, 1H), 7.24 (d, 1H), 7.36–7.40 (dd, 1H), 8.80 (s, 1H), 11.2 (s, 1H). 11.0 g (27.2 mmol) of the compound from Example 10A were initially charged in a solution of 22 ml of DMA (N, N-dimethylacetamide) and a solution of 10 ml of DMA and 3.54 g (1.1 eq.) Of potassium tert-butoxide at 20 ° C. Added dropwise 30 ° C and stirred for 1 h at 30 ° C on. It was poured onto 200 ml of water and the batch was adjusted to pH 2 with aqueous 1N hydrochloric acid, the residue obtained was filtered off with suction, washed with water and dried in a vacuum oven at 50 ° C. The product was slurried with hot methyl tert-butyl ether, mixed with n-hexane, filtered off with suction and dried. This gave 11.0 g (97% of theory) of the title compound in a purity of 89%.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.53-1.56 (m, 2H), 1.92-2.23 (m, 6H), 2.11 (s, 3H), 7.17-7.19 (d, 1H ), 7.24 (d, 1H), 7.36-7.40 (dd, 1H), 8.80 (s, 1H), 11.2 (s, 1H).

Ausgangsverbindungen und Intermediate für Vergleichsbeispiele: Starting compounds and intermediates for comparative examples:

Beispiel 12A Example 12A

Methyl-1-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}cyclohexancarboxylat

Figure 00330001
Methyl 1 - {[(5-bromo-2-methylphenyl) acetyl] amino} cyclohexanecarboxylate
Figure 00330001

2.06 g (9.00 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure (beschrieben in EP 1791816 und WO 2006/29799 ) wurden in 3.7 ml (51.3 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei 80 °C gerührt und anschließend eingeengt. Man löste den Rückstand in 20 ml Dichlormethan. 2.09 g (10.8 mmol) Methyl-1-amino-cyclohexancarboxylathydrochlorid wurden in 25 ml Dichlormethan gelöst, mit 55 mg (0.45 mmol) 4-Dimethylaminopyridin und 3.1 ml (22.5 mmol) Triethylamin versetzt und 0.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Man tropfte die Lösung des Säurechlorids hinzu und rührte 36 h bei Raumtemperatur. Anschließend verdünnte man mit Dichlormethan, wusch mit Wasser, 1N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete, filtrierte und engte ein. Man erhielt 2.80 g (84% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.15–1.31 (m, 1H), 1.37–1.58 (m, 5H), 1.59–1.73 (m, 2H), 1.86–1.99 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 3.51 (s, 2H), 3.54 (s, 3H), 7.10 (d, 1H), 7.30 (dd, 1H), 7.39 (d, 1H), 8.26 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.30 min; MS (ESIpos): m/z = 368 [M + H]+. 2.06 g (9.00 mmol) of (5-bromo-2-methylphenyl) acetic acid (described in EP 1791816 and WO 2006/29799 ) were dissolved in 3.7 ml (51.3 mmol) of thionyl chloride. The reaction mixture was stirred for 2 h at 80 ° C and then concentrated. The residue was dissolved in 20 ml of dichloromethane. 2.09 g (10.8 mmol) of methyl 1-amino-cyclohexanecarboxylate hydrochloride were dissolved in 25 ml of dichloromethane, admixed with 55 mg (0.45 mmol) of 4-dimethylaminopyridine and 3.1 ml (22.5 mmol) of triethylamine and stirred at room temperature for 0.5 h. The solution of the acid chloride was added dropwise and the mixture was stirred at room temperature for 36 h. It was then diluted with dichloromethane, washed with water, 1N aqueous hydrogen chloride solution and saturated aqueous sodium bicarbonate solution, dried, filtered and concentrated. This gave 2.80 g (84% of theory) of the title compound.
1 H-NMR (300MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.15-1.31 (m, 1H), 1.37-1.58 (m, 5H), 1.59-1.73 (m, 2H), 1.86-1.99 (m , 2H), 2.19 (s, 3H), 3.51 (s, 2H), 3.54 (s, 3H), 7.10 (d, 1H), 7.30 (dd, 1H), 7.39 (d, 1H), 8.26 (s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.30 min; MS (ESIpos): m / z = 368 [M + H] + .

Beispiel 13A Example 13A

3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00330002
3- (5-bromo-2-methylphenyl) -4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00330002

Zu 2.80 g (7.60 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A in 15 ml N,N-Dimethylformamid wurden 1.71 g (15.2 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten bei 80 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen versetzte man mit Wasser und tropfte wässrige Hydrogenchlorid-Lösung hinzu. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 2.33 g (90% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.09–1.27 (m, 1H), 1.30–1.41 (m, 2H), 1.51–1.72 (m, 5H), 1.76–1.90 (m, 2H), 2.11 (s, 3H), 7.17 (d, 1H), 7.22 (d, 1H), 7.36 (dd, 1H), 8.19 (s, 1H), 10.87 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 336 [M + H]+. To 2.80 g (7.60 mmol) of the compound from Example 12A in 15 ml of N, N-dimethylformamide were added 1.71 g (15.2 mmol) of potassium tert-butoxide. The reaction mixture was heated at 80 ° C for 15 minutes. After cooling, it was mixed with water and added dropwise aqueous hydrogen chloride solution. The precipitate was filtered off with suction, washed with water and dried. This gave 2.33 g (90% of theory) of the title compound.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.09-1.27 (m, 1H), 1.30-1.41 (m, 2H), 1.51-1.72 (m, 5H), 1.76-1.90 (m , 2H), 2.11 (s, 3H), 7.17 (d, 1H), 7.22 (d, 1H), 7.36 (dd, 1H), 8.19 (s, 1H), 10.87 (s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.09 min; MS (ESIpos): m / z = 336 [M + H] + .

Beispiel 14A Example 14A

Methyl-cis-1-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylat

Figure 00340001
Methyl-cis-1 - {[(5-bromo-2-methylphenyl) acetyl] amino} -4- (trifluoromethyl) cyclohexanecarboxylate
Figure 00340001

19.0 g (82.9 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure ( EP 1791816 A1 und WO 2006/29799 A1 ) wurden unter Stickstoff in 97 ml (1327 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde vier Stunden bei 80 °C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung im Feinvakuum erhielt man 20.5 g (100% d. Th.) der Titelverbindung als bräunliches Öl. 10.00 g (38.22 mmol) Methyl-cis-1-amino-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylathydrochlorid ( EP 1220841 A2 und WO 2001/23354 A3 ), 9.67 g (95.54 mmol) Triethylamin und 233 mg (1.91 mmol) N,N-Dimethylaminopyridin wurden bei Raumtemperatur in 95 ml Dichlormethan gelöst. Anschließend tropfte man eine Lösung von 9.46 g (38.22 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)acetylchlorid in 95 ml Dichlormethan zum Ansatz. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit wässriger, 5%-iger Citronensäure gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Eluent: Dichlormethan/Methanolgradient). Nach Eindampfen und Trocknen wurden 8.84 g (53% d. Th.) der Titelverbindung erhalten, die ohne weitere Charakterisierung in die Folgestufe eingesetzt wurde. 19.0 g (82.9 mmol) of (5-bromo-2-methylphenyl) acetic acid ( EP 1791816 A1 and WO 2006/29799 A1 ) were dissolved under nitrogen in 97 ml (1327 mmol) of thionyl chloride. The reaction mixture was stirred for four hours at 80 ° C and overnight at room temperature and then evaporated in vacuo. After drying in a fine vacuum, 20.5 g (100% of theory) of the title compound were obtained as a brownish oil. 10.00 g (38.22 mmol) of methyl cis-1-amino-4- (trifluoromethyl) cyclohexanecarboxylate hydrochloride ( EP 1220841 A2 and WO 2001/23354 A3 ), 9.67 g (95.54 mmol) of triethylamine and 233 mg (1.91 mmol) of N, N-dimethylaminopyridine were dissolved in 95 ml of dichloromethane at room temperature. Subsequently, a solution of 9.46 g (38.22 mmol) of (5-bromo-2-methylphenyl) acetyl chloride in 95 ml of dichloromethane was added dropwise to the batch. The resulting reaction mixture was stirred at room temperature overnight. For work-up, the mixture was diluted with dichloromethane and the organic phase was washed with aqueous, saturated sodium bicarbonate solution and with aqueous 5% citric acid. After drying over sodium sulfate, the mixture was evaporated and the residue was purified by chromatography on silica gel (eluent: dichloromethane / methanol gradient). Evaporation and drying gave 8.84 g (53% of theory) of the title compound, which was used without further characterization in the subsequent stage.

Beispiel 15A Example 15A

(5s,8s)-3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4-hydroxy-8-(trifluormethyl)-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00350001
(5s, 8s) -3- (5-bromo-2-methylphenyl) -4-hydroxy-8- (trifluoromethyl) -1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00350001

Zu 8.80 g (20.17 mmol) Methyl-cis-1-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 14A) in 100 ml N,N-Dimethylformamid wurden 4.53 g (40.34 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 60 Minuten bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf 800 ml Eiswasser gegossen und mit wässriger Salzsäure angesäuert. Das Rohprodukt wurde abfiltriert und durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Eluent: Hexan/Ethylacetatgradient). Nach Trocknen erhielt man 5.23 g (64% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.40–1.50 (m, 2H), 1.58–1.72 (m, 2H), 1.77–1.86 (m, 2H), 1.86–1.96 (m, 2H), 2.07 (s, 3H), 2.12–2.28 (m, 1H), 7.14 (d, 1H), 7.19 (d, 1H), 7.33 (dd, 1H), 8.33 (s, 1H), 11.01 (s, 1H).
LC-MS (Methode 3): Rt = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z = 406 [M + H]+. To 8.80 g (20.17 mmol) of methyl cis -1 - {[(5-bromo-2-methylphenyl) acetyl] amino} -4- (trifluoromethyl) cyclohexanecarboxylate (Example 14A) in 100 ml of N, N-dimethylformamide was added 4.53 g (40.34 mmol) of potassium tert-butoxide was added. The reaction mixture was stirred at 80 ° C for 60 minutes. For workup, the cooled reaction mixture was poured onto 800 ml of ice water and acidified with aqueous hydrochloric acid. The crude product was filtered off and purified by chromatography on silica gel (eluent: hexane / ethyl acetate gradient). Drying gave 5.23 g (64% of theory) of the title compound.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.40-1.50 (m, 2H), 1.58-1.72 (m, 2H), 1.77-1.86 (m, 2H), 1.86-1.96 (m , 2H), 2.07 (s, 3H), 2.12-2.28 (m, 1H), 7.14 (d, 1H), 7.19 (d, 1H), 7.33 (dd, 1H), 8.33 (s, 1H), 11.01 ( s, 1H).
LC-MS (Method 3): R t = 1.18 min; MS (ESIpos): m / z = 406 [M + H] + .

Beispiel 16A Example 16A

Methyl-cis-1-{[(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4- (trifluormethyl)cyclohexancarboxylat

Figure 00350002
Methyl cis -1 - {[(4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetyl] amino} -4- (trifluoromethyl) cyclohexanecarboxylate
Figure 00350002

5.00 g (19.18 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure ( EP 2029531 A1 und US 2009/298828 A1 ) wurden in 36.51 g (306.84 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde vier Stunden bei 80 °C gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung im Feinvakuum erhielt man 5.4 g (100% d. Th.) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetylchlorid als bräunliches Öl. 5.00 g (19.09 mmol) Methyl-cis-1-amino-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylathydrochlorid ( EP 1220841 A2 und WO 2001/23354 A3 ), 4.83 g (47.73 mmol) Triethylamin und 117 mg (0.955 mmol) N,N-Dimethylaminopyridin wurden bei Raumtemperatur in 40 ml Dichlormethan gelöst. Anschließend tropfte man eine Lösung von 5.33 g (19.09 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetylchlorid in 40 ml Dichlormethan zum Ansatz. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, 5%-iger Citronensäure gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Eluent: Hexan/Ethylacetatgradient). Nach Eindampfen und Trocknen wurden 6.36 g (71% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.35–1.80 (m, 6H), 2.05–2.18 (m, 2H), 2.24 (s, 3H), 2.25–2.40 (m, 1H), 3.49 (s, 3H), 3.56 (s, 2H), 7.19 (d, 1H), 7.40 (dd, 1H), 7.42–7.52 (m, 3H), 7.56–7.65 (m, 2H), 8.34 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.50 min; MS (ESIpos): m/z = 468 [M + H]+. 5.00 g (19.18 mmol) of (4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetic acid ( EP 2029531 A1 and US 2009/298828 A1 ) were dissolved in 36.51 g (306.84 mmol) of thionyl chloride. The reaction mixture was stirred for four hours at 80 ° C and then evaporated in vacuo. Drying in a fine vacuum gave 5.4 g (100% of theory) of (4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) -acetyl chloride as a brownish oil. 5.00 g (19.09 mmol) of methyl cis-1-amino-4- (trifluoromethyl) cyclohexanecarboxylate hydrochloride ( EP 1220841 A2 and WO 2001/23354 A3 ), 4.83 g (47.73 mmol) of triethylamine and 117 mg (0.955 mmol) of N, N-dimethylaminopyridine were dissolved at room temperature in 40 ml of dichloromethane. Subsequently, a solution of 5.33 g (19.09 mmol) of (4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) acetyl chloride in 40 ml of dichloromethane was added dropwise to the batch. The resulting reaction mixture was stirred at room temperature overnight. For workup, the mixture was diluted with dichloromethane and the organic phase was washed with aqueous, 5% citric acid. After drying over sodium sulfate, the mixture was evaporated and the residue was purified by chromatography on silica gel (eluent: hexane / ethyl acetate gradient). Evaporation and drying gave 6.36 g (71% of theory) of the title compound.
1 H-NMR (300MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.35-1.80 (m, 6H), 2.05-2.18 (m, 2H), 2.24 (s, 3H), 2.25-2.40 (m, 1H ), 3.49 (s, 3H), 3.56 (s, 2H), 7.19 (d, 1H), 7.40 (dd, 1H), 7.42-7.52 (m, 3H), 7.56-7.65 (m, 2H), 8.34 ( s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.50 min; MS (ESIpos): m / z = 468 [M + H] + .

Vergleichsbeispiele: Comparative Examples:

für Ausführungsbeispiel 1-1 for embodiment 1-1

V.1-a V.1-a

(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-(trifluormethyl)-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00360001
(5s, 8s) -3- (4'-chloro-3'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -4-hydroxy-8- (trifluoromethyl) -1-azaspiro [4.5] dec-3-ene 2-one
Figure 00360001

Zu 5.00 g (12.4 mmol) der Verbindung aus Beispiel 15A in 500 ml entgastem 1,2-Dimethoxyethan wurden unter Argon 1.01 g (1.24 mmol) Dichlor[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium-Dichlormethan-Komplex gegeben. Man rührte 5 Minuten bei Raumtemperatur und setzte anschließend 3.24 g (18.5 mmol) (4-Chlor-3-fluorphenyl)boronsäure und eine Lösung von 14.1 g (43.3 mmol) Cäsiumcarbonat in 30 ml entgastem Wasser hinzu. Die Reaktionsmischung wurde 2 h unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen gab man 10 ml konzentrierte, wässrige Hydrogenchlorid-Lösung hinzu, trennte die wässrige Phase ab, versetzte mit Magnesiumsulfat, filtrierte über Kieselgel ab, wusch mit Essigsäureethylester nach und engte ein. Nach der Reinigung des Rohproduktes durch Chromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Hexan/Essigsäureethylester-Gradient) und durch Kristallisation aus Essigsäureethylester erhielt man 2.48 g (44% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.45–1.57 (m, 2H), 1.62–1.79 (m, 2H), 1.81–2.05 (m, 4H), 2.19 (s, 3H), 2.20–2.33 (m, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.49–7.58 (m, 2H), 7.64 (t, 1H), 7.70 (dd, 1H), 8.33 (s, 1H), 10.95 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 454 [M + H]+. To 5.00 g (12.4 mmol) of the compound of Example 15A in 500 ml of degassed 1,2-dimethoxyethane was added under argon 1.01 g (1.24 mmol) of dichloro [1,1'-bis (diphenylphosphino) ferrocene] palladium dichloromethane complex. The mixture was stirred at room temperature for 5 minutes and then 3.24 g (18.5 mmol) of (4-chloro-3-fluorophenyl) boronic acid and a solution of 14.1 g (43.3 mmol) of cesium carbonate in 30 ml of degassed water were added. The reaction mixture was refluxed for 2 hours. After cooling, 10 ml of concentrated, aqueous hydrogen chloride solution were added, the aqueous phase was separated off, treated with magnesium sulfate, filtered through silica gel, washed with ethyl acetate and concentrated. Purification of the crude product by chromatography on silica gel (eluent: hexane / ethyl acetate gradient) and crystallization from ethyl acetate gave 2.48 g (44% of theory) of the title compound.
1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.45-1.57 (m, 2H), 1.62-1.79 (m, 2H), 1.81-2.05 (m, 4H), 2.19 (s, 3H ), 2.20-2.33 (m, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.49-7.58 (m, 2H), 7.64 (t, 1H), 7.70 (dd, 1H), 8.33 ( s, 1H), 10.95 (s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.34 min; MS (ESIpos): m / z = 454 [M + H] + .

V.1-b = Tabelle 1, Zeile 3, S. 41 und Tabelle 2, Zeile 3, S.44 der WO08/067911V.1-b = Table 1, line 3, p. 41 and Table 2, line 3, p.44 of WO08 / 067911

3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00370001
3- (4'-chloro-3'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00370001

Zu 150 mg (0.45 mmol) der Verbindung aus Beispiel 13A in 15 ml entgastem 1,2-Dimethoxyethan wurden unter Argon 36.4 mg (0.05 mmol) Dichlor[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium-Komplex gegeben. Man rührte 5 Minuten bei Raumtemperatur und setzte anschließend 117 mg (0.67 mmol) (4-Chlor-3-fluorphenyl)boronsäure und eine Lösung von 509 mg (1.56 mmol) Cäsiumcarbonat in 0.9 ml entgastem Wasser hinzu. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten unter Mikrowellenbestrahlung auf 150 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen gab man 0.3 ml konzentrierte, wässrige Hydrogenchlorid-Lösung hinzu, versetzte mit Magnesiumsulfat, filtrierte über Kieselgel ab, wusch mit Essigsäureethylester nach und engte ein. Nach der Reinigung des Rohproduktes durch HPLC-Chromatographie (C18-Phase, Eluent: Wasser/Acetonitrilgradient/0.1% Ameisensäure) erhielt man 43.7 mg (25% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): 1.11–1.28 (m, 1H), 1.33–1.44 (m, 2H), 1.52–1.73 (m, 5H), 1.78–1.92 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 7.31 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.49–7.57 (m, 2H), 7.64 (t, 1H), 7.70 (dd, 1H), 8.14 (s, 1H), 10.77 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.30 min; MS (ESIpos): m/z = 386 [M + H]+. To 150 mg (0.45 mmol) of the compound from Example 13A in 15 ml of degassed 1,2-dimethoxyethane were added under argon 36.4 mg (0.05 mmol) of dichloro [1,1'-bis (diphenylphosphino) ferrocene] palladium complex. The mixture was stirred for 5 minutes at room temperature and then added 117 mg (0.67 mmol) (4-chloro-3-fluorophenyl) boronic acid and a solution of 509 mg (1.56 mmol) cesium in 0.9 ml degassed water. The reaction mixture was heated at 150 ° C for 10 minutes under microwave irradiation. After cooling, 0.3 ml of concentrated, aqueous hydrogen chloride solution was added, mixed with magnesium sulfate, filtered through silica gel, washed with ethyl acetate and concentrated. After purification of the crude product by HPLC chromatography (C18 phase, eluent: water / acetonitrile gradient / 0.1% formic acid), 43.7 mg (25% of theory) of the title compound were obtained.
1 H-NMR (300MHz, DMSO-d 6 ): 1.11-1.28 (m, 1H), 1.33-1.44 (m, 2H), 1.52-1.73 (m, 5H), 1.78-1.92 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 7.31 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.49-7.57 (m, 2H), 7.64 (t, 1H), 7.70 (dd, 1H), 8.14 (s, 1H), 10.77 (s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.30 min; MS (ESIpos): m / z = 386 [M + H] + .

für Ausführungsbeispiel 1-2 for embodiment 1-2

V.2-a V.2-a

(5s,8s)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-(trifluormethyl)-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00380001
(5s, 8s) -3- (4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) -4-hydroxy-8- (trifluoromethyl) -1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00380001

Zu 6.36 g (13.59 mmol) Methyl-cis-1-{[(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 16A) in 68 ml N,N-Dimethylformamid wurden 3.05 g (27.18 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 60 Minuten bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf 800 ml Eiswasser gegossen und mit wässriger Salzsäure angesäuert. Das Rohprodukt wurde abfiltriert, getrocknet und durch Chromatographie an Kieselgel (Hexan/Ethylacetatgradient) gereinigt. Nach Eindampfen erhielt man 4.1 g (69% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.40–1.55 (m, 2H), 1.58–1.77 (m, 2H), 1.78–2.02 (m, 4H), 2.15 (s, 3H), 2.17–2.30 (m, 1H), 7.27 (d, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.42–7.51 (m, 3H), 7.58–7.66 (m, 2H), 8.29 (s, 1H), 10.90 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 436 [M + H]+. To 6.36 g (13.59 mmol) of methyl cis-1 - {[(4'-chloro-4-methyl-biphenyl-3-yl) -acetyl] -amino} -4- (trifluoromethyl) -cyclohexanecarboxylate (Example 16A) in 68 ml of N, N -Dimethylformamide was added 3.05 g (27.18 mmol) of potassium tert-butoxide. The reaction mixture was stirred at 80 ° C for 60 minutes. For workup, the cooled reaction mixture was poured onto 800 ml of ice water and acidified with aqueous hydrochloric acid. The crude product was filtered off, dried and purified by chromatography on silica gel (hexane / ethyl acetate gradient). Evaporation gave 4.1 g (69% of theory) of the title compound.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.40-1.55 (m, 2H), 1.58-1.77 (m, 2H), 1.78-2.02 (m, 4H), 2.15 (s, 3H ), 2.17-2.30 (m, 1H), 7.27 (d, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.42-7.51 (m, 3H), 7.58-7.66 (m, 2H), 8.29 (s, 1H), 10.90 (s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.32 min; MS (ESIpos): m / z = 436 [M + H] + .

V.2-b = Beispiel I-1-a18 der WO03/059065V.2-b = Example I-1-a18 of WO03 / 059065

3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00380002
3- (4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) -4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00380002

  • 1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): 1.10–1.29 (m, 1H), 1.33–1.43 (m, 2H), 1.52–1.73 (m, 5H), 1.78–1.92 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 7.29 (d, 1H), 7.35 (d, 1H), 7.45–7.52 (m, 3H), 7.62–7.68 (m, 2H), 8.10 (br. s., 1H), 10.82 (br. s, 1H). 1 H-NMR (300MHz, DMSO-d 6 ): 1.10-1.29 (m, 1H), 1.33-1.43 (m, 2H), 1.52-1.73 (m, 5H), 1.78-1.92 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 7.29 (d, 1H), 7.35 (d, 1H), 7.45-7.52 (m, 3H), 7.62-7.68 (m, 2H), 8.10 (br, s, 1H), 10.82 ( br. s, 1H).

Tabelle V zeigt die Vergleichsbeispiele, welche die Anmelderin als den nächstliegenden Stand der Technik ansieht in der Übersicht. Tab. V

Figure 00390001
Table V shows the comparative examples, which Applicant regards as the closest prior art in the overview. Tab. V
Figure 00390001

Ausführungsbeispiele: EXAMPLES

Beispiel 1-1 Example 1-1

3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00400001
3- (4'-chloro-3'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00400001

Zu 8.19 g (18.0 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A in 80 ml N,N-Dimethylformamid wurden unter Stickstoff 2.23 g (19.9 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend gab man das Reaktionsgemisch auf Eiswasser, tropfte 1N wässrige Hydrogenchlorid-Lösung bis zu einem pH-Wert von 1–2 hinzu, rührte 30 Minuten, saugte ab, wusch mit Wasser und trocknete den Niederschlag. Zur weiteren Reinigung wurde das Produkt in 1N wässriger Natriumhydroxidlösung gelöst, durch Ansäuern mit wässriger 1 N Salzsäure ausgefällt, 30 Minuten gerührt, mit Wasser gewaschen, abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 7.50 g (97% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.50–1.62 (m, 2H), 2.05–2.31 (m, 6H), 2.20 (s, 3H), 7.32 (d, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.49–7.57 (m, 2H), 7.64 (t, 1H), 7.69 (dd, 1H), 8.32 (s, 1H), 11.08 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.26 min; MS (ESIpos): m/z = 422 [M + H]+. To 8.19 g (18.0 mmol) of the compound from Example 5A in 80 ml of N, N-dimethylformamide were added under nitrogen 2.23 g (19.9 mmol) of potassium tert-butoxide. The reaction mixture was stirred for 15 minutes at room temperature. Then the reaction mixture was added to ice-water, 1N aqueous hydrogen chloride solution was added dropwise to a pH of 1-2, stirred for 30 minutes, filtered off with suction, washed with water and dried the precipitate. For further purification, the product was dissolved in 1 N aqueous sodium hydroxide solution, precipitated by acidification with aqueous 1 N hydrochloric acid, stirred for 30 minutes, washed with water, filtered off and dried. 7.50 g (97% of theory) of the title compound were obtained.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.50-1.62 (m, 2H), 2.05-2.31 (m, 6H), 2.20 (s, 3H), 7.32 (d, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.49-7.57 (m, 2H), 7.64 (t, 1H), 7.69 (dd, 1H), 8.32 (s, 1H), 11.08 (s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.26 min; MS (ESIpos): m / z = 422 [M + H] + .

Beispiel 1-2 Example 1-2

3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00400002
3- (4'-chloro-4-methylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00400002

Zu 11.1 g (25.5 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A in 22 ml N,N-Dimethylacetamid wurden unter Argon bei 20 bis 30 °C 3.31 g (28.0 mmol) Kalium-tert-butylat in 10 ml N,N-Dimethylacetamid gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 3 h bei 30 °C. Anschließend gab man das Reaktionsgemisch auf 250 ml Eiswasser, tropfte 1N wässrige Hydrogenchlorid-Lösung bis zu einem pH-Wert von 2 hinzu, saugte den Niederschlag ab und wusch mit Wasser nach. Zur weiteren Reinigung wurde das Produkt in Methylenchlorid aufgenommen, mit 50 ml 1N wässriger Natriumhydroxid-Lösung extrahiert, die wässrige Phase mit wässriger 1 N Salzsäure angesäuert, abgesaugt, mit Wasser gewaschen, zur Reinigung mit 25 ml heißem Acetonitril auf dem Ultraschallbad aufgeschlämmt, abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhielt 5.70 g (55% d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 1.54–1.56 (d, 2H), 2.07–2.33 (m, 6H), 2.19 (s, 3H), 7.29–7.31 (d, 1H), 7.36 (d, 1H), 7.48–7.53 (m, 3H), 7.64–7.71 (m, 2H), 8.28 (s, 1H), 11.5 (s, 1H).
LC-MS (Methode 2): Rt = 1.24 min; MS (ESIpos): m/z = 404 [M + H]+. To 11.1 g (25.5 mmol) of the compound from Example 6A in 22 ml of N, N-dimethylacetamide were added under argon at 20 to 30 ° C 3.31 g (28.0 mmol) of potassium tert-butoxide in 10 ml of N, N-dimethylacetamide. The reaction mixture was stirred at 30 ° C. for 3 h. Subsequently, the reaction mixture was added to 250 ml of ice water, 1N aqueous hydrogen chloride solution was added dropwise to a pH of 2, the precipitate was filtered off with suction and washed with water. For further purification, the product was taken up in methylene chloride, extracted with 50 ml of 1N aqueous sodium hydroxide solution, the aqueous phase acidified with aqueous 1 N hydrochloric acid, filtered off with suction, washed with water, slurried with 25 ml of hot acetonitrile on the ultrasonic bath, filtered off with suction, washed and dried. 5.70 g (55% of theory) of the title compound were obtained.
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ = 1.54-1.56 (d, 2H), 2.07-2.33 (m, 6H), 2.19 (s, 3H), 7.29-7.31 (d, 1H), 7.36 (d, 1H), 7.48-7.53 (m, 3H), 7.64-7.71 (m, 2H), 8.28 (s, 1H), 11.5 (s, 1H).
LC-MS (Method 2): R t = 1.24 min; MS (ESIpos): m / z = 404 [M + H] + .

Beispiel 1-3 Example 1-3

8,8-Difluor-3-(4'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00410001
8,8-difluoro-3- (4'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00410001

2.80 g (5.94 mmol) der Verbindung aus Beispiel 7A wurden in einer Lösung von 8 ml DMA (N,N-Dimethylacetamid) vorgelegt und eine Lösung von 5 ml DMA und 1.75 g (2.5 eq.) Kalium-tertbutylat bei 20 °C zugetropft und für 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Man goss auf 200 ml Wasser und stellte den Ansatz mit konzentrierter wässriger Salzsäure auf pH 2 ein und saugte den erhaltenen Rückstand ab. Nach flashsäulenchromatographischer Reinigung (Silicagel; Essigester/n-Hexan 1:1) erhielt man 1.07 g (44 % d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.55–1.57 (m, 2H), 2.07–2.30 (m, 6H), 2.19 (s, 3H), 7.24–7.34 (m, 4H), 7.45–7.47 (dd, 1H), 7.63–7.67 (m, 2H), 8.28 (s, 1H), 11.05 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.21 min; MS (ESIpos): m/z = 388 [M + H]+. 2.80 g (5.94 mmol) of the compound from Example 7A were initially charged in a solution of 8 ml of DMA (N, N-dimethylacetamide) and a solution of 5 ml of DMA and 1.75 g (2.5 eq.) Of potassium tert-butylate was added dropwise at 20.degree and stirred for 4 h at room temperature. 200 ml of water were poured in and the batch was adjusted to pH 2 with concentrated aqueous hydrochloric acid and the residue obtained was filtered off with suction. To purified by flash column chromatography (silica gel, ethyl acetate / n-hexane 1: 1) gave 1.07 g (44% of th.) Of the title compound.
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.55-1.57 (m, 2H), 2.07-2.30 (m, 6H), 2.19 (s, 3H), 7.24-7.34 (m, 4H), 7.45-7.47 (dd, 1H), 7.63-7.67 (m, 2H), 8.28 (s, 1H), 11.05 (s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.21 min; MS (ESIpos): m / z = 388 [M + H] + .

Beispiel 1-4 Example 1-4

3-(4,4'-Dichlorbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00420001
3- (4,4'-dichlorobiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00420001

3.20 g (5.74 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A wurden in einer Lösung von 14 ml DMA (N,N-Dimethylacetamid) vorgelegt und eine Lösung von 9 ml DMA und 1.69 g (2.5 eq.) Kalium-tert-butylat bei 20 °C zugetropft und für 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Man goss auf 200 ml Wasser und stellte den Ansatz mit konzentrierter wässriger Salzsäure auf pH 2 ein und saugte den erhaltenen Rückstand ab. Nach flashsäulenchromatographischer Reinigung (Silicagel; Essigester/n-Hexan 1:1) erhielt man 1.50 g (52% d. Th.) der Titelverbindung vom Schmelzpunkt Fp. 156 ° C.
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.50–1.62 (m, 2H), 2.02–2.24 (m, 6H), 7.50–7.57 (m, 4H), 7.58–7.65 (m, 1H), 7.66–7.72 (m, 2H), 8.37 (s, 1H), 11.4 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.28 min; MS (ESIpos): m/z = 424 [M + H]+. 3.20 g (5.74 mmol) of the compound from Example 8A were initially charged in a solution of 14 ml of DMA (N, N-dimethylacetamide) and a solution of 9 ml of DMA and 1.69 g (2.5 eq.) Of potassium tert-butoxide at 20 ° C was added dropwise and stirred for 4 h at room temperature. 200 ml of water were poured in and the batch was adjusted to pH 2 with concentrated aqueous hydrochloric acid and the residue obtained was filtered off with suction. After purification by flash column chromatography (silica gel, ethyl acetate / n-hexane 1: 1), 1.50 g (52% of theory) of the title compound of melting point mp 156 ° C. were obtained.
1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.50-1.62 (m, 2H), 2.02-2.24 (m, 6H), 7.50-7.57 (m, 4H), 7.58-7.65 ( m, 1H), 7.66-7.72 (m, 2H), 8.37 (s, 1H), 11.4 (s, 1H).
LC-MS (Method 1): R t = 1.28 min; MS (ESIpos): m / z = 424 [M + H] + .

Beispiel 1-5 Example 1-5

3-(4'-Chlor-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00420002
3- (4'-chloro-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00420002

2.55 g (5.29 mmol) der Verbindung aus Beispiel 9A wurden in einer Lösung von 5 ml DMA (N,N-Dimethylacetamid) vorgelegt und eine Lösung von 5 ml DMA und 1.88 g (3 eq.) Kalium-tert-butylat bei 20 °C zugetropft und für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Man goss auf 200 ml Wasser und stellte den Ansatz mit konzentrierter wässriger Salzsäure auf pH 2 ein und saugte den erhaltenen Rückstand ab. Nach flashsäulenchromatographischer Reinigung (Silicagel; Essigester/n-Hexan 2:1) erhielt man 0.87 g (31 % d. Th.) der Titelverbindung.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.55 (m, 2H), 2.07–2.33 (m, 6H), 1.98 (d, 3H), 2.13 (s, 3H), 7.03–7.05 (d, 1H), 7.11–7.13 (d, 1H), 7.28–7.31 (m, 2H), 7.46–7.49 (m, 2H), 8.22 (s, 1H), 10.95 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 418 [M + H]+. 2.55 g (5.29 mmol) of the compound from Example 9A were initially charged in a solution of 5 ml of DMA (N, N-dimethylacetamide) and a solution of 5 ml of DMA and 1.88 g (3 eq.) Of potassium tert-butoxide at 20 ° C was added dropwise and stirred for 24 h at room temperature. 200 ml of water were poured in and the batch was adjusted to pH 2 with concentrated aqueous hydrochloric acid and the residue obtained was filtered off with suction. After purification by flash column chromatography (silica gel, ethyl acetate / n-hexane 2: 1), 0.87 g (31% of theory) of the title compound were obtained.
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.55 (m, 2H), 2.07-2.33 (m, 6H), 1.98 (d, 3H), 2.13 (s, 3H), 7.03 -7.05 (d, 1H), 7.11-7.13 (d, 1H), 7.28-7.31 (m, 2H), 7.46-7.49 (m, 2H), 8.22 (s, 1H), 10.95 (s, 1H).
LC-MS (method 1): R t = 1.31 min; MS (ESIpos): m / z = 418 [M + H] + .

Beispiel 1-6 Example 1-6

3-(3',4'-Difluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Figure 00430001
3- (3 ', 4'-difluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Figure 00430001

In 5 ml Ethylenglykoldimethylether wurden 0.74 g (2.0 mmol) der Verbindung aus Beispiel 11A vorgelegt, 14.5 ml 2M wässrige Natriumcarbonat-Lösung zugetropft und 10 mg Bis(trisphenylphosphin)palladium(II)chlorid zugegeben. Anschließend gab man 0.35 g (2.2 mmol) 3,4-Difluorphenylboronsäure zu und rührte über Nacht unter Rückfluss. Nach Abkühlen wurde mit 1N wässriger Salzsäure angesäuert, mit Essigsäureethylester extrahiert, getrocknet und eingeengt. Die Reinigung erfolgte durch eine MPLC-Trennung an Kieselgel mit Hexan/Essigsäureethylester 1/1 als Eluationsmittel. Man erhielt 0.7 g (70% d. Th.) der Titelverbindung. Anschließend wurden 395 mg nochmals mittels HPLC gereinigt [Säule: Chromatorex C18, 10 µm, 125 mm × 30 mm; Eluent: Wasser/Acetonitril-Gradient unter Zusatz von 0.1% Ameisensäure]. Man erhielt 121 mg der Titelverbindung.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.49–1.63 (m, 2H), 2.02–2.35 (m, 9H), 7.31 (d, 1H), 7.38 (d, 1H), 7.43–7.57 (m, 3H), 7.65–7.77 (m, 1H), 8.37 (s, 1H), 11.08 (s, 1H).
LC-MS (Methode 2): Rt = 1.20 min; MS (ESIpos): m/z = 406 [M + H]+. In 5 ml of ethylene glycol dimethyl ether, 0.74 g (2.0 mmol) of the compound from Example 11A were initially charged, 14.5 ml of 2M aqueous sodium carbonate solution were added dropwise and 10 mg of bis (trisphenylphosphine) palladium (II) chloride added. Subsequently, 0.35 g (2.2 mmol) of 3,4-difluorophenylboronic acid were added and the mixture was stirred at reflux overnight. After cooling, it was acidified with 1N aqueous hydrochloric acid, extracted with ethyl acetate, dried and concentrated. The purification was carried out by MPLC separation on silica gel with hexane / ethyl acetate 1/1 as eluent. 0.7 g (70% of theory) of the title compound were obtained. Subsequently, 395 mg were again purified by HPLC [column: Chromatorex C18, 10 μm, 125 mm × 30 mm; Eluent: water / acetonitrile gradient with addition of 0.1% formic acid]. 121 mg of the title compound were obtained.
1 H-NMR (400MHz, DMSO-d 6 ): δ [ppm] = 1.49-1.63 (m, 2H), 2.02-2.35 (m, 9H), 7.31 (d, 1H), 7.38 (d, 1H), 7.43-7.57 (m, 3H), 7.65-7.77 (m, 1H), 8.37 (s, 1H), 11.08 (s, 1H).
LC-MS (method 2): R t = 1.20 min; MS (ESIpos): m / z = 406 [M + H] + .

3. Assays 3. Assays

3.1 Human ACC-Enzymassays 3.1 Human ACC enzyme assays

Die ACC1- und ACC2- Inhibitionsdaten wurden mit beiden im folgenden beschriebenen Assays erhoben. Normalerweise wurde für beide Messungen eine gemeinsame serielle Verdünnungsreihe der Testsubstanzen erstellt und von dieser Verdünnungsreihe dann mit einem 384well-50-nl-Kapillarpipettor (HummingbirdTM von Genomics Solutions) mehrere Substanzplattenkopien erstellt. Diese wurden dann jeweils in dem ACC1- und dem ACC2-Assay verwendet, so dass für eine optimale Vergleichbarkeit beide Enzyminhibitionsmessungen mit Kopien derselben Substanzverdünnungsreihe durchgeführt wurden. The ACC1 and ACC2 inhibition data were collected with both assays described below. Normally, a serial serial dilution series of the test substances was prepared for both measurements, and multiple copies of the substance were then made from this dilution series with a 384well 50 nl capillary pipettor (Hummingbird ™ from Genomics Solutions). These were then used in the ACC1 and ACC2 assays, respectively, so that for optimal comparability, both enzyme inhibition measurements were made on copies of the same dilution series.

Human ACC1 Enzymssay Human ACC1 enzyme assay

Die hACC1-inhibitorische Wirkung der Substanzen dieser Erfindung wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen hACC1-Assay gemessen. Im Wesentlichen wird die Enzymaktivität gemessen durch Quantifizierung des als Nebenprodukt der Enzymreaktionen gebildeten Adenosin-di-phosphat (ADP) mittels des ADP-GloTM- Nachweissystems der Firma Promega. Bei diesem wird zunächst das in der Enzymreaktion nicht verbrauchte Adenosin-tri-phosphat (ATP) mittels einer Adenylatzyclase („ADP-GLO-Reagenz“) quantitativ in cAMP überführt, die Adenylatzyklase dann gestoppt und anschließend („Kinase Detection Reagenz“) wird dann das gebildete ADP in ATP umgewandelt und dieses in einer luziferasebasierten Reaktion in ein Glow-Lumineszenzsignal umgesetzt. Als Enzym wurde rekombinantes C-terminal FLAG-getagtes humanes ACC1 (Acetyl-Coenzym A Carboxylase alpha Transkript Variante 1) (GenBank Accession No. NM_198834) (Aminosäuren 39 – Ende) verwendet, exprimiert in Baculovirus-infizierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Anti-FLAG-Affinitätschromatographie. The hACC1 inhibitory activity of the substances of this invention was measured in the hACC1 assay described in the following paragraphs. Essentially, the enzyme activity is measured by quantifying the adenosine di-phosphate (ADP) formed as a by-product of the enzyme reactions by means of the ADP-Glo ™ detection system from Promega. In this case, the adenosine tri-phosphate (ATP) not consumed in the enzyme reaction is first quantitatively converted into cAMP by means of an adenylate cyclase ("ADP-GLO reagent"), the adenylate cyclase is then stopped and then ("kinase detection reagent") is then converted the formed ADP into ATP and converted this into a glow luminescence signal in a luciferase-based reaction. The enzyme used was recombinant C-terminal FLAG-tagged human ACC1 (acetyl-coenzyme A carboxylase alpha transcript variant 1) (GenBank Accession No. NM_198834) (amino acids 39- end) expressed in baculovirus-infected insect cells (Hi5) and purified by anti-FLAG affinity chromatography.

Für den Assay wurden 50 nl einer 100fach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine weiße low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert, 2,5 µl einer Lösung von hACC1 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 mM Kaliumcitrat, 12 mM NaHCO3, 2 mM Di-thio-threitol (DTT), 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA)] hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 2,5 µl einer Lösung von Adenosin-tri-phosphat (ATP, 100 µM ⇒ Endkonzentration in 5 µl Assayvolumen ist 50 µM) und Acetyl-CoA (20 µM ⇒ Endkonzentration in 5 µl Assayvolumen ist 10 µM) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 45 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des hACC1 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 1,75 ng/µl. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 2,5 µl des „ADP-GLO-Reagenz“ (1:1,5-fach verdünnt) und die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert, um das nicht umgesetzte ATP vollständig in cAMP zu überführen. Anschließend wurden 2,5 µl des „Kinase Detection Reagenz“ (1,2fach konzentrierter als vom Hersteller angegeben) zugegeben, die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert und dann die Lumineszenz mit einem geeigneten Messgerät (Viewlux oder Topcount von Perkin-Elmer oder Pherastar von BMG Labtechnologies) gemessen. Die Menge des emittierten Lichtes wurde als Maß für die Menge des gebildeten ADP und damit für die Enzymaktivität der hACC1 genommen. Die Daten wurden normalisiert (Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0 % Inhibition, alle anderen Assaykomponente aber kein Enzym = 100 % Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanz auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 µM bis 1 nM (20 µM, 6.7 µM, 2.2 µM, 0.74 µM, 0.25 µM, 82 nM, 27 nM, 9.2 nM, 3.1 nM and 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der 100fach konzentrierten Lösung durch serielle 1:3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC50-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet wurde. For the assay, 50 μl of a 100X concentrated solution of the test substance in DMSO were pipetted into a white low-volume 384 well microtiter plate (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany), 2.5 μl of a solution of hACC1 in assay buffer [50 mM HEPES / NaOH pH 7.5, 2mM MgCl 2 , 2mM potassium citrate, 12mM NaHCO 3 , 2mM thio-threitol (DTT), 0.005% (w / v) bovine serum albumin (BSA)] and the mixture for 15 min incubated to allow a Vorbindung the substances to the enzyme prior to the enzyme reaction. Then the enzyme reaction was started by adding 2.5 μl of a solution of adenosine tri-phosphate (ATP, 100 μM ⇒ final concentration in 5 μL assay volume is 50 μM) and acetyl-CoA (20 μM ⇒ final concentration in 5 μL assay volume is 10 μM) in assay buffer and the resulting mixture for the 45 min reaction time at 22 ° C incubated. The concentration of hACC1 was adjusted to the respective activity of the enzyme and adjusted so that the assay worked in the linear range. Typical concentrations were in the range of 1.75 ng / μl. The reaction was stopped by adding 2.5 μl of the "ADP-GLO reagent" (diluted 1: 1.5 fold) and the resulting mixture incubated for 1 h at 22 ° C to fully add the unreacted ATP into cAMP convict. Subsequently, 2.5 μl of the "Kinase Detection Reagent" (1.2 times more concentrated than indicated by the manufacturer) was added, the resulting mixture incubated for 1 h at 22 ° C and then the luminescence with a suitable instrument (Viewlux or Topcount from Perkin-Elmer or pherastar from BMG Labtechnologies). The amount of light emitted was taken as a measure of the amount of ADP formed and thus of the enzyme activity of hACC1. The data were normalized (enzyme reaction without inhibitor = 0% inhibition, all other assay component but no enzyme = 100% inhibition). Typically, the test substance was incubated on the same microtiter plates at 10 different concentrations ranging from 20 μM to 1 nM (20 μM, 6.7 μM, 2.2 μM, 0.74 μM, 0.25 μM, 82 nM, 27 nM, 9.2 nM, 3.1 nM and 1 nM, serial dilutions were assayed at 100-fold concentrated solution level by serial 1: 3 dilutions) in duplicate for each concentration prior to assay, and IC 50 values were calculated using a 4-parameter fit using in-house software.

Human ACC2-Enzymassay Human ACC2 enzyme assay

Die hACC2-inhibitorische Wirkung der Substanzen dieser Erfindung wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen hACC2-Assay gemessen. Im Wesentlichen wird die Enzymaktivität gemessen durch Quantifizierung des als Nebenprodukt der Enzymreaktionen gebildeten Adenosin-di-phosphat (ADP) mittels des ADP-GloTM-Nachweissystems der Firma Promega. Bei diesem wird zunächst das in der Enzymreaktion nicht verbrauchte Adenosin-tri-phosphat (ATP) mittels einer Adenylatzyclase („ADP-GLO-Reagenz“) quantitativ in cAMP überführt, die Adenylatzyklase dann gestoppt und anschließend („Kinase Detection Reagenz“) wird dann das gebildete ADP in ATP umgewandelt und dieses in einer luziferasebasierten Reaktion in ein Glow-Lumineszenzsignal umgesetzt. The hACC2 inhibitory activity of the substances of this invention was measured in the hACC2 assay described in the following paragraphs. Essentially, the enzyme activity is measured by quantifying the adenosine di-phosphate (ADP) formed as a by-product of the enzyme reactions using the ADP-Glo ™ detection system from Promega. In this case, the adenosine tri-phosphate (ATP) not consumed in the enzyme reaction is first quantitatively converted into cAMP by means of an adenylate cyclase ("ADP-GLO reagent"), the adenylate cyclase is then stopped and then ("kinase detection reagent") is then converted the formed ADP into ATP and converted this into a glow luminescence signal in a luciferase-based reaction.

Als Enzym wurde rekombinantes C-terminal FLAG-getagtes humanes ACC2 (Acetyl-Coenzym A Carboxylase 2, GenBank Accession No. NP_001084) (Aminosäuren 27 – Ende) verwendet, exprimiert in Baculovirus-infizierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Anti-FLAG-Affinitätschromatographie. Für den Assay wurden 50 nl einer 100fach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine weiße low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert, 2,5 µl einer Lösung von hACC2 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 mM Kaliumcitrat, 12 mM NaHCO3, 2 mM Di-thio-threitol (DTT), 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA)] hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 2,5 µl einer Lösung von Adenosin-tri-phosphat (ATP, 100 µM ⇒ Endkonzentration in 5 µl Assayvolumen ist 50 µM) und Acetyl-CoA (20 µM ⇒ Endkonzentration in 5 µl Assayvolumen ist 10 µM) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 45 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des hACC2 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 2 ng/µl. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 2,5 µl des „ADP-GLO-Reagenz“ (1:1,5-fach verdünnt) und die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert, um das nicht umgesetzte ATP vollständig in cAMP zu überführen. Anschließend wurden 2,5 µl des „Kinase Detection Reagenz“ (1,2fach konzentrierter als vom Hersteller angegeben) zugegeben, die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert und dann die Lumineszenz mit einem geeigneten Messgerät (Viewlux oder Topcount von Perkin-Elmer oder Pherastar von BMG Labtechnologies) gemessen. Die Menge des emittierten Lichtes wurde als Maß für die Menge des gebildeten ADP und damit für die Enzymaktivität der hACC2 genommen. Die Daten wurden normalisiert (Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0 % Inhibition, alle anderen Assaykomponente aber kein Enzym = 100 % Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanz auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 µM bis 1 nM (20 µM, 6.7 µM, 2.2 µM, 0.74 µM, 0.25 µM, 82 nM, 27 nM, 9.2 nM, 3.1 nM and 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der 100fach konzentrierten Lösung durch serielle 1:3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC50-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet wurde. The enzyme used was recombinant C-terminal FLAG-tagged human ACC2 (acetyl-coenzyme A carboxylase 2, GenBank Accession No. NP_001084) (amino acids 27-end) expressed in baculovirus-infected insect cells (Hi5) and purified by anti-FLAG affinity chromatography. For the assay, 50 μl of a 100X concentrated solution of the test substance in DMSO were pipetted into a white low-volume 384 well microtiter plate (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany), 2.5 μl of a solution of hACC2 in assay buffer [50 mM HEPES / NaOH pH 7.5, 2mM MgCl 2 , 2mM potassium citrate, 12mM NaHCO 3 , 2mM thio-threitol (DTT), 0.005% (w / v) bovine serum albumin (BSA)] and the mixture for 15 min incubated to allow a Vorbindung the substances to the enzyme prior to the enzyme reaction. Then the enzyme reaction was started by adding 2.5 μl of a solution of adenosine tri-phosphate (ATP, 100 μM ⇒ final concentration in 5 μl assay volume is 50 μM) and acetyl-CoA (20 μM ⇒ final concentration in 5 μl assay volume is 10 μM) in assay buffer and the resulting mixture for the 45 min reaction time at 22 ° C. The concentration of hACC2 was adjusted to the respective activity of the enzyme and adjusted so that the assay worked in the linear range. Typical concentrations were in the range of 2 ng / μl. The reaction was stopped by adding 2.5 μl of the "ADP-GLO reagent" (diluted 1: 1.5 fold) and the resulting mixture incubated for 1 h at 22 ° C to fully add the unreacted ATP into cAMP convict. Subsequently, 2.5 μl of the "Kinase Detection Reagent" (1.2 times more concentrated than indicated by the manufacturer) was added, the resulting mixture incubated for 1 h at 22 ° C and then the luminescence with a suitable instrument (Viewlux or Topcount from Perkin-Elmer or pherastar from BMG Labtechnologies). The amount of light emitted was taken as a measure of the amount of ADP formed and thus of the enzyme activity of hACC2. The data were normalized (enzyme reaction without inhibitor = 0% inhibition, all other assay component but no enzyme = 100% inhibition). Typically, the test substance was incubated on the same microtiter plates at 10 different concentrations ranging from 20 μM to 1 nM (20 μM, 6.7 μM, 2.2 μM, 0.74 μM, 0.25 μM, 82 nM, 27 nM, 9.2 nM, 3.1 nM and 1 nM, serial dilutions were assayed at 100-fold concentrated solution level by serial 1: 3 dilutions) in duplicate for each concentration prior to assay, and IC 50 values were calculated using a 4-parameter fit using in-house software.

3.2 Zell-Assays 3.2 Cell Assays

In Übereinstimmung mit der Erfindung, wurden die Substanzen in Zell-basierten Assays getestet, das bedeutet die Fähigkeit der Substanzen die Tumorzellproliferation nach einer 96stündigen Substanzinkubation zu hemmen. Die Zellviabilität wurde mittels dem CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) getestet. Die Zellen wurden in einer Dichte von 2000–5000 Zellen/Well (abhängig von der Zelllinie) in 100µl Wachstumsmedium auf 96well Microtiterplatten ausgesät. Für jede untersuchte Zelllinie, wurden Zellen auf eine separate Platte zur Bestimmung der Lumineszenz an t = 0 Stunden und t = 96 Stunden ausgesät. Nach einer Übernachtinkubation bei 37°C, wurden die Lumineszenzwerte für die t = 0 Proben bestimmt. Die Dosis-Platten für die t = 96 Stunden Zeitpunkte wurden mit in Wachstumsmedium verdünnten Substanzen behandelt. Die Zellen wurden dann für 96 Stunden bei 37°C inkubiert, anschließend die Lumineszenzwerte für die t = 96 – Stunden Proben bestimmt. Für die Datenanalyse wurden die t = 0 Werte von den t = 96 Stunden Werte abgezogen für behandelte und unbehandelte Proben. Die prozentualen Unterschiede in der Luminescenz zwischen mit Substanz behandelten und Kontrollwerten wurden benutzt um die prozentuale Wachstumshemmung zu bestimmen. In accordance with the invention, the substances were tested in cell-based assays, that is, the ability of the substances to tumor cell proliferation after a 96-hour substance incubation to inhibit. Cell viability was tested using the CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay ® (Promega). The cells were seeded at a density of 2000-5000 cells / well (depending on the cell line) in 100 μl growth medium on 96 well microtiter plates. For each cell line examined, cells were seeded on a separate plate to determine luminescence at t = 0 hours and t = 96 hours. After overnight incubation at 37 ° C, the luminescence values were determined for the t = 0 samples. The dose plates for the t = 96 hour time points were treated with substances diluted in growth medium. The cells were then incubated for 96 hours at 37 ° C, then the luminescence values were determined for the t = 96-hour samples. For data analysis, the t = 0 values were subtracted from the t = 96 hours values for treated and untreated samples. The percentage differences in luminescence between substance-treated and control values were used to determine the percent growth inhibition.

Die Substanzen wurden in folgenden Zelllinien untersucht, die beispielhaft die angegebenen Indikationen vertreten: Zelllinie Quelle Indikation MCF7 ATCC Hormonrezeptor-positives Mammakarzinom KM12 NCI Kolorektales Karzinom PC3 DMSZ Androgenrezeptor-negatives Prostatakarzinom H460 ATCC Nicht-Kleinzelliges Bronchialkarzinom ATCC: American Type Culture Collection
NCI: National Cancer Institute
DMSZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH The substances were investigated in the following cell lines, which exemplify the indicated indications: cell line source indication MCF7 ATCC Hormone receptor positive breast cancer KM12 NCI Colorectal carcinoma PC3 DMSZ Androgen receptor negative prostate cancer H460 ATCC Non-small cell lung carcinoma ATCC: American Type Culture Collection
NCI: National Cancer Institute
DMSZ: German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH

3.3 Analyse der ACC1 Expression in Tumor- and Normalgewebe 3.3 Analysis of ACC1 expression in tumor and normal tissues

Die ACC1 Expression wurde mittels eines Microrrays bestimmt. Dafür wurde die RNA aus verschiedenen Tumorgeweben und den korrespondierenden Normalgeweben isoliert. Methodisch wurde Trizol RNA extraction Reagenz (Invitrogen) verwendet und eine Aufreinigung mittels des RNeasy Mini Kit (Qiagen) angeschlossen. Ausserdem wurde ein DNase I (Qiagen) Verdau durchgeführt, um genomische DNA zu eliminieren. Zur Qualitätskontrolle wurde eine Analyse der totalen RNA mittels eines RNA LabChip auf einer Agilent Bioanalyzer 2100 Platform (Agilent Technologies) durchgeführt und die RNA Konzentration mittels des Peqlab NanoDrop Systems bestimmt. Zur Hybridisierung wurde der „one-cycle eukaryotic target labeling assay“ von Affymetrix verwendet und der Array anschliessend auf einem AffymetrixGeneChip 3000 scanner (Affymetrix) ausgelesen. Auswertung und Qualitätskontrolle erfolgten unter Verwendung der Expressionist Pro 4.0 Refiner (GeneData) Software. The ACC1 expression was determined by means of a microrray. For this, the RNA was isolated from different tumor tissues and the corresponding normal tissues. Methodically, Trizol RNA extraction reagent (Invitrogen) was used and purification was performed using the RNeasy Mini Kit (Qiagen). In addition, DNase I (Qiagen) digestion was performed to eliminate genomic DNA. For quality control, total RNA analysis was performed using an RNA LabChip on an Agilent Bioanalyzer 2100 Platform (Agilent Technologies) and RNA concentration determined using the Peqlab NanoDrop System. For hybridization, the "one-cycle eukaryotic target labeling assay" from Affymetrix was used and the array was then read on an Affymetrix GeneChip 3000 scanner (Affymetrix). Evaluation and quality control were performed using the Expressionist Pro 4.0 Refiner (GeneData) software.

3.4 Assays zur Bestimmung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (logP/D) der Membranaffinität (logMA) und der Proteinbindung an humanes Serum Albumin (Kd HSA) 3.4 Assays for Determining the Octanol-Water Partition Coefficient (logP / D) of Membrane Affinity (logMA) and Protein Binding to Human Serum Albumin (K d HSA)

Assay zur Bestimmung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (logP/D): Assay for determining the octanol-water partition coefficient (logP / D):

Der Verteilungskoeffizient Oktanol/Wasser P bzw. D ist ein Schlüsselparameter zur Abschätzung von Membran-Penetration und Permeabilität. Er ist definiert als Verhältnis der Gleichgewichtskonzentrationen einer Substanz im Zwei-Phasensystem Oktanol/Wasser. P/D = COktanol / CWasser

P
= Partition (engl. Verteilung)
D
= Distribution (engl. Verteilung)
cOktanol
= Konzentration der Substanz in der Oktanol-Phase
cWasser
= Konzentration der Substanz in der wässrigen Phase
The partition coefficient octanol / water P or D is a key parameter for estimating membrane penetration and permeability. It is defined as the ratio of the equilibrium concentrations of a substance in the two-phase system octanol / water. P / D = CO-ethanol / C-water
P
= Partition
D
= Distribution
cOktanol
= Concentration of the substance in the octanol phase
cwater
= Concentration of the substance in the aqueous phase

Er wird üblicherweise in Form des dekadischen Logarithmus (logP bzw. logD) angegeben. It is usually given in the form of the decadic logarithm (logP or logD).

Der logP beschreibt das Verteilungsverhalten einer Substanz, die ausschließlich in ihrer neutralen Form vorliegt. Der logD beschreibt das Verteilungsverhalten einer Substanz bei einem bestimmten pH-Wert; in Abhängigkeit von der Ionisierungskonstante pKa des Substanz, kann dabei ein Teil der Substanz in ionischer, ein Teil in neutraler Form vorliegen. The logP describes the distribution behavior of a substance that exists exclusively in its neutral form. The logD describes the distribution behavior of a substance at a certain pH value; in Depending on the ionization constant pKa of the substance, part of the substance may be present in ionic form, part in neutral form.

Der logP/D-Wert der Wirkstoffe wurde mit einer isokratischen HPLC-Methode (HPLC = High performance liquid chromatography) bestimmt (Literatur: OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 117 ). Die Methode basiert auf der Korrelation der HPLC-Retentionszeit der Testsubstanz mit der von Referenzsubstanzen mit bekannten Verteilungskoeffizienten. The logP / D value of the active ingredients was determined by means of an isocratic HPLC method (HPLC = high performance liquid chromatography) (literature: OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 117 ). The method is based on the correlation of the HPLC retention time of the test substance with that of reference substances with known partition coefficients.

Die Testsubstanz wurde als 10 mM-DMSO-Lösung (DMSO = Dimethylsulfoxid) eingesetzt. 10 µl dieser Lösung wurden mit einem Methanol-Wasser-Gemisch im Verhältnis 7 + 3 auf 100 µl aufgefüllt. The test substance was used as 10 mM DMSO solution (DMSO = dimethyl sulfoxide). 10 μl of this solution were made up to 100 μl with a methanol / water mixture in the ratio 7 + 3.

Die neun Referenzsubstanzen wurden einzeln in Methanol gelöst. Die Konzentration ist der Tabelle 1 zu entnehmen. Es wurden je 100µl der Stammlösungen zusammen in ein HPLC-Vial gegeben und mit 300µl Wasser gemischt. Tab. 1 Referenzsubstanz Log P Ungefähre Retentionszeit [min] Molare Masse Einwaage Stammlösg. [mg/10ml] Acetanilid 1,0 0,8 135,2 12 4-Methylbenzylalkohol 1,6 0,9 122,2 15 Methylbenzoat 2,1 1,1 136,2 18 Ethylbenzoat 2,6 1,4 150,2 19 Naphthalin 3,6 2,1 128,2 3 1,2,4-Trichlorbenzol 4,2 3,4 181,5 14 2,6-Diphenylpyridin 4,9 4,6 231,3 5 Triphenylamin 5,7 8,0 245,3 8 DDT 6,2 10,3 354,5 10 The nine reference substances were individually dissolved in methanol. The concentration is shown in Table 1. In each case, 100 μl of the stock solutions were added together to an HPLC vial and mixed with 300 μl of water. Tab. 1 reference substance Log P Approximate retention time [min] Molar mass Initial weight [Mg / 10 ml] acetanilide 1.0 0.8 135.2 12 4-methylbenzyl 1.6 0.9 122.2 15 methylbenzoate 2.1 1.1 136.2 18 ethyl benzoate 2.6 1.4 150.2 19 naphthalene 3.6 2.1 128.2 3 1,2,4-trichlorobenzene 4.2 3.4 181.5 14 2,6-diphenylpyridine 4.9 4.6 231.3 5 triphenylamine 5.7 8.0 245.3 8th DDT 6.2 10.3 354.5 10

Zur Bestimmung der Totzeit wurde eine Formamid-Lösung eingesetzt. Dazu wurden 7 mg Formamid in 10 ml Methanol gelöst. 100µl dieser Stammlösung wurden mit 500µl Methanol und 200µl Wasser gemischt. To determine the dead time, a formamide solution was used. For this purpose, 7 mg of formamide were dissolved in 10 ml of methanol. 100μl of this stock solution were mixed with 500μl of methanol and 200μl of water.

Alle Lösungen wurden mit einem Fluss von 1.00ml/min chromatographiert. Chromatographische Bedingungen: HPLC-Anlage Waters Alliance HT 2790 UV-Detektor DAD Waters 996 MS-Detektor MS Micromass ZQ HPLC Software MassLynx 4.1 der Firma Waters Säule Spherisorb ODS 3µm 4,6 × 60 mm Laufmittel Methanol + Wasser mit 0.01M Ammoniumacetat (0.77g/Liter) 75 + 25, pH 7.0 Einspritzvolumina: Formamid 5µl Referenzen 5µl Testsubstanz 15µl Injektionsschema:
Formamid, Referenzen, Testsubstanz 1, Testsubstanz 2, ..., Formamid, Referenzen. All solutions were chromatographed at a flow of 1.00 ml / min. Chromatographic conditions: HPLC system Waters Alliance HT 2790 UV detector DAD Waters 996 MS detector MS Micromass ZQ HPLC software MassLynx 4.1 from Waters pillar Spherisorb ODS 3μm 4.6 × 60 mm eluent Methanol + water with 0.01M ammonium acetate (0.77g / liter) 75 + 25, pH 7.0 Injection volumes: formamide 5μl references 5μl test substance 15μl Injection scheme:
Formamide, references, test substance 1, test substance 2, ..., formamide, references.

Die Auswertung der Retentionszeiten erfolgte im Diodenarray-Detektor (DAD) bei 200–400nm. Mit dem nachgeschalteten Massenspektrometer wurde über die Molekülmasse die Identität der Testsubstanz überprüft. The evaluation of the retention times was carried out in the diode array detector (DAD) at 200-400nm. With the downstream mass spectrometer, the identity of the test substance was checked via the molecular mass.

Der HPLC-Lauf wurde mit der Waters-Software Masslynx 4.1 ausgewertet. Die LogP/D Werte wurden mit der Software “POW Determination” (proprietäre Entwicklung) berechnet. The HPLC run was evaluated using the Waters Masslynx 4.1 software. The LogP / D values were calculated using the software "POW Determination" (proprietary development).

Assays zur Bestimmung der Membranaffinität logMA und der Proteinbindung an humanes Serum Albumin (HSA): Assays for determining the membrane affinity logMA and protein binding to human serum albumin (HSA):

Die Bestimmung der Membranaffinität und der Proteinbindung an humanes Serum Albumin (HSA) erfolgte über die Transil-Technologie (Literatur: A. Loidl-Stahlhofen, A. Eckert, T. Hartmann, M. Schöttner J Pharm Sci 90, 599–606 (2001) . Bei Transil® (vertrieben von der Firma Sovicell in Leipzig) handelt es sich um Glaskügelchen (Durchmesser 10–12 µm), auf denen eine doppelschichtige Membran aus Phosphatidylcholin (MA-Transil) oder kovalent gebundenes humanes Serum Albumin (HSA-Transil) aufgebracht ist. The determination of the membrane affinity and the protein binding to human serum albumin (HSA) took place via the transil technology (literature: A. Loidl-Stahlhofen, A. Eckert, T. Hartmann, M. Schöttner J Pharm Sci 90, 599-606 (2001) , In Transil ® (marketed by the company Sovicell in Leipzig) is glass beads (diameter 10-12 microns), on which a double-membrane of phosphatidylcholine (MA-Transil) or covalently bound human serum albumin (HSA-Transil) applied ,

Zur Bestimmung des logMA und der Proteinbindungskonstante an HSA wurde das kommerziell verfügbare TRANSIL Intestinal Absorption & HSA Binding Combined Assay Kit verwendet. Dabei handelt es sich um eine 96 well Mikrotiterplatte (96 well-MTP), gefüllt mit Transil, mit der für jeweils acht Wirkstoffe die Bindung an MA-Transil und HSA-Transil bestimmt werden kann. Für jeden Wirkstoff steht eine Reihe mit 12 wells auf der Transil-Platte zur Verfügung. Zwei Wells dienen als Referenz und sind nur mit Puffer pH 7.4 befüllt. Fünf weitere Wells enthalten MA-Transil in unterschiedlicher ansteigender Konzentration, die fünf restlichen wells enthalten HSA-Transil in unterschiedlicher ansteigender Konzentration. To determine the logMA and protein binding constant on HSA, the commercially available TRANSIL Intestinal Absorbance & HSA Binding Combined Assay Kit was used. This is a 96-well microtiter plate (96 well-MTP) filled with transil, with which the binding to MA-transil and HSA-transil can be determined for every eight active substances. For each drug, a series of 12 wells on the transil plate is available. Two wells serve as reference and are filled only with buffer pH 7.4. Five more wells contain MA-Transil in varying increasing concentrations, the five remaining wells contain HSA-transil in varying increasing concentrations.

Um die Bindung eines Wirkstoffs an Transil zu ermitteln, wurde der Überstand der wells mit Transil gegen die Referenzlösung ohne Transil über HPLC-MS-Kopplung (HPLC-MS = Highperformance liquid chromatography-mass spectrometry) quantifiziert. In order to determine the binding of a drug to Transil, the supernatant of the wells was quantified with transil against the reference solution without transile via HPLC-MS coupling (HPLC-MS = high-performance liquid chromatography-mass spectrometry).

Die Durchführung des Assays im Einzelnen:
Vom internen Substanzlager wurden die Wirkstoffe in einer 96 well-MTP geliefert. Diese Platte wird als Mutterplatte bezeichnet. Pro well waren 30µl einer 10 mmol Wirkstofflösung in DMSO (Dimethylsulfoxid) enthalten. Zwei wells am Anfang (well A1) und am Ende der Platte (well H12) wurden mit 30µl 10 mmol Warfarinlösung in DMSO befüllt. Warfarin, dessen Membranaffinität und Bindung an HSA bekannt ist, dient zur Überprüfung der Richtigkeit der Messung. Aus der Mutterplatte wurde eine Tochterplatte mit der Verdünnung 1 zu 4000 mit einem Gemisch Puffer pH 7.4 und DMSO im Verhältnis 1 + 1 hergestellt. Die Wirkstoffkonzentration pro well betrug 2.5 µmol/Liter, das Volumen pro well betrug 400 µl. Mit einem Hamilton-Pipettierroboter Microlab STAR wurden die 96 Wirkstoffe aus der Tochterplatte auf insgesamt 12 Transil-Platten verteilt. Pro well der Tochterplatte wurden 12 mal 20µl entnommen. Die Konzentration je well in der Transil-Platte betrug 0.25µmol/Liter, einer Verdünnung 1 zu 10 entsprechend. Der Gehalt an DMSO lag bei 5%. The implementation of the assay in detail:
From the internal substance storage, the active ingredients were delivered in a 96 well MTP. This plate is called a mother plate. Per well 30μl of a 10 mmol drug solution in DMSO (dimethyl sulfoxide) were included. Two wells at the beginning (well A1) and at the end of the plate (well H12) were filled with 30 μl 10 mmol warfarin solution in DMSO. Warfarin, whose membrane affinity and binding to HSA is known, serves to verify the accuracy of the measurement. From the mother plate, a daughter plate with the dilution 1 to 4000 was prepared with a mixture buffer pH 7.4 and DMSO in the ratio 1 + 1. The active ingredient concentration per well was 2.5 μmol / liter, the volume per well was 400 μl. Using a Hamilton Microlab STAR pipetting robot, the 96 active ingredients from the daughter plate were distributed over a total of 12 Transil plates. Per well of the daughter plate were taken 12 times 20μl. The concentration per well in the transil plate was 0.25 μmol / liter, corresponding to a dilution of 1 to 10. The content of DMSO was 5%.

Die befüllten Transil-Platten wurden je zwei Minuten resuspendiert, anschließend mindestens zwei Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann bei 600 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde vom Pipettierroboter 20 µl Überstand aus jedem Well der Transil-Platte abgenommen und in eine separate Mikrotiterplatte überführt. Dabei wurden jeweils die Überstände von vier Transil-Platten in einer Mikrotiterplatte vereinigt („gepoolt“), so dass am Ende drei gepoolte Mikrotiterplatten mit je 80µl Lösung und einer Wirkstoffkonzentration von 62.5 nM pro Well vorlagen. The filled transil plates were each resuspended for two minutes, then allowed to stand for at least two minutes at room temperature and then centrifuged at 600 rpm for five minutes. Subsequently, 20 μl of supernatant from each well of the transil plate was removed from the pipetting robot and transferred to a separate microtiter plate. In each case, the supernatants of four transil plates in a microtiter plate were combined ("pooled"), so that at the end of three pooled microtiter plates with 80μl solution and an active ingredient concentration of 62.5 nM were present per well.

Bevor die Wirkstoffe mittels HPLC-MS quantifiziert werden können, muss für jeden Wirkstoff eine Optimierung durchgeführt werden, bei der durch einmalige Injektion Tochterion sowie optimale elektrische Spannungen ermittelt werden. Dazu fertigte der Pipettierroboter von der Mutterplatte eine Verdünnung von 1 zu 10000000 in einem Acetonitril-Wasser Gemisch im Verhältnis 8 + 2 in einer separaten Mikrotiterplatte an. Diese Mikrotiterplatte wurde mit der Software Discovery Quant Optimize der Firma AB Sciex an der HPLC-MS vermessen. Die drei gepoolten Mikrotiterplatten wurden mit der Software Discovery Quant Analyze der Firma AB Sciex an der HPLC-MS vermessen. Before the active ingredients can be quantified by means of HPLC-MS, an optimization must be carried out for each active ingredient, in which daughter injection and optimum electrical voltages are determined by a single injection. For this purpose, the pipetting robot made a dilution of 1 to 10,000,000 in an acetonitrile-water mixture in the ratio 8 + 2 in a separate microtiter plate from the mother plate. This microtiter plate was measured with the Discovery Quant Optimize software from AB Sciex on the HPLC-MS. The three pooled microtiter plates were measured on the HPLC-MS using the software Discovery Quant Analyze from AB Sciex.

Chromatographische Bedingungen: HPLC-MS-System: Agilent 1200 Rapid resolution HPLC Sciex Triple Quad 5500 Massenspektrometer (Firma AB Sciex) PAL Autosampler DLW Option Software: Analyst 1.4 (Firma AB Sciex) Discovery Quant Optimize (Firma AB Sciex) Discovery Quant Analyze (Firma AB Sciex) Optimierung: Säule: Kapillare Injektionsvolumen: 5 µl Flussrate: 0 min → 80µl/min 0–0.19 min → 80µl/min 0.20–0.65 min → 30µl/min 0.66–0.7 min → 150µl/min Fließmittel: A = Acetonitril + 0.05% Ameisensäure B = Wasser + 0.05% Ameisensäure Isokratisch A:B 8 + 2 Analyse: Säule: Poroshell 120 SB-C18 2.7µm 3 × 30 mm Injektionsvolumen: 2 µl Flussrate: 1ml/min Fließmittel: Gradient A = Acetonitril + 0.05% Ameisensäure B = Wasser + 0.05% Ameisensäure 0 min → 95% A, 5% B 0–1.0 min → 5%A, 95%B linear steigend 1.0–2.2 min → 5% A, 95%B isokratisch 2.21–2.3 min → 95%A, 5% B isokratisch Chromatographic conditions: HPLC-MS system: Agilent 1200 Rapid resolution HPLC Sciex Triple Quad 5500 mass spectrometer (AB Sciex company) PAL autosampler DLW option Software: Analyst 1.4 (company AB Sciex) Discovery Quant Optimize (AB Sciex company) Discovery Quant Analyze (AB Sciex company) Optimization: Pillar: capillary Injection volume: 5 μl Flow rate: 0 min → 80μl / min 0-0.19 min → 80μl / min 0.20-0.65 min → 30μl / min 0.66-0.7 min → 150μl / min Eluent: A = acetonitrile + 0.05% formic acid B = water + 0.05% formic acid Isocratic A: B 8 + 2 Analysis: Pillar: Poroshell 120 SB-C18 2.7μm 3 × 30mm Injection volume: 2 μl Flow rate: 1 ml / min Eluent: gradient A = acetonitrile + 0.05% formic acid B = water + 0.05% formic acid 0 min → 95% A, 5% B 0-1.0 min → 5% A, 95% B increasing linearly 1.0-2.2 min → 5% A, 95% B isocratic 2.21-2.3 min → 95% A, 5% B isocratic

3.5 Bestimmung der Plasmaproteinbindung durch Gleichgewichtsdialyse 3.5 Determination of plasma protein binding by equilibrium dialysis

Die Bestimmung der Bindung von Prüfsubstanzen an Plasmaproteine erfolgt durch Gleichgewichtsdialyse mit Hilfe der Ht-Dialysis Apparatur (96well) aus Teflon und einer semipermeablen Membran (regenerierte Cellulose, MWCO 12–14K). Diese trennt je 150 µl einer Plasma- und einer Pufferseite (50 mM Phosphatpuffer). Die Prüfsubstanz wird in 2 Konzentrationen (üblicherweise 3 und 0.3 µM) zur Plasmaseite hinzugefügt und bindet an Plasmaproteine. Der ungebundene Anteil der Prüfsubstanz passiert die Membran passieren und verteilt sich auf beide Seiten bis ein Gleichgewicht eingestellt ist (ca. nach 6–8h bei 37°C). Die Substanzkonzentration auf Puffer- und Plasmaseite durch LC-MS-Analytik ermittelt. Dafür werden beide Seiten durch Verdünnung mit Puffer oder Plasma auf die gleiche Matrix (10% Plasma) gebracht und anschließend mit Methanol gefällt. Aus dem Quotienten der Puffer- und Plasmakonzentration berechnet sich die freie (ungebundene) Fraktion (fu). Als Kontrollen werden Stabilitätsproben, Wiederfindungsproben mitgeführt. Zusätzlich wird die Substanz in Puffer gegen Puffer dialysiert, um die unspezifische Bindung an Apparatur und Membran und die Einstellung des Gleichgewichtes zu überprüfen. Da es während der Inkubation durch den osmotischen Druck der Plasmaproteine zu einer Verdünnung des Plasmas kommt (Volumenshift), wird dieser mögliche Fehler durch Auswiegen von Leerplasmaproben ermittelt und in die Berechnung der fu einbezogen. Die Gleichgewichtseinstellung und Plasmastabilität sollte einen Wert von 80% nicht unterschreiten und die Recovery mindestens 30% betragen. Eine freie Fraktion von < 1% wird als hohe, zwischen 1 und 10% als moderate und von > 10% als niedrige Plasmaproteinbindung bezeichnet. Determination of the binding of test substances to plasma proteins is carried out by equilibrium dialysis using the Ht-dialysis apparatus (96well) made of Teflon and a semipermeable membrane (regenerated cellulose, MWCO 12-14K). This separates each 150 ul of a plasma and a buffer side (50 mM phosphate buffer). The test substance is added to the plasma side in 2 concentrations (usually 3 and 0.3 μM) and binds to plasma proteins. The unbound portion of the test substance passes through the membrane and spreads on both sides until an equilibrium is established (approximately after 6-8h at 37 ° C). The substance concentration on buffer and plasma side determined by LC-MS analysis. For this purpose, both sides are brought to dilution with buffer or plasma on the same matrix (10% plasma) and then precipitated with methanol. From the quotient of the buffer and plasma concentration, the free (unbound) fraction (fu) is calculated. Controls include stability samples and recovery samples. In addition, the substance is dialyzed in buffer against buffer to check the non-specific binding to the apparatus and membrane and the adjustment of the equilibrium. Since dilution of the plasma occurs during incubation due to the osmotic pressure of the plasma proteins (volume shift), this possible error is determined by weighing empty plasma samples and included in the calculation of the fu. The equilibrium and plasma stability should not be less than 80% and at least 30% recovery. A free fraction of <1% is called high, between 1 and 10% as moderate and> 10% as low plasma protein binding.

3.6 Pharmakokinetische Parameter 3.6 Pharmacokinetic parameters

Bestimmung der pharmakokinetischen Parameter einer Prüfsubstanz in der Ratte und im Hund Determination of the pharmacokinetic parameters of a test substance in the rat and dog

Hierzu wurden die Prüfsubstanzen sowohl für die intravenöse als auch für die intragastrale Applikation in gelöster Form appliziert, wobei verträgliche Lösungsvermittler wie PEG400 und/oder Ethanol in verträglicher Menge verwendet wurden. For this purpose, the test substances were administered in dissolved form both for intravenous and for intragastric administration, using compatible solubilizers such as PEG400 and / or ethanol in a tolerated amount.

Intravenöse Applikation: Intravenous application:

Die Prüfsubstanzen wurden bei einer Dosis von 0.1–1 mg/kg appliziert. Die Applikation erfolgte in der männlichen Ratte als bolus Injektion, im weiblichen Hund als Infusion (15 Min). Dabei wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach bolus Injektion bzw, vor und nach der 15-minütiger Infusion ca. 100–150µL Blutproben über einen Katheter aus der Vena jugularis (Ratte) oder aus der vena saphena (Hund) entnommen. Die Blutproben wurden mit Lithium-Heparin als Antikoagulanz versetzt und bis zur weiteren Aufarbeitung gekühlt aufbewahrt. Nach dem Zentrifugieren der Proben für 15min bei 3000Upm wurde ein Aliquot von 100µL dem Überstand (Plasma) entnommen und durch Zugabe von 400µL kaltem ACN oder Methanol (absolut) gefällt. Die gefällten Proben wurden über Nacht bei 20°C ausgefroren, danach wiederum für 15min bei 3000 UpM zentrifugiert, bevor 150µL des klaren Überstandes zur Konzentrationsbestimmung abgenommen wurde. Die Analytik erfolgte durch ein Agilent 1200 HPLC-System mit angeschlossener LCMS/MS Detektion. The test substances were applied at a dose of 0.1-1 mg / kg. The application was in the male rat as a bolus injection, in the female dog as an infusion (15 min). At various times after bolus injection or before and after the 15-minute infusion, about 100-150 μL blood samples were taken via a catheter from the jugular vein (rat) or from the saphenous vein (dog). The blood samples were treated with lithium heparin as an anticoagulant and kept refrigerated until further processing. After centrifuging the samples for 15 min at 3000 rpm, an aliquot of 100 μl was taken from the supernatant (plasma) and precipitated by adding 400 μl cold ACN or methanol (absolute). The precipitated samples were frozen overnight at 20 ° C, then again centrifuged for 15 min at 3000 rpm before 150μL of the clear supernatant was removed for concentration determination. The analysis was carried out by an Agilent 1200 HPLC system with connected LCMS / MS detection.

Berechnung der PK Parameter (via PK Berechnungssoftware, z.B. WinNonLin®): CLplasma: Gesamtplasma-Clearance der Prüfsubstanz (in L·kg/h); CLblood: Gesamtblut-Clearance der Prüfsubstanz (in L·kg/h), wobei (CLblood = CLplasma·Cp/Cb); Vss: Apparentes Verteilungsvolumen im steady state (in L/kg); t1/2: Halbwertszeit innerhalb eines spezifizierten Intervalls (hier: terminale t1/2, in h); AUCnorm: Fläche unter dem Plasmakonzentrationszeitprofil vom Zeitpunkt Null bis zur Unendlichkeit extrapoliert geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg·L/h); AUC(0-tn)norm: Integrierte Fläche unter dem Plasmakonzentrationszeitprofil vom Zeitpunkt Null bis zum letzten Zeitpunkt, zu dem eine Plasmakonzentration messbar war, geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg·L/h); Cmax: Maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma (in µg/L); Cmax, norm: Maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg/L); Cb/Cp: Verhältnis der Blut zu Plasma Konzentrationsverteilung. Calculation of PK parameters (via PK calculation software, eg WinNonLin ® ): CLplasma: total plasma clearance of the test substance (in L · kg / h); CLblood: total blood clearance of the test substance (in L · kg / h), where (CLblood = CLplasma · Cp / Cb); Vss: Apparent volume of distribution at steady state (in L / kg); t1 / 2: half-life within a specified interval (here: terminal t1 / 2, in h); AUCnorm: area under the plasma concentration time profile from time zero to infinity extrapolated divided by the body weight normalized dose (in kg · L / h); AUC (0-tn) norm: integrated area under the plasma concentration time profile from time zero to the last time a plasma concentration was measurable, divided by the body weight normalized dose (in kg · L / h); Cmax: maximum concentration of the test chemical in plasma (in μg / L); Cmax, norm: maximum concentration of test chemical in plasma divided by body weight normalized dose (in kg / L); Cb / Cp: ratio of blood to plasma concentration distribution.

Intragastrale Applikation: Intragastric application:

Die Prüfsubstanzen wurden bei einer Dosis von 0.3–1 mg/kg mittels einer Sonde intragastral als Bolus an nüchterne männliche Ratten oder weibliche Hunde appliziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation wurden ca. 100–150µL Blutproben über einen Katheter aus der Vena jugularis (Ratte) oder aus der Vena saphena (Hund) entnommen. Die Blutproben wurden mit Lithium-Heparin als Antikoagulanz versetzt und bis zur weiteren Aufarbeitung gekühlt aufbewahrt (Kühlschrank). Nach dem Zentrifugieren der Proben für 15min bei 3000Upm wurde ein Aliquot von 100µL dem Überstand (Plasma) entnommen und durch Zugabe von 400µL kaltem ACN oder Methanol (absolut) gefällt. Die gefällten Proben wurden über Nacht bei –20°C ausgefroren, danach für 15min bei 3000UpM zentrifugiert bevor 150µL des klaren Überstandes zur Konzentrationsbestimmung abgenommen wurde. Die Analytik erfolgte durch ein Agilent 1200 HPLC-System mit angeschlossener LCMS/MS Detektion The test substances were intragastrally administered at a dose of 0.3-1 mg / kg intragastrally as a bolus to fasting male rats or female dogs. At various times after administration, approximately 100-150μL of blood samples were collected via a jugular vein catheter (rat) or saphenous vein (dog). The blood samples were treated with lithium heparin as an anticoagulant and kept refrigerated until further processing (refrigerator). After centrifuging the samples for 15 min at 3000 rpm, an aliquot of 100 μl was taken from the supernatant (plasma) and precipitated by adding 400 μl cold ACN or methanol (absolute). The precipitated samples were frozen overnight at -20 ° C, then centrifuged for 15 min at 3000 rpm, before collecting 150 μL of the clear supernatant for concentration determination. The analysis was carried out by an Agilent 1200 HPLC system with connected LCMS / MS detection

Berechnung der PK Parameter (via PK Berechnungssoftware, z.B. WinNonLin®):
AUCnorm: Fläche unter dem Plasmakonzentrationszeitprofil vom Zeitpunkt Null bis zur Unendlichkeit extrapoliert geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg·L/h); AUC(0-tn)norm: Integrierte Fläche unter dem Plasmakonzentrationszeitprofil vom Zeitpunkt Null bis zum letzten Zeitpunkt, zu dem eine Plasmakonzentration messbar war, geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg·L/h); Cmax: Maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma (in µg/L); Cmax, norm: Maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg/L); t1/2: Halbwertszeit innerhalb eines spezifizierten Intervalls (hier: terminale t1/2, in h); Fobs%: beobachtete orale Bioverfügbarkeit, AUC(0-tn)norm nach i.g. Gabe geteilt durch AUC(0-tn)norm nach i.v. Gabe. tmax: Zeitpunkt, zudem die maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma gemessen wird. Calculation of the PK parameters (via PK calculation software, eg WinNonLin ® ):
AUCnorm: area under the plasma concentration time profile from time zero to infinity extrapolated divided by the body weight normalized dose (in kg · L / h); AUC (0-tn) norm: integrated area under the plasma concentration time profile from time zero to the last time a plasma concentration was measurable, divided by the body weight normalized dose (in kg · L / h); Cmax: maximum concentration of the test chemical in plasma (in μg / L); Cmax, norm: maximum concentration of test chemical in plasma divided by body weight normalized dose (in kg / L); t1 / 2: half-life within a specified interval (here: terminal t1 / 2, in h); Fobs%: observed oral bioavailability, AUC (0-tn) norm after ig administration divided by AUC (0-tn) norm after intravenous administration. tmax: Time at which the maximum concentration of the test substance in the plasma is also measured.

Zur Berechnung der relativen Bioverfügbarkeit einer Testsubstanz wird die AUC(0-tn)norm nach i.g. Gabe einer mikrokristallinen Substanz-Suspension geteilt durch die AUC(0-tn)norm nach Gabe einer Substanz-Lösung. To calculate the relative bioavailability of a test substance, the AUC (0-tn) norm is calculated according to i.g. Administration of a microcrystalline substance suspension divided by the AUC (0-tn) norm after administration of a substance solution.

3.7. in-vivo-Wirksamkeit 3.7. in vivo efficacy

Xenograft Modell Xenograft model

Zur Bestimmung der antitumoralen Wirksamkeit im lebenden Organismus wurden Xenograft-Modelle in immunsupprimierten Mäusen verwendet. Xenograft models were used in immunosuppressed mice to determine antitumoral efficacy in the living organism.

Zunächst wurde hierzu die maximal tolerierbare Dosis (MTD) nach folgendem Protokoll ermittelt:
Weibliche Nacktmäuse (NMRI-nude (nu/nu) mice, Taconic M&B A/S) erhielten über einen Zeitraum von 3 Wochen täglich oral eine definierte Dosis der Testsubstanz und wurden täglich bezüglich Sterblichkeit und Körpergewicht beobachtet. Als MTD definiert wurde die höchste verabreichbare Dosis, bei der während der Behandlungsphase kein Tier starb und es nicht zu einem mehr als 10% Abfall des Körpergewichts im Vergleich zum Ausgangsgewicht kam. First, the maximum tolerable dose (MTD) was determined according to the following protocol:
Female nude mice (NMRI-nude (nu / nu) mice, Taconic M & B A / S) received daily orally a defined dose of the test substance over a period of 3 weeks and were daily observed for mortality and body weight. The highest administered dose was defined as the MTD, during which no animal died during the treatment phase and there was no more than 10% decrease in body weight compared to baseline.

Zur Bestimmung der antitumoralen Wirksamkeit wurden dann Xenograftmodelle verwendet, in denen die Testsubstanzen an ihrer MTD oder, falls diese zuvor nicht zu ermitteln war, an der im Standard-Vehikel höchsten formulierbaren Dosis sowie zum Teil auch in niedrigeren Dosierungen gegeben wurden. Es wurde primär ein Prostatakarzinommodell mit hormon-unabhängigen humanen PC-3 Zellen in männlichen Nacktmäusen (NMRI-nude (nu/nu) mice, Taconic M&B A/S) verwendet. Hierfür wurden pro Tier 3 Mio Tumorzellen (suspendiert in Medium + Matrigel) 1:1, final 0,1 ml) in die Flanke subcutan injiziert. Wenn die Tumore 20–30 mm2 Tumorfläche erreicht hatten, wurden die Mäuse in die Therapiegruppen randomisiert und mit der Therapie begonnen. Die Therapie wurde dann unter 2–3-mal wöchentlicher Messung von Tumorfläche und Körpergewicht fortgesetzt, bis die durchschnittliche Tumorgröße in der Kontrollgruppe, die nur den Vehikel der Testsubstanz erhalten hatte, oder in einer der Behandlungsgruppen 130–160 mm2 erreicht hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Versuch in allen Gruppen abgebrochen und die präparierten Tumore gewogen. Als primärer Erfolgsparameter wurde der T/C-Wert kalkuliert anhand des Effektes auf das finale Tumorgewicht errechnet: Mittelwert der Tumorgewichte in der Behandlungsgruppe dividiert durch den Mittelwert der Tumorgewichte in der Vehikelgruppe. To determine the antitumoral efficacy, xenograft models were then used in which the test substances were added to their MTD or, if this had not previously been determined, at the highest formulation that can be formulated in the standard vehicle and, in some cases, also at lower dosages. A prostate carcinoma model with hormone-independent human PC-3 cells in male nude mice (NMRI-nude (nu / nu) mice, Taconic M & B A / S) was used primarily. For this purpose, 3 million tumor cells (suspended in medium + Matrigel) 1: 1, final 0.1 ml) were injected subcutaneously into the flank per animal. When the tumors reached 20-30 mm 2 of tumor area, the mice were randomized into therapy groups and therapy started. Therapy was then continued with 2-3 times weekly tumor area and body weight measurements until the average tumor size in the control group, which had received only the vehicle of the test substance or in one of the treatment groups, reached 130-160 mm 2 . At this time, the experiment was stopped in all groups and the prepared tumors were weighed. As a primary parameter of success, the T / C value was calculated based on the effect on the final tumor weight: mean of the tumor weights in the treatment group divided by the mean of the tumor weights in the vehicle group.

4. Ergebnisse 4. Results

4.1. Enzymassay 4.1. enzyme assay

Die Tabelle 2 fasst die Ergebnisse in Bezug auf die Ausführungs- und Vergleichsbeispiele aus den Enzymassays zusammen. Für die genaue Bestimmung der Selektivität wurden jeweils die Messungen der Inhibition von ACC1 und ACC2 (jeweils IC50-Bestimmungen) paarweise miteinander verglichen, bei denen in beiden Assays Kopien derselben Substanzverdünnungsreihe verwendet wurden. Wenn entweder die die ACC1- oder die ACC2-IC50-Bestimmung aufgrund mangelnder Datenqualität nicht ausgewertet wurde, blieben jeweils beide Messungen unberücksichtigt und wurden nicht in der Tabelle aufgeführt. Die Selektivität der Hemmung von ACC1 gegenüber der Hemmung von ACC2 wurde dann bestimmt als Mittelwert der in den einzelnen Messungen beobachteten Selektivitäten. Tab. 2

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Table 2 summarizes the results with respect to the experimental and comparative examples from the enzyme assays. For accurate determination of selectivity, the measurements of inhibition of ACC1 and ACC2 (IC50 determinations) were compared in pairs using copies of the same series of dilutions in both assays. If either the ACC1 or the ACC2-IC50 determination was not evaluated due to poor data quality, both measurements were left unconsidered and were not listed in the table. The selectivity of the inhibition of ACC1 over the inhibition of ACC2 was then determined as the mean of the selectivities observed in the individual measurements. Tab. 2
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Diese Daten zeigen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen humanes ACC stark inhibieren und eine deutliche Selektivität gegen humanes ACC2 besitzen. Diese Eigenschaft war unbekannt, nicht nahegelegt und nicht ohne unzumutbaren Aufwand auffindbar. These data show that the compounds of the invention strongly inhibit human ACC and have a marked selectivity against human ACC2. This property was unknown, not obvious, and could not be found without undue burden.

4.2 Zell-Assays 4.2 Cell Assays

Die Tabelle 3 fasst die Ergebnisse in Bezug auf die Ausführungs- und Vergleichsbeispiele aus den Cellassays zusammen. Tab.3 Beispiel KM12 IC50 (µmol/L) PC3 IC50 (µmol/L) H460 IC50 (µmol/L) MCF7 IC50 µm/l] 1-1 0.028 0.039 0.131 0.022 1-2 0.058 0.050 0.134 0.030 1-3 0.578 0.476 0.678 0.209 1-4 0.319 0.231 0.481 0.086 1-5 0.668 0.506 0.769 0.205 1-6 0.257 0.158 0.371 0.045 V.1-a 0.245 0.398 0.573 0.030 V.1-b 0.022 V.2-a 0.037 0.038 0.057 0.035 V.2-b 0.041 Table 3 summarizes the results relating to the experimental and comparative examples from the cell assays. Table 3 example KM12 IC50 (μmol / L) PC3 IC50 (μmol / L) H460 IC50 (μmol / L) MCF7 IC50 μm / l] 1-1 0028 0039 0131 0022 1-2 0058 0050 0134 0030 1-3 0578 0476 0678 0209 1-4 0319 0231 0481 0086 1-5 0668 0506 0769 0205 1-6 0257 0158 0371 0045 V.1-a 0245 0398 0573 0030 V.1-b 0022 V.2-a 0037 0038 0057 0035 V.2-b 0041

4.3 ACC1 Expression in Tumor- und Normalgewebe 4.3 ACC1 expression in tumor and normal tissue

Die ACC1 Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe wurde mittels Microarray bestimmt (1). Die Expression von ACC1 war signifikant hochreguliert im Vergleich zum Normalgewebe in Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Bronchialkarzinomen und Pankreaskarzinomen. The expression of ACC1 in tumor and corresponding normal tissue was determined by microarray ( 1 ). The expression of ACC1 was significantly upregulated compared to normal breast cancer, colorectal carcinoma, bronchial carcinoma and pancreatic carcinoma.

4.4 Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (logP/D), Membranaffinität (logMA) und Proteinbindung an humanes Serum Albumin (Kd HSA) 4.4 Octanol-water partition coefficient (logP / D), membrane affinity (logMA) and protein binding to human serum albumin (K d HSA)

Tabelle 4 zeigt die ermittelten logP/D, logMAund Kd HSA-Werte. Table 4 shows the calculated log P / D, K d logMAund shows HSA values.

Die Auswertung der HPLC-Peaks erfolgte über Discovery Quant Analyze. Die Berechnung der Ergebnisse (logMA bzw. Bindungskonstante an HSA Kd) erfolgte über ein von der Firma Sovicell bereitgestelltes Excelworkbook. Tab. 4 Beispiel logP/D pH7.4 logMA Kd HSA [µmol/l] 1-1 1.9 (n = 3) 1.87 (1.7–2, n = 3) 3.04 (2.23–3.64, n = 3) V.1-a 2.55 (2.4–2.7, n = 2) 2.55 (2.4–2.7, n = 2) 1.43 (1.16–1.7, n = 2) V.1-b 2.8 (2.7–2.9, n = 5) 2.55 (2.4–2.9, n = 4) 3.5 (2.52–4.27, n = 4) 1-2 1.73 (1.5–1.9, n = 3) 1.83 (1.7–1.9, n = 3) 3.86 (2.81–5.39, n = 3) V.2-a 2.23 (1.8–2.5, n = 3) 2.38 (2.0–2.7, n = 4) 3.07 (2.38–2.8, n = 3) V.2-b 2.77 (2.7–2.9, n = 4) 2.05 (1.9–2.2, n = 2) 3.22 (2.35–4.1, n = 2) The evaluation of the HPLC peaks was carried out via Discovery Quant Analyze. The calculation of the results (logMA or binding constant on HSA K d ) was carried out using an Excelworkbook provided by Sovicell. Tab. 4 example logP / D pH7.4 log MA K d HSA [μmol / l] 1-1 1.9 (n = 3) 1.87 (1.7-2, n = 3) 3.04 (2.23-3.64, n = 3) V.1-a 2.55 (2.4-2.7, n = 2) 2.55 (2.4-2.7, n = 2) 1.43 (1.16-1.7, n = 2) V.1-b 2.8 (2.7-2.9, n = 5) 2.55 (2.4-2.9, n = 4) 3.5 (2.52-4.27, n = 4) 1-2 1.73 (1.5-1.9, n = 3) 1.83 (1.7-1.9, n = 3) 3.86 (2.81-5.39, n = 3) V.2-a 2.23 (1.8-2.5, n = 3) 2.38 (2.0-2.7, n = 4) 3.07 (2.38-2.8, n = 3) V.2-b 2.77 (2.7-2.9, n = 4) 2.05 (1.9-2.2, n = 2) 3.22 (2.35-4.1, n = 2)

4.5 Plasmaproteinbindung durch Gleichgewichtsdialyse 4.5 Plasma protein binding by equilibrium dialysis

Tabelle 5 zeigt die durch Gleichgewichtsanalyse ermittelte Bindung an Plasmaproteine des Menschen, der Maus und der Ratte. Tab.5 Beispiel fu [%] (human) fu [%] (Maus) fu [%] (Ratte) fu (Maus) / fu (human) 1-1 0.35 (0.33–0.37, n = 3) 1.84 (1.02–2.71, n = 4) 0.27 (0.26–0.28, n = 3) 5 V.1-a 0.05 (n = 1) 1.9 (n = 1) - 39 V.1-b 0.4 (0.40–0.41, n = 2) 7.46 (7.35–7.57, n = 2) 6.12 (5.61–6.64, n = 2) 19 1-2 0.42 (n = 1) 3.49 (2.96–4.02, n = 2) - 8 V.2-a 0.07 (n = 1) 2.41 (n = 1) - 34 V.2-b 0.36 (n = 1) 2.81 (1.29–3.87, n = 6) 0.71 (0.14–2.92, n = 8) 8 Table 5 shows the equilibrium analysis of binding to human, mouse and rat plasma proteins. Tab.5 example fu [%] (human) fu [%] (mouse) fu [%] (rat) fu (mouse) / fu (human) 1-1 0.35 (0.33-0.37, n = 3) 1.84 (1.02-2.71, n = 4) 0.27 (0.26-0.28, n = 3) 5 V.1-a 0.05 (n = 1) 1.9 (n = 1) - 39 V.1-b 0.4 (0.40-0.41, n = 2) 7.46 (7.35-7.57, n = 2) 6.12 (5.61-6.64, n = 2) 19 1-2 0.42 (n = 1) 3.49 (2.96-4.02, n = 2) - 8th V.2-a 0.07 (n = 1) 2.41 (n = 1) - 34 V.2-b 0.36 (n = 1) 2.81 (1.29-3.87, n = 6) 0.71 (0.14-2.92, n = 8) 8th

4.6 Pharmakokinetische Parameter 4.6 Pharmacokinetic parameters

Pharmakokinetische Parameter aus der Ratte. Pharmacokinetic parameters from the rat.

Tabelle 6 zeigt die pharmakokinetischen Parameter aus der Ratte. Tab. 6 Beispiel CLPlasma [L/h/kg] CLBlut [L/h/kg] t ½ [h] Vss [L/kg] F [%] 1-1 0.010 0.022 40 0.55 95 V.1-a - - - - - V.1-b - - - - - 1-2 0.006 0.012 52 0.36 123 V.2-a - - - - - V.2-b - - - - - Table 6 shows the pharmacokinetic parameters from the rat. Tab. 6 example CL Plasma [L / h / kg] CL blood [L / h / kg] t ½ [h] Vss [L / kg] F [%] 1-1 0010 0022 40 12:55 95 V.1-a - - - - - V.1-b - - - - - 1-2 0006 0012 52 12:36 123 V.2-a - - - - - V.2-b - - - - -

4.7 in-vivo-Wirksamkeit 4.7 in vivo efficacy

Maximal tolerierbare Dosis (MTD) in der Maus Maximum tolerable dose (MTD) in the mouse

Das Beispiel 1-1 wurde weiblichen Nacktmäusen (NMRI nu/nu) appliziert: Dosis: s. Tab. 7 Applikationsart: per os Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15(70/5/25, v/v/v) (Solutol HS15: Polyoxyethylenester der 12-Hydroxystearinsäure) Applikationsvolumen: 10ml/kg Schema: s. Tab. 7 Example 1-1 was administered to female nude mice (NMRI nu / nu): Dose: s. Tab. 7 administration: per os Vehicle: PEG400 / ethanol / Solutol HS 15 (70/5/25, v / v / v) (Solutol HS15: polyoxyethylene ester of 12-hydroxystearic acid) Application volume: 10ml / kg scheme: s. Tab. 7

Der Behandlungsphase folgte eine Beobachtungsphase von 21 Tagen. Die dabei aufgetretenen Todesfälle sowie die Wirkung auf das Körpergewicht sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tab. 7 Substanz Dosis (mg/kg) Schema Maximale Körpergewichtsveränderung (%) Todesfälle 1-1 12,5 21 Tage, 1mal täglich plus 11 0 von 4 1-1 25 21 Tage, 1mal täglich plus 12 0 von 4 1-1 50 21 Tage, 1mal täglich plus 6 0 von 4 1-1 75 21 Tage, 1mal täglich plus 8 0 von 4 1-1 100 21 Tage, 1mal täglich plus 14 0 von 4 1-1 50 21 Tage, 2mal täglich plus 11 0 von 4 The treatment phase was followed by a 21-day observation period. The deaths that occurred as well as the effect on body weight are summarized in Table 1. Tab. 7 substance Dose (mg / kg) scheme Maximum body weight change (%) mortality 1-1 12.5 21 days, once a day plus 11 0 of 4 1-1 25 21 days, once a day plus 12 0 of 4 1-1 50 21 days, once a day plus 6 0 of 4 1-1 75 21 days, once a day plus 8 0 of 4 1-1 100 21 days, once a day plus 14 0 of 4 1-1 50 21 days, twice a day plus 11 0 of 4

Demzufolge liegt die MTD für eine 21tägige Behandlung bei 1mal täglicher Gabe oberhalb von 100 mg/kg. Demzufolge liegt die MTD für eine 21tägige Behandlung bei 2mal täglicher Gabe oberhalb von 50 mg/kg. As a result, the MTD is above 100 mg / kg for a 21-day course of treatment once daily. As a result, the MTD is above 50 mg / kg for a 21-day treatment twice daily.

In vivo Wirksamkeit im PC3-Xenograft-Modell in der Maus In vivo efficacy in the mouse PC3 xenograft model

Das Beispiel 1-1 wurde nachfolgend im PC-3 Prostatakarzinom-Xenograft-Modell männlichen Nacktmäusen (NMRI nu/nu) appliziert: Dosis: s. Tab. 8 Applikationsart: per os Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15 (70/5/25, v/v/v) Applikationsvolumen: 10ml/kg Schema: s. Tab. 8 Anzahl der Mäuse: 9 Tab. 8 Substanz Dosis (mg/kg) Schema T/C Maximale Körpergewichts veränderung (%) Todesfälle 1-1 40 17 Tage, 2mal täglich 0,26 minus 2 0 von 9 1-1 80 Tag 1–3 70 ab Tag 4 17 Tage, 2mal täglich 0,26 minus 7 0 von 9 Example 1-1 was subsequently applied in the PC-3 prostate carcinoma xenograft model male nude mice (NMRI nu / nu): Dose: s. Tab. 8 administration: per os Vehicle: PEG400 / ethanol / Solutol HS 15 (70/5/25, v / v / v) Application volume: 10ml / kg scheme: s. Tab. 8 Number of mice: 9 Tab. 8 substance Dose (mg / kg) scheme T / C Maximum body weight change (%) mortality 1-1 40 17 days, twice a day 0.26 minus 2 0 out of 9 1-1 80 days 1-3 70 from day 4 17 days, twice a day 0.26 minus 7 0 out of 9

Therapeutische Wirksamkeit wurde definiert als T/C-Wert von ⇐ 0,50. Gute Verträglichkeit wurde definiert als maximale Körpergewichtsveränderung von ⇐ minus 10% und 100% Überleben der Versuchstiere. Da es nach Applikation von 80 mg/kg und 2mal täglicher Gabe nach 3 Tagen in individuellen Tieren zu einem Körpergewichtsverlust von mehr als 10% kam, wurde die Dosis ab Tag 4 auf 70 mg/kg und 2mal tägliche Gabe reduziert. Demzufolge zeigte sich bei 40 mg/kg und 2mal täglicher Gabe therapeutische Wirksamkeit und gute Verträglichkeit. Demzufolge zeigte sich bei 80 mg/kg für die ersten 3 Tage gefolgt von 70 mg/kg (jeweils 2mal täglicher Gabe) therapeutische Wirksamkeit und gute Verträglichkeit. Therapeutic efficacy was defined as the T / C value of ⇐ 0.50. Good tolerability was defined as maximum body weight change of ⇐ minus 10% and 100% survival of the experimental animals. Since a body weight loss of more than 10% occurred in individual animals after application of 80 mg / kg and 2 times daily administration after 3 days, the dose was reduced from day 4 to 70 mg / kg and twice daily dosing. Consequently, at 40 mg / kg and twice daily therapeutic efficacy and good tolerability. As a result, at 80 mg / kg for the first 3 days followed by 70 mg / kg (given twice daily), therapeutic efficacy and good tolerability were found.

Vorhersage humaner pharmakokinetischer Parameter und humaner therapeutischer Dosis Prediction of human pharmacokinetic parameters and human therapeutic dose

Die Vorhersage der humanen pharmakokinetischen (PK) Parameter (Tabelle 9) erfolgte auf Basis der in vivo PK Parameter, die für die Ratte erhoben wurden (single species scaling) unter Berücksichtigung von Spezies-Unterschieden in der freien Fraktion (fu) im Plasma. Die wirksame AUC (area under curve) wurde basierend auf dem gemessenen Plasma Konzentrationszeitprofil bei in vivo Wirksamkeit im PC3-Tumormodell der Maus (nu/nu Maus) bestimmt. Die Ermittlung der therapeutischen Humandosis erfolgte mittels vorhergesagter humaner Clearance (CL), der Annahme einer 100%igen Bioverfügbarkeit (F = 1) und der wirksamen AUC im Tiermodell nach folgender Formel:

Figure 00610001
Tab. 9 Beispiel Dosis (Maus) [mg/kg] ther. AUC (Maus) [mg·h/L] fu (Maus/ human) ber. AUC (human) [mg·h/L] vorh. CL (human) [L/h/kg] vorh. Dosis (human) [mg/kg] vorh. Dosis (human) [mg/Patient] 1-1 40 [2 × tägl] 80 [2 × tägl] 376 6085 4 1882 3041 0.003 5.6 9.1 395 639 V.1-a - - - - - - - V.1-b - - - - - - - 1-2 - - - - - - - V.2-a - - - - - - - V.2-b - - - - - - - ther. = therapeutisch
ber. = berechnet
vorh. = vorhergesagt (fu-korrigiert) The prediction of the human pharmacokinetic (PK) parameters (Table 9) was based on the in vivo PK parameters, which were collected for the rat (single species scaling), taking into account species differences in the free fraction (fu) in the plasma. The effective area-of-area (AUC) was determined based on the measured plasma concentration time profile for in vivo efficacy in the mouse PC3 tumor model (nu / nu mouse). The therapeutic human dose was determined by predicted human clearance (CL), assuming 100% bioavailability (F = 1) and the effective AUC in the animal model according to the following formula:
Figure 00610001
Tab. 9 example Dose (mouse) [mg / kg] ther. AUC (mouse) [mg.h / L] fu (mouse / human) About AUC (human) [mg.h / L] existing CL (human) [L / h / kg] previous dose (human) [mg / kg] previous dose (human) [mg / patient] 1-1 40 [2 × daily] 80 [2 × daily] 376 6085 4 1882 3041 0003 5.6 9.1 395 639 V.1-a - - - - - - - V.1-b - - - - - - - 1-2 - - - - - - - V.2-a - - - - - - - V.2-b - - - - - - - ther. = therapeutic
calculated = calculated
prev. = predicted (fu-corrected)

Figuren: Characters:

1: ACC1 Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe 1 : ACC1 expression in tumor and corresponding normal tissue

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Claims (15)

Verbindung gemäß Formel (I)
Figure 00630001
wobei R1 für eine Methylgruppe oder ein Chloratom und R2 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und R3 für ein Wasserstoff- oder ein Fluoratom und R4 für ein Chlor- oder Fluoratom stehen, sowie deren Salze Compound according to formula (I)
Figure 00630001
wherein R 1 is a methyl group or a chlorine atom and R 2 is a hydrogen atom or a methyl group and R 3 is a hydrogen or a fluorine atom and R 4 is a chlorine or fluorine atom, and their salts Verbindungen – 3-(3',4'-Difluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on, – 3-(4'-Chlor-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on, – 3-(4,4'-Dichlorbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on, – 8,8-Difluor-3-(4'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on, – 3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on, – 3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-8,8-difluor-4-hydroxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on, links 3- (3 ', 4'-difluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one, 3- (4'-chloro-2,4-dimethylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one, 3- (4,4'-dichlorobiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one, 8,8-Difluoro-3- (4'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one, 3- (4'-chloro-4-methyl-biphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one, 3- (4'-chloro-3'-fluoro-4-methylbiphenyl-3-yl) -8,8-difluoro-4-hydroxy-1-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one, Verbindung gemäß Formel (I)
Figure 00630002
wobei R1 für eine Methylgruppe oder ein Chloratom und R2 für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und R3 für ein Wasserstoff- oder ein Fluoratom und R4 für ein Chlor- oder Fluoratom stehen, sowie deren Salze zur Verwendung als Arzneimittel. Compound according to formula (I)
Figure 00630002
wherein R 1 is a methyl group or a chlorine atom and R 2 is a hydrogen atom or a methyl group and R 3 is a hydrogen or a fluorine atom and R 4 is a chlorine or fluorine atom, and their salts for use as a medicament. Verbindung gemäß Anspruch 3 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. A compound according to claim 3 for the prophylaxis and / or therapy of tumor diseases. Verbindung gemäß Anspruch 4 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. A compound according to claim 4 for the prophylaxis and / or therapy of breast cancers, in particular hormone receptor-positive breast carcinomas, colorectal carcinomas, prostate carcinomas, in particular androgen receptor-negative prostate carcinomas or non-small cell bronchial carcinomas. Verbindung gemäß Anspruch 5 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen oder Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen. A compound according to claim 5 for the prophylaxis and / or therapy of hormone receptor-positive breast carcinomas or androgen receptor-negative prostate carcinomas. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Use of a compound of the formula (I) according to Claim 1 for the preparation of a medicament for the prophylaxis and / or therapy of tumor diseases. Verwendung gemäß Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. Use according to claim 7 for the manufacture of a medicament for the prophylaxis and / or therapy of breast, colorectal, prostate or non-small cell bronchial carcinoma. Verwendung gemäß Anspruch 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder Therapie von Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen oder Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen. Use according to claim 8 for the manufacture of a medicament for the prophylaxis and / or therapy of hormone receptor-positive breast carcinomas or androgen receptor-negative prostate carcinomas. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen des Menschen oder eines anderen Säugetiers. Use of a compound of the formula (I) according to Claim 1 for the prophylaxis and / or therapy of diseases of humans or of another mammal. Verwendung gemäß Anspruch 10 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Use according to claim 10 for the prophylaxis and / or therapy of tumor diseases. Verwendung gemäß Anspruch 11 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. Use according to claim 11 for the prophylaxis and / or therapy of breast, colorectal, prostate or non-small cell lung carcinoma. Verwendung gemäß Anspruch 12 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen oder Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen. Use according to claim 12 for the prophylaxis and / or therapy of hormone receptor-positive breast carcinomas or androgen receptor-negative prostate carcinomas. Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 in Kombination mit einem weiteren Wirkstoff. Compound of formula (I) according to claim 1 in combination with another active ingredient. Pharmazeutische Formulierung enthaltend eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1. Pharmaceutical formulation containing a compound of formula (I) according to claim 1.
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