DE102011078342A1 - Rehybridizing probe system for the qualitative and quantitative measurement of specific nucleic acids in real time - Google Patents

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Abstract

Das Verfahren zur RealTime- bzw. Endpunkt- Bestimmung von Nukleinsäuren erfolgt mittels rehybridisiest charakterisiert durch eine Möglichkeit, einen homogenen und automatisierbaren Hochdurchsatz-Nukleinsäurenachweis zu ermöglichen. Durch das rehybridisierende Sondensystem wird auch ein Multiplex-Nachweis ermöglicht. In einer besonders effizienten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für eine qualitative oder quantitative Echtzeitmessung von spezifischen Targetnukleinsäuren zwei Sonden eingesetzt. Dadurch kann eine deutliche Verstärkung der Nachweissensitivität und Signalstärke erzeugt werden sowie eine Targetdifferenzierung erreicht werden.The procedure for real-time or endpoint determination of nucleic acids is carried out by rehybridisiest characterized by a way to enable a homogeneous and automatable high-throughput nucleic acid detection. The rehybridizing probe system also enables multiplex detection. In a particularly efficient embodiment of the present invention, two probes are used for a qualitative or quantitative real-time measurement of specific target nucleic acids. As a result, a significant increase in the detection sensitivity and signal strength can be generated and a target differentiation can be achieved.

Description

Das neuartige rehybridisierende Sondensystem dient dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit und damit der molekularen Diagnostik. Das neuartige Sondensystem ist charakterisiert durch eine Möglichkeit, einen homogenen und automatisierbaren Hochdurchsatz-Nukleinsäurenachweis zu ermöglichen. Durch das rehybridisierende Sondensystem wird auch ein Multiplex-Nachweis ermöglicht.The novel rehybridizing probe system is used for the qualitative and quantitative detection of nucleic acid sequences in real time and thus for molecular diagnostics. The novel probe system is characterized by a possibility to enable a homogeneous and automatable high-throughput nucleic acid detection. The rehybridizing probe system also enables multiplex detection.

In einer besonders effizienten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für eine qualitative oder quantitative Echtzeitmessung von spezifischen Targetnukleinsäuren zwei Sonden eingesetzt. Dadurch kann eine deutliche Verstärkung der Nachweissensitivität und Signalstärke erzeugt werden sowie eine Targetdifferenzierung erreicht werden.In a particularly efficient embodiment of the present invention, two probes are used for a qualitative or quantitative real-time measurement of specific target nucleic acids. As a result, a significant increase in the detection sensitivity and signal strength can be generated and a target differentiation can be achieved.

Stand der TechnikState of the art

Die Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik oder der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.Genetic diagnostics has become an indispensable part of modern medical laboratory diagnostics, forensic diagnostics, veterinary laboratory diagnostics or food and environmental diagnostics.

Revolutioniert wurde die genetische Diagnostik mit der Erfindung der PCR-Technologie, die es gestattet, jede beliebige Nukleinsäuresequenz spezifisch zu vervielfachen.Genetic diagnostics has been revolutionized with the invention of PCR technology, which makes it possible to specifically multiply any nucleic acid sequence.

Diese Technologie besitzt aber neben ihren eindeutigen Vorteilen (wie Sensitivität, Spezifität) auch ihre Nachteile. Für die Durchführung der Amplifikationsreaktion werden teure Geräte benötigt, die den schnellen Temperaturwechsel gewährleisten können; die Ergebnisse der Amplifizierung bzw. die mit der Amplifizierung gekoppelte Sondenhybridisierung müssen ebenfalls mittels teurer und aufwendig zu bedienender Labortechnik ausgewertet werden. Hierbei ist eine „einfache” Visualisierung mittels Gelelektrophorese manchmal wegen ihrer Ungenauigkeit unzureichend.However, apart from its clear advantages (such as sensitivity, specificity), this technology also has its disadvantages. To carry out the amplification reaction expensive equipment is needed, which can ensure the rapid change in temperature; the results of the amplification or the probe hybridization coupled with the amplification must also be evaluated by means of expensive and expensive laboratory technology. Here, a "simple" visualization by gel electrophoresis is sometimes insufficient because of its inaccuracy.

Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist z. B. die Light Cycler Technologie (Fa. Roche). Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle Hybridisierungssonden, bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3'-Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5'-Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA-Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog. FRET-Effekt kommen kann. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind und sich in räumlicher Nähe befinden. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionssystems äußerst hoch.A widely used method for the detection of specific nucleic acids is z. B. the Light Cycler technology (Roche). The Roche company developed special hybridization probes consisting of two different oligonucleotides, each labeled with only one fluorochrome. At the 3 'end of one probe is the acceptor, the other oligonucleotide is provided at the 5' end with a donor. The probes are chosen so that they both bind to the same DNA strand, the distance between the acceptor and donor may only be a maximum of 1 to 5 nucleotides, so that it can come to the so-called. FRET effect. The measurement of the fluorescence takes place during the annealing step, whereby only light of this wavelength is detectable, as long as both probes are bound to the DNA and are in close proximity. The melting point of both probes should be identical in this system. By using two hybridizing probes in addition to the primers used, the specificity of this detection system is extremely high.

Eine weitere Real-Time-PCR-Anwendung zum Nachweis spezifischer Nukleinsäure-Targets kann mit sog. Double Dye Sonden, welche in der Patentschrift US 5210015 und US 5487972 offenbart sind (TaqMan-Sonden), durchgeführt werden. Double Dye Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5'-Ende, der Quencherfarbstoff am 3'-Ende. Zusätzlich befindet sich am 3'-Ende der Sonde eventuell noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstärke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched”, d. h. gelöscht. Dieser FRET-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5'-3' Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5'-3' Exonukleaseaktivität (Taq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TaqMan-Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.Another real-time PCR application for the detection of specific nucleic acid targets can with so-called. Double Dye probes, which in the patent US 5210015 and US 5487972 disclosed (TaqMan probes). Double Dye Probes carry two fluorochromes on a probe. The reporter dye is here at the 5 'end, the quencher dye at the 3' end. In addition, there may still be a phosphate group at the 3 'end of the probe, so that the probe can not function as a primer during elongation. As long as the probe is intact, the intensity of light released is small, since almost all of the light energy produced by the reporter's excitation is absorbed and transformed by the quencher due to its proximity. The emitted light of the reporter dye is "quenched", ie erased. This FRET effect is also retained after the probe has bound to the complementary DNA strand. During the elongation phase, the polymerase hits the probe and hydrolyzes it. The ability of the polymerase to hydrolyze an oligonucleotide (or probe) during strand synthesis is referred to as 5'-3 'exonuclease activity. Not all polymerases have 5'-3 'exonuclease activity (Taq and Tth polymerase). First, this principle has been described for the Taq polymerase. The principle is called the TaqMan principle. After probe hydrolysis, the reporter dye is no longer in close proximity to the quencher. The emitted fluorescence is no longer transformed, this increase in fluorescence is measured.

Eine weitere Möglichkeit zum spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels Real-Time-PCR-Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR GreenTM u. ä.). Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifikationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog. Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR-Reaktion.Another possibility for the specific detection of amplification products by means of real-time PCR technology is the use of intercalating dyes (ethidium bromide, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 or SYBR Green TM u. ä.). However, a clear differentiation between specific amplification event or artifact is absolutely necessary. To achieve this, one uses a so-called melting point analysis at the end of the actual PCR reaction.

Mittels Real-Time-PCR-Anwendungen ist es darüber hinaus auch möglich, eine Quantifizierung der nachzuweisenden Targets durchzuführen.By means of real-time PCR applications, it is also possible to carry out a quantification of the targets to be detected.

Wie schon aufgeführt, ist die Nutzung des sog. TaqMan-Assays Stand der Technik. Dieses elegante Verfahren der Echtzeit-Messung von Targetnukleinsäuren wird weltweit für die qualitative und quantitative molekulare Diagnostik eingesetzt.As already mentioned, the use of the so-called TaqMan assay is state of the art. This elegant method of real-time measurement of target nucleic acids is used worldwide for qualitative and quantitative molecular diagnostics.

Anwendungslimitierend sind die für diese Nachweistechnologie bestehenden Schutzrechte. Dadurch ist die Anwendung extrem teuer und kann so z. B. in Entwicklungs- und Schwellenländern oftmals nicht genutzt werden. Ziel der Erfindung war es deshalb, ein alternatives System zu finden, welches ebenfalls die Durchführung eines homogenen Assays erlaubt und dieselben Anwendungsfelder bedienen kann.Application-limiting are the existing protective rights for this detection technology. As a result, the application is extremely expensive and can be such. B. in developing and emerging countries often not used. The aim of the invention was therefore to find an alternative system, which also allows the implementation of a homogeneous assay and can serve the same fields of application.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Lösungen zu beseitigen bzw. alternative Lösungen bereitzustellen.The invention had the object of eliminating the disadvantages of the solutions described in the prior art or to provide alternative solutions.

Lösung der AufgabeSolution of the task

Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.The problem has been solved according to the features of the claims.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Nachweissystem, was eine komplette Alternative zu den bestehenden Real-Time-PCR-Nachweistechnologien darstellt.The present invention describes a detection system, which is a complete alternative to existing real-time PCR detection technologies.

Dabei handelt es sich um ein rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von Nukleinsäuren in Echtzeit.It is a rehybridizing probe system for the qualitative and quantitative measurement of nucleic acids in real time.

Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem stellt ein oder mehrere Paare von einander jeweils zugeordneten Oligonukleotiden dar. Die Oligonukleotide des jeweiligen Paares sind partiell oder vollständig komplementär. Ein Oligonukleotid des Paares besitzt darüber hinaus eine Komplementarität zur Target-Nukleinsäure. Dabei ist die Hybridisierungstemperatur einer der Sonden zur Targetnukleinsäure höher als die Hybridisierungstemperatur zwischen den Sonden des jeweiligen Paares. Dabei ist eine Sonde mit einem Reporterfarbstoff (im allgemeinen Sinne) und die andere Sonde des jeweiligen Paares mit entsprechendem Quencherfarbstoff markiert.The rehybridizing probe system according to the invention represents one or more pairs of mutually associated oligonucleotides. The oligonucleotides of the respective pair are partially or completely complementary. An oligonucleotide of the pair also has a complementarity to the target nucleic acid. In this case, the hybridization temperature of one of the probes to the target nucleic acid is higher than the hybridization temperature between the probes of the respective pair. One probe is labeled with a reporter dye (in the general sense) and the other probe of the respective pair is labeled with a corresponding quencher dye.

Eine Amplifikationsreaktion mit dem rehybridisierenden Sondensystem ist in 1 dargestellt.An amplification reaction with the rehybridizing probe system is in 1 shown.

Am Anfang der PCR sind die jeweiligen Oligonukleotidpaare miteinander hybridisiert und die Fluoreszenz der Probe in Folge eines FRET-Effekts gequencht. Nachfolgend werden die Doppelhelixbindungen bei 95°C denaturiert. Nach der Abkühlung der Reaktion auf die Hybridisierungstemperatur 1 (Anealing, HT1) wird die Targetnukleinsäure mithilfe der im Reaktionsansatz enthaltenen Primer amplifiziert. Gleichzeitig bindet auch die zu der Targetsequenz komplementäre Sonde, die während der Vervielfältigungsreaktion der Targetnukleinsäure von der 5'-3' Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase zerstört wird. Anschließend wird der PCR-Mix auf die Hybridisierungstemperatur des jeweiligen Sondenpaares (Reanealing, HT2) abgekühlt. Die freien Sonden rehybridisieren und die Fluoreszenz der nach der Reaktion übrig gebliebenen Sonde wird gequencht. Die von der Taq-Polymerase zerstörten Sonden können aber nicht rehybridisieren, wobei die Quenchung verhindert wird. Diese Freisetzung der Fluoreszenz liegt überraschenderweise in der direkten Proportionalität zu dem Amplifikationsgeschehen und liefert daher auch eine quantitative Information über das Vorhandensein der Targetnukleinsäure.At the beginning of the PCR, the respective oligonucleotide pairs are hybridized with each other and the fluorescence of the sample is quenched as a result of a FRET effect. Subsequently, the double helix bonds are denatured at 95 ° C. After the reaction has cooled to hybridization temperature 1 (annealing, HT1), the target nucleic acid is amplified using the primers contained in the reaction mixture. At the same time, the complementary to the target sequence probe, which is destroyed during the amplification reaction of the target nucleic acid from the 5'-3 'exonuclease activity of the Taq polymerase also binds. Subsequently, the PCR mix is cooled to the hybridization temperature of the respective probe pair (Reanealing, HT2). The free probes rehybridize and the fluorescence of the probe left over after the reaction is quenched. However, the probes destroyed by the Taq polymerase can not rehybridize, preventing quenching. This release of fluorescence is surprisingly in direct proportionality to the amplification event and therefore also provides quantitative information about the presence of the target nucleic acid.

Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem offenbart in einer weiteren speziellen Ausführungsform überraschenderweise einen zusätzlichen und erheblichen Vorteil. So führt die Verwendung von zwei Sonden in einem Reaktionsansatz zu einer viel höheren diagnostischen Sensitivität. Dabei bindet eine erste Sonde an den „Plus-Strang” und eine zweite Sonde an den „Minus-Strang” der Targetnukleinsäure. Wenn beide Sonden mit demselben Farbstoff markiert sind, führt diese Ausführungsform zu einer deutlich höheren Fluoreszenz sowie zu früheren CT-Werten bei der Echtzeit-Messung. Diese Beobachtung ist im Ausführungsbeispiel dargestellt. Damit kann eine viel höhere diagnostische Sensitivität erreicht werden, als z. B. mit einem System, welches eine dem Stand der Technik entsprechende TaqMan-Sonde zur quantitativen Echtzeitmessung benutzt. Die erfindungsgemäße Verwendung von zwei Sonden offenbart überraschenderweise noch einen weiteren wesentlichen Vorteil. Über die Nutzung einer zweiten Sonde wird es möglich, einen zweiten Detektionssequenzbereich in die Nachweisreaktion einzuführen. Dies ist gerade dann bedeutsam, wenn spezifische Zielsequenzen durch Mutationen häufig variieren. Mit einer zweiten Sonde kann somit ein größerer Sequenzbereich spezifisch für die Nachweisreaktion abgedeckt werden. In einem solchen Fall kann die zweite Sonde dann z. B. auch mit einem anderen Farbstoff markiert sein als die erste Sonde. Damit können dann beide Sonden unabhängig voneinander gemessen und detektiert werden. Die Platzierung von mehreren Sonden kann auch ggf. auf dem gleichen Strang der Zielnukleinsäure erfolgen.Surprisingly, in a further specific embodiment, the rehybridizing probe system according to the invention surprisingly discloses an additional and considerable advantage. Thus, the use of two probes in a reaction approach results in much higher diagnostic sensitivity. Here, a first probe binds to the "plus strand" and a second probe to the "minus strand" of the target nucleic acid. When both probes are labeled with the same dye, this embodiment results in significantly higher fluorescence as well as earlier C T values in the real-time measurement. This observation is in the Embodiment shown. Thus, a much higher diagnostic sensitivity can be achieved than z. Example, with a system which uses a TaqMan probe according to the prior art for the quantitative real-time measurement. Surprisingly, the use of two probes according to the invention discloses yet another significant advantage. By using a second probe, it becomes possible to introduce a second detection sequence region into the detection reaction. This is especially important when specific target sequences often vary due to mutations. With a second probe, a larger sequence range can thus be covered specifically for the detection reaction. In such a case, the second probe then z. B. also be labeled with a different dye than the first probe. This allows both probes to be measured and detected independently of each other. The placement of multiple probes may also be done on the same strand of the target nucleic acid.

Mit dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren steht somit ein alternatives Verfahren zur qualitativen und quantitativen Echtzeitmessung von Nukleinsäuren zur Verfügung, welches gegenüber dem Stand der Technik eingesetzter Verfahren sogar noch deutliche Vorteile aufzeigt. Darüber hinaus handelt es sich auch um ein homogenes Assay-Format, welches universell einsetzbar ist und auch mit allen eingesetzten Geräten zur Echtzeitmessung von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann.The present inventive method thus provides an alternative method for the qualitative and quantitative real-time measurement of nucleic acids, which even shows significant advantages over methods used in the prior art. In addition, it is also a homogeneous assay format, which is universally applicable and can be performed with all devices used for real-time measurement of nucleic acids.

Das erfindungsgemäße Verfahren und Testkit eignen sich bestens für einen Salmonellen-TestThe method and test kit according to the invention are ideally suited for a Salmonella test

Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem stellt ein oder mehrere Paare von einander jeweils zugeordneten Oligonukleotiden dar. Die Oligonukleotide des jeweiligen Paares sind partiell oder vollständig komplementär. Ein Oligonukleotid des Paares besitzt darüber hinaus eine Komplementarität zur Target-Nukleinsäure. Dabei ist die Hybridisierungstemperatur einer der Sonden zur Targetnukleinsäure höher als die Hybridisierungstemperatur zwischen den Sonden des jeweiligen Paares. Dabei ist eine Sonde mit einem Reporterfarbstoff (im allgemeinen Sinne) und die andere Sonde des jeweiligen Paares mit entsprechendem Quencherfarbstoff markiert.The rehybridizing probe system according to the invention represents one or more pairs of mutually associated oligonucleotides. The oligonucleotides of the respective pair are partially or completely complementary. An oligonucleotide of the pair also has a complementarity to the target nucleic acid. In this case, the hybridization temperature of one of the probes to the target nucleic acid is higher than the hybridization temperature between the probes of the respective pair. One probe is labeled with a reporter dye (in the general sense) and the other probe of the respective pair is labeled with a corresponding quencher dye.

Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Schrittes der Rehybridisierung (im Gegensatz dafür wird bei Taqman während des Annealing Schrittes/Extension gemessen).The fluorescence is measured during the rehybridization step (in contrast, Taqman is measured during the annealing step / extension).

Die Sondenmarkierung mit sämtlichen dafür geeigneten Farbstoffen (Reporter/Quencher Systeme), sowie Umkehrung der Farbstoffe sind auch möglich.Probe labeling with all suitable dyes (Reporter / Quencher systems), as well as reversal of the dyes are also possible.

Die Sonde die an das Target bindet, sollte modifiziert sein, damit keine Verlängerung erfolgt (z. B. Phosphorylierung, etc.).The probe that binds to the target should be modified so that it does not elongate (eg, phosphorylation, etc.).

Die andere Sonde soll vorzugsweise kürzer sein, als Sonde fürs Target oder eine nichtkomplementäre Sequenz zur Targetsonde besitzen.The other probe should preferably be shorter than having probe for the target or a non-complementary sequence to the target probe.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Doppelsondensystem mit gleicher Markierung zur Steigerung der Sensitivität verwendet.According to a preferred embodiment of the invention, a double probe system with the same mark is used to increase the sensitivity.

Es ist auch möglich, ein Doppelsondensystem mit unterschiedlicher Markierung zur zusätzlichen Targetdiskriminierung zu verwenden.It is also possible to use a dual probe system with different markings for additional target discrimination.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen dargestellt. Dabei stellen die Ausführungsbeispiele keine Limitierung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.The invention will be illustrated below with reference to exemplary embodiments. The embodiments do not represent a limitation of the method according to the invention.

Ausführungsbeispiel 1:Embodiment 1

Testung der Hybridisierung, Denaturierung und Rehybridisierung der Sondenpaare.Testing of hybridization, denaturation and rehybridization of probe pairs.

Dieser Versuch belegt, dass die Sondenpaare (Reporter/Quencher) FAM/BHQ1 und ROX/BHQ2 die Fluoreszenz der Probe in der Abhängigkeit von der Temperatur verändern. Dieses Experiment beweist darüber hinaus, dass es sich nicht um die herkömmlichen „TaqMan”-Sonden handelt ( FAM/BHQ1; ROX/BHQ2). Alle Messungen wurden auf dem Real-Time-PCR-Gerät (QTower; Analytik Jena AG) durchgeführt.This experiment proves that the probe pairs (reporter / quencher) FAM / BHQ1 and ROX / BHQ2 change the fluorescence of the sample as a function of the temperature. This experiment also proves that they are not the traditional "TaqMan" probes ( FAM / BHQ1; ROX / BHQ2). All measurements were carried out on the real-time PCR apparatus (QTower, Analytik Jena AG).

Es wurden folgende Ansätze getestet:The following approaches were tested:

Ansatz A: Approach A:

15 μl-PCR-Ansatz mit 2 FAM bzw. BHQ1 markierten Sondenpaaren. Jede FAM-markierte Sonde wurde in einer Konzentration von 0,15 pmol/μl des PCR-Ansatzes der Reaktion zugefügt. ( ; 1-6) Sondenpaar 1:

Figure 00060001
Sondenpaar 2:
Figure 00060002
15 μl PCR assay with 2 FAM or BHQ1 labeled probe pairs. Each FAM-labeled probe was added to the reaction at a concentration of 0.15 pmol / μl of the PCR assay. ( ; 1-6) probe pair 1:
Figure 00060001
Probe pair 2:
Figure 00060002

Ansatz BApproach B

15 μl PCR-Ansatz mit einer FAM/BHQ-markierten TaqMan-Sonde der gleichen Sequenz wie die Sonde 1A in der Konzentration 0,3 pmol/μl des PCR-Ansatzes (2a; 7-9).

Figure 00070001
15 μl PCR batch with a FAM / BHQ-labeled TaqMan probe of the same sequence as probe 1A in the concentration 0.3 pmol / μl of the PCR mixture ( 2a ; 7-9).
Figure 00070001

Bei der Erhöhung der Cycler-Temperatur bis 95°C wurde bei den PCR-Proben mit der FAM/BHQ1-markierten Sonde kein relevanter Anstieg der Fluoreszenz beobachtet. Die geringe Fluoreszenzerhöhung dieser Sonde ist durch die „Streckung” der Sonde zu erklären. Ein solcher „Fluoreszenzanstieg” wird z. B. bei der Patentschrift EP 0 826 066 B1 als Messgröße verwendet. Bei dem erfindungsgemäßen rehybridisierenden Sondensystem zeigt sich ein anderes Temperaturverlaufsbild:

  • – Bei einer Temperatur von 40°C (dies ist die Hybridisierungstemperatur des jeweiligen Sondenpaares) ist die Fluoreszenz niedrig.
  • – Bei einer Erhöhung der Temperatur auf 95°C denaturiert die Wasserstoffbindung zwischen den beiden Sonden des Paars, FAM und BHQ1 verlieren ihre räumliche Nähe und die Fluoreszenz der Probe steigt um das drei- bis vierfache an.
  • – Dieser Prozess scheint auch reversibel zu sein. Eine Temeraturverringerung auf die Hybridisierungstemperatur des Sondenpaars führt zur Rehybridisierung der Sonden. Dieser Prozess bewirkt dann ein erneutes deutliches Absinken der Probenfluoreszenz.
When increasing the cycler temperature to 95 ° C, no significant increase in fluorescence was observed in the PCR samples with the FAM / BHQ1-labeled probe. The low fluorescence increase of this probe can be explained by the "extension" of the probe. Such a "fluorescence increase" is z. B. in the patent EP 0 826 066 B1 used as a measured variable. The rehybridizing probe system according to the invention shows another temperature profile image:
  • - At a temperature of 40 ° C (this is the hybridization temperature of each pair of probes), the fluorescence is low.
  • - Increasing the temperature to 95 ° C denatures hydrogen bonding between the two probes of the pair, FAM and BHQ1 lose their spatial proximity and the fluorescence of the sample increases three to four times.
  • - This process also seems to be reversible. Temerature reduction to the hybridization temperature of the probe pair leads to rehybridization of the probes. This process then causes a further significant decrease in sample fluorescence.

Ansatz 3Approach 3

15 μl-PCR-Ansatz mit jeweils nur einem ROX bzw. BHQ2 markierten Sondenpaar. Die ROX-markierte Sonde wurde in einer Konzentration von 0,15 pmol/μl des PCR-Ansatzes der Reaktion zugefügt. (2b 1-3 nd 4-6) Sondenpaar 1:

Figure 00070002
Sondenpaar 2:
Figure 00070003
15 μl PCR assay with only one ROX or BHQ2 labeled probe pair. The ROX-labeled probe was added to the reaction at a concentration of 0.15 pmol / μl of the PCR assay. ( 2 B 1-3 nd 4-6) probe pair 1:
Figure 00070002
Probe pair 2:
Figure 00070003

Figure 00080001
Figure 00080001

Ansatz 4 Approach 4

15 μl-PCR-Ansatz mit zwei ROX bzw. BHQ2 markierten Sondenpaaren (wie bei Punkt 3 beschrieben (7-9).15 μl PCR assay with two ROX or BHQ2 labeled probe pairs (as described in point 3 (7-9).

Bei diesem Ansatz konnte man gleichfalls eine Denaturierung und Rehybridisierung der ROX-BHQ2-Sondenpaare während der Temperaturveränderung beobachten. Dies eröffnet eine Möglichkeit für den multiplexen Nachweis der Proben. Darüber hinaus sieht man, dass die Anwendung von zwei Sondenpaaren zu einer deutlichen Signalverstärkung führt. Dies ermöglicht die Steigerung der diagnostischen Sensitivität.In this approach, one could also observe a denaturation and rehybridization of the ROX-BHQ2 probe pairs during the temperature change. This opens up a possibility for the multiplex detection of the samples. In addition, it can be seen that the use of two pairs of probes leads to a significant signal amplification. This allows the increase in diagnostic sensitivity.

Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2

Relative Quantifizierung einer unbekannten Probe mittels des erfindungsgemäßen rehybridisierenden Sondensystem.Relative quantification of an unknown sample by means of the rehybridizing probe system according to the invention.

Im Ansatz werden zwei Salmonellen-DNA-Proben mit einer unbekannten Konzentration und eine Standardverdünnungsreihe amplifiziert. Die Reaktion wurde auf einem anderen Real-Time-Gerät (BioRad) durchgeführt. Die Target-Nukleinsäure (HilA-Gen von Salmonella sp.) wurde mit folgenden Primern amplifiziert: PCR-Primer:

Figure 00080002
Rehybrydisierende Sondenpaare Sondenpaar 1:
Figure 00080003
Sondenpaar 2:
Figure 00090001
Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung) Pro Probe: sense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl antisense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl Sonden (je 25 pmol/μl) je 0,1 μl dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μl 10X PCR-Buffer (MgCl2 included) 1,5 μl Taq-DNA-Polymerase 0,75 U PCR-Grade H2O add 15 μl Initially, two salmonella DNA samples of unknown concentration and standard dilution series are amplified. The reaction was performed on another real-time device (BioRad). The target nucleic acid (HilA gene from Salmonella sp.) Was amplified with the following primers: PCR primer:
Figure 00080002
Rehybrydisizing probe pairs Probe pair 1:
Figure 00080003
Probe pair 2:
Figure 00090001
Reaction batch (amplification / hybridization) Per sample: sense primer (50 pmol / μl) 0.1 μl antisense primer (50 pmol / μl) 0.1 μl Probes (25 pmol / μl each) 0.1 μl each dNTP mix (12.5 mM) 0.3 μl 10X PCR Buffer (MgCl 2 included) 1.5 μl Taq DNA polymerase 0.75 U PCR grade H 2 O add 15 μl

Zur Testung wurden auch 3 negative Proben (beinhaltend nur PCR-Chemikalien und H2O) eingesetzt. Amplifikations-/Hybridisierungskonditionen Schritt 1: Denaturierung 95°C 180'' Schritt 2: Amplifizierung/Rehybridisierung 45 Zyklen 95°C 10'' 52°C 10'' 40°C 30'' For testing, 3 negative samples (including only PCR chemicals and H 2 O) were used. Amplification / hybridization conditions Step 1: denaturation 95 ° C 180 '' Step 2: Amplification / rehybridization 45 cycles 95 ° C 10 '' 52 ° C 10 '' 40 ° C 30 ''

Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Rehybridisierungsphase (40°C) jedes Zyklus (3a und 3b).The fluorescence release was measured in real time during the rehybridization phase (40 ° C) of each cycle ( 3a and 3b ).

3a zeigt die Real-Time-PCR-Ergebnisse

S:
Standard- Verdünnungsreihe
P:
Probe
N:
Negativkontrolle
3a shows the real-time PCR results
S:
Standard dilution series
P:
sample
N:
negative control

3b zeigt die Standardkurve der getesteten Proben 3b shows the standard curve of the samples tested

Die nachfolgende Tabelle 1 enthält die jeweiligen Ct-Werte und die Berechnung der relativen Probenkonzentration. Quantification Data

Figure 00100001
Tabelle 1 Table 1 below shows the respective Ct values and the calculation of the relative sample concentration. Quantification Data
Figure 00100001
Table 1

Dieser Versuch beweist, dass das erfindungsgemäße Sondensystem eine relative Quantifizierung der Targetnukleinsäure, ähnlich wie bei einer Real-Time-TaqMan-Quantifizierung ermöglicht. Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem funktioniert auch auf gängigen kommerziell verfügbaren Geräten und kann damit auf diesen Systemen als eine Alternative zu TaqMan-Tests eingesetzt werden, ohne das ein neues Gerätesystem benötigt wird. This experiment proves that the probe system of the present invention allows relative quantification of the target nucleic acid, similar to a real-time TaqMan quantification. The rehybridizing probe system according to the invention also works on common commercially available devices and can thus be used on these systems as an alternative to TaqMan tests, without the need for a new device system.

Ausführungsbeispiel 3Embodiment 3

Vergleich einer relativen Quantifizierung einer unbekannten Probe mittels des rehybridisierenden Sondensystems und mittels herkömmlichen TaqMan Sonden.Comparison of a relative quantification of an unknown sample by means of the rehybridizing probe system and by means of conventional TaqMan probes.

Es werden zwei unterschiedliche Real-Time-PCR-Ansätze mit den gleichen Standardreihen und Proben gegeneinander getestet. Die Reaktionen wurden auf einem dritten Real-Time-Gerät (Eppendorf AG) durchgeführt. Die Target-Nukleinsäure (HilA-Gen von Salmonella sp.) wurde in beiden Fällen mit folgenden Primern amplifiziert: PCR-Primer

Figure 00110001
Ansatz 1: Erfindungsgemäße rehybrydisierende Sondenpaare: Sondenpaar 1:
Figure 00110002
Sondenpaar 2:
Figure 00110003
Ansatz 2: TaqMan-Sonde:
Figure 00110004
Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung) Pro Probe: sense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl antisense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl Sonden (je 25 pmol/μl) je 0,1 μl dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μl 10X PCR-Buffer (MgCl2 included) 1,5 μl Taq-DNA-Polymerase 0,75 U PCR-Grade H2O add 15 μl Two different real-time PCR approaches with the same standard series and samples are tested against each other. The reactions were performed on a third real-time device (Eppendorf AG). The target nucleic acid (HilA gene from Salmonella sp.) Was amplified in both cases with the following primers: PCR primer
Figure 00110001
Approach 1: Rehybrydising probe pairs according to the invention: Probe pair 1:
Figure 00110002
Probe pair 2:
Figure 00110003
Approach 2: TaqMan probe:
Figure 00110004
Reaction batch (amplification / hybridization) Per sample: sense primer (50 pmol / μl) 0.1 μl antisense primer (50 pmol / μl) 0.1 μl Probes (25 pmol / μl each) 0.1 μl each dNTP mix (12.5 mM) 0.3 μl 10X PCR Buffer (MgCl 2 included) 1.5 μl Taq DNA polymerase 0.75 U PCR grade H 2 O add 15 μl

Zur Testung wurden auch 3 negative Proben (beinhaltend nur PCR-Chemikalien und H2O) eingesetzt. Amplifikations-/Hybridisierungskonditionen Ansatz 1 Schritt 1: Denaturierung 95°C 120'' Schritt 2: Amplifizierung/Rehybridisierung 40 Zyklen 95°C 15'' 52°C 15'' 40°C 40'' For testing, 3 negative samples (including only PCR chemicals and H 2 O) were used. Amplification / Hybridization Conditions Approach 1 Step 1: denaturation 95 ° C 120 '' Step 2: Amplification / rehybridization 40 cycles 95 ° C 15 '' 52 ° C 15 '' 40 ° C 40 ''

Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Rehybridisierungsphase (40°C) jedes Zyklus (4a). Amplifikations-/Hybridisierungskonditionen Ansatz 2 Schritt 1: Denaturierung 95°C 120'' Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen 95° C15'' 53°C 60'' The fluorescence release was measured in real time during the rehybridization phase (40 ° C) of each cycle ( 4a ). Amplification / Hybridization Conditions Approach 2 Step 1: denaturation 95 ° C 120 '' Step 2: amplification 40 cycles 95 ° C15 '' 53 ° C 60 ''

Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Anealingphase (53°C) jedes Zyklus (4b).The fluorescence release was measured in real time during the annealing phase (53 ° C) of each cycle ( 4b ).

Die nachfolgenden Tabellen 2 und 3 zeigen die jeweiligen Ct-Werte und die Ergebnisse der relativen Quantifizierung im Vergleich der beiden Nachweissysteme. Tabelle 2: Ansatz mittels des erfindungsgemäßen rehybridisierenden Sondensystems Pos Name Ct FAM Amount FAM [Copies] B2 Std_1/1 20,79 1,00 B3 Std_0.1/1 25,48 0,100 B4 Std_0.01/1 28,72 1,000E-2X B5 Std_0.001/1 32,31 1,000E-3X B6 Std_0.0001/1 35,94 1,000E-4X B8 2 30,20 4,170E-3X C2 Std_1/1 21,05 1,00 C3 Std_0.1/1 26,09 0,100 C4 Std_0.01/1 28,93 1,000E-2X C5 Std_0.001/1 32,53 1,000E-3X C6 Std_0.0001/1 36,15 1,000E-4X C8 2 30,51 3,440E-3X E6 3 - E7 3 - E8 3 - Tabelle 3: Ansatz mit TaqMan-System Name Ct FAM Amount FAM [Copies] 1_1/1 21,39 1,00 1_0.1/1 25,47 0,100 1_0.01/1 29,09 1,000E-2X 1_0.001/1 32,77 1,000E-3X 1_0.0001/1 35,71 1,000E-4X 2 30,23 3,750E-3X 1_1/1 21,06 1,00 1_0.1/1 25,62 0,100 1_0.01/1 29,04 1,000E-2X 1_0.001/1 32,64 1,000E-3X 1_0.0001/1 34,59 1,000E-4X 2 29,84 4,830E-3X 3 - - 3 - - 3 - - Tables 2 and 3 below show the respective Ct values and the relative quantification results comparing the two detection systems. Table 2: Approach by means of the rehybridizing probe system according to the invention Pos Surname Ct FAM Amount FAM [Copies] B2 Std_1 / 1 20.79 1.00 B3 Std_0.1 / 1 25.48 0,100 B4 Std_0.01 / 1 28.72 1,000E-2X B5 Std_0.001 / 1 32.31 1,000E-3X B6 Std_0.0001 / 1 35.94 1,000E-4X B8 2 30,20 4,170E-3X C2 Std_1 / 1 21.05 1.00 C3 Std_0.1 / 1 26,09 0,100 C4 Std_0.01 / 1 28.93 1,000E-2X C5 Std_0.001 / 1 32.53 1,000E-3X C6 Std_0.0001 / 1 36.15 1,000E-4X C8 2 30.51 3,440E-3X E6 3 - E7 3 - E8 3 - Table 3: Approach with TaqMan system Surname Ct FAM Amount FAM [Copies] 1_1 / 1 21.39 1.00 1_0.1 / 1 25.47 0,100 1_0.01 / 1 29,09 1,000E-2X 1_0.001 / 1 32,77 1,000E-3X 1_0.0001 / 1 35.71 1,000E-4X 2 30.23 3,750E-3X 1_1 / 1 21,06 1.00 1_0.1 / 1 25.62 0,100 1_0.01 / 1 29,04 1,000E-2X 1_0.001 / 1 32.64 1,000E-3X 1_0.0001 / 1 34.59 1,000E-4X 2 29.84 4,830E-3X 3 - - 3 - - 3 - -

Wie man aus den Versuchsergebnissen entnehmen kann, sind die Ergebnisse mit beiden Systemen sowohl in Bezug auf die R^2-Werte, die PCR-Effizienz, die Ct-Werte und die Methodensensitivität absolut vergleichbar.As can be seen from the experimental results, the results are absolutely comparable with both systems in terms of R ^ 2 values, PCR efficiency, Ct values, and method sensitivity.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Claims (9)

Verfahren zur RealTime- bzw. Endpunkt-Bestimmung von Nukleinsäuren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellung mindestens eines miteinander hybridisierten Sondenpaares, welches eine Hybridisierungstemperatur aufweist, die niedriger ist als die Hybridisierungstemperatur einer dieser Sonden zur Nukleinsäure (Target), wobei die eine Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die ein auswertbares Signal erzeugt ist und die andere Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die dieses Signal aufheben kann in einem konventionellen Amplifikationsansatz mit einer Polymerase mit 5'-3' Exonukleaseaktivität b) Erwärmen der zu bestimmenden Nukleinsäure und des miteinander hybridisierten Sondenpaares auf eine Temperatur, so dass sowohl eine Strangtrennung des Sondenpaares als auch der Nukleinsäure erfolgt c) Abkühlung des Ansatzes auf eine Temperatur, bei der eine Sonde mit einem Strang der Nukleinsäure (Target) hybridisiert, Zugabe, wobei die Nukleinsäure amplifiziert und die an die Nukleinsäure hybridisierte Sonde durch die 5'-3' Exonukleaseaktivität der Polymerase gespalten wird. d) Abkühlung des Ansatzes auf eine Temperatur, bei der das ursprüngliche Sondenpaar re-hybridisiert. e) Bestimmung der Nukleinsäuren durch Auswertung des Signals, das nach der Rehybridisierung vorhanden ist.Method for real-time or end-point determination of nucleic acids, characterized by the following steps: a) providing at least one hybridized probe pair having a hybridization temperature which is lower than the hybridization temperature of one of these probes to the nucleic acid (target), wherein one probe of the probe pair is provided with a label which generates an evaluable signal and the other Probe of the probe pair is provided with a label that can cancel this signal in a conventional amplification approach with a polymerase with 5'-3 'exonuclease activity b) heating the nucleic acid to be determined and the pair of probes hybridized with one another to a temperature such that both a strand separation of the probe pair and of the nucleic acid takes place c) cooling the batch to a temperature at which a probe hybridizes to a strand of the nucleic acid (target), adding, whereby the nucleic acid is amplified and the probe hybridized to the nucleic acid is cleaved by the 5'-3 'exonuclease activity of the polymerase. d) cooling the batch to a temperature at which the original probe pair re-hybridizes. e) Determination of the nucleic acids by evaluation of the signal that is present after rehybridization. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde, die mit dem Target hybridisiert, gegen eine Verlängerung geschützt ist, vorzugsweise mittels Phosphorylierung.A method according to claim 1, characterized in that the probe which hybridizes with the target is protected against extension, preferably by means of phosphorylation. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde, die mit dem Target hybridisiert, länger ist als die andere Sonde des Sondenpaares oder die andere Sonde eine zum Target nicht-komplementäre Sequenz enthält.A method according to claim 1, characterized in that the probe which hybridizes with the target is longer than the other probe of the probe pair or the other probe contains a non-complementary sequence to the target. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Markierungen der Sonden um Farbstoffe, vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoffe, bzw. Quencher handelt.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is the labels of the probes to dyes, preferably fluorescent dyes, or quencher. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein miteinander hybridisiertes Sondenpaar eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that at least one mutually hybridized probe pair is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere miteinander hybridisierte Sondenpaare eingesetzt werden.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that a plurality of probes hybridized with each other are used. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweiligen Sondenpaare unterschiedliche Markierungen aufweisen.A method according to claim 6, characterized in that the respective pairs of probes have different markings. Testkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend a) mindestens ein miteinander hybridisiertes Sondenpaares, welches eine Hybridisierungstemperatur aufweist, die niedriger ist als die Hybridisierungstemperatur einer dieser Sonden zur Nukleinsäure (Target), wobei die eine Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die ein auswertbares Signal erzeugt ist und die andere Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die dieses Signal aufheben kann. b) an sich bekannte Primer und eine Polymerase mit 5'-3' Exonukleaseaktivität c) an sich bekannte Geräte zum Erwärmen, Abkühlen und Auswerten des Mess-Signals.Test kit for the detection of nucleic acids, comprising a) at least one pair of probes hybridized to one another, which has a hybridization temperature which is lower than the hybridization temperature of one of these probes to the nucleic acid (target), wherein one probe of the probe pair is provided with a label which generates an evaluable signal and the other probe of the probe pair is provided with a mark that can cancel this signal. b) known primers and a polymerase with 5'-3 'exonuclease activity c) devices known per se for heating, cooling and evaluating the measurement signal. Verwendung des Verfahrens oder des Testkits zum Nachweis von Salmonellen.Use of the method or the test kit for the detection of Salmonella.
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WO2016083354A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Roche Diagnostics Gmbh Detecting single nucleotide polymorphism using overlapping hydrolysis probes

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