DE102011013326A1

DE102011013326A1 - Neue Fibrinolyse-Inhibitoren und deren mdizinische Verwendung

Info

Publication number: DE102011013326A1
Application number: DE102011013326A
Authority: DE
Inventors: Birgit Felser; Dieter U. Preiss
Original assignee: SOLUTION SHOP AG
Current assignee: SOLUTION SHOP AG
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2012-09-13
Also published as: WO2012119744A1

Abstract

Fibrinolyse-Inhibitoren und deren medizinische Verwendung zur antifibrinolytischen Therapie und Prophylaxe. Bekannte Fibrinolyse-Inhibitoren werden bei chirurgischen Eingriffen, die größere intraoperative oder perioperative Blutverluste zur Folge haben, oder bei Eingriffen mit extrakorporaler Zirkulation angewendet, um das Ausmaß der Blutverluste zu verringern. Nachteilig ist das Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen. Um derartige Nachteile zu vermeiden, werden für die antifibrinolytische Therapie und Prophylaxe Proteine verwendet, die Aminosäuresequenzen aufweisen, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus SEQ ID NO: 1 (dBPS1 = duck Basic Protein Small 1), SEQ ID NO: 2 (dBPS2), SEQ ID NO: 3 (Meleagrin), SEQ ID NO: 4 (similar to meleagrin) besteht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Blutstillung und insbesondere neue Fibrinolyse-Inhibitoren (Antifibrinolytica), die zur therapeutischen oder prophylaktischen, antifibrinolytischen Behandlung verwendet werden können. Die Erfindung betrifft die therapeutische, auch prophylaktische, Verwendung der genannten Fibrinolyse-Inhibitoren sowie medizinische Behandlungsverfahren, bei denen die genannten Inhibitoren zu therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken an einen menschlichen oder tierischen Organismus verabreicht werden. Die Erfindung umfaßt ferner die Verwendung der neuen Fibrinolyse-Inhibitoren auf dem Gebiet der Labormedizin.
Fibrin wird bei dem nach Gefäßverletzungen stattfindenden Prozess der Blutstillung während der sogenannten Fibrinbildungsphase gebildet. Durch die nachfolgende Polymerisation wird ein die Wunde verschließendes Gerinnsel (Thrombus) gebildet. Fibrin entsteht aus löslichem Fibrinogen unter Einwirkung des Enzyms Thrombin, nachdem dieses aktiviert wurde.
Während der Wundheilungsphase wird durch das fibrinolytische System bewirkt, dass Fibrin wieder aufgelöst wird, sobald es für die Wundheilung nicht mehr benötigt wird. Bei der Fibrinolyse wird das unlösliche Fibrin durch enzymatisch gesteuerte, proteolytische Reaktionen in lösliche Fibrinspaltprodukte überführt. Der zentrale Schritt hierbei ist die Aktivierung von Plasminogen zu dem proteolytischen Enzym Plasmin, welches die Spaltung von Fibrin bewirkt.
Bei chirurgischen Eingriffen, die größere intraoperative oder perioperative Blutverluste zur Folge haben, oder bei Eingriffen mit extrakorporaler Zirkulation (mittels Herz-Lungen-Maschine) werden Antifibrinolytika angewendet, um das Ausmaß der Blutverluste zu verringern. Infolgedessen wird eine geringere Anzahl von Blutkonserven (Spenderblut) benötigt, als dies ohne Verabreichung von Antifibrinolytika der Fall wäre.
Zu den genannten chirurgischen Eingriffen, bei denen Antifibrinolytika zur Verminderung von Blutverlusten eingesetzt werden, gehören insbesondere kardiochirurgische Eingriffe wie z. B. Bypass-Operationen, Herklappenchirurgie oder Herztransplantationen, oder chirurgische Eingriffe an der Leber.
Des weiteren werden Antifibrinolytika bei lokaler oder generalisierter Fibrinolyse angewendet, beispielsweise bei lokalen Blutungen in der Gynäkologie und Geburtshilfe oder in der Zahnheilkunde.
Der Protease-Inhibitor Aprotinin (Trasylol^®; BAYER AG) wurde als Antifibrinolytikum z. B. bei Operationen am offenen Herzen oder in der Leberchirurgie verabreicht, um den Blutverlust und somit den Bedarf an Bluttransfusionen zu minimieren. Die antifibrinolytische Wirkung des Aprotinins beruht auf der Hemmung der Aktivierung von Plasminogen zum aktiven Plasmin.
Aufgrund von Hinweisen auf unerwünschte Nebenwirkungen (v. a. renale Komplikationen, cerebrovaskuläre Ereignisse) bzw. eine erhöhte Sterblichkeit wurde Aprotinin (Trasylol^®) weltweit vom Markt genommen. Die Anwendung von Aprotinin ist nur noch unter strengen Voraussetzungen in Ausnahmefällen zulässig.
Einige der unerwünschten Nebenwirkungen, wie z. B. das Risiko eines Nierenversagens, sind vermutlich darauf zurückzuführen, dass Aprotinin eine breite Substratspezifität aufweist und deshalb nicht nur antifibrinolytisch, sondern auch antithrombolytisch und antikoagulatorisch wirkt (durch Hemmung von Streptokinase, t-PA und Urokinase).
Als Antifibrinolytika, die anstelle von Aprotinin verwendet werden können, sind die synthetischen ω-Aminocarbonsäuren Tranexamsäure (TA), ε-Aminocapronsäure (EACA) und p-Aminomethylbenzoesäure (PAMBA) zu nennen. Diese Inhibitoren sind gegenüber Aprotinin vorteilhaft, da sie spezifisch die Fibrinolyse hemmen, ohne andere proteolytische Prozesse zu beeinflussen. Allerdings kann es nach Verabreichung von TA zu Sehstörungen (z. B. Visusverlust, Störung des Farbsinnes) kommen.
Ob die oben erwähnten Antifibrinolytika aus der Klasse der synthetischen ω-Aminocarbonsäuren dieselbe Wirksamkeit hinsichtlich der Verminderung von Blutverlusten bei chirurgischen Eingriffen, insbesondere bei Eingriffen mit extrakorporaler Zirkulation, erreichen wie Aprotinin, ist zu bezweifeln. Wie oben erwähnt, ist die Anwendung von Aprotinin unter strengen Voraussetzungen in Ausnahmefällen immer noch zulässig. Das Medikament steht in einigen Ländern, einschließlich der USA, für bestimmte Patientengruppen bei begründetem medizinischem Bedarf noch immer zur Verfügung, was ein Indiz dafür ist, dass hochwirksame Fibrinolyse-Inhibitoren dringend benötigt werden.
Bei der Suche nach neuen, besser verträglichen Fibrinolyse-Inhibitoren wurden beispielsweise Varianten oder Analoge des Aprotinins in Betracht gezogen (z. B. WO 2006/17355 A2 WO 2008/110301 ). Von DIETRICH et al. wurde ein niedermolekularer Serinprotease-Inhibitor (700 Da) mit antifibrinolytischen und antikoagulatorischen Eigenschaften beschrieben (DIETRICH W, NICKLISCH M, KOSTER A, VAN DE LOCHT A: CU-2010 – A novel antifibrinolytic protease inhibitor displays also anticoagulant properties. Anesth. Analg. 2009; 108 (SCA Suppl.), 1–104, SCA86). Ferner wurde der aus Schlangengift isolierte Serinprotease-Inhibitor Textilinin-1 als Ersatz für Aprotinin vorgeschlagen (FLIGHT SM, JOHNSON LA, DU QS, WARNER RL, TRABI M, GAFFNEY PJ, LAVIN MF, DE JERSEY J, MASCI PP: Textilinin-1, an alternative anti-bleeding agent to aprotinin: Importance of plasmin inhibition in controlling blond loss. British J. of Haematology 145, 207–211). Die vorgenannten Inhibitoren haben bislang keinen Eingang in die klinische Anwendung gefunden.
Der vorliegenden Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, neue Wirkstoffe mit antifibrinolytischer Wirkung zur therapeutischen Verwendung, insbesondere bei chirurgischen Eingriffen, bereitzustellen, wobei die vorstehend genannten Nachteile der bekannten Antifibrinolytika vermieden oder verringert werden. Des weiteren lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Methoden zur therapeutischen Behandlung bereitzustellen, mittels welcher die genannten Wirkstoffe zum Zwecke der antifibrinolytischen Behandlung, insbesondere zur Verminderung des Blutverlustes bei chirurgischen Eingriffen, an Menschen oder Tiere verabreicht werden.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Proteins oder einer Kombination aus mindestens zwei Proteinen, wie nachfolgend definiert, für die Verwendung zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur prophylaktischen antifibrinolytischen Behandlung, gelöst.
Ein erfindungsgemäßes Protein weist eine Aminosäuresequenz auf, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 (gemäß angefügtem Sequenzprotokoll) und Aminosäuresequenzen, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu einer der vorgenannten SEQ ID NOS: 1 bis 4 aufweisen, besteht. Die genannte Kombination umfaßt mindestens zwei Proteine, welche jeweils eine der vorstehend genannten Aminosäuresequenzen aufweisen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die oben genannten Proteine, einzeln oder in Kombination, antifibrinolytisch wirken (d. h. als Fibrinolyse-Inhibitoren), wobei keine antikoagulatorische Wirkung erzeugt wird oder eine solche allenfalls in sehr geringem Ausmaß zu beobachten ist. Aufgrund dieses Eigenschaften sind die oben genannten Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4, einzeln oder in Kombination, in vorteilhafter Weise für die Verwendung bei der antifibrinolytischen Therapie oder antifibrinolytischen Prophylaxe, insbesondere zur Verminderung des Blutverlustes bei chirurgischen Eingriffen, geeignet. Aufgrund des Fehlens einer antikoagulatorischen Wirkung ist das Risiko für das Auftreten von Nebenwirkungen vermindert.
Die gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Proteine (einschließlich ihrer Varianten) haben eine blutstillende Wirkung. Sie sind vorteilhaft, weil – anders als Aprotinin – keine Auswirkungen auf das Gerinnungssystem haben und frei von schwerwiegenden Nebenwirkungen sind, insbesondere keine nierenschädigende Wirkung haben. Des weiteren sind auch keine immunologischen Nebenwirkungen bekannt.
Ohne sich damit in irgendeiner Weise festlegen zu wollen, wird derzeit vermutet, dass die antifibrinolytische Wirkung der oben genannten, erfindungsgemäß verwendeten Proteine auf eine spezifische oder selektive Hemmung der Plasminbildung zurückzuführen ist. Dies steht auch im Einklang mit der Beobachtung, dass die erfindungsgemäßen Proteine keine antikoagulatorische Wirkung ausüben.
Die oben genannten Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 sind im Stand der Technik bekannt, wie im Sequenzprotokoll vermerkt.
Die Isolierung, Sequenzierung und biochemische Charakterisierung der Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 wurde von NAKNUKOOL et al. beschrieben (NAKNUKOOL, S., HAYAKAWA, S., SUN, Y. and OGAWA, M.: "Structural and physicochemical characteristics of novel basic Proteins isolated from duck egg white"; Biosci. Biotechnol. Biochem. 72(8) 2008, S. 2082–2091).
Die von NAKNUKOOL et al. beschriebenen Proteine ”Duck Basic Protein Small 1” (dBPS1) und ”Duck Basic Protein Small 2” (dBPS1) wurden aus dem Eiweiß von Enteneiern isoliert. Die Aminosäuresequenzen von dBPS1 bzw. dBPS2 entsprechen den oben angegebenen Sequenzen SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2. Die vorgenannten Sequenzen sind unter den Accession-Nummern P85123 bzw. P85124 in der Swiss-Prot-Datenbank abrufbar (Versions-Nr. P85123.1 bzw. P85124.1). SEQ ID NO: 2 ist identisch mit der Sequenz von Cygnin (P02785, Swiss-Prot).
Die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 sind wie folgt:

SEQ ID NO: 1 (= dBPS1)
QKKGFCAGYC SYSCAKTDEW TFHQTCGKMY CCIPPPKKG (39 aa)

SEQ ID NO: 2 (= dBPS2)
QVRKYCPKVG YCSSKCSKAD VWSLSSDCKF YCCLPPGWK (39 aa)
Die biologische Funktion der Proteine dBPS1 und dBPS2 war bisher unbekannt. Die oben erwähnte Publikation von NAKNUKOOL et al. enthält keinerlei Hinweise bezüglich möglicher Funktionen von dBPS1 und dBPS2.
Die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 entsprechen den im Stand der Technik bekannten Proteinen Meleagrin und ”Similar to meleagrin” (Accession-No. P21376 (Swiss-Prot), XP_429908 (NCBI)). Diese Proteine weisen eine Sequenzähnlichkeit zu dBPS1 und dBPS2 auf (NAKNUKOOL et al., a. a. O, Fig. 4). Auch bezüglich dieser Proteine ist eine biologische Funktion bisher nicht bekannt.

SEQ ID NO: 3 (Meleagrin)
QVLKYCPKIG YCSSKCSKAE VWAYSPDCKV HCCVPANQKW (40 aa)

SEQ ID NO: 4 (”similar to meleagrin”)
VLKYCPKIGY CSNTCSKTQI WATSHGCKMY CCLPASWKWK (40 aa)
Anmerkung: Die oben gezeigte Sequenz ist eine Teilsequenz der Sequenz ”similar to meleagrin” (Accession-Nr. XP_429908; Gesamtlänge 63 aa), wobei die Aminosäuren 1–40 den Aminosäuren 24–63 der Gesamtsequenz von ”similar to meleagrin” entsprechen.
Die genannten Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 weisen untereinander eine hohe Sequenzähnlichkeit auf. Ferner zeichnen sie sich durch das Vorhandensein von 6 Cysteinresten aus, welche die Ausbildung von drei intramolekularen Disulfidbrücken ermöglichen, wodurch eine sehr kompakte und stabile Proteinfaltung zustande kommt (vgl. NAKNUKOOL et al., a. a. O., Fig. 4).
Gemäß vorliegender Erfindung wird entweder ein einziges Protein, das eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 aufweist, für den genannten therapeutischen Zweck verwendet, oder es wird eine Kombination aus mindestens zwei Proteinen, von welchen ein jedes eine der genannten Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 aufweist, verwendet.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf solche Proteine beschränkt, deren Sequenz mit einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 identisch ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass einige oder mehrere Aminosäuren in einer Polypeptidsequenz durch andere Aminosäuren ersetzt (oder hinzugefügt oder weggelassen) oder chemisch modifiziert werden können, ohne dass dadurch die biologische Funktion des Proteins beeinträchtigt wird. Deshalb umfaßt die vorliegende Erfindung ferner auch funktionelle Varianten (wie z. B. Derivate, allele Varianten, Fragmente, Homologe, Analoge, Fusionsproteine), die eine zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ähnliche Aminosäuresequenz haben und die erwähnte antifibrinolytische Wirkung aufweisen. Es ist zu erwarten, dass derartige Varianten (Homologe) beispielsweise aus dem Eiweiß von Eiern weiterer Vogelarten isoliert werden können.
Bevorzugte Varianten sind solche, die sich gegenüber SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden. Als konservative Substitution wird der Austausch einer Aminosäure gegen eine andere Aminosäure, die ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften aufweist, verstanden. Derartige konservative Substitutionen sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der substituierten, inserierten oder deletierten Aminosäuren weniger als 15, insbesondere weniger als 10, besonders bevorzugt weniger als 5.
Ferner ist für den Fachmann plausibel, dass auch Sequenzen, welche weniger als die vollständige Länge der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4 aufweisen, die erwähnte antifibrinolytische Aktivität aufweisen können. Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung auch Proteine, welche eine aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 4 ausgewählte Sequenz enthalten, wobei diese Sequenz N-terminal oder/und C-terminal durch weitere Aminosäurereste verlängert ist.
Insbesondere erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf funktionelle Varianten (wie Homologe oder allele Varianten), die Aminosäuresequenzen aufweisen, welche eine Ähnlichkeit zu einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 aufweisen, wobei die Sequenzidentität mindestens 70% beträgt, vorzugsweise mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%.
Die Bestimmung der Sequenzidentität oder -ähnlichkeit (in ”% Identität”) zweier Proteine kann mittels bekannter algorithmischer Verfahren wie z. B. unter Verwendung von Programmen wie ”FASTA”1

1: Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63–99 (1990)

2

2: Smith und Waterman, J. Mol. Biol. 147, 195–197 (1981)

3

3: Altschul S F et al., J. Mol. Biol. 215, 301–410 (1990), Nucleic Acids Res. 25, 389–3402 (1997)

www.ncbi.nlm.nih.gov

Im allgemeinen handelt es sich bei den vorstehend genannten Proteinen, welche für die erfindungsgemäßen therapeutischen Zwecke verwendet werden, um basische Proteine mit niedriger Molekülmasse (insbesondere weniger als 10 kDA), die mindestens zwei Disulfidbrücken aufweisen und eine antifibrinolytische Wirkung haben.
Vorzugsweise liegt die Molekülmasse der gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Proteine jeweils im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere im Bereich von 4 bis 6 kDa. Die Bestimmung der Molekülmasse kann auf dem Fachmann bekannte Weise z. B. mittels SDS-PAGE (in Gegenwart eines reduzierenden Agens) ermittelt werden. Im Zweifelsfall gilt der massenspektrometrisch ermittelte Wert.
Der isoelektrische Punkt (pI) liegt oberhalb von 7,0, insbesondere oberhalb von 8,0, vorzugsweise oberhalb von 9,0.
Vorzugsweise enthalten die Primärsequenzen der erfindungsgemäß verwendeten Proteine mindestens 4, insbesondere 6 Cysteinreste, welche die Ausbildung von zwei, vorzugsweise von drei Cysteinbrücken ermöglichen.
Für die vorliegende Erfindung kommen ferner auch solche funktionellen Varianten der oben definierten Proteine in Betracht, die durch Glykosylierung, Acylierung, Pegylierung, usw. modifiziert sind.
Verfahren zur Ermittlung der antifibrinolytischen Wirkung durch Bestimmung der Hemmung der Plasminbildung (siehe Beispiel) sind dem Fachmann bekannt. Da die Aktivierung von Plasminogen zu dem proteolytischen (fibrinspaltenden) Enzym Plasmin den zentralen Schritt bei der Fibrinolyse darstellt, kann die Plasminbildung als Maß für die Fibrinolyse dienen.
Hierbei kann allgemein so vorgegangen werden, wie im nachfolgenden Ausführungsbeispiel beschrieben: Die Plasminbildung wird in Gegenwart von t-PA (gewebsspezifischer Plasminogenaktivator) untersucht. Nach Zusatz eines geeigneten Substrates wird die enzymatische Aktivität des Plasmins in dem Versuchsansatz bestimmt und mit einem entsprechenden Kontrollansatz (ohne Zusatz eines Inhibitors) verglichen. Als ”antifibrinolytische Wirkung” wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine jede Verminderung der Plasmin-Aktivität, relativ zu einem entsprechenden Kontroll-Experiment ohne Zusatz des zu untersuchenden Proteins (Inhibitor), verstanden.
Die Messung der Plasmin-Aktivität kann beispielsweise mittels Thrombelastometrie oder Thrombelastographie erfolgen (Rotationsthromboelastometrie, ROTEM^®). Bei diesen im Stand der Technik bekannten Standardmethoden werden die Gerinnungseigenschaften des Blutes durch viskoelastische Messungen untersucht. Dabei kann die Gerinnselfestigkeit (maximum clot firmness, MCF) sowie die nachfolgende Auflösung (Lyse) des Gerinnsels bestimmt werden. Der Lyse-Index (LI) gibt die Abnahme innerhalb von 60 Minuten nach Gerinnselbildung an; er ist somit ein Maß für die fibrinolytische Wirkung (Fibrinolyse).
Insbesondere liegt eine antifibrinolytische Wirkung im Sinne der vorliegenden Erfindung dann vor, wenn die zur Auflösung eines Gerinnsels benötigte Zeit (unter sonst gleichen Bedingungen) mindestens das 1,1-Fache, vorzugsweise das 1,5-Fache der ohne Inhibitorzusatz benötigten Zeit beträgt, oder wenn die nach einer definierten Dauer der Lyse (z. B. 60 min) verbleibende Masse eines Gerinnsels mindestens der 1,1-fachen Masse, vorzugsweise der 1,5-fachen Masse, eines Gerinnsels entspricht, welches ohne Inhibitorzusatz während des genannten Lyse-Zeitraums unter ansonsten gleichen Bedingungen erhalten wurde.
Erfindungsgemäß verwendbare Proteine, welche die Sequenzen SEQ ID NO: 1 (dBPS1), SEQ ID NO: 2 (dBPS2), SEQ ID NO: 3 (Meleagrin) oder SEQ ID NO: 4 (similar to meleagrin) aufweisen, oder entsprechende Varianten mit einer Sequenzidentität von mindestens 70%, können beispielsweise folgendermaßen erhalten werden:

– durch Extraktion bzw. Isolierung aus einem natürlich vorkommenden biologischen Material, insbesondere aus dem Eiweiß von Vogeleiern (vorzugsweise Enteneier). Hierbei kann beispielsweise nach der von NAKNUKOOL beschriebenen Methode vorgegangen werden (NAKNUKOOL et al., a. a. O., S. 2083, "Protein Purification"). Gemäß dieser Methode wird das mit Wasser verdünnte Eiweiß (aus Enteneiern) durch Zusatz von HCl auf pH 6,0 eingestellt und der nach Zentrifugation verbleibende Überstand über eine SP-Sepharosesäule aufgetrennt. Fraktionen mit Molekülmassen von weniger als 9,4 kDa werden gesammelt, dialysiert (3500 MWCO) und anschließend über Sephacryl S-300 gereinigt. Die Reinheit des gereinigten Proteins kann mittels SDS-PAGE kontrolliert werden.
– mittels gentechnischer Methoden (durch operative Verknüpfung einer für SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 kodierenden Nucleotidsequenz mit einer Expressionskontrollsequenz eines geeigneten Expressionsvektors, Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirtszellen mit dem rekombinanten Vektor, Expression des Proteins in den Wirtszellen, Gewinnung des exprimierten Proteins aus den Wirtszellen bzw. dem Kulturmedium).
– mittels chemischer Synthese.

Gemäß vorliegender Erfindung können die oben erwähnten Proteine sowohl einzeln als auch in Kombination verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombination von Proteinen verwendet, die ein erstes Protein, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 1 aufweist, sowie ein zweites Protein, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 2 aufweist, umfaßt. Vorzugsweise liegt die Molekülmasse des ersten Proteins und des zweiten Proteins jeweils im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere 4 bis 6 kDa.
Hinsichtlich der relativen Anteile der beiden Proteine in der Kombination wird bevorzugt, dass der Massenanteil des zweiten Proteins mindestens der 1,5-fachen, vorzugweise mindestens der doppelten, besonders bevorzugt mindestens der dreifachen Masse des ersten Proteins entspricht.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Kombination von Proteinen

– dBPS1 (SEQ ID NO: 1) als das genannte erste Protein und
– dBPS2 (SEQ ID NO: 2) als das genannte zweite Protein.

Die beiden Proteine dBPS1 und DBPS2 können in gleichen oder annähernd gleichen Anteilen in der Kombination enthalten sein (d. h. im Mengenverhältnis 1:1). Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der Massenanteil des zweiten Proteins (dBPS2) mindestens das 1,5-Fache, vorzugweise mindestens das Doppelte, besonders bevorzugt mindestens das Dreifache der Masse des ersten Proteins (dBPS1).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die vorstehend genannten Kombinationen mindestens dBPS1 und dBPS2, wobei diese beiden Proteine aus dem Eiweiß von Enteneiern isoliert wurden.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner die Möglichkeit ein, dass statt isolierter oder gereinigter Proteine Extrakte oder Mischungen verwendet werden, welche die genannten Proteine, einzeln oder in Kombination, enthalten.
Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung auch proteinhaltige, antifibrinolytisch wirksame Zusammensetzungen (z. B. Mischungen, Extrakte, partiell gereinigte Fraktionen), welche aus dem Eiweiß von Vogeleiern, vorzugweise von Enteneiern, stammende Bestandteile enthalten, wobei diese Bestandteile zumindest ein basisches Protein mit einer Molekülmasse von höchstens 15 kDa, insbesondere von höchstens 10 kDA umfassen,
für die Anwendung in einem Verfahren zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe, vorzugsweise zur Behandlung oder Prophylaxe eines während oder infolge einer Operation auftretenden Blutverlustes, besonders bevorzugt bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen.
Die genannten proteinhaltigen, aus dem Eiweiß von Vogeleiern herstellbaren Zusammensetzungen weisen eine antifibrinolytische Wirkung auf, die mittels bekannter Methode – wie oben beschrieben – festgestellt werden kann. Die Herstellung bzw. Isolation kann beispielsweise nach der von NAKNUKOOL beschriebenen Methode erfolgen (NAKNUKOOL et al., a. a. O., S. 2083, "Protein Purification".
Vorzugsweise weist das in den proteinhaltigen Zusammensetzungen enthaltene basische Protein, oder zumindest eines der basischen Proteine, mindestens 4, insbesondere 6 Cysteinreste auf.
Des weiteren ist der isoelektrische Punkt des/der in den proteinhaltigen Zusammensetzungen enthaltene(n) Proteins/Proteine jeweils größer als 7,0, vorzugsweise größer als 8,0, besonders bevorzugt größer als 9,0.
Die Molekülmasse des/der in den proteinhaltigen Zusammensetzungen enthaltene(n) basischen Proteins bzw. der basischen Proteine liegt vorzugsweise im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere 4 bis 6 kDa.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die vorstehend beschriebene proteinhaltige Zusammensetzung zwei der genannten basischen Proteine in Kombination, wobei die Molekülmasse jeweils 4 bis 6 kDa beträgt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das basische Protein oder die basischen Proteine eine Aminosäuresequenz auf, wie weiter oben mit Bezugnahme auf SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 4 definiert.
Die vorstehend beschriebenen proteinhaltigen Zusammensetzungen, welche aus dem Eiweiß von Vogeleiern erhältlich sind, können auf dem Fachmann bekannte Weise als pharmazeutische Formulierungen (Medikamente) formuliert werden.
Die Anwendung des/der oben definierten Proteins/Proteine, bzw. der genannten proteinhaltigen Zusammensetzung, in einem Verfahren zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe erfolgt im allgemeinen in der Weise, dass ein erfindungsgemäßes Protein oder eine Kombination von Proteinen (wie oben beschrieben), oder die genannte proteinhaltige Zusammensetzung, mittels einer geeigneten pharmazeutischen Darreichungsform, d. h. als pharmazeutische Zubereitung (= Arzneimittel, Medikament), an einen zu behandelnden menschlichen oder tierischen Organismus verabreicht wird.
Hierfür geeignete Formulierungen, pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe, Träger, Vehikel usw. sind dem auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen sachkundigen Fachmann allgemein bekannt. Die Verabreichung kann insbesondere auf oralem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, subkutanem oder topischem Verabreichungsweg erfolgen.
Besonders bevorzugt sind Formulierungen zur parenteralen (z. B. intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen) Verabreichung, wie z. B. Injektions- und Infusionslösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisate, Pulver). Als Vehikel für flüssige Formulierungen können z. B. Wasser, isotonische Lösungen, Kochsalzlösungen, Dextroselösungen, etc. verwendet werden. Falls erforderlich, können Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer usw. zugefügt werden.
Demzufolge werden durch die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zubereitungen (d. h. Medikamente) bereitgestellt, welche ein erfindungsgemäßes Protein oder eine Kombination von Proteinen, wie oben definiert, enthalten. Eine solche pharmazeutische Zubereitung enthält eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, wie oben beschrieben, zusammen mit einem Träger oder Vehikel. Für pharmazeutische Zubereitungen geeignete Träger oder Vehikel sind dem Fachmann bekannt.
Der Wirkstoffgehalt eines erfindungsgemäßen Medikaments liegt vorzugsweise im Bereich von 1–95 Gew.-%, insbesondere 5–70 Gew.-%. Abhängig von der jeweiligen Darreichungsform, der beabsichtigten Dosierung und dem speziellen Behandlungszweck kann der jeweils geeignete Wirkstoffgehalt auch außerhalb der angegebenen Prozentbereiche liegen. Der Begriff ”Wirkstoff” bezieht sich auf die oben definierten, erfindungsgemäßen Proteine und Kombinationen von Proteinen.
Die oben definierten Proteine, sowie die solche Proteine enthaltenden Zubereitungen (Arzneimittel), sind gemäß vorliegender Erfindung für die Anwendung in einem Verfahren zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe vorgesehen.
Besonders bevorzugt ist die Anwendung zur antifibrinolytischen Behandlung oder Prophylaxe eines während oder infolge einer Operation auftretenden Blutverlustes, insbesondere bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen (z. B. Bypass-Operationen, Herklappenchirurgie oder Herztransplantationen, oder chirurgische Eingriffe an der Leber). In diesen Fällen kann durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Proteine (wie oben definiert) eine Reduzierung der intraoperativen Blutverluste bewirkt werden, so dass eine geringere Anzahl von Blutkonserven benötigt wird oder auf diese völlig verzichtet werden kann.
Die Höhe der zu verabreichenden Dosis hängt u. a. vom Gerinnungsstatus des zu behandelnden Patient, Art und Dauer der Operation, Operationsverlauf usw. ab und ist in jedem Einzelfall nach fachmännischem Ermessen individuell zu ermitteln. Falls erforderlich, können zwei oder mehrere Dosen in zeitlicher Abfolge verabreicht werden.
Als ”therapeutisch wirksame Menge” des/der zu verabreichenden Proteins/Proteine wird eine Menge verstanden, die zu einer günstigen Wirkung (beispielsweise bezüglich des intraoperativen Blutverlustes) führt. Diese Menge kann – in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren, wie Geschlecht, Alter, Körpergewicht des Patienten usw., erheblich variieren. Die Auswahl und ggf. Anpassung der jeweils geeigneten Dosis gehört zu den Fähigkeiten der Fachleute. Als Orientierungswert für eine ”wirksame Dosis” kann von einem Bereich von 0,0001 bis 100 mg/kg oder 0,01 bis 10 mg/kg (Körpergewicht) ausgegangen werden.
Neben der erwähnten Verwendung zur antifibrinolytischen Behandlung oder Prophylaxe bei Operationen, insbesondere bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen, können die erfindungsgemäßen antifibrinolytischen Proteine oder proteinhaltigen Zusammensetzungen bei verschiedenen weiteren Indikationen zur Anwendung kommen, wie z. B. bei lokaler oder generalisierter Fibrinolyse, insbesondere bei lokaler oder generalisierter Hyperfibrinolyse, beispielsweise bei schweren Traumata mit größeren Blutverlusten, bei lokalen Blutungen in der Gynäkologie und Geburtshilfe oder in der Zahnheilkunde, sowie bei traumatisch-hämorrhagischen Schockzuständen. Die vorstehend beschriebenen anti-fibrinolytischen Proteine und proteinhaltigen Zusammensetzungen können gemäß vorliegender Erfindung ferner zur Prophylaxe oder Therapie einer disseminierten intravaskulären Koagulopathie (DIC; auch 'Verbrauchskoagulopathie' genannt) verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren Verfahren zur Hemmung der Fibrinolyse, welche zumindest einen Schritt aufweisen, bei welchem einer Person oder einem Tier, die/das einer antifibrinolytischen Behandlung bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung, jeweils wie weiter oben definiert, verabreicht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer Krankheit oder eines Krankheitszustandes, die/der mit Blutungen oder Blutverlusten verbunden ist, und die eine blutstillende Behandlung erfordern. Ein solches erfindungsgemäßes Verfahren weist einen Schritt auf, in welchem einer Person oder einem Tier, die/das einer blutstillenden Behandlung bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung, jeweils wie oben beschrieben, verabreicht wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem genannten Krankheitszustand um einen Blutverlust, der während oder infolge eines chirurgischen Eingriffs auftritt, insbesondere bei kardiochirurgischen Eingriffen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung, jeweils wie oben definiert, oder einer pharmazeutischen Zubereitung, welche ein solches Protein oder eine solche Kombination enthält,
zur Hemmung oder zum Herunterregulieren der Plasminbildung ohne Beeinträchtigung des Gerinnungssystems, insbesondere ohne Beeinträchtigung der Thrombinbildung.
Diese Verwendung ist für die therapeutische Behandlung verschiedener Krankheiten oder Krankheitszustände von Bedeutung, die mit einer erhöhten oder unerwünschten Fibrinolyse einhergehen und bei denen eine Hemmung oder das Herunterregulieren der Plasminbildung ohne Beeinträchtigung des Gerinnungssystems notwendig ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich vor allem auf die therapeutische bzw. prophylaktische Behandlung von Menschen, d. h. im Bereich der Humanmedizin. Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung auch in vorteilhafter Weise in der Veterinärmedizin angewendet werden, beispielsweise zur Behandlung von Nutztieren oder Heimtieren, zur Behandlung derselben (oder entsprechender) Krankheiten oder Krankheitszustände wie oben beschrieben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen, oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung, jeweils wie oben definiert, für labormedizinische Zwecke, insbesondere zur Hemmung der Fibrinolyse in labormedizinischen Testverfahren.
Beispiele
Die Erfindung wird anhand der nachfolgend beschriebenen Beispiele näher erläutert:
In den nachfolgend beschriebenen Experimenten wurde eine Lösung verwendet, welche die Proteine ”dBPS1” und ”dBPS2” im Verhältnis (w/w) von ca. 1:3 enthielt. Diese Lösung wird nachfolgend als ”dBPS” bezeichnet.
1) Hemmung der Plasminbildung
Aus gesunden, freiwilligen Probanden gewonnenes normales Plasma (NP) wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen (bis zu x μg (ml)) der erfindungsgemäßen Proteinkombination ”dBPS” behandelt.
Zur Untersuchung des fibrinolytischen Systems wurde die Plasminbildung gemessen, welche als ein geeignetes Maß für die Fibrinolyse dient. Plasmin bewirkt die Spaltung von Fibrin, wie eingangs erwähnt.
Die Plasminbildung wurde in Gegenwart von t-PA (gewebsspezifischer Plasminogenaktivator; 200 U/ml) untersucht. Das Enzym t-PA bewirkt die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin, welches die Fibrinolyse katalysiert. Die enzymatische Aktivität des Plasmins wurde nach Zusatz eines geeigneten Substrates bestimmt.
1 zeigt, dass die Bildung von Plasmin durch Zusatz der erfindungsgemäßen Proteine (dBPS) konzentrationsabhängig gehemmt wurde, verglichen mit dem Kontrollexperiment ”ohne dBPS”.
2) Keine Beeinträchtigung der Thrombinbildung
Zur Untersuchung des Blutgerinnungssystems wurde die Thrombinbildung gemessen, welche als ein geeignetes Maß für die Gerinnung dient. Thrombin bewirkt die Bildung von Fibrin aus löslichem Fibrinogen, wie eingangs erwähnt.
Die Thrombinbildung wurde in der Weise durchgeführt, dass zu dem vorher mit Citrat versetzten NP Calcium im Überschuss zugesetzt wurde, in Gegenwart von Faktor III (= tissue factor; Konzentration: 5 pm), koagulationsfördernden Phospholipiden (4 μm) und einem für Thrombin geeigneten Substrat.
Anmerkung: Faktor III ist ein Gerinnungsfaktor, der die Bildung von Thrombin aus Prothrombin initiiert.
2 zeigt, dass die Thrombinbildung durch den Zusatz der erfindungsgemäßen Proteine (dBPS) nicht beeinträchtigt wurde, und dass diese Proteine somit keinen Einfluss auf das Gerinnungssystem haben, insbesondere keine antikoagulatorische Wirkung herbeiführen.
In weiteren Versuchen wurde bestätigt, dass Trasylol (Aprotinin) in dem oben unter (2) beschriebenen Testsystem antikoagulatorisch wirkt, wie bereits bekannt. Diese unerwünschte Wirkung ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass Aprotinin auf die unterschiedlichsten Proteasen hemmend wirkt und deshalb auch auf verschiedene an der Blutgerinnung beteiligte Proteasen hemmend wirkt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2006/17355 A2 [0012]
WO 2008/110301 [0012]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

DIETRICH W, NICKLISCH M, KOSTER A, VAN DE LOCHT A: CU-2010 – A novel antifibrinolytic protease inhibitor displays also anticoagulant properties. Anesth. Analg. 2009; 108 (SCA Suppl.), 1–104, SCA86 [0012]
FLIGHT SM, JOHNSON LA, DU QS, WARNER RL, TRABI M, GAFFNEY PJ, LAVIN MF, DE JERSEY J, MASCI PP: Textilinin-1, an alternative anti-bleeding agent to aprotinin: Importance of plasmin inhibition in controlling blond loss. British J. of Haematology 145, 207–211 [0012]
NAKNUKOOL, S., HAYAKAWA, S., SUN, Y. and OGAWA, M.: ”Structural and physicochemical characteristics of novel basic Proteins isolated from duck egg white”; Biosci. Biotechnol. Biochem. 72(8) 2008, S. 2082–2091 [0020]
NAKNUKOOL et al. [0021]
NAKNUKOOL et al., a. a. O, Fig. 4 [0024]
NAKNUKOOL et al., a. a. O., Fig. 4 [0026]
Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63–99 (1990) [0032]
Smith und Waterman, J. Mol. Biol. 147, 195–197 (1981) [0032]
Altschul S F et al., J. Mol. Biol. 215, 301–410 (1990), Nucleic Acids Res. 25, 389–3402 (1997) [0032]
www.ncbi.nlm.nih.gov [0032]
NAKNUKOOL et al., a. a. O., S. 2083, ”Protein Purification” [0042]
NAKNUKOOL et al., a. a. O., S. 2083, ”Protein Purification” [0051]

Claims

Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1 (dBPS1), SEQ ID NO: 2 (dBPS2), SEQ ID NO: 3 (Meleagrin), SEQ ID NO: 4 (similar to meleagrin) und Aminosäuresequenzen, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu einer der vorgenannten SEQ ID NOS: 1 bis 4 aufweisen, besteht, oder eine Kombination von mindestens zwei Proteinen, welche jeweils eine der vorstehend genannten Aminosäuresequenzen aufweisen, für die Anwendung in einem Verfahren zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe.
Protein oder Kombination von Proteinen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzidentität mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95% beträgt.
Protein oder Kombination von Proteinen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Aminosäuresequenz mindestens 4, insbesondere 6 Cysteinreste aufweist.
Protein oder Kombination von Proteinen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das/die Protein(e) zwei oder drei Disulfidbrücken aufweist/aufweisen.
Protein oder Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülmasse jeweils im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere 4 bis 6 kDa, liegt.
Protein oder Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der isoelektrische Punkt jeweils größer als 7,0 ist, vorzugsweise größer als 8,0, besonders bevorzugt größer als 9,0 ist.
Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein erstes Protein, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 1 aufweist, sowie ein zweites Protein, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 2 aufweist, umfaßt.
Kombination von Proteinen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülmasse des ersten Proteins und des zweiten Proteins jeweils im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere 4 bis 6 kDa, liegt.
Kombination von Proteinen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie als das genannte erste Protein dBPS1 (SEQ ID NO: 1) und als das genannte zweite Protein dBPS2 (SEQ ID NO: 2) enthält.
Kombination von Proteinen nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Massenanteil des zweiten Proteins mindestens der 1,5-fachen, vorzugweise mindestens der doppelten, besonders bevorzugt mindestens der dreifachen Masse des ersten Proteins entspricht.
Protein oder Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche zur antifibrinolytischen Behandlung, insbesondere zur antifibrinolytischen Prophylaxe, bei Operationen.
Protein oder Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe, insbesondere zur Behandlung oder Prophylaxe eines während oder infolge einer Operation auftretenden Blutverlustes, vorzugsweise bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen, sowie zur antifibrinolytischen Behandlung bei schweren Traumata mit größeren Blutverlusten, bei lokalen Blutungen in der Gynäkologie und Geburtshilfe oder in der Zahnheilkunde oder bei traumatisch-hämorrhagischen Schockzuständen, sowie zur Prophylaxe oder Therapie einer disseminierten intravaskulären Koagulopathie.
Protein oder Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder die Kombination von Proteinen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist.
Protein oder Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das/die Protein(e) mittels gentechnischer Methoden aus einer mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformierten oder transfizierten Wirtszelle hergestellt wurde(n).
Protein oder Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das/die Protein(e) aus tierischem Material, insbesondere aus dem Eiweiß von Vogeleiern, isoliert wurde(n).
Pharmazeutische Zubereitung, welche ein Protein oder eine Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche enthält, zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur anti-fibrinolytischen Prophylaxe, insbesondere zur Behandlung oder Prophylaxe eines während oder infolge einer Operation auftretenden Blutverlustes, vorzugsweise bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen, sowie zur antifibrinolytischen Behandlung bei schweren Traumata mit größeren Blutverlusten, bei lokalen Blutungen in der Gynäkologie und Geburtshilfe oder in der Zahnheilkunde oder bei traumatisch-hämorrhagischen Schockzuständen, sowie zur Prophylaxe oder Therapie einer disseminierten intravaskulären Koagulopathie.
Verwendung eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche, oder einer pharmazeutischen Zubereitung, welche ein solches Protein oder eine solche Kombination enthält, zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur anti-fibrinolytischen Prophylaxe, insbesondere zur Behandlung oder Prophylaxe eines während oder infolge einer Operation auftretenden Blutverlustes, vorzugsweise bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen, sowie zur antifibrinolytischen Behandlung bei schweren Traumata mit größeren Blutverlusten, bei lokalen Blutungen in der Gynäkologie und Geburtshilfe oder in der Zahnheilkunde oder bei traumatisch-hämorrhagischen Schockzuständen, sowie zur Prophylaxe oder Therapie einer disseminierten intravaskulären Koagulopathie.
Verwendung eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen nach einem der vorangehenden Ansprüche, oder einer pharmazeutischen Zubereitung, welche ein solches Protein oder eine solche Kombination enthält, zur Hemmung oder zum Herunterregulieren der Plasminbildung ohne Beeinträchtigung des Gerinnungssystems, insbesondere ohne Beeinträchtigung der Thrombinbildung.
Proteinhaltige Zusammensetzung, welche aus dem Eiweiß von Vogeleiern, vorzugweise von Enteneiern, stammende Bestandteile enthält, wobei diese Bestandteile zumindest ein basisches Protein mit einer Molekülmasse von höchstens 15 kDa, insbesondere von höchstens 10 kDA umfassen, für die Anwendung in einem Verfahren zur antifibrinolytischen Behandlung oder zur antifibrinolytischen Prophylaxe, insbesondere zur Behandlung oder Prophylaxe eines während oder infolge einer Operation auftretenden Blutverlustes, vorzugsweise bei Operationen am offenen Herzen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen, sowie zur antifibrinolytischen Behandlung bei schweren Traumata mit größeren Blutverlusten, bei lokalen Blutungen in der Gynäkologie und Geburtshilfe oder in der Zahnheilkunde oder bei traumatischhämorrhagischen Schockzuständen, sowie zur Prophylaxe oder Therapie einer disseminierten intravaskulären Koagulopathie.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das basische Protein oder zumindest eines der basischen Proteine mindestens 4, insbesondere 6 Cysteinreste aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass der isoelektrische Punkt des/der Proteins/Proteine jeweils größer als 7,0 ist, vorzugsweise größer als 8,0, besonders bevorzugt größer als 9,0 ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülmasse des basischen Proteins bzw. der basischen Proteine jeweils im Bereich von 4 bis 10 kDa, insbesondere 4 bis 6 kDa, liegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwei der genannten basischen Proteine enthält, wobei die Molekülmasse jeweils 4 bis 6 kDa beträgt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das basische Protein oder die basischen Proteine eine Aminosäuresequenz aufweist bzw. aufweisen, wie in den Ansprüchen 1 bis 3 definiert.
Verfahren zur Hemmung der Fibrinolyse, welches einen Schritt aufweist, bei welchem einer Person oder einem Tier, die/das einer antifibrinolytischen Behandlung bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 24 verabreicht wird.
Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe einer Krankheit oder eines Krankheitszustandes, die/der mit Blutungen oder Blutverlusten verbunden ist, und die eine blutstillende Behandlung erfordern, wobei das Verfahren einen Schritt aufweist, bei welchem einer Person oder einem Tier, die/das einer blutstillenden Behandlung bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 19 bis 24 verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der genannten Krankheit um eine generalisierte oder lokale Hyperfibrinolyse handelt.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem genannten Krankheitszustand um einen Blutverlust handelt, der während oder infolge eines chirurgischen Eingriffs auftritt, insbesondere bei kardiochirurgischen Eingriffen und/oder beim Einsatz von Herz-Lungen-Maschinen.
Verwendung eines Proteins oder einer Kombination von Proteinen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einer proteinhaltigen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 24, für labormedizinische Zwecke, insbesondere zur Hemmung der Fibrinolyse in labormedizinischen Testverfahren.