DE102010048476A1

DE102010048476A1 - Hybrid compounds of 4- and 8-aminoquinolines for the prophylactic and therapeutic treatment of malaria and other parasitic diseases

Info

Publication number: DE102010048476A1
Application number: DE102010048476A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Bringmann; Melanie Lödige; Gabriel Pradel; Matthew Lewis; Ann-Kristin Müller; Leane Lehmann; Uta Schurigt; Heidrun Moll; Reto Brun
Original assignee: Universitaet Heidelberg; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Current assignee: Universitaet Heidelberg; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2012-08-23
Also published as: WO2012048894A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Hybridverbindungen aus 4- und 8-Aminochinolinen, Verfahren zu deren Herstellung und ihre medizinischen Verwendungen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die prophylaktischen, kausal- und suppressiv-prophylaktischen sowie therapeutischen Eigenschaften der Hybridverbindungen aus der Klasse der 4- und 8-Aminochinoline auf Malaria-Erreger, Leishmanien und andere Parasiten und deren Verwendung, insbesondere als bioaktive Wirkstoffe für biotechnologische und medizinische Anwendungen.The present invention relates to hybrid compounds from 4- and 8-aminoquinolines, processes for their preparation and their medical uses. The present invention relates in particular to the prophylactic, causal and suppressive prophylactic and therapeutic properties of the hybrid compounds from the class of 4- and 8-aminoquinolines on malaria pathogens, leishmanias and other parasites and their use, in particular as bioactive agents for biotechnological and medical Applications.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Hybridverbindungen aus 4- und 8-Aminochinolinen, Verfahren zu deren Herstellung und ihre medizinischen Verwendungen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die prophylaktischen, kausal- und suppressiv-prophylaktischen sowie therapeutischen Eigenschaften der Hybridverbindungen aus der Klasse der 4- und 8-Aminochinoline auf Malaria-Erreger, Leishmanien und andere Parasiten und deren Verwendung, insbesondere als bioaktive Wirkstoffe für biotechnologische und medizinische Anwendungen.The present invention relates to hybrid compounds of 4- and 8-aminoquinolines, processes for their preparation and their medical uses. The present invention relates in particular to the prophylactic, causal and suppressive-prophylactic and therapeutic properties of the hybrid compounds from the class of 4- and 8-aminoquinolines on malaria pathogens, Leishmania and other parasites and their use, in particular as bioactive agents for biotechnological and medical applications.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Malaria ist eine der verheerendsten tropischen Infektionskrankheiten und die am weitesten verbreitete Protozoenerkrankung. Mehr als eine Million Menschen sterben pro Jahr; hunderte Millionen leiden unter akuten Attacken, oftmals mehrere Male innerhalb eines Jahres, darunter vor allem Kinder und schwangere Frauen im sub-saharischen Afrika.Malaria is one of the most devastating tropical infectious diseases and the most prevalent protozoan disease. More than one million people die each year; Hundreds of millions suffer from acute attacks, often several times within one year, especially children and pregnant women in sub-Saharan Africa.

Verursacht wird Malaria von intrazellulären, einzelligen Parasiten der Gattung Plasmodium. Plasmodien haben einen sehr komplexen Entwicklungszyklus, der zwischen Mücken und Wirbeltieren als Wirt wechselt. Durch einen Mückenstich erfolgt die Transmisson der Sporozoiten in den Wirt. Diese werden über den Blutkreislauf sehr schnell, innerhalb von etwa einer halben Stunde, zur Leber transportiert und entwickeln sich dort in den Leberzellen zu den präerythrozytären Gewebeschizonten, den so genannten Leberstadien. Aus einem einzigen Gewebeschizont können sich Tausende von Merozoiten entwickeln, die dann unter Ruptur der Leberzellen freigesetzt werden und Erythrozyten befallen. In diesen replizieren sie sich synchron, was zu den typischerweise zyklischen Fieberanfällen führt. Unter Zerstörung der roten Blutkörperchen werden wiederum Tausende von Merozoiten freigesetzt, die erneut Erythrozyten befallen und so den Zyklus der asexuellen Reproduktion von neuem in Gang setzen. Weitere hieraus resultierende Symptome einer Malaria-Infektion sind vor allem hämolytische Anämie und Splenomegalie. Plasmodium falciparum, der Erreger der Malaria tropica, ist hierbei die gefährlichste Art, denn durch seine Fähigkeit zur Zytoadhärenz und Kapillarsequestration ist ein tödliches Multiorganversagen möglich.Malaria is caused by intracellular, single-celled parasites of the genus Plasmodium. Plasmodia have a very complex developmental cycle, alternating between mosquitoes and vertebrates as hosts. By a mosquito bite the transmisson of the sporozoites takes place in the host. These are transported via the bloodstream very quickly, within about half an hour, to the liver and develop there in the liver cells to the pre-erythrocytic Gewebeschizonten, the so-called liver stages. Thousands of merozoites can develop from a single tissue scrap, which is then released by rupture of liver cells and infects erythrocytes. In these, they replicate synchronously, which leads to the typically cyclical attacks of fever. In turn, red blood cell destruction kills thousands of merozoites that re-infect erythrocytes, resuming the cycle of asexual reproduction. Other resulting symptoms of malaria infection are mainly hemolytic anemia and splenomegaly. Plasmodium falciparum, the causative agent of malaria tropica, is the most dangerous species here, as its ability to maintain adherence and capillary sequestration can result in fatal multi-organ failure.

Mehr als 90% der laufenden Forschungsprojekte weltweit zielen auf die Entwicklung von Medikamenten gegen die asexuellen Blutstadien von P. falciparum. Derzeit steht kein Arzneistoff zur Verfügung, der alle Entwicklungsstadien und alle Spezies gleichermaßen gut beeinflusst. Eine Malaria-Prophylaxe im engeren Sinn ist nicht möglich, da keine Wirkstoffe zur Verfügung stehen, die eine Infektion verhindern, also an den Sporozoiten selbst angreifen. Kausal-prophylaktisch wirken Stoffe, die die Ausbildung von Gewebeschizonten verhindern und so einen Befall von Erythrozyten vermeiden; ausschließlich Pyrimethamin, Proguanil und Atovaquon verfügen über diese Wirkung [ Wells et al., 2009 ]. Die so genannte suppressive Prophylaxe beinhaltet Verbindungen, die durch blutschizontozide Wirkung das Auftreten klinischer Symptome verhindert. Prophylaktisch nutzbare Substanzen müssen gerade bei längerer Anwendung eine geringe Toxizität und eine ausreichend lange Verweildauer im Körper aufweisen. Ein großer Nachteil ist auch die sehr rasche Resistenzentwicklung gegen verfügbare Arzneimittel in der Behandlung der klinischen Symptome, was eine mögliche prophylaktische Nutzung weiterhin einschränkt. Zur Rezidiv-Prophylaxe bei einer Infektion mit P. vivax wird ausschließlich Primaquin eingesetzt, da es als einziges Malariamittel gegen Hypnozoiten wirksam ist und eine gewebeschizontozide und gametozide Wirkung besitzt [siehe Webseite der FDA:
http://www.accessdata.fda.gor/drugsatfda_docs/label/2008/008316s017Ib1.pdf ].More than 90% of ongoing research projects worldwide are focused on the development of drugs for the asexual blood stages of P. falciparum. At present, no drug is available that affects all stages of development and all species equally well. Malaria prophylaxis in the narrower sense is not possible because no drugs are available that prevent infection, so attack on the sporozoites themselves. Causal-prophylactic substances that prevent the formation of tissue scans and thus avoid an attack of erythrocytes; only pyrimethamine, proguanil and atovaquone have this effect [ Wells et al., 2009 ]. The so-called suppressive prophylaxis contains compounds that prevent the onset of clinical symptoms through schiztozontozide effect. Prophylactic substances must have a low toxicity and a sufficiently long residence time in the body especially with prolonged use. A major disadvantage is the very rapid development of resistance to available drugs in the treatment of clinical symptoms, which further limits a possible prophylactic use. For prevention of recurrence in infection with P. vivax, only primaquine is used because it is the only anti-hypnozoite antimalarial drug with a tissue-secretory and gametocidal effect [see FDA website:
http: //www.accessdata.fda.gor/drugsatfda_docs/label/2008/008316s017Ib1.pdf ].

Primaquin, ein Vertreter der Substanzklasse der 8-Aminochinoline der 2. Generation, hat mit seiner gewebeschizontoziden und transmissionsblockierenden Wirkung grundsätzlich eine kausal-prophylaktische Wirkung und wird seit den 1950er Jahren [ Tekwanie & Wailer, 2006 ] zur Rezidivprophylaxe bei Infektionen mit P. vivax in einer Dosierung von 15 mg (freie Base)/Tag benutzt, da es als einziges Antimalariamittel in der Lage ist, die extrem widerstandsfähigen Hypnozoiten zu eliminieren und somit die Entwicklung von Blutstadien aus diesen zu verhindern. Kontraindiziert ist es bei Patienten, die unter Granulozytopenie, rheumathoider Arthritis oder Lupus erythematodes leiden. Auch bei gleichzeitiger Verabreichung von hämolytisch oder myelosuppressiv wirkenden Arzneistoffen ist die Anwendung untersagt. Patienten, die unter einer Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase- oder einer NADH-Methämoglobin-Reduktase-Defizienz leiden, dürfen Primaquin nur unter strenger Überwachung einnehmen. Problematisch ist hierbei, dass in den endemischen Malaria-Gebieten bis zu 20% der Erkrankten eine solche Defizienz besitzen können [ Beutler & Deparc, 2007 ]. Das Therapieschema sieht aufgrund des sehr schnellen Metabolismus von Primaquin eine 14-tägige tägliche Einnahme vor und geht hierdurch mit einer höheren Akkumulation von möglicherweise toxischen Metaboliten einher. Da aber während der Einnahme zur Elimination der Ruheformen kein direkter Effekt auf die Symptome der Erkrankung sichtbar ist, ist die Compliance häufig nicht ausreichend gut und der Patient führt die Behandlung nicht zu Ende, was die Resistenzentwicklung der Erreger unterstützt. Durch die Weiterentwicklung des Primaquins entstand das auf alle Stadien wirkende Tafenoquin [ Shanks et al., 2001 ], ein 8-Aminochinolin der 3. Generation, welches durch seine längere Halbwertszeit und somit kurze Behandlungsdauer von 2–3 Tagen bezüglich suppressiver und prophylaktischer Wirksamkeit, Compliance und Resistenzen aussichtsreich erscheint und sich zur Zeit in klinischen Studien befindet. Dennoch wurde auch hier eine hämolytische Antwort in zwei G6PD-defizienten Patienten beobachtet, die in einem der Fälle eine Behandlung durch Bluttransfusion nötig machte.Primaquin, a member of the substance class of the 8-aminoquinolines of the 2nd generation, has basically a causal prophylactic effect with its tissue-cytontic and anti-transmission activity and has been used since the 1950s [ Tekwanie & Wailer, 2006 ] is used to prevent recurrence in infections with P. vivax at a dosage of 15 mg (free base) / day, as it is the only antimalarial drug capable of eliminating the extremely resistant hypnozoites and thus preventing the development of blood stages from them. It is contraindicated in patients with granulocytopenia, rheumatoid arthritis or lupus erythematosus. Even with the simultaneous administration of haemolytic or myelosuppressive acting drugs, the application is prohibited. Patients suffering from glucose-6-phosphate dehydrogenase or NADH-methemoglobin reductase deficiency should only take primaquine under close supervision. A problem here is that up to 20% of the patients in the endemic malaria areas can have such a deficiency [ Beutler & Deparc, 2007 ]. The regimen provides for a 14-day daily intake due to the very rapid metabolism of primaquine, which is associated with a higher accumulation of potentially toxic metabolites. However, there is no direct effect on the symptoms of the disease when taken to eliminate the forms of rest compliance is often not good enough and the patient does not complete the treatment, which supports the pathogen resistance development. The further development of primaquine led to the formation of tafenoquin [all stages] Shanks et al., 2001 ], a 3rd generation 8-aminoquinoline, which, due to its longer half-life and thus short treatment period of 2-3 days, appears to be promising in terms of suppressive and prophylactic efficacy, compliance and resistance and is currently in clinical trials. Nevertheless, a haemolytic response was also observed in two G6PD-deficient patients, requiring treatment by blood transfusion in one of the cases.

Chloroquin ist günstig in seiner Bereitstellung und ein sehr sicheres Arzneimittel, wenn es in der richtigen Dosierung verwendet wird. Es wird nach oraler Gabe rasch und nahezu vollständig über den Magen-Darm-Trakt aufgenommen. Der im Plasma gefundene Anteil ist zu 50 bis 60% an Plasmaproteine gebunden und im Verlauf einer Behandlung reichert es sich in den Organen an. Mehr als die Hälfte des aufgenommenen Chloroquins wird unverändert renal ausgeschieden, der Rest in der Leber zu Desethyl-(der Hauptmetabolit, auch mit antimalarialer Aktivität) und Bisdesethyl-Chloroquin umgewandelt. Chloroquin besitzt eine blutschizontozide Wirkung, das heißt es führt zu einer Hemmung im späteren erythrozytären Stadium des Erregers. Chloroquin war einstmals das weltweit am häufigsten verwendete Medikament zur Therapie und Vorbeugung der Malaria, es ist jedoch heutzutage aufgrund resistenter Erreger zunehmend unwirksam.Chloroquine is beneficial in its supply and a very safe medicine when used in the right dosage. It is absorbed quickly and almost completely via the gastrointestinal tract after oral administration. The proportion found in the plasma is bound to 50-60% of plasma proteins and accumulates in the organs during treatment. More than half of the absorbed chloroquine is excreted unchanged renal, the remainder in the liver to desethyl (the main metabolite, also with antimalarial activity) and bisdesethyl-chloroquine converted. Chloroquine has a schiztozontozide effect, that is, it leads to an inhibition in the later erythrocytären stage of the pathogen. Chloroquine was once the world's most widely used drug for the treatment and prevention of malaria, but it is now increasingly ineffective due to resistant pathogens.

Primaquin wirkt nicht nur selbst antimalarial gegen die Parasiten, sondern auch gegen Chloroquin-Resistenzen, indem es die Effluxpumpen, die Chloroquin bei resistenten Erregern wieder aus den Zellen heraus transportieren, beeinflusst [ Edstein et al., 2003 ].Primaquin is not only antimalarial against the parasites, but also against chloroquine resistance, by influencing the efflux pumps that transport chloroquine out of the cells in resistant pathogens [ Edstein et al., 2003 ].

Um mögliche Resistenzentwicklungen weitgehend zu vermeiden, stehen folgende Lösungsansätze zur Verfügung. Durch das Wechseln der Therapieschemata, also der empfohlenen zu applizierenden Medikamente, soll die langfristige Anwendung dieser Arzneistoffe in endemischen Gebieten vermieden werden. Man erhofft sich, dass durch die Reexpansion des Wildtyps der Erreger das Ausbreiten der womöglich bereits mutierten Formen verringert wird [ Egan & Kaschula, 2007 ]. Auch die Weiterentwicklung bereits bekannter Leitstrukturen oder etablierter Wirkstoffe ist eine Möglichkeit, um die Widerstandsfähigkeit der Parasiten zu senken. So genannte ’resistance-reversing agents’ – also bereits in anderen Indikationsgebieten etablierte Arzneistoffe ohne selbst über eine Wirkung gegen die Erreger zu verfügen – sollen die Wirksamkeit an resistenten Stämmen verbessern. Dies gelingt allerdings nur, wenn das Target selbst nicht durch die Resistenzausbildung verändert wurde [Egan & Kaschula, 2007]. Es besteht die Möglichkeit der parallelen Verabreichung des antimalarialen Medikaments und des resistence-reversing agents. Im Jahr 2001 wurde ein Report der WHO veröffentlicht, der die Kombinationstherapie antimalarialer Wirkstoffe empfiehlt, die Monotherapie mit neuen Arzneistoffen ablehnt [ World Health Organization; Antimalarial drug combination therapy. Report of a technical consultation; 2001 ]. Ziel ist die Verbesserung des therapeutischen Effekts und die Verzögerung von Resistenzentwicklungen, durch die gleichzeitige Anwendung von zwei oder mehr blutschizontoziden Arzneistoffen mit verschiedenen Wirkmechanismen und biochemischen Targets, die auch allein appliziert wirksam sind. Problematisch kann hierbei sein, wenn die Halbwertszeiten der beiden Stoffe unterschiedlich lang sind oder sie sich stark in ihrem pharmakokinetischen Profil unterscheiden, d. h. einer der beiden Wirkstoffe bereits vollständig eliminiert ist, während der andere noch in signifikanten Konzentrationen vorliegt. In diesem Fall kann der Erreger Resistenzen gegen einen oder sogar beide Wirkstoffe entwickeln.In order to largely avoid possible development of resistance, the following solutions are available. By changing the therapeutic regimens, ie the recommended drugs to be administered, the long-term use of these drugs in endemic areas should be avoided. It is hoped that re-expansion of the wild-type pathogen will reduce the spread of possibly mutated forms [ Egan & Kaschula, 2007 ]. The further development of already known lead structures or established active substances is one way to reduce the resistance of parasites. So-called 'resistance-reversing agents' - ie drugs already established in other indications without even having an effect against the pathogens - should improve the efficacy of resistant strains. However, this only succeeds if the target itself was not altered by resistance training [Egan & Kaschula, 2007]. There is the possibility of parallel administration of the antimalarial drug and the resistence-reversing agents. In 2001, a report was published by the WHO recommending the combination of antimalarial drugs that reject monotherapy with new drugs [ World Health Organization; Antimalarial drug combination therapy. Report of a technical consultation; 2001 ]. The aim is to improve the therapeutic effect and delay the development of resistance, by the simultaneous use of two or more schizontontide drugs with different mechanisms of action and biochemical targets, which are also applied alone effective. The problem here may be when the half-lives of the two substances are different lengths or they differ greatly in their pharmacokinetic profile, ie one of the two drugs is already completely eliminated, while the other is still present in significant concentrations. In this case, the pathogen can develop resistance to one or even both drugs.

Es besteht somit ein Bedarf an Verbindungen, insbesondere Antimalariamitteln, die die Nachteile der bekannten Wirkstoffe überwinden und eine verbesserte Wirksamkeit aufweisen.Thus, there is a need for compounds, especially antimalarials, that overcome the disadvantages of the known agents and have improved efficacy.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher Verbindungen zu entwickeln, die als effektive und wirksame Wirkstoffe gegen Malaria und weitere parasitäre Erreger geeignet sind und die Nachteile der bekannten Wirkstoffe überwinden, insbesondere die bekannten Resistenzen.The object of the present invention was therefore to develop compounds which are suitable as effective and effective agents against malaria and other parasitic pathogens and overcome the disadvantages of the known active compounds, in particular the known resistances.

Hybridwirkstoffehybrid agents

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Verbindungen der Formel 1 gelöst.The object is achieved by providing the compounds of formula 1.

Erfindungsgemäß umfassen Verbindungen der Formel 1 8-Aminochinolin und 4-Aminochinolin verbunden durch die Linker L¹, L² und L³.According to the invention, compounds of the formula 1 include 8-aminoquinoline and 4-aminoquinoline joined by the linkers L ¹ , L ² and L ³ .

Erfindungsgemäß sind Verbindungen der Formel 1

Verbindungen wobei L¹, L² und L³, die Linker, jeweils ausgewählt sind aus

unsubstituiertem, monosubstituiertem oder polysubstituiertem Alkyl, welches gerade, verzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein kann;
gesättigten, ungesättigten, unsubstituierten, monosubstituierten oder polysubstituierten heterocyclischen Ringsystemen;
unsubstituierten, monosubstituierten, polysubstituierten oder kondensierten Aryl- oder Heteroarylresten, oder
unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Benzyl- oder Acylgruppe (wie Acetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen),

L¹, L² und L³ können jeweils substituiert sein, wobei der Substituent ausgewählt ist aus
Hydroxy- (-OH), Alkoxy- (wie -OMe, -OEt, -OnPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu) oder Acyloxy (wie -OCOMe, -OCOEt, -OCOPh), dessen O-Alkyl- oder O-Acylgruppe verzweigt, unverzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt ist;
Thiol (-SH) oder über ein Schwefelatom gebundene S-Alkyl- (wie SMe, -SEt) oder S-Acylgruppen (wie -SCOMe, -SCOEt, -SCOPh), dessen S-Alkyl oder S-Acylgruppe verzweigt, unverzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein kann;
primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen (wie -NH₂, -NHR, -NRR' mit R, R' = Alkyl, Aryl), primäre, sekundäre oder tertiäre Amidgruppen (wie -NC) und andere Stickstoffsubstituenten (wie -NO₂), oder
Halogen (wie -F, -Cl, -Br, -I), -CN, -CNO, -CNS, -SCN, -OCN, -NC oder anderen funktionellen Gruppen mit Heteroatomen;

R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁹, R¹⁸, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴ sind jeweils ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Substituenten, die ausgewählt sind aus
Halogen (wie -F, -Cl, -Br, -I), -CN, -CNO, -CNS, -SCN, -OCN, -NC oder anderen funktionellen Gruppen mit Heteroatomen (wie Trifluormethan-enthaltende Reste, wie z. B. CF₃, (CH₂)_nCF₃, 3-(Trifluormethyl)-phenoxy)
-H oder substituiertem, monosubstituiertem oder polysubstituiertem Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein kann,
Hydroxy- (-OH), oder Alkoxy- (wie -OMe, -OEt, -OnPr, -OiPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu) oder Acyloxysubstituenten (wie -OCOMe, -OCOEt, -OCOPh), dessen O-Alkyl- oder O-Acylgruppe verzweigt, unverzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt ist,
Thiol (-SH) oder über ein Schwefelatom gebundene S-Alkyl- (wie -SMe, -SEt) oder S-Acylgruppen (wie SCOMe, -SCOEt, -SCOPh),
primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen (wie -NH₂, -NHR, -NRR' mit R, R' = Alkyl, Aryl), primäre, sekundäre oder tertiäre Amidgruppen (wie -NC) und andere Stickstoffsubstituenten (wie -NO₂),
gesättigten, ungesättigten, unsubstituierten, monosubstituierten oder polysubstituierten heterocyclischen Ringsystemen;
unsubstituierten, monosubstituierten, polysubstituierten oder kondensierten Aryl- oder Heteroarylresten, oder
unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Benzyl- oder Acylgruppe (wie Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen),

R⁷, R⁸ sind gleich oder verschieden und sind ausgewählt aus H,
ein oder zwei unsubstituierten, monosubstituierten oder polysubstituierten, gesättigten oder partiell ungesättigten Heterocyclen oder
ein oder zwei Aryl- oder Heteroarylresten (beispielsweise 7-Chloro-chinolin-4-yl oder 6-Methoxychinolin-8-yl) sowie
geraden, verzweigten, cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Alkylresten.According to the invention, compounds of the formula 1

Compounds wherein L ¹ , L ² and L ³ , the linkers, are each selected from

unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted alkyl which may be straight, branched, cyclic, saturated or unsaturated;
saturated, unsaturated, unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted heterocyclic ring systems;
unsubstituted, monosubstituted, polysubstituted or fused aryl or heteroaryl radicals, or
unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl or acyl group (such as acetyl, fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, branched or heteroatom- or aryl-substituted acyl groups),

L ¹ , L ² and L ³ may each be substituted, wherein the substituent is selected from
Hydroxy (-OH), alkoxy (such as -OMe, -OEt, -OnPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu) or acyloxy (such as -OCOMe, -OCOEt, -OCOPh), its O-alkyl branched or unbranched, cyclic, saturated or unsaturated;
Thiol (-SH) or sulfur-bonded S-alkyl (such as SMe, -SEt) or S-acyl groups (such as -SCOMe, -SCOEt, -SCOPh), its S-alkyl or S-acyl branched, unbranched, cyclic , saturated or unsaturated;
primary, secondary or tertiary amino groups (such as -NH ₂ , -NHR, -NRR 'with R, R' = alkyl, aryl), primary, secondary or tertiary amide groups (such as -NC) and other nitrogen substituents (such as -NO ₂ ), or
Halogen (such as -F, -Cl, -Br, -I), -CN, -CNO, -CNS, -SCN, -OCN, -NC or other heteroatom functional groups;

R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ and R ⁹ , R ¹⁸ , R ¹¹ , R ¹² , R ¹³ , R ¹⁴ are each one or more identical or different substituents selected from
Halogen (such as -F, -Cl, -Br, -I), -CN, -CNO, -CNS, -SCN, -OCN, -NC or other functional groups containing heteroatoms (such as trifluoromethane-containing radicals, such as CF ₃ , (CH ₂ ) _n CF ₃ , 3- (trifluoromethyl) phenoxy)
-H or substituted, monosubstituted or polysubstituted alkyl, wherein the alkyl may be straight, branched, cyclic, saturated or unsaturated,
Hydroxy (-OH), or alkoxy (such as -OMe, -OEt, -OnPr, -OiPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu) or acyloxy substituents (such as -OCOMe, -OCOEt, -OCOPh), whose O-alkyl or O-acyl group is branched, unbranched, cyclic, saturated or unsaturated,
Thiol (-SH) or S-alkyl (such as -SMe, -SEt) or S-acyl groups bonded via a sulfur atom (such as SCOMe, -SCOEt, -SCOPh),
primary, secondary or tertiary amino groups (such as -NH ₂ , -NHR, -NRR 'with R, R' = alkyl, aryl), primary, secondary or tertiary amide groups (such as -NC) and other nitrogen substituents (such as -NO ₂ ),
saturated, unsaturated, unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted heterocyclic ring systems;
unsubstituted, monosubstituted, polysubstituted or fused aryl or heteroaryl radicals, or
unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl or acyl group (such as formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, branched or heteroatom or aryl substituted acyl groups),

R ⁷ , R ⁸ are the same or different and are selected from H,
one or two unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted, saturated or partially unsaturated heterocycles or
one or two aryl or heteroaryl radicals (for example, 7-chloro-quinolin-4-yl or 6-methoxyquinolin-8-yl) and
straight, branched, cyclic, saturated or unsaturated alkyl radicals.

Für die Verbindungen der Formel 1 gilt weiterhin
m und o sind jeweils 0 oder 1;
n und p sind jeweils 1 oder 2;
q und r sind jeweils 0 oder 1.For the compounds of formula 1 is still valid
m and o are each 0 or 1;
n and p are each 1 or 2;
q and r are each 0 or 1.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Stereoisomere und deren Gemische, Tautomere, Isomere, physiologisch verträgliche Salze und Solvate davon.The compounds of the invention also include stereoisomers and mixtures thereof, tautomers, isomers, physiologically acceptable salts and solvates thereof.

Die Erfindung betrifft ebenfalls alle möglichen Stereoisomere und deren Gemische. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung die physiologisch verträglichen Salze und Solvate der erfindungsgemäßen Verbindungen.The invention also relates to all possible stereoisomers and mixtures thereof. Furthermore, the present invention encompasses the physiologically tolerated salts and solvates of the compounds according to the invention.

– 4- und 8-Aminochinolin-Bestandteile der Hybridverbindungen- 4- and 8-aminoquinoline components of the hybrid compounds

Bei den 4- und 8-Aminochinolin-„Bausteinen” oder Bestandteilen der erfindungsgemäßen Hybridverbindungen handelt es sich um die pharmazeutisch wirksamen Bestandteile der Verbindungen.The 4- and 8-aminoquinoline "building blocks" or components of the hybrid compounds according to the invention are the pharmaceutically active constituents of the compounds.

Bevorzugt handelt es sich um die Pharmakophore von Primaquin (8-Aminochinolin-Bestandteil) und Chloroquin (4-Aminochinolin-Baustein) oder deren Derivaten, insbesondere mit verschiedenen Substituenten und Substitutionsmustern sowie Weiterentwicklungen, siehe u. a. Tafenoquin und Mefloquin.Preference is given to the pharmacophores of primaquine (8-aminoquinoline component) and chloroquine (4-aminoquinoline component) or derivatives thereof, in particular with different substituents and substitution patterns, as well as further developments, see, inter alia. a. Tafenoquine and mefloquine.

– Wahl der Substituenten- Choice of substituents

Durch die Auswahl der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴ können die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften der Verbindungen insbesondere der Pharmakophore beeinflusst und gesteuert werden.By selecting the substituents R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ and R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² , R ¹³ , R ¹⁴ , the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of the compounds, in particular the Pharmacophores are influenced and controlled.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel 1, wobei die folgenden Substituenten jeweils ausgewählt sind aus:
R¹ Alkoxy, insbesondere Methoxy, Alkyl, insbesondere verzweigt, weiter insbesondere
tBu, Trifluormethan-enthaltende Reste, insbesondere CF₃,
R³ Trifluormethan-enthaltende Reste, insbesondere 3-(Trifluormethyl)-phenoxy;
R⁴ Trifluormethan-enthaltende Reste, insbesondere 3-(Trifluormethyl)-phenoxy;
R⁵ Alkoxy, insbesondere Methoxy;
R¹⁰ Halogen, insbesondere -Cl;
R¹² H, Halogen, insbesondere -Cl, Alkoxy, insbesondere Methoxy, und/oder
R¹³ Alkoxy, insbesondere Methoxy.Preference is given to compounds of the formula 1 where the following substituents are each selected from:
R ¹ alkoxy, in particular methoxy, alkyl, in particular branched, more particularly
tBu, trifluoromethane-containing radicals, in particular CF ₃ ,
R ³ trifluoromethane-containing radicals, in particular 3- (trifluoromethyl) phenoxy;
R ⁴ trifluoromethane-containing radicals, in particular 3- (trifluoromethyl) phenoxy;
R ^{5 is} alkoxy, in particular methoxy;
R ^{10 is} halogen, in particular -Cl;
R ¹² H, halogen, in particular -Cl, alkoxy, in particular methoxy, and / or
R ^{13 is} alkoxy, especially methoxy.

Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen der Formel 1, wobei
R⁵ Alkoxy, insbesondere Methoxy; und/oder
R¹² Halogen, insbesondere -Cl.Particularly preferred are compounds of formula 1, wherein
R ^{5 is} alkoxy, in particular methoxy; and or
R ^{12 is} halogen, in particular -Cl.

– Wahl der Linker- Choice of linker

Durch die Wahl bzw. Variation des Linkers kann die Flexibilität, die Basizität und das Verhältnis der Pharmakophore in den erfindungsgemäßen Verbindungen beeinflusst bzw. gesteuert werden. So können die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften durch die Wahl der Verlinkungen L¹, L² und L³ variiert und optimiert werden.The choice or variation of the linker can influence or control the flexibility, the basicity and the ratio of the pharmacophores in the compounds according to the invention. Thus, the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties can be varied and optimized by the choice of the links L ¹ , L ² and L ³ .

Die Flexibilität eines Moleküls kann für die Bindung an zelluläre Strukturen entscheidend sein. Die Basizität der Hybridwirkstoffe wird variiert, um möglicherweise auftretende Anreicherungseffekte in beispielsweise sauren Kompartimenten wie den so genannten Nahrungsvakuolen der Blutstadien zu beeinflussen. Ganz besonders interessant ist die Wirkungsveränderung durch Variation der Pharmakophor-Verhältnisse.The flexibility of a molecule may be crucial for binding to cellular structures. The basicity of the hybrid active ingredients is varied in order to influence possible enrichment effects in, for example, acidic compartments, such as the so-called food vacuoles of the blood stages. Of particular interest is the change in the effect of variation in the pharmacophore ratios.

Bevorzugt sind die Linker L¹, L², L³ ausgewählt aus den folgenden (weiter bevorzugt ist Linker L¹ ausgewählt aus den folgenden):

wobei s und t sind jeweils 0 bis 30 sind, also 0, 1, 2, 3, 4 ... 30 (jede Zahl im Bereich 0–30) und u 0 bis 6 ist (also 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6). Preferably, the linkers L ¹ , L ² , L ^{3 are} selected from the following (more preferably, linker L ^{1 is} selected from the following):

where s and t are each 0 to 30,

ie

0, 1, 2, 3, 4 ... 30 (each number in the range 0-30) and u is 0 to 6 (

ie

0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6).

– Verhältnis der Pharmakophore in den Hybridverbindungen- Ratio of pharmacophores in the hybrid compounds

Außerdem umfasst die Erfindung auch alle möglichen Hybride gemäß Formel 1, bei denen die Pharmakophore in wechselnden Verhältnissen, beispielsweise Primaquin-Pharmakophor zu Chloroquin-Pharmakophor 1:2 oder 2:1, vorliegen.In addition, the invention also encompasses all possible hybrids according to formula 1 in which the pharmacophores are present in varying ratios, for example primaquine pharmacophore to chloroquine pharmacophore 1: 2 or 2: 1.

Durch die Auswahl der Linker L¹, L² und L³ kann das Verhältnis der Pharmakophore im Hybridmolekül beeinflusst bzw. gesteuert werden und erlaubt somit eine gezielte Beeinflussung und Steuerung der Aktivität und Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Hybridverbindungen.By selecting the linkers L ¹ , L ² and L ³ , the ratio of the pharmacophores in the hybrid molecule can be influenced or controlled and thus allows specific influencing and control of the activity and mode of action of the hybrid compounds according to the invention.

Wichtig ist dies insbesondere, um die Aktivität gegen einzelne der 4 Entwicklungsstadien der Malaria-Erreger speziell zu beeinflussen bzw. zu steuern. Beispielsweise erhöht das Primaquin-Pharmakophor zu Chloroquin-Pharmakophor 2:1 Verhältnis die Aktivität gegen Leberstadien, Sporozoiten und Gametozyten, dennoch ist auch eine verbesserte Blutstadienaktivität zu erwarten.

a) In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Verbindungen den Linker L¹ und q und r = 0; die Linker L² und L³ fehlen. Hier gilt zudem wenn n = 2, dann ist m = 0 und/oder wenn p = 2, dann ist o = 0.

This is particularly important in order to specifically influence or control the activity against individual of the 4 developmental stages of the malaria pathogens. For example, the primaquine pharmacophore to chloroquine-pharmacophore 2: 1 ratio increases activity against liver stages, sporozoites, and gametocytes, yet improved blood stage activity is also expected.

a) In a preferred embodiment, the compounds according to the invention comprise the linker L ¹ and q and r = 0; the linkers L ² and L ³ are missing. In addition, if n = 2, then m = 0 and / or if p = 2, then o = 0.

Bei dieser Ausführungsform erfolgt die direkte Verlinkung über 8-N oder 4-N, was maximal zwei Pharmakophore pro N möglich macht (siehe auch Formeln 1b bis 1d).In this embodiment, the direct linkage is via 8-N or 4-N, which makes a maximum of two pharmacophores per N possible (see also formulas 1b to 1d).

Ausführungsform mit n = 2 (dann m = 0, d. h. R⁷ fehlt), q und r = 0 (d. h. L² und L³ fehlen) und p = 1:

Embodiment with n = 2 (then m = 0, ie R ⁷ is missing), q and r = 0 (ie L ² and L ³ are missing) and p = 1:

Ausführungsform mit n = 1, q und r = 0 (d. h. L² und L³ fehlen) und p = 2 (dann o = 0, d. h. R⁸ fehlt):

Embodiment with n = 1, q and r = 0 (ie L ² and L ³ are missing) and p = 2 (then o = 0, ie R ⁸ is missing):

Eine bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung umfasst 6-Methoxy-8-Aminochinolin und 4-Amino-7-Chloro-chinolin verbunden durch den Linker L¹, mit der Formel 2a

A preferred compound of the invention comprises 6-methoxy-8-aminoquinoline and 4-amino-7-chloro-quinoline joined by the linker L ¹ , of formula 2a

In dieser Verbindung sind q und r = 0 (die Linker L² und L³ fehlen).In this connection q and r = 0 (the linkers L ² and L ³ are missing).

Eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Verbindung ist:

A preferred embodiment of a compound according to the invention is:

Dabei handelt es sich um ein Dualmolekül aus Primaquin- und Chloroquin-Molekülhälften (bzw. deren Pharmakophoren).This is a dual molecule of primaquine and chloroquine moieties (or their pharmacophores).

Weitere Ausführungsformen mit unterschiedlichen Pharmakophor-Verhältnissen sind beispielsweise: – Beispiel für Primaquin zu Chloroquin 2:1:

– Beispiel für Primaquin zu Chloroquin 1:2:

– Beispiel für Primaquin zu Chloroquin 2:2:

b) In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Verbindungen den Linker L¹ und die Linker L² und/oder L³.

Further embodiments with different pharmacophore ratios are, for example: - Example of primaquine to chloroquine 2: 1:

Example of primaquine to chloroquine 1: 2:

- Example of primaquine to chloroquine 2: 2:

b) In further preferred embodiments, the compounds according to the invention comprise the linker L ¹ and the linker L ² and / or L ³ .

Durch die weiteren Linker L² und/oder L³ ist es möglich je nach dem Aufbau von L² und/oder L³ (insbesondere der N-Anzahl) weitere Pharmakophore einzufügen.The further linker L ² and / or L ³ makes it possible, depending on the structure of L ² and / or L ³ (in particular the N number) to insert further pharmacophores.

Es ist auch möglich, dass die

Ausführungsform mit n = 1, q = 0 (d. h. L² fehlt), m = 1, und p und r = 2:
Eine erfindungsgemäße Verbindung umfassend 6-Methoxy-8-Aminochinolin und zwei 4-Amino-7-Chloro-chinoline verbunden durch den Linker L¹ und zwei Linker L³ (r = 2) mit der Formel 3

wobei die zwei Linker L³ gleich oder verschieden sein können.It is also possible that the

Embodiment with n = 1, q = 0 (ie L ² is absent), m = 1, and p and r = 2:
A compound of the invention comprising 6-methoxy-8-aminoquinoline and two 4-amino-7-chloro-quinolines linked by the linker L ¹ and two linkers L ³ (r = 2) of the formula 3

where the two linkers L ^{3 may be the} same or different.

Weitere bevorzugte Verbindungen sind ausgewählt aus

Further preferred compounds are selected from

Verfahren zur Herstellung der HybridwirkstoffeProcess for the preparation of the hybrid active ingredients

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen gelöst.The object is further achieved according to the invention by methods for preparing the compounds of the invention.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind durch Syntheserouten, auch im größeren bis industriellen Maßstab, zugängig. The compounds of the invention are accessible by synthetic routes, also on a larger scale to industrial scale.

Ein wesentlicher Schritt bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Knüpfung der 4-Amino-N-C-Bindung. Diese kann erfindungsgemäß durch Übergangsmetallkatalysierte Kupplung, bevorzugt Buchwald-Hartwig Amininierung, oder durch nukleophile Substitution erfolgen.An essential step in the preparation of the compounds according to the invention is the formation of the 4-amino-N-C bond. This can be done according to the invention by transition-metal-catalyzed coupling, preferably Buchwald-Hartwig aminination, or by nucleophilic substitution.

Bei der Herstellung der Verbindung 1a werden dabei Primaquin (8-[(4-Amin-1-methylbutyl)amino]-6-methoxychinolin) und 4,7-Dichlorchinolin als Ausgangsverbindungen verwendet.In the preparation of compound 1a, primaquine (8 - [(4-amino-1-methylbutyl) amino] -6-methoxyquinoline) and 4,7-dichloroquinoline are used as starting compounds.

Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um „Hybrid-Wirkstoffe”.The compounds according to the invention are "hybrid active ingredients".

Als „Hybrid-Wirkstoffe” versteht man eine chemische Einheit aus zwei oder mehr strukturellen Domänen mit unterschiedlichen biologischen Funktionen. Sie wirken auf verschiedene Weise. Um den verbesserten Effekt von Hybriden im Vergleich zu den Einzelsubstanzen aufzuzeigen, ist es notwendig, dass die einzelnen Vorläufer der Hybrid-Pharmakophore bzw. Muttersubstanzen weniger aktiv sind als das Gesamtmolekül und auch in kombinierter, äquimolarer Applikation der therapeutische Gesamteffekt nicht höher ist als der des zu vergleichenden Dual-Moleküls. Ein konzeptioneller Vorteil dieser Idee in der Arzneimittelforschung ist, dass keine pharmakokinetischen Probleme aufgrund unterschiedlicher LADME-Parameter der Wirkstoffe wie in einer Kombinationstherapie (z. B. ungleiche Plasmaspiegel trotz gleichzeitiger Applikation wegen unterschiedlicher Löslichkeiten der vorliegenden Formulierung) auftreten. Die biologischen Eigenschaften der Einzelsubstanzen müssen im gleichen Konzentrationsbereich auftreten und die Hybridmoleküle sollten metabolisch stabil sein. Die Pharmakokinetik eines Hybridmoleküls ist zudem eher vorhersagbar als die der kombinierten Wirkstoffe.By "hybrid agents" is meant a chemical entity of two or more structural domains with different biological functions. They work in different ways. In order to demonstrate the improved effect of hybrids compared to the individual substances, it is necessary that the individual precursors of the hybrid pharmacophore or parent substances are less active than the total molecule and also in combined, equimolar application of the total therapeutic effect is not higher than that of to be compared dual molecule. A conceptual advantage of this idea in drug discovery is that there are no pharmacokinetic problems due to different LADME parameters of the drugs as in a combination therapy (eg, uneven plasma levels despite concomitant administration due to different solubilities of the present formulation). The biological properties of the individual substances must occur in the same concentration range and the hybrid molecules should be metabolically stable. The pharmacokinetics of a hybrid molecule are also more predictable than those of the combined drugs.

Drei Strategien liegen der Planung eines Hybridmoleküls zu Grunde: Beide Pharmakophore können am selben Target über verschiedene Mechanismen wirken, sie können unabhängig voneinander an zwei verschiedenen und separaten Zielmolekülen binden (’dual prodrug’ im Falle einer labilen Verbindung beider Molekülhälften) oder aber sie wirken an einer Zielstruktur mit zwei verschiedenen Angriffspunkten gleichzeitig.Three strategies underlie the design of a hybrid molecule: Both pharmacophores can act on the same target via different mechanisms, they can independently bind to two different and separate target molecules ('dual prodrug' in the case of a labile link between the two halves of the molecule) or they can work a target structure with two different attack points simultaneously.

Hybrid-Wirkstoffe werden mit einer Geschwindigkeit/Rate absorbiert, im Körper verteilt, metabolisiert und ausgeschieden. Gleichzeitig verabreichte Wirkstoffe können um die Plasmaproteinbindung konkurrieren und sich somit bezüglich ihrer Bioverfügbarkeit gegenseitig beeinflussen. Bei Hybrid-Arzneistoffen bleibt der plasmaproteingebundene Anteil und die Konzentration des freien Hybrids gleich. Das Verhältnis der Pharmakophore in Hybriden ist jedoch fixiert und nicht durch Dosierung variabel, wie es bei Einzelarzneistoffen, die in einer Kombinationstherapie verwendet werden, der Fall ist. Hervorzuheben ist auch, dass die Verknüpfung zweier verschiedener wirksamer Pharmakophore nicht automatisch zu erfolgreichen Hybridmolekülen führt. Häufig geschieht es, dass die individuellen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) der Pharmakophore sich gegenseitig ausschließen, und die SAR der Einzelsubstanzen sich von denen der Hybride grundsätzlich unterscheiden können. Auch bei moderat aktiven Hybriden ist die Möglichkeit zur Aktivitäts-Optimierung aufgrund der engen SAR schwieriger als bei den Einzelsubstanzen.Hybrid agents are absorbed at a rate / rate, distributed throughout the body, metabolized and excreted. Co-administered drugs may compete for plasma protein binding and thus interfere with each other in their bioavailability. For hybrid drugs, the plasma protein bound fraction and the free hybrid concentration remain the same. However, the ratio of pharmacophores in hybrids is fixed and not variable by dosage, as is the case with single drugs used in combination therapy. It should also be emphasized that the combination of two different effective pharmacophores does not automatically lead to successful hybrid molecules. It often happens that the individual structure-activity relationships (SARs) of the pharmacophores are mutually exclusive, and the SARs of the individual substances can be fundamentally different from those of the hybrids. Even with moderately active hybrids, the ability to optimize activity is more difficult due to the narrow SAR than for the individual substances.

In der vorliegenden Erfindung ist es den Erfindern gelungen, die Vorteile der Wirkstoffe Primaquin und Chloroquin innerhalb von Hybridmolekülen zu kombinieren und so auch deren Nachteile zu überwinden.In the present invention, the inventors have succeeded in combining the advantages of the active ingredients primaquine and chloroquine within hybrid molecules and thus also to overcome their disadvantages.

In einer Ausführungsform, einem Hybrid-Wirkstoff bestehend aus dem ursprünglichen Primaquin und dem 4-Amino-7-chlorochinolin-Pharmakophor des Chloroquins wurden als ’proof-of-concept’ alle dargelegten biologischen Untersuchungen durchgeführt, um die Wirkungsweise der Kombination von prophylaktischen und therapeutischen Wirkungen nachzuweisen.In one embodiment, a hybrid drug consisting of the original primaquine and the chloroquine 4-amino-7-chloro-quinoline pharmacophore, all the biological assays set forth to demonstrate the mode of action of the combination of prophylactic and therapeutic as a 'proof-of-concept' To prove effects.

Primaquin wird sehr rasch durch oxidative Desaminierung zum unwirksamen Carboxyprimaquin verstoffwechselt. Ringoxidierte Metabolite sind ebenfalls bekannt. Chloroquin wird zu 40 bis 70% unverändert renal ausgeschieden, der Rest zum Hauptmetabolit Desethylchloroquin oder zum Bisdesethylchloroquin in der Leber biotransformiert. Dies zeigt die metabolische Stabilität der 4-Amino-Kohlenstoff-Bindung der Chloroquin-Substruktur und auch die Stabilität der 8-Amino-Kohlenstoff-Bindung. In den Hybriden der allgemeinen Formel 1, Beispiel Ausführungsform 1a, wird die metabolische Stabilität der Verlinkung und somit die Verlängerung der Wirksamkeit der Primaquin-Komponente erreicht, da eine Verstoffwechselung zum Carboxyprimaquin unwahrscheinlich erscheint. Weiterhin kann die Halbwertszeit der Hybride im Vergleich zum Primaquin und Chloroquin durch die vorgenommene Variation der hydro- bzw. lipophilen Eigenschaften verändert werden. Primaquine is metabolized very rapidly by oxidative deamination to the inactive carboxyprimaquine. Ring-oxidized metabolites are also known. Chloroquine is excreted unchanged in 40 to 70% renal, the remainder biotransformed to the main metabolite desethylchloroquine or bisdesethylchloroquine in the liver. This demonstrates the metabolic stability of the 4-amino-carbon bond of the chloroquine substructure and also the stability of the 8-amino-carbon bond. In the hybrids of general formula 1, example embodiment 1a, the metabolic stability of the linkage and thus the prolongation of the efficacy of the primaquine component is achieved since a metabolism to carboxyprimaquine seems unlikely. Furthermore, the half-life of the hybrids compared to the primaquine and chloroquine can be changed by the variation of the hydro- or lipophilic properties.

Durch Variierung der Verknüpfung der beiden Molekülhälften werden die pharmkodynamischen und -kinetischen Eigenschaften der Dualmoleküle optimiert.By varying the linkage of the two halves of the molecule, the pharmacodynamic and kinetic properties of the dual molecules are optimized.

Durch die Hybridverbindungen aus Primaquin- und Chloroquin-Pharmakophoren wird die Gesamtwirkung auf Gewebe- und Blutstadien sowie sexuelle Stadien und Sporozoiten ausgeweitet; es konnte eine gute Wirksamkeit bei resistenten Stämmen nachgewiesen werden und die Verringerung der Resistenzbildung durch Ausweitung der Stadienwirksamkeit ermöglicht.The hybrid compounds of primaquine and chloroquine pharmacophores increase the overall effect on tissue and blood stages as well as sexual stages and sporozoites; it has been shown to be effective in resistant strains and to facilitate the reduction of resistance by extending staging efficiency.

Die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen der allgemeinen Formel 1 zeigen Wirkungen auf die Blutstadien des Parasiten und sind somit zur klassischen Behandlung der klinischen Symptome geeignet. Desweiteren sind sie aktiv gegen Sporozoiten, sie hemmen deren Beweglichkeit und somit deren hohe Geschwindigkeit, mit denen die Erreger in die Blutbahn eindringen und sich so der körpereigenen Immunabwehr, der Phagozytose durch Immunzellen der Haut, entziehen. Das Eindringen der Parasiten in die Leberzellen und auch die Entwicklung der so genannten Leberstadien wird von ihnen negativ beeinflusst, d. h. die erfindungsgemäßen Verbindungen erschweren das Eindringen und deren Entwicklung. Somit zeigen diese Verbindungen nicht nur einen suppressiv-therapeutischen Effekt, sondern wirken auch prophylaktisch im eigentlichen Sinne.The hybrid compounds of the general formula 1 according to the invention have effects on the blood stages of the parasite and are thus suitable for the classical treatment of the clinical symptoms. Furthermore, they are active against sporozoites, they inhibit their mobility and thus their high speed, with which the pathogens penetrate into the bloodstream and thus withdraw the body's own immune system, the phagocytosis by immune cells of the skin. The penetration of the parasites into the liver cells and also the development of the so-called liver stages is negatively influenced by them, d. H. the compounds according to the invention make it difficult to penetrate and to develop them. Thus, these compounds not only have a suppressive-therapeutic effect, but also act prophylactically in the true sense.

Mit der vorliegenden Erfindung wird somit eine neue bioaktive und synthetisch herstellbare Substanzklasse der Hybridmoleküle aus 4- und 8-Aminochinolinen zur Verfügung gestellt; ferner werden Verfahren zu deren Herstellung und auch zu deren Verwendung präsentiert.The present invention thus provides a new bioactive and synthetically producible substance class of the hybrid molecules of 4- and 8-aminoquinolines; furthermore, methods for their production and also for their use are presented.

Besonders hervorzuheben ist, dass die Wirkung der Hybridmoleküle in vitro auf Blutstadien, Leberstadien, Sporozoiten und Gametozyten von P. falciparum und/oder P. berghei sowie in vivo gegen P. berghei und auch die Aktivität gegen L. major und donovani nachgewiesen wurde, auch im Vergleich zur Kombinationsverabreichung der Arzneistoffe und deren Pharmkophore.Of particular note is that the effect of the hybrid molecules in vitro on blood stages, liver stages, sporozoites and gametocytes of P. falciparum and / or P. berghei as well as in vivo against P. berghei and also the activity against L. major and donovani has also been demonstrated compared to combination administration of the drugs and their pharmacophores.

Hybridmoleküle der allgemeinen Formel 1 und dadurch bestehend aus dem Pharmakophor des Chloroquins und des Primaquins mit mindestens zwei verschiedenen Wirkmechanismen, und verbunden über Linkersysteme mit unterschiedlichen pharmakokinetischen und -dynamischen Eigenschaften, wurden an erythrozytären und exoerythrozytären Stadien des humanen Erregers Plasmodium falciparum und des Malaria-Modellorganismus Plasmodium berghei, einem Nagetiererreger, in vitro in Whole-cell-based-Assays sowie in In-vivo-Studien an Mäusen (Inzuchtstämme, C57B1/6) untersucht.Hybrid molecules of general formula 1 and consisting of the pharmacophore of chloroquine and primaquine with at least two different mechanisms of action, and connected via linker systems with different pharmacokinetic and -dynamischen properties, were at erythrocytic and exoerythrocytären stages of the human pathogen Plasmodium falciparum and the malaria model organism Plasmodium berghei, a rodent pathogen, was studied in vitro in whole-cell-based assays as well as in in vivo studies in mice (inbred strains, C57B1 / 6).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch folgende Eigenschaften aus:

– prophylaktische (Effekte auf die infektiösen Sporozoiten),
– kausalprophylaktische (Aktivität gegen intrazelluläre prä-erythrozytäre Stadien; Leberstadien) und
– suppressivprophylaktische (durch Wirkung gegen Blutstadien) sowie
– therapeutische Wirksamkeit/Aktivität.

The compounds according to the invention are characterized by the following properties:

- prophylactic (effects on the infectious sporozoites),
- causal prophylactic (activity against intracellular pre-erythrocytic stages, liver stages) and
- suppressive prophylactic (by action against blood stages) as well
- therapeutic efficacy / activity.

Pharmazeutische ZusammensetzungenPharmaceutical compositions

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von pharmazeutischen Zusammensetzungen gelöst, die eine erfindungsgemäße Verbindung oder deren pharmazeutisch akzeptable Salze und gegebenenfalls akzeptable Träger und/oder Hilfsstoffe umfassen.The object is further achieved according to the invention by the provision of pharmaceutical compositions comprising a compound of the invention or its pharmaceutically acceptable salts and optionally acceptable carriers and / or excipients.

Bevorzugt umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung eine der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie hierin definiert, sowie pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Hilfsstoffe.Preferably, a pharmaceutical composition comprises any of the compounds of the invention as defined herein, as well as pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients.

Bevorzugterweise haben diese pharmazeutische Zusammensetzungen eine Einheits-Dosierungsform, wie Tabletten, Dragees, Pillen, Kapseln, Pulver, Granulat, sterile parenterale Lösungen oder Suspensionen. Weitere Dosierungsformen sind dem Fachmann bekannt. Preferably, these pharmaceutical compositions have a unit dosage form such as tablets, dragees, pills, capsules, powders, granules, sterile parenteral solutions or suspensions. Further dosage forms are known to the person skilled in the art.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mit den üblichen Lösungsmitteln, Hilfs- und Trägerstoffen zu pharmazeutischen Zusammensetzungen verarbeitet werden, wie in Form von Tabletten, Dragees, Pillen, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektion- und Infusionszubereitungen, um therapeutisch zur peroralen, rektalen, transdermalen oder parenteralen Applikation Verwendung zu finden.The compounds according to the invention can be processed with the customary solvents, excipients and carriers into pharmaceutical compositions, such as in the form of tablets, dragees, pills, capsules, dripping solutions, suppositories, injection and infusion preparations, for oral, rectal, transdermal or parenteral therapy Application to find use.

Ein Arzneimittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst eine therapeutisch aktive Menge des Wirkstoffs, d. h. eine therapeutische aktive Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung. Ein Fachmann ist in der Lage anhand der zu behandelnden Erkrankung und unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten die therapeutisch aktive Menge zu ermitteln. Ein Arzneimittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung kann geeigneterweise zwischen ungefähr 0,1 und 1000 mg, bevorzugterweise ungefähr 1 bis 500 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung beinhalten.A pharmaceutical or pharmaceutical composition comprises a therapeutically active amount of the active ingredient, i. H. a therapeutically active amount of a compound of the invention. A person skilled in the art is able to determine the therapeutically active amount on the basis of the disease to be treated and taking into account the condition of the patient. A drug or pharmaceutical composition may suitably contain between about 0.1 and 1000 mg, preferably about 1 to 500 mg of a compound of the invention.

Der pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Hilfsstoff kann eine große Vielzahl von Formen in Abhängigkeit von dem gewünschten Weg der Verabreichung (z. B. oral, parenteral, rektal, transdermal, kutan) haben. Geeignete Träger und Hilfsstoffe sind im Stand der Technik bekannt und können von einem Fachmann ausgewählt werden. Träger schließen inerte pharmazeutische Arzneistoffträger, wie Bindemittel, Suspensionsmittel, Gleitmittel, Geschmacksmittel, Süßstoffe, Konservierungsmittel, Farbstoffe und Beschichtungen, ein.The pharmaceutically acceptable carrier and / or adjuvant may have a wide variety of forms depending on the desired route of administration (e.g., oral, parenteral, rectal, transdermal, cutaneous). Suitable carriers and excipients are known in the art and may be selected by one skilled in the art. Carriers include inert pharmaceutical excipients such as binders, suspending agents, lubricants, flavorings, sweeteners, preservatives, dyes and coatings.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in einer Menge vorliegt, so dass ein Konzentrationsbereich von bevorzugt 0,001 bis 100 μM, weiter bevorzugt von 0,01 bis 10 μM bei einer Behandlung in vivo vorliegt.The pharmaceutical compositions according to the invention are further characterized in that the compound is present in an amount such that a concentration range of preferably 0.001 to 100 μM, more preferably from 0.01 to 10 μM in a treatment in vivo.

Bevorzugt sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur peroralen, rektalen, transdermalen oder parenteralen Applikation.The pharmaceutical compositions are preferred for peroral, rectal, transdermal or parenteral administration.

Medizinische Verwendungen der Verbindungen und ZusammensetzungenMedical uses of the compounds and compositions

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen der erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung als Arzneimittel gelöst.The object is further achieved according to the invention by providing the compounds of the invention or pharmaceutical compositions for use as medicaments.

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen der erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Infektionen mit Malaria- und Leishmaniose-Erregern und anderen protozoalen Erregern gelöst.The object is further achieved according to the invention by providing the compounds of the invention or pharmaceutical compositions for use in the prophylactic and / or therapeutic treatment of infections with malaria and leishmaniasis and other protozoal agents.

Bei den Malaria-Erregern handelt es sich um Erreger der Gattung Plasmodium (wie Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale und Plasmodium malariae sowie Plasmodium knowlesi, aber auch Plasmodium berghei).The malaria pathogens are pathogens of the genus Plasmodium (such as Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale and Plasmodium malariae and Plasmodium knowlesi, as well as Plasmodium berghei).

Bei den protozoalen Leishmaniose-Erregern handelt es sich um Erreger der Gattung Leishmania (wie L. major, L. donovani, L. tropica, L. infantum, L. aethiopica).The protozoal leishmaniasis pathogens are pathogens of the genus Leishmania (such as L. major, L. donovani, L. tropica, L. infantum, L. aethiopica).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen sind zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Infektionen mit den Erregern der Gattung Plasmodium und/oder von Leishmaniose sowie anderen protozoalen Erkrankungen geeignet.The compounds or pharmaceutical compositions of the invention are useful for the prophylactic and / or therapeutic treatment of infections with the pathogens of the genus Plasmodium and / or leishmaniasis, as well as other protozoal diseases.

Sie sind insbesondere zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Malaria und/oder Leishmnaniose und anderen protozoalen Erkrankungen geeignet.They are particularly suitable for the prophylactic and / or therapeutic treatment of malaria and / or Leishmnaniose and other protozoal diseases.

Die Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Malaria umfasst eine Wirkung auf Gewebe- und Blutstadien sowie sexuelle Stadien (Gametozyten) und Sporozoiten der Erreger der Gattung Plasmodium.The use in the prophylactic and / or therapeutic treatment of malaria includes an effect on tissue and blood stages as well as sexual stages (gametocytes) and sporozoites of the pathogens of the genus Plasmodium.

Durch die erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere Hybridverbindungen aus Primaquin- und Chloroquin-Pharmakophoren, wird die Gesamtwirkung auf Gewebe- und Blutstadien sowie sexuelle Stadien und Sporozoiten ausgeweitet; es konnte eine gute Wirksamkeit bei resistenten Stämmen nachgewiesen werden und die Verringerung der Resistenzbildung durch Ausweitung der Stadienwirksamkeit ermöglicht. Die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen zeigen Wirkungen auf die Blutstadien des Malaria-Parasiten und sind somit zur klassischen Behandlung der klinischen Symptome geeignet. Desweiteren sind sie aktiv gegen Sporozoiten, sie hemmen deren Beweglichkeit und somit deren hohe Geschwindigkeit, mit denen die Erreger in die Blutbahn eindringen und sich so der körpereigenen Immunabwehr, der Phagozytose durch Immunzellen der Haut, entziehen. Das Eindringen der Parasiten in die Leberzellen und auch die Entwicklung der so genannten Leberstadien wird von ihnen negativ beeinflusst. Somit zeigen diese Verbindungen nicht nur einen suppressiv-therapeutischen Effekt, sondern wirken auch prophylaktisch im eigentlichen Sinne.The compounds according to the invention, in particular hybrid compounds of primaquine and chloroquine pharmacophores, extend the overall action to tissue and blood stages as well as sexual stages and sporozoites; it has been shown to be effective in resistant strains and reducing the development of resistance by extending the staging efficiency. The hybrid compounds according to the invention show effects on the blood stages of the malaria parasite and are thus suitable for the classical treatment of the clinical symptoms. Furthermore, they are active against sporozoites, they inhibit their mobility and thus their high speed, with which the pathogens penetrate into the bloodstream and thus withdraw the body's own immune system, the phagocytosis by immune cells of the skin. The infiltration of the parasites into the liver cells and also the development of the so-called liver stages is negatively influenced by them. Thus, these compounds not only have a suppressive-therapeutic effect, but also act prophylactically in the true sense.

Besonders hervorzuheben ist, dass die Wirkung der erfindungsgemäßen Hybridmoleküle in vitro auf Blutstadien, Leberstadien, Sporozoiten und Gametozyten von P. falciparum und/oder P. berghei sowie in vivo gegen P. berghei und auch die Aktivität gegen L. major und donovani nachgewiesen wurde, auch im Vergleich zur Kombinationsverabreichung der Arzneistoffe und deren Pharmkophore.It is particularly noteworthy that the effect of the hybrid molecules according to the invention was demonstrated in vitro on blood stages, liver stages, sporozoites and gametocytes of P. falciparum and / or P. berghei as well as in vivo against P. berghei and also the activity against L. major and donovani. also in comparison to the combination administration of the drugs and their pharmacophores.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen weiter verdeutlicht, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die zitierten Referenzen sind hiermit durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.The present invention will be further clarified in the following figures and examples without, however, being limited thereto. The cited references are hereby fully incorporated by reference.

Figurencharacters

1. In vitro Gliding-Motility Assay an Sporozoiten aus Plasmodium berghei.
(A) Einfluß von Verbindung 1a auf die Gleitbewegung (Kontrolle = Wildtyp);
(B) Einfluss der Kontroll-Substanzen auf die Gleitbewegung. 1 , In vitro gliding motility assay on sporozoites from Plasmodium berghei.
(A) Influence of compound 1a on sliding motion (control = wild-type);
(B) Influence of the control substances on the sliding movement.

2. EEF(exoerythrozytäre-Formen)-Entwicklungsasay der Plasmodium berghei Leberstadien.
(A) Ergebnisse des Invasion-Assays; Einfluß der Substanz 1a auf das Invasionsverhalten der P. berghei Sporozoiten in Leberzellen
(B) Darstellung der Leberstadien-Größe in der Immunfluoreszenz; α-HSP70 = Anti-HSP70-Antikörper, DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol) zur Zellkernfärbung; Einfluß der Substanz 1a auf die Differenzierung der P. berghei Leberstadien innerhalb der Leberzelle. Substanz 1a induziert einen Defekt in der Leberstadienentwicklung, was sich in einer verminderten Größe des intrazellulären Parasiten darstellt.
(C) Ergebnisse der intrahepatischen Entwicklung der Parasiten (Substanz 1a und Wirkstoffkontrollen; WT = Wildtyp). Einfluß der Substanz 1a auf den Differenzierungs- sowie Entwicklungsstatus der P. berghei Leberstadien innerhalb der Leberzelle. 2 , EEF (exoerythrocytic forms) developmental assays of Plasmodium berghei liver stages.
(A) results of the invasion assay; Influence of substance 1a on the invasive behavior of P. berghei sporozoites in liver cells
(B) Liver stage size in immunofluorescence; α-HSP70 = anti-HSP70 antibody, DAPI (4 ', 6-diamidin-2-phenylindole) for nuclear staining; Influence of substance 1a on the differentiation of P. berghei liver stages within the liver cell. Substance 1a induces a defect in liver stage development, resulting in a decreased size of the intracellular parasite.
(C) Results of the intrahepatic development of the parasites (substance 1a and drug controls, WT = wild-type). Influence of substance 1a on the differentiation and development status of the P. berghei liver stages within the liver cell.

3. In-vivo Aktivitäten gegen P. berghei.
(A) %-Protektion;
(B) Effekt auf die asexuelle Vermehrung von P. berghei-Blutstadien in vivo
(C) In-vivo-Aktivität gegen Blutstadien des Parasiten. 3 , In vivo activities against P. berghei.
(A)% protection;
(B) Effect on asexual augmentation of P. berghei blood stages in vivo
(C) In vivo activity against blood stages of the parasite.

4. Herstellung der bioaktiven Verbindung 1a
(A) Darstellung des Dualmoleküls 1a durch Buchwald-Hartwig-Aminierung;
(B) Synthese des Hybrids 1a durch nucleophile Substitution unter ’neat’-Bedingungen. 4 , Preparation of bioactive compound 1a
(A) Representation of dual molecule 1a by Buchwald-Hartwig amination;
(B) Synthesis of hybrid 1a by nucleophilic substitution under 'neat' conditions.

5. Synthese von weiteren dualen Molekülen aus Primaquin und Chloroquin. 5 , Synthesis of other dual molecules from primaquine and chloroquine.

6. Synthese von dualen Molekülen aus Primaquin und Chloroquin mit verschiedenen Linkern. 6 , Synthesis of dual molecules of primaquine and chloroquine with different linkers.

BeispieleExamples

Beispiel 1 Biologische AktivitätenExample 1 Biological Activities

Getestet wurden folgende Verbindungen: Verbindung 1a:

sowie Muttersubstanzen Primaquin (8), Chloroquin (9) und deren Pharmakophore (6, 7):

The following compounds were tested: Compound 1a:

and parent substances primaquine (8), chloroquine (9) and their pharmacophores (6, 7):

1.1 Wirkung gegen Parasiten der Gattung Plasmodien (In-vitro-Untersuchungen)1.1 Action against parasites of the genus Plasmodia (in vitro studies)

A) Wirkung gegen erythrozytäre Stadien von Plasmodium falciparumA) Action against erythrocytic stages of Plasmodium falciparum

Protokoll für den Stamm K1Protocol for strain K1

Für die Bestimmung der antiplasmodialen Aktivitäten wurden Kulturen des Plasmodium falciparum Stammes K1 (resistent gegen Chloroquin und Pyrimethamin) verwendet. Es wurde eine Modifikation ( R. G. Ridley, W. Hofheinz, H. Matile, C. Jacquet, A. Dorn, R. Masciadri, S. Jolidon, W. F. Richter, A. Guenzi, M. A. Girometta, H. Urwyler, W. Huber, S. Thaitong, W. Peters; Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40, 1846–1854 ) des ³[H]-Hypoxanthin-Einbau-Tests ( R. E. Desjardins, C. J. Canfield, D. Haynes, J. Chulay; Antimicrob. Agents Chemother. 1979, 16, 710–718 ) verwendet. Mit P. falciparum infizierte menschliche rote Blutkörperchen (0.3% Infektion) bei einem Haematokrit von 2.5% (Volumenanteil der roten Blutzellen) in RPMI 1640 Medium mit dem Serumersatz Albumax II (5 g/l) wurden mit seriellen Verdünnungsreihen der Wirkstoffe in Mikrotiterplatten 48 Stunden lang bei 37°C, unter einer CO₂-angereicherten und O₂-reduzierten Atmosphäre inkubiert. Dann wurde zu jedem Well der Miktrotiterplatte 0.5 μCi ³[H]-Hypoxanthin hinzugegeben, und nach weiteren 24 Stunden Inkubationszeit wurden die Wells mit einem Betaplate Cell Harvester auf Glasfaserfiltern abgeerntet und mit destilliertem Wasser lysiert. Die Inkorporation von radiomarkiertem Hypoxanthin (die mit der Quantität lebender Parasiten korreliert) wurde mit Hilfe eines Szintillationszählers bestimmt. Der IC₅₀-Wert wurde aus sigmoidalen Inhibitionskurven bestimmt. Die Tests wurden im Duplikat durchgeführt und mindestens einmal wiederholt. Als Kontrolle (100% Inkorporation) dienten Parasitenkulturen ohne Zusatz, als Positivkontrolle Kulturen mit einer Verdünnungsreihe von Chloroquin.Cultures of Plasmodium falciparum strain K1 (resistant to chloroquine and pyrimethamine) were used for the determination of antiplasmodial activities. It was a modification ( RG Ridley, W. Hofheinz, H. Matile, C. Jacquet, A. Dorn, R. Masciadri, S. Jolidon, WF Richter, A. Guenzi, MA Girometta, H. Urwyler, W. Huber, S. Thaitong, W Peters; Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40, 1846-1854 ) of the ³ [H] -hypoxanthine incorporation assay ( RE Desjardin, CJ Canfield, D. Haynes, J. Chulay; Antimicrob. Agents Chemother. 1979, 16, 710-718 ) used. P. falciparum-infected human red blood cells (0.3% infection) at 2.5% hematocrit (red blood cell volume fraction) in RPMI 1640 medium with serum replacement albumax II (5 g / l) were serial serially diluted in microtiter plates for 48 hours long at 37 ° C, incubated under a CO ₂ -enriched and O ₂ -reduced atmosphere. Then 0.5 μCi of ³ [H] -Hypoxanthin was added to each well of the microtiter plate, and after a further 24 hours of incubation, the wells were harvested on glass fiber filters with a Betaplate Cell Harvester and lysed with distilled water. The incorporation of radiolabelled hypoxanthine (which correlates with the quantity of live parasites) was determined using a scintillation counter. The IC ₅₀ value was determined from sigmoidal inhibition curves. The tests were performed in duplicate and repeated at least once. As a control (100% incorporation) parasite cultures without additive served as positive control cultures with a dilution series of chloroquine.

Protokoll für die Stämme 3D7 und Dd2, Malstat assayProtocol for strains 3D7 and Dd2, Malstat assay

Für die Bestimmung der antiplasmodialen Aktivitäten wurden Kulturen des chloroquinsensitiven Plasmodium falciparum Stammes 3D7 und chloroquinresistenten Stammes Dd2 verwendet. Die Viabilität der Parasiten wurde mit Hilfe des Malstat-Assays nachgewiesen ( Goodyer et al., 1997 ; Makler et al., 1993, 1998 ), der auf dem Nachweis von Plasmodium-spezifischer Laktatdehydrogenase beruht. Synchronisierte Ringstadien wurden bei 1% Parasitämie und einem Haematokritwert von 5% in RPMI 1640-Medium mit dem Serumersatz Albumax II (5 g/L) in einer 96-Well-Mikrotiterplatte ausplattiert. Der Wirkstoff wurde in einer seriellen Verdünnungsreihen (zwischen 640 pM–50 μM, gelöst in DMSO, DMSO-Konzentration betrug 0.5%) zugegeben und die Platte in einem befeuchten, luftdichten Exsikkator mit 5% CO₂/5% O₂ in N₂ begast und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Parasitenkulturen in der Platte resuspendiert und jeweils 20 μL der Kultur in eine neue 96-Wellplatte überführt. Pro Well wurden 100 μL Malstat-Lösung sowie 20 μL eines 1:1 Gemisches aus NBT-Lösung und Diaphorase-Lösung zugefügt und die Platten für 30 bis 50 Minuten schüttelnd inkubiert. Anschließend wurde die Farbreaktion sofort bei einer Wellenlänge von 630 nm im ELISA-Reader gemessen. Der IC₅₀-Wert wurde aus sigmoidalen Inhibitionskurven mit dem GraphPad Prism4 Programm bestimmt. Die Tests wurden im Dreifachansatz durchgeführt und mindestens einmal wiederholt. Als Negativkontrolle diente 0.5% DMSO, als Positivkontrolle eine Verdünnugsreihe von Chloroquin. Tabelle 1 Wirkung gegen erythrozytäre Stadien von Plasmodium falciparum Substanz Dd2 [μM] IC₅₀ P. falc. 3D7 [μM] IC₅₀ P. falc. IC₅₀ P. falc. K1 [μM] 1a 0.640 0.576 0.090 6 50–10 50–10 > 5 7 4.040 2.698 0.698 8 3.112 0.777 0.627 9 0.026 0.261 0.209 6 + 7 4.924 2.411 0.681 8 + 9 0.026 0.189 0.169 Cultures of the chloroquine-sensitive Plasmodium falciparum strain 3D7 and chloroquine-resistant strain Dd2 were used for the determination of antiplasmodial activities. The viability of the parasites was demonstrated by the Malstat assay ( Goodyer et al., 1997 ; Makler et al., 1993, 1998 ) based on the detection of Plasmodium-specific lactate dehydrogenase. Synchronized ring stages were at 1% parasitemia and 5% hematocrit in RPMI 1640 medium with the serum replacement Albumax II (5 g / L) plated in a 96-well microtiter plate. The active ingredient was added in a serial dilution series (between 640 pM-50 μM, dissolved in DMSO, DMSO concentration was 0.5%) and the plate gassed in a humid, airtight desiccator with 5% CO ₂ /5% O ₂ in N ₂ and incubated at 37 ° C for 72 hours. At the end of the incubation period, the parasite cultures were resuspended in the plate and 20 μL each of the culture transferred to a new 96-well plate. 100 μL of Malstat solution and 20 μL of a 1: 1 mixture of NBT solution and diaphorase solution were added per well and the plates were incubated shaking for 30 to 50 minutes. Subsequently, the color reaction was measured immediately at a wavelength of 630 nm in the ELISA reader. The IC ₅₀ value was determined from sigmoidal inhibition curves using the GraphPad Prism4 program. The tests were performed in triplicate and repeated at least once. The negative control used was 0.5% DMSO, and the positive control was a dilution series of chloroquine. Table 1 Action against erythrocytic stages of Plasmodium falciparum Substance Dd2 [μM] IC ₅₀ P. falc. 3D7 [μM] IC ₅₀ P. falc. IC ₅₀ P. falc. K1 [μM] 1a 0640 0576 0090 6 50-10 50-10 > 5 7 4040 2698 0698 8th 3112 0777 0627 9 0026 0261 0209 6 + 7 4924 2411 0681 8 + 9 0026 0189 0169

Diese IC₅₀-Werte demonstrieren die guten antiplasmodialen Eigenschaften der Verbindung 1a bei Infektionen mit P. falciparum.These IC ₅₀ values demonstrate the good antiplasmodial properties of compound 1a in P. falciparum infections.

Im Stamm 3D7 (Chloroquin sensitiver Stamm) zeigte 1a eine Aktivität, die mit ihrem IC₅₀-Wert = 0.640 μM deutlich (5-fach) über Primaquin (IC₅₀-Wert = 3.112 μM) liegt. Im Vergleich zu Chloroquin (IC₅₀-Wert = 0.026 μM) ist die Substanz 25-fach weniger wirksam, zeigt aber dennoch gute Aktivitäten, die deutlich unter 1 μM liegen.In strain 3D7 (chloroquine sensitive strain), 1a showed an activity that was clearly (5-fold) above primaquine (IC ₅₀ = 3.112 μM) with its IC ₅₀ value = 0.640 μM. Compared to chloroquine (IC ₅₀ value = 0.026 μM), the substance is 25-fold less effective, but still shows good activities that are well below 1 μM.

Im Vergleich zur gleichzeitigen, äquimolaren Applikation der beiden Pharmakophore, die Substanzen 6 und 7 mit einem IC₅₀-Wert von 4.924 μM, zeigt sich Substanz 1a aktiver. Die Kombination der beiden Muttersubstanzen Primaquin (8) und Chloroquin (9) zeigen weder einen additiven noch einen synergistischen Effekt und liegt mit einem IC₅₀-Wert von 0.026 μM im Bereich der Einzelsubstanz Chloroquin und ist damit ebenfalls wie Chloroquin allein aktiver als Substanz 1a.In comparison to simultaneous, equimolar administration of the two pharmacophores, substances 6 and 7 with an IC ₅₀ value of 4.924 μM, substance 1a is more active. The combination of the two parent substances primaquine (8) and chloroquine (9) show neither an additive nor a synergistic effect and is in the range of the individual substance chloroquine with an IC ₅₀ value of 0.026 μM and is thus as chloroquine alone more active than substance 1a.

Beide Kombinationen zeigen eine Aktivität im Bereich des Chloroquins bzw. dessen Pharmakophors. Dies zeigt, dass bei einem Chloroquin sensitiven Stamm wie 3D7 durch die Gabe von Primaquin keine Wirkverbesserung erzielt wird.Both combinations show an activity in the range of chloroquine or its pharmacophore. This shows that in a chloroquine-sensitive strain such as 3D7 by the administration of primaquine no effect improvement is achieved.

Substanz 1a zeigte im Stamm Dd2 (Chloroquin resistenter Stamm) eine vergleichbare gute Aktivität wie in 3D7. Der IC₅₀-Wert = 0.576 μM liegt hier nur zweifach über Primaquin (IC₅₀-Wert = 1.115 μM), aber im Vergleich zu Chloroquin (IC₅₀-Wert = 0.261 μM) ist die Substanz nur zweifach weniger wirksam.Substance 1a showed comparable good activity in strain Dd2 (chloroquine resistant strain) as in 3D7. The IC ₅₀ value = 0.576 μM is only two times higher than primaquine (IC ₅₀ value = 1.115 μM), but compared to chloroquine (IC ₅₀ value = 0.261 μM), the substance is only two times less effective.

Die gleichzeitige, äquimolare Applikation der beiden Pharmakophore 6 und 7 mit einem IC₅₀-Wert von 2.411 μM zeigt zwar im Vergleich zu 3D7 eine verbesserte, dennoch schwächere Wirkung als Substanz 1a. Substanz 1a ist weniger aktiv als die Kombination der beiden Muttersubstanzen Primaquin (8) und Chloroquin (9), die zwar weder einen additiven noch einen synergistischen Effekt zeigt (IC₅₀-Wert von 0.261 μM), aber im Vergleich zum Stamm 3D7 eine leichte Verbesserung, denn die Kombination ist etwas aktiver als Chloroquin allein. Dies gibt einen positiven Hinweis auf den hierin beschriebenen ’Resistance-Reverser’-Effekt des Primaquins. Substanz 1a zeigt dennoch auch am Stamm Dd2 eine sehr gute Aktivität.The simultaneous, equimolar administration of the two pharmacophores 6 and 7 with an IC ₅₀ value of 2.411 μM shows an improved but weaker effect than substance 1a compared to 3D7. Substance 1a is less active than the combination of the two parent substances primaquine (8) and chloroquine (9), which shows neither an additive nor a synergistic effect (IC ₅₀ value of 0.261 μM), but a slight improvement compared to strain 3D7 because the combination is slightly more active than chloroquine alone. This gives a positive indication of the primaquine 'resistance-reverser' effect described herein. Substance 1a nevertheless shows a very good activity even on strain Dd2.

Substanz 1a zeigte im Stamm K1 (Chloroquin und Pyrimethamin resistenter Stamm) eine signifikant bessere Aktivität als in 3D7 und Dd2. Der IC₅₀-Wert = 0.090 μM liegt hier siebenfach über Primaquin (IC₅₀-Wert = 0.627 μM), und ist im Vergleich zu Chloroquin (IC₅₀-Wert = 0.209 μM) zweifach wirksamer.Substance 1a showed significantly better activity in strain K1 (chloroquine and pyrimethamine resistant strain) than in 3D7 and Dd2. The IC ₅₀ value = 0.090 μM is seven times higher than primaquine (IC ₅₀ value = 0.627 μM), and is twice as effective compared to chloroquine (IC ₅₀ value = 0.209 μM).

Die gleichzeitige, äquimolare Applikation der beiden Pharmakophore 6 und 7 mit einem IC₅₀-Wert von 0.681 μM zeigt zwar im Vergleich zu 3D7 und Dd2 eine verbesserte, dennoch schwächere Wirkung als Substanz 1a. Substanz 1a ist auch aktiver als die Kombination der beiden Muttersubstanzen Primaquin (8) und Chloroquin (9), die einen leichten additiven Effekt zeigt (IC₅₀-Wert von 0.169 μM). Dies gibt wiederum einen positiven Hinweis auf den ’Resistance-Reverser’-Effekt des Primaquins. Im Stamm K1 ist Verbindung 1a der Kombination aus 8 und 9 klar überlegen. The simultaneous, equimolar application of the two pharmacophores 6 and 7 with an IC ₅₀ value of 0.681 μM shows an improved but weaker effect than substance 1a compared to 3D7 and Dd2. Substance 1a is also more active than the combination of the two parent substances primaquine (8) and chloroquine (9), which shows a slight additive effect (IC ₅₀ value of 0.169 μM). This in turn gives a positive indication of the 'resistance-reverser' effect of primaquine. In strain K1 compound 1a is clearly superior to the combination of 8 and 9.

B) Wirkung gegen exoerythrozytäre Stadien von P. falciparum und P. bergheiB) Action against exoerythrocytic stages of P. falciparum and P. berghei

B-1) Gliding-Motility-Assay an Sporozoiten aus Plasmodium bergheiB-1) Gliding Motility Assay on Sporozoites from Plasmodium berghei

Mit Hilfe dieser Methode kann das typische Bewegungsmuster der Sporozoiten untersucht werden. Sporozoiten sind die infektiösen Überträgerstadien, die bei dem Stich einer infektiösen Malaria-Mücke (Anopheles ssp.) auf den Wirbeltierwirt übertragen werden. Inhibition der Beweglichkeit von Sporozoiten würde zu einer reduzierten Infektion in der Leber und nachträglich im Blut (Pathologie der Malaria) führen. Beim ’Gliding’ über eine mit Protein beschichtete (Albumin-)Oberfläche (in vitro) hinterlassen Sporozoiten eine Spur von Oberflächenproteinen, welche durch Antikörper angefärbt werden kann. Hierzu wird ein 8-Well-Objektträger mit je 30 μl RPMI/3% BSA pro Well für 15 Minuten bei 37°C inkubiert, um somit die Oberfläche vollständig mit BSA/Albumin zu bedecken. Daraufhin gibt man für weitere 15 Minuten bei 37°C isolierte, infektiöse Sporozoiten auf die beschichteten Wells des Objektträgers. Diese werden anschließend für 10 Minuten mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach dem Fixierungsschritt erfolgen Waschschritte mit PBS/1% FCS und ein 15-minütiger Blockierungsschritt mit PBS/10% FCS bei 37°C. Als erster Antikörper wird anti-PbCSP für 45 Minuten bei 37°C auf die Sporozoiten gegeben. Das Circumsporozoite-Protein (CSP) ist ein GPI-verankertes Oberflächenprotein, welches die Oberfläche des Sporozoiten vollständig bedeckt. Während der Bewegung der Sporozoiten wird das CSP von der Oberfläche nach und nach zum posterioren Pol abgestreift; dieses Abstreifen und somit das Bewegungsmuster der Sporozoiten lässt sich in der Immunfluoreszenz durch fluoreszierende, zirkuläre Spuren auf dem Objektträger nachweisen. Nach dreimaligem Waschen mit PBS/1% FCS werden die Sporozoiten mit dem sekundären Immunfluoreszenz-Antikörper anti-Maus Alexa Fluor 488 inkubiert. Drei letzte Waschschritte erfolgen, bevor das Präparat mit 50% Glycerol in PBS eingebettet und mit Nagellack luftdicht versiegelt wird. Die Bewegungsspuren der Sporozoiten können dann direkt unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden.Using this method, the typical movement pattern of the sporozoites can be examined. Sporozoites are the infectious carrier stages that are transmitted to the vertebrate host by the bite of an infectious malaria mosquito (Anopheles ssp.). Inhibition of motility of sporozoites would lead to a reduced infection in the liver and subsequently in the blood (pathology of malaria). When gliding over a protein-coated (albumin) surface (in vitro), sporozoites leave a trail of surface proteins that can be stained by antibodies. For this purpose, an 8-well slide with 30 .mu.l of RPMI / 3% BSA per well for 15 minutes at 37 ° C incubated, so as to cover the surface completely with BSA / albumin. Then, for another 15 minutes at 37 ° C isolated, infectious sporozoites on the coated wells of the slide. These are then fixed for 10 minutes with 4% paraformaldehyde. After the fixation step, wash with PBS / 1% FCS and a 15 minute blocking step with PBS / 10% FCS at 37 ° C. As the first antibody anti-PbCSP is given for 45 minutes at 37 ° C on the sporozoites. Circumsporozoite protein (CSP) is a GPI-anchored surface protein that completely covers the surface of the sporozoite. During the movement of the sporozoites, the CSP is gradually stripped from the surface to the posterior pole; this stripping and thus the movement pattern of the sporozoites can be detected in the immunofluorescence by fluorescent, circular traces on the slide. After washing three times with PBS / 1% FCS, the sporozoites are incubated with the secondary immunofluorescent antibody anti-mouse Alexa Fluor 488. Three final washes are taken before the preparation is embedded with 50% glycerol in PBS and sealed airtight with nail polish. The traces of movement of the sporozoites can then be viewed directly under the fluorescence microscope.

Auswertung des In-vitro-Gliding-Motility-ExperimentsEvaluation of the in vitro gliding motility experiment

Die Bewegungsmuster der Speicheldrüsen-Sporozoiten auf dem Objektträger wurden in 7 Kategorien eingeteilt. Sporozoiten wurden, bevor diese auf den Objektträger fixiert wurden, mit Verbindung 1a in den Konzentrationen 10 nM, 100 nM und 1 M prä-inkubiert. Im Vergleich dazu wurden Sporozoiten von Plasmodium berghei nicht vorbehandelt (siehe Kontroll-Well). Mit steigender Substanz-Konzentration sieht man im Vergleich zur Kontrolle, dass Sporozoiten nicht mehr in der Lage sind, sich auf der mit Protein-beschichteten Oberfläche festzusetzen (nicht angeheftet). Dies impliziert, dass einige Parasiten durch die Vorbehandlung mit Verbindung 1a einen Adhäsion-Defekt zeigen.Movement patterns of the salivary sporozoites on the slide were classified into 7 categories. Sporozoites were pre-incubated with compound 1a at concentrations of 10 nM, 100 nM and 1 M before being fixed on the slide. In comparison, sporozoites from Plasmodium berghei were not pretreated (see control well). As the concentration of the substance increases, compared with the control, sporozoites are no longer able to settle on the protein-coated surface (not attached). This implies that some parasites show an adhesion defect by pretreatment with compound 1a.

Siehe 1.Please refer 1 ,

B-2) EEF-(ezoerythrozytäre-Formen)Entwicklungsassay der Plasmodium berghei LeberstadienB-2) EEF (ezoerythrocytic forms) developmental assay of Plasmodium berghei liver stages

Bevor Plasmodium-Parasiten die Erythrozyten infizieren, durchlaufen die Sporozoiten in den Hepatozyten ein Stadium der Schizogonie, bei dem sie als exoerythrozytäre-Form (EEF) vorliegen. In vitro können diese Stadien in Hepatozyten (humane Hepatoma-Zelllinien, HepG2 und/oder Huh7) kultiviert und nach Antikörperfärbung analysiert werden ( Frevert et al., Mol Biochem Parasitol. 1996 Feb-Mar; 76 (1–2): 257–66 ). Zur Analyse von EEF-Formen werden die Hepatozyten 1 Tag vor dem Experiment in 8-Well-Objektträgern ausplattiert und bis zur Konfluenz kultiviert. Dazu werden die Zellen in einer Konzentration von 3 × 10⁴ pro Well ausgesät und bei 37°C inkubiert. Für das Experiment werden in 100 μl Suspension 10000 Sporozoiten pro Well pipettiert und für die Invasion der Sporozoiten in die Hepatozyten 90 min bei 37°C inkubiert. Nach der Invasion der Sporozoiten wird die Suspension von den Zellen abgenommen, die Hepatozyten werden mit vorgewärmtem Kulturmedium bedeckt und über Nacht bei 37°C inkubiert. An Tag 2 wird das Medium morgens und abends gewechselt, je nachdem zu welchen Zeitpunkten man sich den Entwicklungsstand der Parasiten innerhalb der Leberzelle anschauen möchte, werden die Zellen mit kaltem Methanol für 10 min fixiert und dreimal mit PBS/1% FCS gewaschen. Nach einem 30-minütigen Blockierungsschritt mit PBS/10% FCS bei 37°C werden die Zellen mit dem primären Antikörper anti-PbHSP70 und dem sekundären Antikörper anti-Maus Alexa Fluor 488 inkubiert und anschließend wird das Präparat eingebettet (siehe oben) und luftdicht verschlossen. Die Entwicklung von Speicheldrüsen-Sporozoiten kann somit zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Invasion in Leberzellen gestoppt werden. Der inhibitorische Effekt der zugrunde liegenden Substanz wurde nach Zugabe der Verbindung 1a nach erfolgter Invasion zu unterschiedlichen Zeitpunkten getestet.Before Plasmodium parasites infect the erythrocytes, the sporozoites undergo a stage of schizogony in the hepatocytes, in which they are present as an exoerythrocytic form (EDF). In vitro, these stages can be cultured in hepatocytes (human hepatoma cell lines, HepG2 and / or Huh7) and analyzed after antibody staining ( Frevert et al., Mol Biochem Parasitol. 1996 Feb-Mar; 76 (1-2): 257-66 ). To analyze EEF forms, the hepatocytes are plated in 8-well slides one day before the experiment and grown to confluence. For this purpose, the cells are seeded in a concentration of 3 × 10 ⁴ per well and incubated at 37 ° C. For the experiment, 10000 sporozoites per well are pipetted into 100 μl of suspension and incubated for 90 min at 37 ° C. for the invasion of the sporozoites into the hepatocytes. After invasion of the sporozoites, the suspension is removed from the cells, the hepatocytes are covered with prewarmed culture medium and incubated overnight at 37 ° C. On day 2, the medium is changed in the morning and in the evening, depending on when you want to look at the stage of development of parasites within the liver cell, the cells are fixed with cold methanol for 10 min and washed three times with PBS / 1% FCS. After a 30 minute blocking step with PBS / 10% FCS at 37 ° C, the cells are treated with the primary antibody anti-PbHSP70 and the secondary antibody anti-mouse Alexa Fluor 488 is incubated and then the preparation is embedded (see above) and sealed airtight. The development of salivary sporozoites can thus be stopped at different times after invasion into liver cells. The inhibitory effect of the underlying substance was tested at various times after addition of compound 1a after invasion.

Die Invasion von infektiösen Speicheldrüsen-Sporozoiten ist durch prä-Inkubation mit 1a nicht beeinflusst (siehe 2A). Es ist bekannt, dass in einem In-vitro-System zirka 40% der Speicheldrüsen-Sporozoiten es schaffen, die Leberzellen erfolgreich zu invadieren, während die verbliebenen 60% extrazellulär vorliegen und absterben.The invasion of infectious salivary sporozoites is not affected by pre-incubation with 1a (see 2A ). It is known that in an in vitro system about 40% of the salivary gland sporozoites succeed in invading liver cells, while the remaining 60% are extracellular and die.

In der in 2B gezeigten Immunfluoreszenz ist jeweils exemplarisch ein Leberstadium zum Zeitpunkt 48 h abgebildet. Leberstadien sind mit dem anti-PbHSP70-Antikörper angefärbt. Intrazelluläre Sporozoiten wurden 90 min nach der Invasion mit den vorliegenden Substanzen inkubiert (1a). Im Vergleich zu WT (Wildtyp), d. h. nicht behandelten Parasiten sieht man sehr deutlich, dass die Leberstadien(EEF)-Entwicklung nach Behandlung mit 1a (100 nM) ein dramatisches Wachstumsdefizit aufweisen (siehe Größe der Leberstadien im Vergleich zur Kontrolle, den unbehandelten Parasiten).In the in 2 B The immunofluorescence shown in each case exemplifies a liver stage at 48 h. Liver stages are stained with the anti-PbHSP70 antibody. Intracellular sporozoites were incubated with the present substances 90 min after invasion (1a). Compared to WT (wild-type), ie untreated parasites, it can be seen very clearly that the liver stage (EDF) development after treatment with 1a (100 nM) has a dramatic growth deficit (see size of liver stages compared to control, the untreated parasites ).

Die Anzahl der Leberstadien nach Behandlung 1a ist hingegen nur wenig reduziert (siehe Auswertung unten; Kontrolle entspricht Wildtyp-Parasiten ohne Behandlung). Im Vergleich zu Primaquin zeigt das Derivat einen ähnlichen Wachstumsdefekt in der intrahepatischen Entwicklung der Parasiten (siehe 2C).In contrast, the number of liver stages after treatment 1a is only slightly reduced (see evaluation below, control corresponds to wild-type parasites without treatment). Compared to primaquine, the derivative shows a similar growth defect in the intrahepatic development of the parasites (see 2C ).

B-3) In-vitro-Assays (Zusammenfassung der Ergebnisse aus den In-vitro-Daten)B-3) In vitro assays (summary of results from in vitro data)

Siehe Tabellen 2–6.See Tables 2-6.

Die Verbindung 1a reduzierte die Leberstadien-Anzahl im Vergleich zum Wildtyp auf 62.5%. Dies liegt zwischen der Aktivität des Primaquin-Pharmkophors (6, 72.5%) und von Primaquin (8, 57.1%). Interessant ist, dass das Primaquin-Pharmakophor allein schon eine deutliche Aktivität zeigt; im Falle des Chloroquin-Pharmkophors im Vergleich zur Muttersubstanz Chloroquin wurde ein signifikanter Aktivitätsunterschied auf Blutstadien festgestellt – hier ist die Seitenkette für die Anreicherung essentiell. Für die Wirkung auf Leberstadien ist offensichtlich die Seitenkette des Primaquins von untergeordneter Bedeutung. Chloroquin (9) und sein Pharmakophor (7) zeigten keinen Effekt auf die Anzahl der Leberstadien – der erhöhte Wert für 7 erscheint eher artifiziell. Die Ergebnisse der Komplikationsverabreichung der Muttersubstanzen (66.1%) bzw. deren Pharmakophore (71.1%) liegen im Bereich des Primaquins und dessen Pharmakophors. Mit 62.5% ist Verbindung 1a sogar besser wirksam als die kombinierten Arzneistoffe oder deren Pharmkophore.Compound 1a reduced the number of liver stages to 62.5% compared to the wild type. This is between the activity of the primaquine pharmacophor (6, 72.5%) and primaquine (8, 57.1%). It is interesting that the primaquine pharmacophore alone already shows a clear activity; in the case of the chloroquine-pharmacophore compared to the parent substance chloroquine, a significant activity difference was found on blood stages - here the side chain is essential for the enrichment. Obviously, the side chain of primaquine is of secondary importance for the effect on liver stages. Chloroquine (9) and its pharmacophore (7) had no effect on the number of liver stages - the increased value for 7 appears rather artificial. The results of the complication administration of the parent substances (66.1%) and their pharmacophores (71.1%) are in the range of primaquine and its pharmacophore. At 62.5% compound 1a is even more effective than the combined drugs or their pharmacophores.

Für die Interpretation der Aktivität gegen Leberstadien sind die Morphologie und der Durchmesser der Leberstadien bedeutender als deren Anzahl. Auch hier liegt die Wirkung von 1a auf den Durchmesser (1a = 5.30 μm) zwischen dem von 6 (5.60 μm) und 8 (5.21 μm), die sich deutlich vom Wildtyp unterscheiden (7.80 μm). Der Effekt von Chloroquin (9) liegt mit 7.21 μm im Bereich des Wildtyp; auch hier zeigt das Pharmakophor (7) einen von der Muttersubstanz abweichenden Effekt, mit 5.50 μm liegt es im Bereich von 6 und 8. Da sich die Wirkung des Pharmakophors signifikant von der Muttersubstanz unterscheidet und im Vergleich zur Kombination-Applikation von 7 und 9 keinen Synergismus zeigt, ist es wahrscheinlich, dass dieser Wert ein Artefakt ist. Substanz 1a ist geringfügig wirksamer als die Kombination der Pharmkophore 6 und 7, und auch aktiver als die Kombination der Arzneistoffe 8 und 9. Beide Kombinationsapplikationen liegen wieder im Bereich des Primaquin bzw. dessen Pharmakophor.

Tabelle 5. Invasionsverhalten in Leberzellen.

Zählung 1 [%] Zählung 2 [%] Mittelwert [%] SD Auf WT normalisiert ca. IC₈₀ Wildtyp (WT) 45 45 45 0 100.00% 50 nM 1 μM (1a) 33.3 31.4 32.4 1.4 71.40% 100 nM (1a) 33.3 34.6 33.9 0.9 75.00% 10 nM (1a) 40 35.3 37.6 3.3 83.10%

Tabelle 6. Aktivitäten der Kombinationsverabreichung auf die Malaria-Leberstadienentwicklung.

Substanz Mittelwert Normiert auf WT Durchmesser des Leberstadiums Durchmesser, normiert auf WT Wildtyp (WT) 280 100% 7.80 μm - 1a 175 62.5% 5.3 μm 67.9% 6 203 72.5% 5.60 μm 71.8% 7 374 133.5% 5.50 μm 70.5% 8 160 57.1% 5.21 μm 66.8% 9 288 102.9% 7.21 μm 92.4% 6 + 7 199 71.1% 5.80 μm 74.3% 8 + 9 185 66.1% 5.50 μm 70.5%

For the interpretation of the activity against liver stages the morphology and the diameter of the liver stages are more important than their number. Again, the effect of 1a on the diameter (1a = 5.30 microns) is between that of 6 (5.60 microns) and 8 (5.21 microns), which differ significantly from the wild type (7.80 microns). The effect of chloroquine (9) is 7.21 μm in the wild-type region; Here too, the pharmacophore (7) shows an effect deviating from the parent substance, with 5.50 μm being in the range of 6 and 8. Since the effect of the pharmacophore differs significantly from the parent substance and in comparison to the combination application of 7 and 9 none Synergism shows, it is likely that this value is an artifact. Substance 1a is slightly more effective than the combination of

pharmacophores

6 and 7, and also more active than the combination of

drugs

8 and 9. Both combination applications are again in the primaquine range or its pharmacophore.

Table 5. Invasion behavior in liver cells.

Count 1 [%] Count 2 [%] Average [%] SD Normalized to WT about IC ₈₀ Wild type (WT) 45 45 45 0 100.00%

50nM

1 μM (1a) 33.3 31.4 32.4 1.4 71.40% 100nM (1a) 33.3 34.6 33.9 0.9 75.00% 10nM (1a) 40 35.3 37.6 3.3 83.10%

Table 6. Combination administration activities on malaria liver stage development.

substance Average Standardized on WT Diameter of the liver stage Diameter, normalized to WT Wild type (WT) 280 100% 7.80 μm - 1a 175 62.5% 5.3 μm 67.9% 6 203 72.5% 5.60 μm 71.8% 7 374 133.5% 5.50 μm 70.5% 8th 160 57.1% 5.21 μm 66.8% 9 288 102.9% 7.21 μm 92.4% 6 + 7 199 71.1% 5.80 μm 74.3% 8 + 9 185 66.1% 5.50 μm 70.5%

B-4) Gametozytentest (Gametocytogenesis inhibition assay)B-4) Gametocytogenesis inhibition assay

Es wurde getestet, ob die Substanzen einen Einfluss auf Entwicklung der Gametozyten haben, wurde 1 mL einer jungen Gametozytenkultur (Gametozyten der Stadien I–II) mit dem Wirkstoff im Bereich IC₅₀ behandelt und in einer 24-Well-Platte im Dreifachansatz ausplattiert. Die Platte wird in einem befeuchteten, luftdichten Exsikkator mit 5% CO₂/5% O₂ in N₂ begast und für 24 h bei 37°C inkubiert. Nach 24 h wurde das Medium abgesaugt und die Gametozytenkultur mit der Zugabe des Wirkstoffs im Bereich IC₅₀ mit frischen RPMI 1640 Medium (Zusatz: 25 mM Hepes, 0.37 mM Hypoxanthine, 10% A + Serum) versehen. Negativkontrollen wurden mit DMSO in einer Konzentration von 0.5% oder mit Chloroquin behandelt, Positivkontrollen wurden mit Primaquin behandelt. Am nächsten Tag wurde das Medium erneut gewechselt (ohne Zugabe des Wirkstoffs) und die Platte für weitere 6 Tage mit täglichem Mediumwechsel im Exsikkator inkubiert. Am Tag 7 wurde von jedem Well ein Blutausstrich angefertigt und die Gametozytämie (Anzahl Gametozyten auf 100 Erythrozyten) bestimmt.It was tested whether the substances have an influence on the development of gametocytes, 1 mL of a young gametocyte culture (gametocytes of stages I-II) was treated with the active ingredient in the range IC ₅₀ and plated in a 24-well plate in triplicate. The plate is gassed in a humidified, airtight desiccator with 5% CO ₂ /5% O ₂ in N ₂ and incubated for 24 h at 37 ° C. After 24 h, the medium was aspirated and the gametocyte culture with the addition of the drug in the range IC ₅₀ with fresh RPMI 1640 medium (added: 25 mM Hepes, 0.37 mM hypoxanthines, 10% A + serum) provided. Negative controls were treated with DMSO at 0.5% or with chloroquine, positive controls were treated with primaquine. The next day, the medium was changed again (without addition of the drug) and the plate incubated for a further 6 days with daily medium change in the desiccator. On day 7, a blood smear of each well was prepared and gametocytemia (number of gametocytes per 100 erythrocytes) determined.

Substanz 1a war 5-fach schwächer wirksam als Primaquin und zeigte im Vergleich zu den beiden Negativkontrollen, DMSO 0.5% und Chloroquin, dennoch deutlich einen moderaten Effekt auf die Gametozyten-Entwicklung und verfügt somit über einen transmissionsblockierenden Effekt. Tabelle 7. Ergebnisse des Gametozytentests (Gametocytogenesis inhibition assay) Substanz Gametozytämie 1a 1,8 ± 0,26 Primaquin (8) 0,3 ± 0,08 Chloroquin (9) 2,1 ± 0,32 DMSO behandelt 2,5 ± 0,26 Substance 1a was 5-fold weaker than primaquine and, in comparison to the two negative controls, DMSO 0.5% and chloroquine, still showed a moderate effect on gametocyte development and thus has a transmission-blocking effect. Table 7. Results of gametocyteesis inhibition assay substance Gametozytämie 1a 1.8 ± 0.26 Primaquine (8) 0.3 ± 0.08 Chloroquine (9) 2.1 ± 0.32 DMSO treated 2.5 ± 0.26

1.2 Wirkung gegen Parasiten der Gattung Plasmodien (In-vivo-Untersuchungen) 1.2 Action against parasites of the genus plasmodia (in vivo investigations)

A) In-vivo-Aktivitäten gegen P. bergheiA) In vivo activities against P. berghei

Siehe 3.Please refer 3 ,

Mäuse (n = 3 pro Gruppe) wurden 20000 P. berghei ANKA Sporozoiten am Tag 0 verabreicht und Substanz 1a zur verabreichenden Dosis von 60 mg/kg an den Tagen 0, 1 und 3 entweder intraperitoneal oder subcutan appliziert. Die Substanz 1a zeigte keine therapeutische Wirkung, wenn die Substanz subkutan injiziert wurde; alle Mäuse entwickelten Malaria (Blutstadien) an Tag 5 Post-Infektion. Allerdings konnte bei intraperitonealer Verabreichung von Substanz 1a beobachtet werden, dass alle Mäuse bis Tag 12 nach der Infektion überlebten. Kontrolle (unbehandelt) = Wildtyp P. berghei ANKA Sporozoiten.Mice (n = 3 per group) were administered 20000 P. berghei ANKA sporozoites on day 0 and substance 1a administered at the administering dose of 60 mg / kg on days 0, 1 and 3 either intraperitoneally or subcutaneously. Substance 1a showed no therapeutic effect when the substance was injected subcutaneously; All mice developed malaria (blood stages) on day 5 post infection. However, with intraperitoneal administration of substance 1a, it was observed that all mice survived until day 12 after infection. Control (untreated) = wild type P. berghei ANKA sporozoites.

Überraschend ist, dass Mäuse nach intraperitonealer Behandlung mit der Substanz 1a einen offensichtlichen phänotypischen Wechsel von experimenteller zerebralen Malaria (ECM) hin zu einem Anämie-Phänotypen durchlaufen. Tod durch ECM wird durch die Sequestrierung des Malaria-Parasiten im Gehirn (Mikrovaskulatur) ausgelöst und geht mit einer relativ niedrigen Blutstadien-Parasitämie (> 12%) an Tag 5–10 nach der Infektion einher, während anämische Malaria mit hoher Blutstadien-Parasitämie assoziert ist (50–90%) und schliesslich zum Tode am Tag 20–30 nach der Infektion führt. Ein solcher nicht-zerebraler Phänotyp wurde in Mäusen, die mit Substanz, 1a behandelt wurden beobachtet.Surprisingly, mice undergo an apparent phenotypic change from experimental cerebral malaria (ECM) to an anemia phenotype after intraperitoneal treatment with substance 1a. Death by ECM is triggered by the sequestration of the malaria parasite in the brain (microvasculature) and is associated with relatively low blood stage parasitemia (> 12%) on days 5-10 post infection, while anemic malaria associates with high blood stage parasitemia is (50-90%) and eventually leads to death on the day 20-30 after infection. Such a non-cerebral phenotype was observed in mice treated with substance 1a.

Mäuse (n = 3 pro Gruppe) wurden 107 parasitierte Erythrozyten an Tag 0 verabreicht (intravenös). An Tag zwei und drei Post-Infektion wurden die Tiere mit der Substanz 1a behandelt (60 mg/kg). Substanz 1a wurde entweder subkutan oder intraperitoneal appliziert. Die Substanz 1a zeigt dabei einen deutlichen Einfluss auf die Blutstadien-Entwicklung: innerhalb von 4 Tagen sank die Parasitendichte auf 0–0.1%). Es konnten keine signifikanten Unterschiede auf den therapeutischen Effekt der Substanz 1a zwischen intraperitonealer oder subkutaner Verabreichung beobachtet werden.Mice (n = 3 per group) were given 107 parasitized erythrocytes on day 0 (intravenously). On day two and three post infection animals were treated with substance 1a (60 mg / kg). Substance 1a was administered either subcutaneously or intraperitoneally. The substance 1a shows a clear influence on the development of the blood stage: within 4 days the parasite density decreased to 0-0.1%). There were no significant differences in the therapeutic effect of substance 1a between intraperitoneal or subcutaneous administration.

1.3 Wirkung gegen Parasiten der Gattung Leishmanien (In-vitro-Untersuchungen)1.3 Action against parasites of the genus Leishmania (in vitro studies)

A) L. majorA) L. major

Protokoll für die Substanztestungen und Pharmakophore sowie MuttersubstanzenProtocol for substance testing and pharmacophores as well as parent substances

Der IC₅₀-Wert der Verbindungen wurde mit Hilfe des Alamar-Blue^®-Tests unter standardisierten Bedingungen ermittelt. Für diesen Test wurden Leishmania major Promastigoten (Stamm: MHOM/IL/81/FE/BNI), welche auf Blutagarplatten bei 27°C und 5% CO₂ gezüchtet wurden, verwendet. Anschließend wurden die Promastigoten zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und auf eine Zellkonzentration von 1 × 10⁸ ml^–1 mit RPMI Medium eingestellt. Die Messung wird in einer 96-Loch Zellkulturplatte in einem Volumen von 200 μl durchgeführt. Eine 50 mM Stammlösung der Substanzen wurde durch Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt. Die Substanzen wurden anschließend seriell in DMSO verdünnt. Jede dieser Substanzvorverdünnungen wurde schließlich mit Medium 1:90 verdünnt und vollständig vermischt. 180 μl dieser Mischungen wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte transferiert und mit je 20 μl der entsprechenden Zellsuspension versetzt (finale Zellkonzentration 1 × 10⁷ ml^–1). Der finale Verdünnungsfaktor betrug somit 1:100. Der Test wird für jede Substanzkonzentration als Doppelbestimmung durchgeführt. Die finalen Substanzkonzentrationen betrugen 500 μM, 100 μM, 20 μM und 4 μM. Wachstumskontrollen in DMSO-haltigem Medium (finale DMSO Konzentration 1%), welche nur Promastigoten ohne Substanzbehandlung enthielten wurden mitgeführt. Kontrollen, welche nur Medium und die zu untersuchende Substanz in der höchsten verwendeten Konzentration (500 μM) enthielten, wurden ebenfalls getestet. Die Zellkulturplatte wurde bei 27°C und 5% CO₂ inkubiert. Nach 24 h wurde in jede Vertiefung 20 μl Alamar-Blue^® gegeben und die Platten für weitere 48 h inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die optische Dichte bei 550 nm (Testwellenlänge) und 630 nm (Referenzwellenlänge) in einem ELISA-Reader bestimmt. Die IC₅₀-Werte wurden durch lineare Interpolation berechnet.The IC ₅₀ value of the compounds was determined using the Alamar ^Blue® test under standardized conditions. For this test, Leishmania major promastigotes (strain: MHOM / IL / 81 / FE / BNI) grown on blood agar plates at 27 ° C and 5% CO ₂ were used. Subsequently, the promastigotes were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and adjusted to a cell concentration of 1 x 10 ⁸ ml ^-1 with RPMI medium. The measurement is performed in a 96-well cell culture plate a volume of 200 ul performed. A 50 mM stock solution of the substances was prepared by dissolution in dimethyl sulfoxide (DMSO). The substances were then serially diluted in DMSO. Each of these preliminary substance dilutions was finally diluted 1:90 with medium and completely mixed. 180 μl of these mixtures were transferred into the wells of the microtiter plate and mixed with 20 μl each of the corresponding cell suspension (final cell concentration 1 × 10 ⁷ ml ^-1 ). The final dilution factor was thus 1: 100. The test is performed for each substance concentration as a double determination. The final substance concentrations were 500 μM, 100 μM, 20 μM and 4 μM. Growth controls in DMSO-containing medium (final DMSO concentration 1%) containing only promastigotes without substance treatment were included. Controls containing only medium and the substance of interest at the highest concentration used (500 μM) were also tested. The cell culture plate was incubated at 27 ° C and 5% CO ₂ . After 24 hours, 20 μl of Alamar- ^{Blue® was} added to each well and the plates were incubated for a further 48 hours. After this incubation, the optical density was determined at 550 nm (test wavelength) and 630 nm (reference wavelength) in an ELISA reader. The IC ₅₀ values were calculated by linear interpolation.

Protokoll für die Kontrollsubstanzen Amphotericin B, Miltefosin und PentamidinProtocol for the control substances amphotericin B, miltefosine and pentamidine

Der IC₅₀-Wert der Kontrollsubstanzen wurde mit Hilfe des Alamar-Blue^®-Tests unter standardisierten Bedingungen ermittelt. Für diesen Test wurden Leishmania major Promastigoten (Stamm: MHOM/L/81/FE/BNI), welche auf Blutagarplatten bei 27°C und 5% CO₂ gezüchtet wurden, verwendet. Anschließend wurden die Promastigoten zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und auf eine Zellkonzentration von 1 × 10⁸ ml^–1 mit RPMI Medium eingestellt. Die Messung wird in einer 96-Loch Zellkulturplatte in einem Volumen von 200 μl durchgeführt. Eine 10 mM Stammlösung der Kontrollsubstanzen wurde durch Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt. Die Substanzen wurden anschließend seriell in DMSO verdünnt. Jede dieser Substanzvorverdünnungen wurde schließlich mit Medium 1:90 verdünnt und vollständig vermischt. 180 μl dieser Mischungen wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte transferiert und mit je 20 μl der entsprechenden Zellsuspension versetzt (finale Zellkonzentration 1 × 10⁷ ml^–1). Der finale Verdünnungsfaktor betrug somit 1:100. Der Test wird für jede Substanzkonzentration als Doppelbestimmung durchgeführt. Die finalen Substanzkonzentrationen betrugen 100 μM, 20 μM, 4 μM und 0.8 μM. Wachstumskontrollen in DMSO-haltigem Medium (finale DMSO Konzentration 1%), welche nur Promastigoten ohne Substanzbehandlung enthielten wurden mitgeführt. Kontrollen, welche nur Medium und die zu untersuchende Substanz in der höchsten verwendeten Konzentration (100 μM) enthielten, wurden ebenfalls getestet. Die Zellkulturplatte wurde bei 27°C und 5% CO₂ inkubiert. Nach 24 h wurde in jede Vertiefung 20 μl Alamar-Blue^® gegeben und die Platten für weitere 48 h inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die optische Dichte bei 550 nm (Testwellenlänge) und 630 nm (Referenzwellenlänge) in einem ELISA-Reader bestimmt. Die IC₅₀-Werte wurden durch lineare Interpolation berechnet. Tabelle 8. In-vitro-Bioaktivitäten gegen den Leishmaniose-Erreger L. major Substanz L. major [μM] 1a 18.6 6 > 500 7 204 8 235.75 9 251.4 6 + 7 197 8 + 9 158.5 Amphotericin B 3.1 Miltefosin 31.9 Pentamidin 35.9 The IC ₅₀ value of the control substances was determined using the Alamar ^Blue® test under standardized conditions. For this test, Leishmania major promastigotes (strain: MHOM / L / 81 / FE / BNI) grown on blood agar plates at 27 ° C and 5% CO ₂ were used. Subsequently, the promastigotes were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and adjusted to a cell concentration of 1 x 10 ⁸ ml ^-1 with RPMI medium. The measurement is carried out in a 96-well cell culture plate in a volume of 200 μl. A 10 mM stock solution of the control substances was prepared by dissolution in dimethyl sulfoxide (DMSO). The substances were then serially diluted in DMSO. Each of these preliminary substance dilutions was finally diluted 1:90 with medium and completely mixed. 180 μl of these mixtures were transferred into the wells of the microtiter plate and mixed with 20 μl each of the corresponding cell suspension (final cell concentration 1 × 10 ⁷ ml ^-1 ). The final dilution factor was thus 1: 100. The test is performed for each substance concentration as a double determination. The final substance concentrations were 100 μM, 20 μM, 4 μM and 0.8 μM. Growth controls in DMSO-containing medium (final DMSO concentration 1%) containing only promastigotes without substance treatment were included. Controls containing only medium and the substance to be tested at the highest concentration used (100 μM) were also tested. The cell culture plate was incubated at 27 ° C and 5% CO ₂ . After 24 hours, 20 μl of Alamar- ^{Blue® was} added to each well and the plates were incubated for a further 48 hours. After this incubation, the optical density was determined at 550 nm (test wavelength) and 630 nm (reference wavelength) in an ELISA reader. The IC ₅₀ values were calculated by linear interpolation. Table 8. In vitro bioactivities against the leishmaniasis pathogen L. major substance L. major [μM] 1a 18.6 6 > 500 7 204 8th 235.75 9 251.4 6 + 7 197 8 + 9 158.5 Amphotericin B 3.1 miltefosine 31.9 pentamidine 35.9

Dieser Wert zeigt die gute Aktivität der Verbindung 1a bei Infektionen mit L. major. Im gleichen Testsystem wurden zur Referenzierung etablierte Arzneistoffe vermessen. Im Vergleich mit den IC₅₀-Werten von Miltefosin (31.9 μM) und Pentamidin (35.9 μM) ist die Substanz 1a 2.4- resp. 2.7-fach stärker aktiv, gegenüber Amphotericin B (3.1 μM) schwächer aktiv.This value indicates the good activity of compound 1a in infections with L. major. In the same test system established drugs were measured for referencing. In comparison with the IC ₅₀ values of miltefosine (31.9 μM) and pentamidine (35.9 μM), the substance is 1a 2.4 resp. 2.7 times more active, less active than amphotericin B (3.1 μM).

Auch im Vergleich zur gleichzeitigen, äquimolaren Applikation der beiden Pharmakophore, die Substanzen 6 und 7, und der beiden Muttersubstanzen Primaquin (8) und Chloroquin (9) zeigt sich Substanz 1a überlegen, denn beide Kombinationsapplikationen zeigten jeweils mit einem IC₅₀-Wert von > 100 μM nur eine schwache Wirkung auf L. major.Compared to the simultaneous, equimolar administration of the two pharmacophores, substances 6 and 7, and the two parent substances primaquine (8) and chloroquine (9), substance 1a is also superior, since both combination applications showed an IC ₅₀ value of> 100 μM only a weak effect on L. major.

B) L. donovani; Axenischer-Amastigoten-AssayB) L. donovani; Axenic amastigotes assay

50 μl Kulturmedium, eine Mischung aus SM-Medium ( I. Cunningham; J. Protozool. 1977, 24, 325–329 ) und SDM-79 Medium ( R. Brun, M. Schonenberger; Acta Trop. 1979, 36, 289–292 ) im Verhältnis 1:1, pH-Wert = 5.4, ergänzt mit 10% Hitze-inaktiviertem FBS, wurde in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. Seriell verdünnte Lösungen der Substanzen in jeweils zweifacher Ausführung wurden in einem Bereich von 30 bis 0.041 μg/ml hergestellt. 10⁵ axenisch-gewachsene Amastigoten von L. donovani (Stamm MHOM-ET/67/L82) wurden zu 50 μl Medium pro Well hinzugegeben und die Mikrotiterplatte wurde bei 37°C unter 5% CO₂-Atmosphere für 72 Stunden inkubiert. 10 μl einer Resazurin-Lösung ( B. Weniger, C. Vonthron-Senecheau, M. Kaiser, R. Brun, R. Anton; Phytomedicine 2006, 13, 176–180 ) (12.5 mg Resazurin in 100 ml destilliertem Wasser) werden in jedes Well gegeben und für weitere 2–4 Stunden inkubiert. Die Fluoreszenzentwicklung der Platte wurde dann in einem Spectramax Gemini XC Mikrotiterplatten-Fluorometer (Molecular Devices Cooperation, Sunnyvale, CA, USA) unter Nutzung einer Anregungswellenlänge von 536 nm und einer Emissionswellenlänge von 588 nm vermessen ( B. Raz, M. Iten, Y. Grether-Bühler, R. Kaminsky, R. Brun; Acta Trop. 1997, 68, 139–147 ) und in Prozent der Kontrolle angegeben. Daten wurden im Graphik-Programm Softmax Pro (Molecular Devices) ausgewertet und IC₅₀-Werte kalkuliert. Miltefosin (Zentaris GmbH, Germany) wurde als Positivkontrolle verwendet.50 μl of culture medium, a mixture of SM medium ( I. Cunningham; J. Protozool. 1977, 24, 325-329 ) and SDM-79 medium ( R. Brun, M. Schonenberger; Acta Trop. 1979, 36, 289-292 1: 1, pH = 5.4, supplemented with 10% heat-inactivated FBS, was added to each well of a 96-well microtiter plate. Serially diluted solutions of the substances in duplicate were prepared in a range of 30 to 0.041 μg / ml. 10 ⁵ axenically grown amastigotes of L. donovani (strain MHOM-ET / 67 / L82) were added to 50 μl medium per well and the microtiter plate was incubated at 37 ° C under 5% CO ₂ atmosphere for 72 hours. 10 μl of a resazurin solution ( B. Less, C. Vonthron-Senecheau, M. Kaiser, R. Brun, R. Anton; Phytomedicine 2006, 13, 176-180 ) (12.5 mg resazurin in 100 ml distilled water) are added to each well and incubated for a further 2-4 hours. The fluorescence development of the plate was then measured in a Spectramax Gemini XC microtiter plate fluorometer (Molecular Devices Cooperation, Sunnyvale, CA, USA) using an excitation wavelength of 536 nm and an emission wavelength of 588 nm ( B. Raz, M. Iten, Y. Grether-Bühler, R. Kaminsky, R. Brun; Acta Trop. 1997, 68, 139-147 ) and expressed as a percentage of the control. Data were in the graphics program Softmax Pro (Molecular Devices) evaluated and calculated IC ₅₀ values. Miltefosine (Zentaris GmbH, Germany) was used as a positive control.

Gegen L. donovani zeigte Substanz 1a nur eine sehr schwache Wirksamkeit. Tabelle 9. In-vitro-Bioaktivität gegen den Leishmaniose-Erreger L. donovani Substanz L. donvani [μg/ml] 1a 28.7 Miltefosin 0.194 Against L. donovani substance 1a showed only a very weak activity. Table 9. In vitro bioactivity against leishmaniasis L. donovani substance L. donvani [μg / ml] 1a 28.7 miltefosine 0194

1.4 Wechselwirkung mit zellulären Strukturen (In-vitro-Untersuchung)1.4 Interaction with cellular structures (in vitro study)

A) Interkalationsfähigkeit mit DNAA) Intercalation ability with DNA

Da in der Literatur die DNA-Interkalation von Chloroquin beschrieben ist, wurde die Verbindung 1a auch dahingehend untersucht [ Meshnick, 1990 ].Since the literature describes the DNA intercalation of chloroquine, the compound 1a was also investigated [ Meshnick, 1990 ].

Die Interkalationsfähigkeit der Testsubstanzen wurde anhand der Verdrängung von Ethidiumbromid aus der DNA ermittelt. Der Interkalationsassay wurde in Mikrotiterplatten (96-Well-Format) durchgeführt. Hierbei wurden zwei verschiedene Ethidiumbromidendkonzentrationen (0.1 μM und 0.04 μM) eingesetzt. Neben der konzentrationsabhängigen Verdrängung von Ethidiumbromid aus der DNA wurde auch die Eigenfluoreszenz der Testsubstanz und der Reagenzienblindwert bei Anregung mit einer Wellenlänge von 535 nm und einer Emissionswellenlänge von 595 nm bestimmt. Für die Bestimmung der Eigenfluoreszenz der Testsubstanz wurden 200 μl 0.11 μM beziehungsweise 0.043 μM Ethidiumbromid (0.11 μM beziehungsweise 0.043 μM gelöst in Puffer, pH 7.0) in ein Well pipettiert. Für die Bestimmung der Messwerte der Testsubstanz wurden 200 μl 0.11 μM beziehungsweise 0.043 μM Ethidiumbromid (0.11 μM beziehungsweise 0.043 μM gelöst in Puffer, pH 7.0) mit einer DNA-Konzentration von 0.024 μg/200 μl (0.024 μg gelöst in Puffer, pH 7.0) in ein Well pipettiert. Die Positivkontrolle Berenil und die Testsubstanzen wurden beginnend bei 14.3 mM seriell um den Faktor 10 verdünnt und jeweils 15 μl in ein Ethidiumbromid mit oder ohne DNA enthaltendes Well pipettiert. Auf diese Weise wurde pro Well ein Gesamtvolumen von 215 μl und eine DNA-Konzentration von 0.022 μg/200 μl erhalten. Die Mikrotiterplatten wurden sofort für 10 s geschüttelt und bei 535 nm Anregungs- und 595 nm Emissionswellenlänge nacheinander vermessen. Die Einzelmesswerte der Testsubstanzen (mindestens drei) wurden um den arithmetischen Mittelwert der Eigenfluoreszenzen (mindestens drei Replikate) korrigiert. Die korrigierten Einzelmesswerte wurden arithmetisch gemittelt und gegen den Logarithmus der Konzentration aufgetragen. Wenn unter diesen Testbedingungen Eigenfluoreszenzen der Testsubstanzen messbar waren, wurden diese Konzentrationen nicht für die weitere Auswertung berücksichtigt. Erreichten die korrigierten Fluoreszenzintensitäten bei den höheren Testsubstanzkonzentrationen die Fluoreszenzintensitäten der Eigenfluoreszenz, wurde eine sigmoidale Ausgleichskurve (Logistic-Funktion) mittels dem Computerprogramm Origin^® Pro 8 erstellt und der dabei errechnete EC₅₀-Wert für die weitere Beschreibung der relativen Wirkstärke übernommen.The intercalation ability of the test substances was determined by displacement of ethidium bromide from the DNA. The intercalation assay was carried out in microtiter plates (96-well format). Two different concentrations of ethidium bromide (0.1 μM and 0.04 μM) were used. In addition to the concentration-dependent displacement of ethidium bromide from the DNA, the intrinsic fluorescence of the test substance and the reagent blank value at excitation with a wavelength of 535 nm and an emission wavelength of 595 nm were determined. 200 μl 0.11 μM or 0.043 μM ethidium bromide (0.11 μM or 0.043 μM dissolved in buffer, pH 7.0) were pipetted into a well to determine the intrinsic fluorescence of the test substance. 200 μl 0.11 μM or 0.043 μM ethidium bromide (0.11 μM or 0.043 μM dissolved in buffer, pH 7.0) with a DNA concentration of 0.024 μg / 200 μl (0.024 μg dissolved in buffer, pH 7.0) were determined for the determination of the measured values of the test substance. pipetted into a well. The positive control Berenil and the test substances were serially diluted by a factor of 10 beginning at 14.3 mM and in each case 15 μl were pipetted into a well containing ethidium bromide with or without DNA. In this way, a total volume of 215 μl and a DNA concentration of 0.022 μg / 200 μl was obtained per well. The microtiter plates were immediately shaken for 10 s and sequentially measured at 535 nm excitation and 595 nm emission wavelengths. The individual measured values of the test substances (at least three) were corrected by the arithmetic mean of the eigenfluorescences (at least three replicates). The corrected individual readings were arithmetically averaged and plotted against the logarithm of the concentration. If autofluorescence of the test substances was measurable under these test conditions, these concentrations were not taken into account for further evaluation. When the corrected fluorescence intensities at the higher test substance concentrations reached the fluorescence intensities of the autofluorescence, a sigmoidal balance curve (logistic function) was generated by the computer program ^Origin® Pro 8 and the calculated EC ₅₀ value was used for the further description of the relative potency.

Unter den beschriebenen Testbedingungen zeigte Berenil im Konzentrationsbereich von 10 pM bis 1 mM keine Eigenfluoreszenz. Bei einer Ethidiumbromidkonzentration von 0.1 μM wies Berenil einen arithmetisch gemittelten EC₅₀-Wert aus mindestens drei Bestimmungen auf einer Platte von 0.22 ± 0.03 μM und bei einer Ethidiumbromidkonzentration von 0.04 μM einen EC₅₀-Wert von 0.22 ± 0.05 μM auf.Under the test conditions described, Berenil showed no autofluorescence in the concentration range from 10 pM to 1 mM. At an ethidium bromide concentration of 0.1 μM, Berenil had an arithmetic average EC ₅₀ value of at least three determinations on a 0.22 ± 0.03 μM plate and an EC ₅₀ value of 0.22 ± 0.05 μM for an ethidium bromide concentration of 0.04 μM.

Chloroquin zeigte unter den beschriebenen Testbedingungen in dem Konzentrationsbereich von 10 pM bis 1 mM keine Eigenfluoreszenz und wies bei 0.1 μM Ethidiumbromid einen arithmetisch gemittelten EC₅₀-Wert aus mindestens drei Bestimmungen auf einer Platte von 2.06 ± 0.23 μM und bei 0.04 μM Ethidiumbromid einen EC₅₀-Wert von 1.28 ± 0,05 μM auf. Somit besitzt Chloroquin eine 5–10fach schwächere Interkalationsfähigkeit als die Positivkontrolle Berenil.Chloroquine showed no autofluorescence under the described test conditions in the concentration range of 10 pM to 1 mM and had an arithmetically averaged EC ₅₀ value of at least three determinations on a 2.06 ± 0.23 μM plate and 0.04 μM ethidium bromide on an EC ₅₀ at 0.1 μM ethidium bromide Value of 1.28 ± 0.05 μM. Thus, chloroquine has a 5-10-fold weaker intercalation ability than the Berenil positive control.

Primaquin zeigte unter den gegebenen Testbedingungen eine Eigenfluoreszenz im Konzentrationsbereich von 100 μM und 1 mM auf. Primaquin verdrängte Ethidiumbromid aus der DNA und führte zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensitäten um 10%. Eine Quantifizierung der relativen Wirkstärke war in diesem Testsystem aufgrund der Eigenfluoreszenz nicht möglich.Primaquine showed autofluorescence in the concentration range of 100 μM and 1 mM under the given test conditions. Primaquine repressed Ethidiumbromid from the DNA and led to a decrease of fluorescence intensities by 10%. Quantification of relative potency was not possible in this test system due to intrinsic fluorescence.

1a zeigte unter den Testbedingungen unabhängig von der Ethidiumbromidendkonzentration eine Eigenfluoreszenz in dem Konzentrationsbereich von 100 μM und 1 mM. Die Verbindung 1a verdrängte ebenfalls Ethidiumbromid aus der DNA und führte zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensitäten um 25%. Die relative Wirkstärke konnte unter den gegebenen Testbedingungen aufgrund der Eigenfluoreszenz nicht berechnet werden.1a showed autofluorescence in the concentration range of 100 μM and 1 mM under the test conditions, irrespective of the final concentration of ethidium bromide. Compound 1a also displaced ethidium bromide from the DNA and resulted in a 25% decrease in fluorescence intensities. The relative potency could not be calculated under the given test conditions due to intrinsic fluorescence.

Bei gleicher Konzentration verdrängte 1a mehr Ethidiumbromid aus der DNA als Primaquin aber weniger als Chloroquin und die Positivkontrolle Berenil.At the same concentration, 1a displaced more ethidium bromide from the DNA than primaquine but less than chloroquine and the positive control Berenil.

Beispiel 2 Synthese der VerbindungenExample 2 Synthesis of the compounds

Die Verfahrensprodukte der allgemeinen Formel 1 sind durch Syntheserouten, auch im größeren bis industriellen Maßstab, zugängig.The process products of the general formula 1 are accessible by synthetic routes, also on a larger scale to industrial scale.

2.1 Herstellung der bioaktiven Verbindung 1a2.1 Preparation of the bioactive compound 1a

Synthese von N¹-(7-Chlorochinolin-4-yl)-N⁴-(6-methoxychinolin-8-yl)pentan-1,4-diamin (1a)Synthesis of N ¹ - (7-chloroquinolin-4-yl) -N ⁴ - (6-methoxy-quinolin-8-yl) -pentane-1,4-diamine (1a)

Die Knüpfung der 4-Amino-N-C-Bindung kann auf zwei Wegen erfolgen.

a) Durch Buchwald-Hartwig-Aminierung: Dieses Verfahren zeichnet sich aufgrund seiner guten Durchführbarkeit v. a. im kleineren Labormaßstab aus. Siehe 4A. Die Base 8 des kommerziell erhältlichen Primaquin-Diphosphats wird durch Extraktion einer Natriumhydrogencarbonat alkalischen wäßrigen Lösung mit Dichlormethan freigesetzt und in den nachfolgenden Synthesen verwendet. 13.4 mg Pd₂(dba)₃ (2.5 mol-%) und 18.5 mg ±-BINAP (5.0 mol-%) werden unter Stickstoff-Atmosphäre in 2 ml Dioxan suspendiert und bei Raumtemperatur 10 min gerührt. 68.0 mg (0.343 mMol) 4,7-Dichlorchinolin werden unter Stickstoffatmosphäre in 8 ml Dioxan gelöst. Nach 10 min wird unter Stickstoff-Fluss die Suspension des Katalysator-Systems zu dieser Lösung hinzu gegeben, gefolgt von der Lösung der freien Base des Primaquins 8 aus 67.0 mg (0.258 mMol) in 5 ml Dioxan hinzugeben und der Base KOtBu (57.6 mg, 0.513 mMol). Im vorgeheizten Ölbad (85°C) wird die Mischung 3 h lang erhitzt. Nach beendeter Reaktion und vollständigem Umsatz des 4,7-Dichlorchinolins wird die Reaktionsmischung mit Dichlormethan verdünnt und der enthaltene Feststoff abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt und säulenchromatographisch auf desaktiviertem Kieselgel mit einer Mischung aus Petrolether und Ethylacetat = 1/2 aufgereinigt. Das Produkt wurde als beiger Feststoff erhalten. Ausbeute: 25.9 mg (0.062 mMol, 18%)
b) Durch nucleophile Substitution: die Synthese der Wahl, da hierbei auf den Katalysator und weitere Zusätze verzichtet werden kann und die chromatographische Trennung des Gemisches erheblich leichter fällt. Siehe 4B. 425.2 mg (1.639 mMol) der freien Base des Primaquins 8 und 162.3 mg (0.819 mMol) von 4,7-Dichlorchinolin werden zusammen im vorgeheizten Ölbad für eine Dauer von 6.5 h auf 120°C erhitzt. Die Reaktionsmischung lässt man abkühlen, versetzt mit Natriumhdyrogencarbonat-alkalischer Lösung und extrahiert erschöpfend mit Dichlormethan. Die vereinten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Säulenchromatographische Aufreinigung auf desaktiviertem Kieselgel (Petrolether/Ethylacetat = 1/1) lieferte einen beigen Feststoff. Ausbeute: 283.9 mg (0.674 mMol, 82%) Schmp: 65°C (PE/EE) IR (ATR-FTIR): ν = 3376 (w, br), 3252 (w, br), 3055 (w, br), 2956 (w, br), 2934 (w, br), 2866 (w, br), 2359 (s), 2341 (s), 1612 (m), 1573 (s), 1516 (s), 1451 (m), 1421 (m), 1385 (m), 1367 (m), 1330 (m), 1278 (w), 1240 (w), 1218 (m), 1196 (m), 1158 (m), 1134 (m), 1078 (w), 1050 (m), 1029 (w) cm^–1. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ = 1.31 (d, ³J_H-H = 6.36 Hz, 3H, Me), 1.80–1.83 (m, 2H, 3-CH₂), 1.89–1.94 (m, 2H, 2-CH₂), 3.29–3.36 (m, 2H, 1-CH₂), 3.67–3.72 (m, 1H, 4-H), 3.84 (s, 3H, OMe), 5.56 (s, br, 1H, N¹-H), 6.03 (d, ³J_{H_H} = 8.58 Hz, 1H, N⁴-H), 6.28 (d, ⁴J_H-H = 2.22 Hz, 1H, 7'-H), 6.30 (d, ³J_H-H = 5.52 Hz, 1H, 3''-H), 6.33 (d, ⁴J_H-H = 2.22 Hz, 1H, 5'-H), 7.17 (dd, ³J_H-H = 8.94 Hz, ⁴J_H-H = 1.98 Hz, 1H, 6''-H), 7.30 (dd, ³J_H-H = 8.22 Hz, ⁴J_H-H = 4.20 Hz, 1H, 3'-H), 7.57 (d, ³J_H-H = 9.00 Hz, 1H, 5'-H), 7.90 (d, ⁴J_H-H = 1.92 Hz, 1H, 8''-H), 7.92 (dd, ³J_H-H = 8.28 Hz, ⁴J_H-H = 1.20 Hz, 4'-H), 8.35 (d, ³J_H-H = 5.46 Hz, 1H, 2''-H), 8.51 (dd, ³J_H-H = 4.05 Hz, ⁴J_H-H = 1.35 Hz, 1H, 2'-H) ppm. ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ = 20.97 (Me), 25.34 (C-2), 34.13 (C-3), 43.41 (C-1), 48.00 (C-4), 55.44 (OMe), 92.23 (C-5'), 97.43 (C-7'), 99.04 (C-3''), 117.06 (C-4''a), 121.62 (C-5''), 122.22 (C-3'), 125.55 (C-6''), 127.80 (C-8''), 130.15 (C-4'a), 135.11 (C-4'), 135.45, 135.55, 144.68 (C-2'), 144.98 (C-8'a), 148.01 (C-8''a), 150.50 (C-4''), 150.88 (C-2''), 159.56 (C-8') ppm. MS (EI, 70 eV): m/z (%) = 423.2/422.2/420.2 [M]⁺ (10), 241.2 (100), 178.0 [C₉H₇ClN₂]⁺

HRMS (ES') berechnet für C₂₄H₂₆Cl₁N₄O₁: 421.17897 [M + H]⁺; Gemessen: 421.17897 [M + H]⁺

The formation of 4-amino-NC bond can be done in two ways.

a) By Buchwald-Hartwig amination: This method is characterized on the basis of its good feasibility, especially in the smaller laboratory scale. Please refer 4A , The base 8 of the commercially available primaquine diphosphate is liberated by extraction of a sodium bicarbonate alkaline aqueous solution with dichloromethane and used in the following syntheses. 13.4 mg of Pd ₂ (dba) ₃ (2.5 mol%) and 18.5 mg ± BINAP (5.0 mol%) are suspended under nitrogen atmosphere in 2 ml of dioxane and stirred at room temperature for 10 min. 68.0 mg (0.343 mmol) of 4,7-dichloroquinoline are dissolved in 8 ml of dioxane under a nitrogen atmosphere. After 10 minutes, the suspension of the catalyst system is added to this solution under nitrogen flow, followed by the solution of the free base of primaquine 8 from 67.0 mg (0.258 mmol) in 5 ml of dioxane and the base KOtBu (57.6 mg, 0.513 mmol). In a preheated oil bath (85 ° C), the mixture is heated for 3 h. After completion of the reaction and complete conversion of 4,7-dichloroquinoline, the reaction mixture is diluted with dichloromethane and the solid contained filtered off. The filtrate is concentrated under reduced pressure and purified by column chromatography on deactivated silica gel with a mixture of petroleum ether and ethyl acetate = 1/2. The product was obtained as a beige solid. Yield: 25.9 mg (0.062 mmol, 18%).
b) By nucleophilic substitution: the synthesis of choice, as this can be dispensed with the catalyst and other additives and the chromatographic separation of the mixture is much easier. Please refer 4B , 425.2 mg (1.639 mmol) of the free base of primaquine 8 and 162.3 mg (0.819 mmol) of 4,7-dichloroquinoline are heated together in a preheated oil bath at 120 ° C for a period of 6.5 h. The reaction mixture is allowed to cool, mixed with sodium bicarbonate-alkaline solution and extracted exhaustively with dichloromethane. The combined organic phases are dried over magnesium sulfate, filtered off and the solvent removed in vacuo. Column chromatographic purification on deactivated silica gel (petroleum ether / ethyl acetate = 1/1) provided a beige solid. Yield: 283.9 mg (0.674 mmol, 82%) mp: 65 ° C. (PE / EE) IR (ATR-FTIR): ν = 3376 (w, br), 3252 (w, br), 3055 (w, br), 2956 (w, br), 2934 (w, br), 2866 (w, br), 2359 (s), 2341 ( s), 1612 (m), 1573 (s), 1516 (s), 1451 (m), 1421 (m), 1385 (m), 1367 (m), 1330 (m), 1278 (w), 1240 ( w), 1218 (m), 1196 (m), 1158 (m), 1134 (m), 1078 (w), 1050 (m), 1029 (w) cm ^-1 . ¹ H-NMR (600 MHz, CDCl ₃ ): δ = 1.31 (d, ³ J _HH = 6.36 Hz, 3H, Me), 1.80-1.83 (m, 2H, 3-CH ₂ ), 1.89-1.94 (m, 2H, 2-CH ₂ ), 3.29-3.36 (m, 2H, 1-CH ₂ ), 3.67-3.72 (m, 1H, 4-H), 3.84 (s, 3H, OMe), 5.56 (s, br, 1H, N ¹ -H), 6.03 (d, ³ J _{H_H} = 8.58 Hz, 1H, N ⁴ -H), 6.28 (d, ⁴ J _HH = 2.22 Hz, 1H, 7'-H), 6.30 (d, ³ J _HH = 5.52 Hz, 1H, 3 '' - H), 6.33 (d, ⁴ J _HH = 2.22 Hz, 1H, 5'-H), 7.17 (dd, ³ J _HH = 8.94 Hz, ⁴ J _HH = 1.98 Hz, 1H, 6 "-H), 7.30 (dd, ³ J _HH = 8.22 Hz, ⁴ J _HH = 4.20 Hz, 1H, 3'-H), 7.57 (d, ³ J _HH = 9.00 Hz, 1H , 5'-H), 7.90 (d, ⁴ J _HH = 1.92 Hz, 1H, 8 "-H), 7.92 (dd, ³ J _HH = 8.28 Hz, ⁴ J _HH = 1.20 Hz, 4'-H) , 8.35 (d, ³ J _HH = 5.46 Hz, 1H, 2 '' - H), 8.51 (dd, ³ J _HH = 4.05 Hz, ⁴ J _HH = 1.35 Hz, 1H, 2'-H) ppm. ¹³ C-NMR (150 MHz, CDCl _3): δ = 20.97 (Me), 25.34 (C-2), 34.13 (C-3), 43.41 (C-1), 48.00 (C-4), 55.44 (OMe ), 92.23 (C-5 '), 97.43 (C-7'), 99.04 (C-3 ''), 117.06 (C-4''a), 121.62 (C-5 ''), 122.22 (C). 3 '), 125.55 (C-6''), 127.80 (C-8''), 130.15 (C-4'a), 135.11 (C-4'), 135.45, 135.55, 144.68 (C-2 ') , 144.98 (C-8'a), 148.01 (C-8''a), 150.50 (C-4 ''), 150.88 (C-2 ''), 159.56 (C-8 ') ppm. MS (EI, 70 eV): m / z (%) = 423.2 / 422.2 / 420.2 [M] ⁺ (10), 241.2 (100), 178.0 [C ₉ H ₇ ClN ₂ ] ⁺

HRMS (ES ') calculated for C ₂₄ H ₂₆ Cl ₁ N ₄ O _1: 421.17897 [M + H] ⁺ ; Measured: 421.17897 [M + H] ⁺

2.2 Synthesestrategien von weiteren erfindungsgemäßen Hybridmolekülen2.2 Synthesis Strategies of Further Hybrid Molecules of the Invention

Siehe 5 und 6.Please refer 5 and 6 ,

5 stellt eine divergente Syntheseroute dar, über die gleich mehrere Derivate für Struktur-Aktivitäts-Studien gewonnen werden. Diese unterscheiden sich hier besonders in der Flexibilität der Verlinkung, in deren Basizitäten und der Verhältnisse der einzelnen Pharmakophore zueinander. 5 represents a divergent synthetic route through which several derivatives for structure-activity studies are obtained. These differ in particular in the flexibility of the link, in their basicities and the relationships of the individual pharmacophores to one another.

6 stellt die Einführung von lipophilen (hier beispielsweise aromatischen) Linker dar, wobei die einzelnen Aromaten natürlich auch noch weiter funktionalisiert sein können. 6 represents the introduction of lipophilic (here, for example, aromatic) linker, wherein the individual aromatics can of course also be further functionalized.

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Frevert et al., Mol Biochem Parasitol. 1996 Feb-Mar; 76 (1–2): 257–66 [0095] Frevert et al., Mol Biochem Parasitol. 1996 Feb-Mar; 76 (1-2): 257-66 [0095]
I. Cunningham; J. Protozool. 1977, 24, 325–329 [0112] I. Cunningham; J. Protozool. 1977, 24, 325-329 [0112]
R. Brun, M. Schonenberger; Acta Trop. 1979, 36, 289–292 [0112] R. Brun, M. Schonenberger; Acta Trop. 1979, 36, 289-292 [0112]
B. Weniger, C. Vonthron-Senecheau, M. Kaiser, R. Brun, R. Anton; Phytomedicine 2006, 13, 176–180 [0112] B. Less, C. Vonthron-Senecheau, M. Kaiser, R. Brun, R. Anton; Phytomedicine 2006, 13, 176-180 [0112]
B. Raz, M. Iten, Y. Grether-Bühler, R. Kaminsky, R. Brun; Acta Trop. 1997, 68, 139–147 [0112] B. Raz, M. Iten, Y. Grether-Bühler, R. Kaminsky, R. Brun; Acta Trop. 1997, 68, 139-147 [0112]
Meshnick, 1990 [0114] Meshnick, 1990 [0114]

Claims

Verbindung, umfassend 8-Aminochinolin und 4-Aminochinolin verbunden durch die Linker L¹, L² und L³, mit der Formel 1

wobei L¹, L² und L³, die Linker, jeweils ausgewählt sind aus unsubstituiertem, monosubstituiertem oder polysubstituiertem Alkyl, welches gerade, verzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein kann; gesättigten, ungesättigten, unsubstituierten, monosubstituierten oder polysubstituierten heterocyclischen Ringsystemen; unsubstituierten, monosubstituierten, polysubstituierten oder kondensierten Aryl- oder Heteroarylresten; oder unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Benzyl- oder Acylgruppe, wobei L¹, L² und L³ jeweils substituiert sein können und der Substituent ausgewählt ist aus Hydroxy-, Alkoxy- oder Acyloxy, dessen O-Alkyl- oder O-Acylgruppe verzweigt, urverzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt ist; Thiol oder über ein Schwefelatom gebundene S-Alkyl- oder S-Acylgruppen, dessen S-Alkyl oder S-Acylgruppe verzweigt, unverzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein kann; primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, primäre, sekundäre oder tertiäre Amidgruppen und andere Stickstoffsubstituenten, Halogen, -CN, -CNO, -CNS, -SCN, -OCN, -NC oder andere funktionellen Gruppen mit Heteroatomen; R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴ jeweils ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Substituenten sind, die ausgewählt sind aus Halogen, -CN, -CNO, -CNS, -SCN, -OCN, -NC oder andere funktionellen Gruppen mit Heteroatomen; -H oder substituiertem, monosubstituiertem oder polysubstituiertem Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein kann, Hydroxy-, oder Alkoxy- oder Acyloxysubstituenten, dessen O-Alkyl- oder O-Acylgruppe verzweigt, unverzweigt, cyclisch, gesättigt oder ungesättigt ist, Thiol oder über ein Schwefelatom gebundene S-Alkyl- oder S-Acylgruppen, primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, primäre, sekundäre oder tertiäre Amidgruppen und andere Stickstoffsubstituenten, gesättigten, ungesättigten, unsubstituierten, monosubstituierten oder polysubstituierten heterocyclischen Ringsystemen unsubstituiertem, monosubstituiertem, polysubstituiertem oder kondensiertem Aryl- oder Heteroarylresten, unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Benzyl- oder Acylgruppe, R⁷, R⁸ gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus H, ein oder zwei unsubstituierten, monosubstituierten oder polysubstituierten, gesättigten oder partiell ungesättigten Heterocyclen oder ein oder zwei Aryl- oder Heteroarylresten (beispielsweise 7-Chloro-chinolin-4-yl oder 6-Methoxychinolin-8-yl) sowie geraden, verzweigten, cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Alkylresten m und o jeweils 0 oder 1; n und p jeweils 1 oder 2; q und r jeweils 0 oder 1 sind und Stereoisomere und deren Gemische, Tautomere, Isomere, physiologisch verträgliche Salze und Solvate davon.A compound comprising 8-aminoquinoline and 4-aminoquinoline joined by the linkers L ¹ , L ² and L ³ , of the formula 1

wherein L ¹ , L ² and L ³ , the linkers are each selected from unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted alkyl which may be straight, branched, cyclic, saturated or unsaturated; saturated, unsaturated, unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted heterocyclic ring systems; unsubstituted, monosubstituted, polysubstituted or fused aryl or heteroaryl radicals; or unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl or acyl group, wherein L ¹ , L ² and L ^{3 may} each be substituted and the substituent is selected from hydroxy, alkoxy or acyloxy whose O-alkyl or O-acyl branched, branched, ur is cyclic, saturated or unsaturated; Thiol or sulfur atom-bonded S-alkyl or S-acyl groups whose S-alkyl or S-acyl group may be branched, unbranched, cyclic, saturated or unsaturated; primary, secondary or tertiary amino groups, primary, secondary or tertiary amide groups and other nitrogen substituents, halogen, -CN, -CNO, -CNS, -SCN, -OCN, -NC or other heteroatom functional groups; R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² , R ¹³ , R ^{14 are} each one or more identical or different substituents selected from halogen , -CN, -CNO, -CNS, -SCN, -OCN, -NC or other heteroatom functional groups; -H or substituted, monosubstituted or polysubstituted alkyl, wherein the alkyl may be straight, branched, cyclic, saturated or unsaturated, hydroxy, or alkoxy or acyloxy, its O-alkyl or O-acyl branched, unbranched, cyclic, saturated or unsaturated, thiol or sulfur atom-bonded S-alkyl or S-acyl groups, primary, secondary or tertiary amino groups, primary, secondary or tertiary amide groups and other nitrogen substituents, unsubstituted, monosubstituted, saturated, unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted heterocyclic ring systems , polysubstituted or fused aryl or heteroaryl radicals, unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl or acyl group, R ⁷ , R ^{8 are the} same or different and are selected from H, one or two unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted, saturated or partially unsaturated heterocycles or one or two aryl or heteroaryl radicals (for example, 7-chloro-quinolin-4-yl or 6-methoxyquinolin-8-yl) and straight, branched, cyclic, saturated or unsaturated alkyl radicals m and o are each 0 or 1; n and p are each 1 or 2; q and r are each 0 or 1 and stereoisomers and mixtures thereof, tautomers, isomers, physiologically acceptable salts and solvates thereof.

Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ Alkoxy, insbesondere Methoxy, Alkyl, insbesondere verzweigt, weiter insbesondere tBu, Trifluormethan-enthaltende Reste, insbesondere CF3, R³ Trifluormethan-enthaltende Reste, insbesondere 3-(Trifluormethyl)-phenoxy; R⁴ Trifluormethan-enthaltende Reste, insbesondere 3-(Trifluormethyl)-phenoxy; R⁵ Alkoxy, insbesondere Methoxy; R¹⁰ Halogen, insbesondere -Cl; R¹² H, Halogen, insbesondere -Cl, Alkoxy, insbesondere Methoxy, und/oder R¹³ Alkoxy, insbesondere Methoxy.A compound according to claim 1, wherein R ^{1 is} alkoxy, in particular methoxy, alkyl, in particular branched, more particularly tBu, trifluoromethane-containing radicals, in particular CF ³ , R ³ trifluoromethane-containing radicals, in particular 3- (trifluoromethyl) phenoxy; R ⁴ trifluoromethane-containing radicals, in particular 3- (trifluoromethyl) phenoxy; R ⁵ alkoxy, especially methoxy; R ^{10 is} halogen, in particular -Cl; R ¹² H, halogen, in particular -Cl, alkoxy, in particular methoxy, and / or R ¹³ alkoxy, in particular methoxy.

Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend 6-Methoxy-8-Aminochinolin(e) und 4-Amin-7-Chloro-chinolin(e) verbunden durch den Linker L¹, ausgewählt aus

A compound according to claim 1 or 2 comprising 6-methoxy-8-aminoquinoline (s) and 4-amine-7-chloro-quinoline (s) joined by the linker L ¹ selected from

Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend 6-Methoxy-8-Aminochinolin und zwei 4-Amino-7-Chloro-chinoline verbunden durch den Linker L¹ und zwei Linker L³ mit der Formel 3

wobei die zwei Linker L³ gleich oder verschieden sein können.A compound according to claim 1 or 2 comprising 6-methoxy-8-aminoquinoline and two 4-amino-7-chloro-quinolines linked by the linker L ¹ and two linker L ^{3 of} the formula 3

where the two linkers L ^{3 may be the} same or different.

Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Linker L¹, L², L³ jeweils ausgewählt sind aus

, wobei s und t jeweils 0 bis 30 sind und u 0 bis 6 ist.A compound according to any one of claims 1 to 4, wherein the linkers L ¹ , L ² , L ^{3 are} each selected from

where s and t are each 0 to 30 and u is 0 to 6.

Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung

ist.A compound according to any one of claims 1 to 5, wherein the compound

is.

Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus

A compound according to any one of claims 1 to 5, wherein the compound is selected from

Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren einen Schritt der Knüpfung der 4-Amino-N-C-Bindung umfasst, die durch Übergangsmetall-katalysierte Kupplung, bevorzugt Buchwald-Hartwig Amininierung, oder durch nukleophile Substitution erfolgt.A process for preparing a compound according to any one of the preceding claims, which process comprises a step of forming the 4-amino-N-C bond, which is by transition metal-catalyzed coupling, preferably Buchwald-Hartwig aminination, or by nucleophilic substitution.

Verfahren nach Anspruch 8 zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 6 ausgehend von den Ausgangsverbindungen 6-Methoxy-8-aminochinolin und 4,7-Dichlorchinolin.Process according to claim 8 for the preparation of the compound according to claim 6 starting from the starting compounds 6-methoxy-8-aminoquinoline and 4,7-dichloroquinoline.

Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7.Pharmaceutical composition comprising at least one compound according to any one of claims 1 to 7.

Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur peroralen, rektalen, transdermalen oder parenteralen Applikation.Pharmaceutical composition according to claim 10 for peroral, rectal, transdermal or parenteral application.

Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 oder 11 zur Verwendung als Arzneimittel.A compound according to any one of claims 1 to 7 or a pharmaceutical composition according to any one of claims 10 or 11 for use as a medicament.

Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Infektionen mit den Erregern der Gattung Plasmodium und/oder der Gattung Leishmania sowie weiteren parasitären Erregern.A compound or pharmaceutical composition according to claim 12 for use in the prophylactic and / or therapeutic treatment of infections with the pathogens of the genus Plasmodium and / or the genus Leishmania and other parasitic agents.

Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13 zur Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Malaria und/oder Leishmaniose sowie weiteren parasitären Erkrankungen.A compound or pharmaceutical composition according to claim 13 for use in the prophylactic and / or therapeutic treatment of malaria and / or leishmaniasis and other parasitic diseases.

Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Verwendung bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Malaria eine Wirkung auf Gewebe- und Blutstadien sowie sexuelle Stadien und Sporozoiten der Erreger der Gattung Plasmodium umfasst.A compound or pharmaceutical composition according to claim 13 or 14, wherein the use in the prophylactic and / or therapeutic treatment of malaria comprises an effect on tissue and blood stages as well as sexual stages and sporozoites of the pathogens of the genus Plasmodium.