DE102010017130B4 - Hybrid compound, its use and process for its preparation - Google Patents

Abstract

Hybrid-Verbindung der Formel A-B wobei
A ein Aminopyrazol oder ein Derivat davon ist und
B ein Peptid und
A und B unmittelbar oder mittels eines Linkers kovalent miteinander verbunden sind
dadurch gekennzeichnet, dass B ein D-Peptid ist, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus:
3-Aminopyrazol-5-Carbonsäure, 3-Nitropyrazol-5-Carbonsäure, Derivate davon mit ersetzter heterocyclischer CH-Gruppe gegen –N-, -O- oder -S- sowie 3-Aminopyrazol-5-carbonsäure-Dimer, –Trimer oder -Tetramer;
B ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus:
D3-Peptid, SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12;
der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus:
kein Linker, GABA, TEG, TEG-Dimer, PEG, alpha-Aminosäuren, alpha-Amino-omega-carbonsäure.

Hybrid compound of the formula AB wherein
A is an aminopyrazole or a derivative thereof and
B is a peptide and
A and B are covalently linked to each other directly or by means of a linker
characterized in that B is a D-peptide, wherein A is selected from the group of compounds consisting of:
3-aminopyrazole-5-carboxylic acid, 3-nitropyrazole-5-carboxylic acid, derivatives thereof with replaced heterocyclic CH group against -N-, -O- or -S- and 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid dimer, trimer or tetramer;
B is selected from the group of compounds consisting of:
D3 peptide, SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12;
the linker is selected from the group of compounds consisting of:
no linker, GABA, TEG, TEG-dimer, PEG, alpha-amino acids, alpha-amino-omega-carboxylic acid.

Description

Die Erfindung betrifft eine Hybrid-Verbindung basierend auf Aminopyrazolen und Peptiden zur Verwendung als Therapeutikum bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung bzw. eine Proteinfehlfaltung eine Rolle spielt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.The invention relates to a hybrid compound based on aminopyrazoles and peptides for use as a therapeutic in the treatment of diseases in which an aberrant protein aggregation or multimerization or a protein misfolding plays a role. Furthermore, the invention relates to a process for the preparation of these compounds.

Erkrankungen, bei denen die Proteinaggregation oder Proteinfehlfaltungen beziehungsweise die Amyloidedegeneration eine Rolle spielen, sind eine heterogene Gruppe klinischer Zustände, die als ein gemeinsames Merkmal die Ablagerung spezifischer Proteine in der Konformation von Beta-Faltblattstrukturen haben. Zu dieser Gruppe von Proteinaggregationserkrankungen bzw. Proteinfehlfaltungserkrankungen gehört auch die Morbus Alzheimer Krankheit umgangssprachlich auch als Alzheimer Krankheit bezeichnet, bzw. Alzheimersche Demenz (AD). Die Alzheimersche Demenz ist die häufigste Demenzform und betrifft heute mehr als 60% der geschätzten 24 Millionen demenzkranken Menschen weltweit. Als pathologisches Hauptmerkmal der AD ist die Bildung von senilen oder amyloiden Plaques, bestehend aus dem A (Amyloid) -beta-Peptid und neurofibrillösen Ablagerungen aus dem Tau-Protein. Das A -beta-Peptid entsteht durch die Aktivität mindestens zweier verschiedener Proteasen aus einem Vorläuferprotein, genannt „Amyloid precursor protein“ (APP). Dieses ist in der Zellwand von Neuronen lokalisiert. Bei dem proteolytischen Abbau von APP und durch nachträgliche Modifikation entstehen A-beta-Fragmente unterschiedlicher Länge und Art. Die Amyloid-Kaskadenhypothese wurde in den 90er Jahren aufgestellt und postuliert, dass die Ablagerung von A-beta in Form von Plaques Auslöser der Krankheitssymptome ist. Unterschiedliche Studien weisen darauf hin, dass kleinere, frei diffundierbare A-beta-Oligomere toxischer sind als die in den Plaques abgelagerten A -beta-Fibrillen.Diseases involving protein aggregation or protein misfolding or amyloid degeneration are a heterogeneous group of clinical states that share the common feature of depositing specific proteins in the conformation of beta-sheet structures. Alzheimer's disease is also known as Alzheimer's disease, or Alzheimer's disease (AD), as part of this group of protein aggregation disorders or protein misfolding disorders. Alzheimer's disease is the most common form of dementia and today affects more than 60% of the estimated 24 million people with dementia worldwide. The major pathological feature of AD is the formation of senile or amyloid plaques, consisting of the A (amyloid) beta-peptide and neurofibrillary deposits from the tau protein. The A beta peptide results from the activity of at least two different proteases from a precursor protein called "amyloid precursor protein" (APP). This is localized in the cell wall of neurons. The proteolytic degradation of APP and subsequent modification produce A-beta fragments of varying length and type. The amyloid cascade hypothesis was postulated in the 1990's and postulated that the deposition of A-beta in the form of plaques is the cause of the disease symptoms. Different studies indicate that smaller, freely diffusible A-beta oligomers are more toxic than the plaque-deposited A-beta fibrils.

Bisher gibt es nur palliative Therapien der Alzheimerschen Demenz. Die Ursachen für diese Erkrankung können bisher nicht behandelt werden, obgleich mit Hochdruck an unterschiedlichen Therapiemöglichkeiten geforscht wird. Häufig steht hierbei die Verhinderung der A-beta-Aggregation im Fokus, zum Beispiels durch Substanzen, die an A-beta-Peptide binden und so eine Aggregation unmöglich machen, bzw. bereits bestehende Aggregate auflösen. Ein solcher Ansatz ist aus der WO 2007/112922 bekannt, in der nicht-peptidische Wirkstoffe auf Aminopyrazolbasis beschrieben werden.So far, there are only palliative therapies of Alzheimer's dementia. The causes of this disease can not be treated so far, although research is being carried out with great urgency on different treatment options. Frequently, the focus is on the prevention of A-beta aggregation, for example, by substances that bind to A-beta peptides and thus make aggregation impossible, or dissolve already existing aggregates. Such an approach is out of the WO 2007/112922 in which non-peptide aminopyrazole-based drugs are described.

Eine andere Gruppe von letalen neurodegenerativen Krankheiten sind die Transmissiblen Spongiformen Enzephalopatien (TSE) oder Prion-Erkrankungen, wie die humane Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD), die Schafskrankheit Scrapie und die bovine spongiforme Enzephalopatie (BSE). Sie stellen eine besondere Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen dar, weil sie neben der spontanen oder genetisch bedingten Form, wie der Name sagt, auch durch Infektion hervorgerufen werden können. Die strukturelle Umwandlung von zellulärem Prionprotein (PrPc) in krankheitsassoziiertes, beta-Faltblatt reiches PrPSc führt zur tödlichen Akkumulation von PrPSc in amyloiden Proteindepots. Wie auch für die Alzheimische Demenz gibt es für diese Krankheiten aktuell keine kausalen Therapien.Another group of lethal neurodegenerative diseases are transmissible spongiform encephalopathies (TSE) or prion diseases such as human Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), sheep disease scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE). They represent a special group of neurodegenerative diseases, because they can be caused by infection in addition to the spontaneous or genetic form, as the name implies. The structural conversion of cellular prion protein (PrPc) into disease-associated, beta-sheet-rich PrPSc leads to the fatal accumulation of PrPSc in amyloid protein deposits. As for Alzheimer's dementia, there are currently no causal therapies for these diseases.

Obwohl sich die Alzheimersche Demenz und die Prion-Erkrankungen auf den pathophysiologischen Niveau deutlich unterscheiden, konnte gezeigt werden, dass beta-Faltblatt-reiche A-beta-Oligomere und beta-Faltblatt-reiches PrP^Sc durch die gleiche konformations-spezifischen Antikörper erkannt werden.Although Alzheimer's disease and prion diseases differ markedly at the pathophysiological level, it has been shown that beta-sheet-rich A-beta oligomers and beta-sheet-rich PrP ^{Sc are recognized} by the same conformation-specific antibody.

Aus der WO2007/11922A1 sind nicht-peptidische Wirkstoffe auf Aminopyrazolbasis sowie Verfahren zu deren Herstellung bekannt. P. Rzepecki et al „Synthesis and binding stues of Alzheimer ligands on solid support“ in: Journal of Organic Chemitry, ISSN 022-9263, 2007, 72, 36 14 - 24 beschreibt die Herstellung von Aminopyrazolen und Derivaten. Aminopyrazol/Peptid-Hybrid-Verbindungen, enthaltend ein D-Peptid werden nicht gezeigt.From the WO2007 / 11922A1 For example, non-peptidic aminopyrazole-based drugs and methods for their preparation are known. P. Rzepecki et al. "Synthesis and binding stues of Alzheimer's ligands on solid support" in: Journal of Organic Chemistry, ISSN 022-9263, 2007, 72, 36 14-24 describes the preparation of aminopyrazoles and derivatives. Aminopyrazole / peptide hybrid compounds containing a D-peptide are not shown.

Aus DE102008037564A1 sind Zusammensetzugnen enthaltend D-Peptide oder Antikörper zur Verwendung als Therapeutikum bekannt. Hybrid-Verbindungen auf Aminopyrazol/Aminopyrazol-Derivat-Basis werden nicht gezeigt.Out DE102008037564A1 For example, compositions containing D-peptides or antibodies for use as a therapeutic are known. Aminopyrazole aminopyrazole derivative-based hybrid compounds are not shown.

Verbindungen, die solche A -beta-Oligomere vermindern, sind z.B. Peptide wie sie in der PCT/EP 02/03862 A oder aus der WO 02/081505 A2 beschrieben werden.Compounds which reduce such A-beta oligomers are, for example, peptides as described in U.S. Pat PCT / EP 02/03862 A or from the WO 02/081505 A2 to be discribed.

Bisher können allerdings nur die Symptome solcher Krankheiten wie z.B. der Alzheimerschen Demenz oder der Prion-Erkrankung behandelt werden. Es gibt noch keine zugelassenen Medikamente, die diese Krankheitsprozesse aufhalten oder rückgängig machen können.So far, however, only the symptoms of such diseases as e.g. Alzheimer's disease or prion disease. There are still no approved drugs that can stop or reverse these disease processes.

Außerdem zeigen einige der bisher eingesetzten Medikamente unerwünschte Nebenwirkungen wie z.B. Übelkeit, Magen-Darm-Beschwerden, Schwindel oder Schlafstörungen. In addition, some of the drugs used to date show unwanted side effects such as nausea, gastrointestinal complaints, dizziness or sleep disturbances.

Es besteht somit ein Bedarf an Verbindungen, welche z.B. toxische A -beta-Oligomere bzw. -Multimere oder -Aggregate davon oder Proteinfehlfaltungen spezifisch erkennen, vorbeugend verhindern und gegebenenfalls auflösen oder in nicht-toxische Verbindungen zu überführen.There is thus a need for compounds which are known e.g. specifically recognize, preventively prevent and, where appropriate, dissolve or convert into non-toxic compounds toxic A -beta oligomers or multimers or aggregates thereof or protein misfoldings.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, solche Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die durch ihre spezifische Wirkungsweise keine Nebeneffekte zeigen, die später zu evtl. unerwünschten Nebenwirkungen führen könnten. Des Weiteren sollen die erfindungsgemäßen Verbindungen schon in kleinen Konzentrationen wirksam sein, um auch auf diesem Wege Nebeneffekte zu vermeiden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sollen toxische A-beta-Oligomere bzw. -Multimere oder -Aggregate davon oder Proteinfehlfaltungen spezifisch erkennen, vorbeugend verhindern und gegebenenfalls auflösen oder in nicht-toxische Verbindungen überführen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Hybrid-Verbindung der Formel A-B gemäß Anspruch 1.The object of the present invention is to provide those compounds which, by virtue of their specific mode of action, show no side effects which could later lead to any undesired side effects. Furthermore, the compounds of the invention should be effective even in small concentrations in order to avoid side effects in this way.
The compounds according to the invention are intended to specifically recognize toxic preventive and, where appropriate, dissolve or convert into non-toxic compounds toxic A-beta oligomers or multimers or aggregates thereof or protein misfoldings.
This object is achieved by the hybrid compound of the formula AB according to claim 1.

Ein Aminopyrazolderivat im Sinne der Erfindung ist 3-Aminopyrazol-5-carbonsäure oder 3-Nitropyrazol-5-carbonsäure sowie alle Abkömmlinge, in denen die heterocyclische CH-Gruppe gegen -CR- oder -N- oder -O- oder -S- ausgetauscht wurde, sowie alle daraus abgeleiteten peptidischen Dimere, Trimere oder -Tetramere.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Aminopyrazolderivat“ als Oberbegriff für die o.g. Derivate der 3-Aminopyrazol-5-carbonsäure und ihre Dimere, Trimere und Tetramere verwendet.
Des Weiteren wird in einer bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung das Aminopyrazol-Trimer als Verbindung A eingesetzt.An aminopyrazole derivative according to the invention is 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid or 3-nitropyrazole-5-carboxylic acid and all derivatives in which the heterocyclic CH group is replaced by -CR- or -N- or -O- or -S- and all derived peptidic dimers, trimers or tetramers.
For the purposes of the present invention, the term "aminopyrazole derivative" is used as a generic term for the abovementioned derivatives of 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid and their dimers, trimers and tetramers.
Furthermore, in a preferred variant of the present invention, the aminopyrazole trimer is used as compound A.

In der vorliegenden Erfindung ist das Peptid B ein D-Peptid. D-Peptide sind Peptide, die bevorzugt nur D-Aminosäuren enthalten oder daraus bestehen.In the present invention, peptide B is a D-peptide. D-peptides are peptides which preferably contain only or consist of D-amino acids.

In einer Variante der Erfindung weisen die D-Peptide auch teilweise L-Aminosäuren auf. „Teilweise“ L-Aminosäuren bedeutet, dass 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 oder mehr Aminosäuren homolog zur Aminosäuresequenz des aus D-Aminosäuren bestehenden D-Peptids durch jeweils die gleiche Aminosäure in der L-Konformation ersetzt sind.In a variant of the invention, the D-peptides also have partial L-amino acids. "Partial" L-amino acids means that 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 or more amino acids homologous to the amino acid sequence of the D-amino acid D-peptide by the same amino acid in each case L-conformation are replaced.

„D-Peptide“ bestehen in einer Variante aus einer retro-inversen Sequenz zum Amyloid beta-Peptid oder Amyloid beta-Peptid-Teilfragmenten und vollständig aus D-Aminosäuren."D-peptides" in one variant consist of a retro-inverse sequence to the amyloid beta-peptide or amyloid beta-peptide subfragments and all of D-amino acids.

Ein „Teilfragment“ besteht aus 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder mehr Aminosäuren homolog zur Aminosäuresequenz des Amyloid beta-Peptids.A "partial fragment" consists of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 or more amino acids homologous to the amino acid sequence of the amyloid beta peptide.

In einer weiteren Variante binden die erfindungsgemäßen D-Peptide an die Multimerisierungsdomäne des Amyloid beta-Peptids. In einer weiteren Variante weisen die D-Peptide die Sequenz SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 auf und bestehen vollständig aus D-Aminosäuren.
„D3“-Peptid: rprtr Ihthr nr (SEQ ID NO:1)
retro-inverso-A-beta(1-16): kqhhv eygsd hrfea d (SEQ ID NO:2)In a further variant, the D-peptides according to the invention bind to the multimerization domain of the amyloid beta peptide. In a further variant, the D-peptides have the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and consist entirely of D-amino acids.
"D3" peptide: rprtr Ihthr nr (SEQ ID NO: 1)
retro-inverso-A-beta (1-16): kqhhv eygsd hrfea d (SEQ ID NO: 2)

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Peptid das Sequenzmotiv SHYRHISP (SEQ ID NO: 3)oder aktive Fragmente davon.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Peptid das Sequenzmotiv GISWQQSHHLVA (SEQ ID NO: 4)oder aktive Fragmente davon.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Peptid das Sequenzmotiv PRTRLHTH (SEQ ID NO: 5) oder aktive Fragmente davon.In another embodiment of the present invention, the peptide comprises the sequence motif SHYRHISP (SEQ ID NO: 3) or active fragments thereof.
In a further embodiment of the present invention, the peptide comprises the sequence motif GISWQQSHHLVA (SEQ ID NO: 4) or active fragments thereof.
In a further embodiment of the present invention, the peptide comprises the sequence motif PRTRLHTH (SEQ ID NO: 5) or active fragments thereof.

In einer weiteren Variante wird das Peptid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Peptiden mit den D-Aminosäure-Sequenzen : a) QSHYRHISPAQV (SEQ ID NO: 6); b) QSHYRHISPDQV (SEQ ID NO: 7); c) QSHYRHISPAR (SEQ ID NO: 8); d) KSHYRHISPAKV (SEQ ID NO: 9); e) RPRTRLHTHRNR (SEQ ID NO: 10); i) RPRTRLHTHRTE (SEQ ID NO: 11); und g) KPRTRLHTHRNR (SEQ ID NO: 12); Bevorzugt sind ferner Sequenzen, die sich von den Sequenzen a) bis g) um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden ; sowie Sequenzen, die die Sequenzen a) bis g) sowie Sequenzen, die sich von den Sequenzen a) bis g) um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden, umfassen.In a further variant, the peptide is selected from the group consisting of peptides having the D-amino acid sequences: a) QSHYRHISPAQV (SEQ ID NO: 6); b) QSHYRHISPDQV (SEQ ID NO: 7); c) QSHYRHISPAR (SEQ ID NO: 8); d) KSHYRHISPAKV (SEQ ID NO: 9); e) RPRTRLHTHRNR (SEQ ID NO: 10); i) RPRTRLHTHRTE (SEQ ID NO: 11); and g) KPRTRLHTHRNR (SEQ ID NO: 12); Also preferred are sequences which differ from the sequences a) to g) by up to three amino acids; and sequences comprising sequences a) to g) and sequences differing from sequences a) to g) by up to three amino acids.

In einer weiteren Variante weisen die D-Peptide Fragmente der oben genannten Sequenzen auf oder weisen homologe Sequenzen zu den oben genannten Sequenzen auf. In a further variant, the D-peptides have fragments of the abovementioned sequences or have homologous sequences to the abovementioned sequences.

„Homologe Sequenzen“ bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit mindestens einer der oben genannten Sequenzen von mindestens 70%, 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, insbesondere 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% aufweist. Homologe Sequenzen zu den erfindungsgemäßen Sequenzen bestehend aus D-Aminosäuren können auch teilweise L-Aminosäuren enthalten. Anstelle des Begriffs „Identität“ werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe „homolog“ oder „Homologie“ gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T.F. und Waterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz / Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S.B. und Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3."Homologous sequences" in the sense of the invention means that an amino acid sequence has an identity with at least one of the abovementioned sequences of at least 70%, 75%, 80%, particularly preferably 85%, 90%, in particular 91%, 92%, 93%. , 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%. Homologous sequences to the sequences of the invention consisting of D-amino acids may also partially contain L-amino acids. Instead of the term "identity", the terms "homologous" or "homology" are used synonymously in the present description. The identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is determined by comparison with the help of the program BESTFIT based on the algorithm of Smith, TF and Waterman, MS (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) calculated by setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameter for nucleic acids: gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3. Preferably, the identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is defined by the identity of the nucleic acid sequence / polypeptide sequence over the entire sequence length, as determined by comparison with the aid of the GAP program based on the algorithm of Needleman, SB and Wunsch, CD (J. Mol. Biol. 48: 443-453) calculated by setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acid gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.

Unter dem Begriff „Retro-inverses Peptid“ oder „Retro-inverso Peptid“ wird erfindungsgemäß ein Peptid bezeichnet, welches sich aus Aminosäuren in der D-Form zusammensetzt (invers: Chiralität des alpha-C-Atoms invers zur L-Form), bei dem zusätzlich die Sequenzreihenfolge zum ursprünglichen Peptid umgekehrt wurde (retro = rückwärts; siehe auch Regenmortel und Muller, 1998; Current Opinion in Biotechnology 9:377 -382 ).The term "retro-inverse peptide" or "retro-inverso peptide" according to the invention refers to a peptide which is composed of amino acids in the D-form (inverse: chirality of the alpha-C atom inverse to the L-form), in In addition, the order of sequence was reversed to the original peptide (retro = backward, see also Rainmortel and Muller, 1998; Current Opinion in Biotechnology 9: 377-382 ).

In der vorliegenden Erfindung wird der Linker ausgewählt aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus: GABA (γ-Aminobuttersäure), TEG (Triethylenglykol), TEG₂ (Triethylenglykol-Dimer), PEG (Polyethylenglykol), α-Aminosäure sowie alpha-Amino-omega-carbonsäure , wobei die zentralen Kettenglieder wahlweise ganz oder nur zum Teil aus Alkylenresten bestehen (-CH₂)_n-. Alternativ können einzelne CH₂-Gruppen durch -O-, -N- und -S-Atome bzw. durch Carbonylgruppen oder CHR-Gruppen ersetzt werden (mit R= sämtliche proteinogenen Aminosäurereste). Ausführungsbeispiele sind:In the present invention, the linker is selected from the group of compounds consisting of: GABA (γ-aminobutyric acid), TEG (triethylene glycol), TEG ₂ (triethylene glycol dimer), PEG (polyethylene glycol), α-amino acid, and alpha-amino omega -carboxylic acid, wherein the central chain links optionally wholly or only partially consist of alkylene radicals (-CH ₂ ) _n -. Alternatively, individual CH ₂ groups can be replaced by -O-, -N- and -S-atoms or by carbonyl groups or CHR groups (with R = all proteinogenic amino acid residues). Exemplary embodiments are:

Zerolinker (direkte Anbindung); b) GABA; c) TEG; d) TEG2 (Strukturen siehe unten):Zerolinker (direct connection); b) GABA; c) TEG; d) TEG2 (structures below):

Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hybrid-Verbindungen mit Aminopyrazol-Trimer als A und D3-Peptid (SEQ ID NO 1) als B die unmittelbar kovalent miteinander verknüpft sind.Preferred subject of the present invention are hybrid compounds with aminopyrazole trimer as A and D3 peptide (SEQ ID NO 1) as B which are directly covalently linked together.

Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hybrid-Verbindungen mit Aminopyrazol-Trimer als A und D3-Peptid (SEQ ID NO 1) als B die über GABA als Linker kovalent miteinander verknüpft sind. Preferred subject of the present invention are hybrid compounds with aminopyrazole trimer as A and D3 peptide (SEQ ID NO 1) as B which are covalently linked together via GABA as a linker.

Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hybrid-Verbindungen mit Aminopyrazol-Trimer als A und D3-Peptid (SEQ ID NO 1) als B die über TEG2 (TEG-Dimer) als Linker kovalent miteinander verknüpft sind.Preferred subject of the present invention are hybrid compounds with aminopyrazole trimer as A and D3 peptide (SEQ ID NO 1) as B which are covalently linked together via TEG2 (TEG-dimer) as a linker.

Bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hybrid-Verbindungen mit Aminopyrazol-Trimer als A und D3-Peptid (SEQ ID NO 1) als B die über TEG als Linker kovalent miteinander verknüpft sind, der Formel I:

Preferred subject matter of the present invention are hybrid compounds having aminopyrazole trimer as A and D3 peptide (SEQ ID NO 1) as B which are covalently linked to one another via TEG as linker, of the formula I:

Die Herstellung der Aminopyrazole und deren Derivate ist zum Beispiel in der WO 2007/112922 A1 , WO 03/095429 A1 oder von Rzepecki et al (J. Biol. Chem., Vol. 279, No. 46, pp 47497-47505, 2004) beschrieben.The preparation of aminopyrazoles and their derivatives is described, for example, in US Pat WO 2007/112922 A1 . WO 03/095429 A1 or from Rzepecki et al (J. Biol. Chem., Vol. 279, No. 46, pp 47497-47505, 2004) described.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Hybrid-Verbindung der Formel A-B.
Die Synthese ist dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Schutzgruppen versehenes Aminopyrazolderivat mit einer freien C-terminalen Carboxylgruppe an die N-terminale Aminogruppe eines mit Schutzgruppen versehenen Peptids gekuppelt wird, wobei das Peptid an eine feste Phase gebunden ist.
In einer Ausführung der Erfindung wird PMB (Paramethoxybenzyl) als Schutzgruppe für die heterocyclische NH-Funktion verwendet.Another object of the present invention is a process for the preparation of the hybrid compound of the formula AB.
The synthesis is characterized in that a capped aminopyrazole derivative having a free C-terminal carboxyl group is coupled to the N-terminal amino group of a protected peptide, the peptide being bound to a solid phase.
In one embodiment of the invention, PMB (paramethoxybenzyl) is used as a protecting group for the NH heterocyclic function.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Hybridverbindungen der Formel A-B erfolgt prinzipiell unter Synthesebedingungen und in Lösungsmitteln sowie gemäß Verfahren wie sie aus der Literatur bekannt sind ( J. Org. Chem., Vol. 72, pp 3614-3624, 2007 ).The preparation of the hybrid compounds of the formula AB according to the invention is carried out in principle under synthesis conditions and in solvents and according to methods known from the literature ( J. Org. Chem., Vol. 72, pp 3614-3624, 2007 ).

In einer Ausführung der Erfindung erfolgt die Kopplung des Aminopyrazols an das Peptid mittels Peptidkupplungsreagenzien, wie sie aus der Literatur bekannt sind, z.B. ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: HCTU (2-(6-Chloro-1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-Tetramethylamonium Hexafluorophosphat), Diisopropylethylamin, BOP Reagenz, CDI, DEPBT, EDC.HCl, HATU, HPTU, HCTU, HOAt, PyBOP, PyBrOp, TATU, TBTU, TDBTU, TSTU, BopCl, PyClop.In one embodiment of the invention, the coupling of the aminopyrazole to the peptide is accomplished by means of peptide coupling reagents known in the literature, e.g. selected from the group consisting of: HCTU (2- (6-chloro-1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethylammonium hexafluorophosphate), diisopropylethylamine, BOP reagent, CDI, DEPBT, EDC.HCl, HATU, HPTU, HCTU, HOAt, PyBOP, PyBrOp, TATU, TBTU, TDBTU, TSTU, BopCl, PyClop.

In einer weiteren Ausführungform der vorliegenden Erfindung wird bei der Synthese Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) als Schutzgruppe der Verbindung B eingesetzt.In another embodiment of the present invention, Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) is used as the protecting group of compound B in the synthesis.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel A-B, wobei zwischen dem Aminopyrazol und dem Peptid ein Linker, wie oben beschrieben, kovalent gebunden wird.Another embodiment of the present invention is a compound of formula A-B wherein a linker is covalently linked between the aminopyrazole and the peptide as described above.

Die Herstellung dieser mit einem Linker versehenen Hybridverbindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung A, welche mit Schutzgruppen wie oben beschrieben versehen ist, mit ihrer C-terminalen Carboxylgruppe zunächst an den Linker gekoppelt wird, und anschließend diese Einheit bestehend aus einem Aminopyrazol, bevorzugt Trimer, und einem Linker, mit der freien Carboxylgruppe des Linkers an das mit Schutzgruppen versehene Peptid gebunden wird.The preparation of this linker-containing hybrid compound is characterized in that the compound A, which is provided with protective groups as described above, is first coupled with its C-terminal carboxyl group to the linker, and then this unit consisting of an aminopyrazole, preferably trimer , and a linker, with the free carboxyl group of the linker attached to the protected peptide.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist das Peptid während der Synthese der Hybridverbindungen an ein Harz als feste Phase gebunden.In a variant of the present invention, the peptide is bound to a resin as a solid phase during synthesis of the hybrid compounds.

In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Hybridverbindung nach der erfolgreichen Kopplung der Verbindungen A und B (ggf. mit einem Linker dazwischen) zunächst mittels Säure die Schutzgruppen des Peptids entfernt und die gesamte Hybridverbindung, bei der die Aminopyrazoleinheit noch mit Schutzgruppen versehen ist, von dem Harz gelöst. Danach werden auch die PMB-Schutzgruppen der Pyrazoleinheit mittels heißer Säure entfernt. Bevorzugt wird bei der Entfernung der Schutzgruppen mit Säuren Trifloressigsäure eingesetzt (70°C, 3h). In one embodiment of the present invention, in the preparation of the hybrid compound according to the invention after the successful coupling of compounds A and B (optionally with a linker therebetween), the protecting groups of the peptide are first removed by acid and the entire hybrid compound wherein the aminopyrazole moiety is still deprotected is provided detached from the resin. Thereafter, the PMB protecting groups of the pyrazole unit are also removed by means of hot acid. Trifloroacetic acid is preferably used in the removal of the protective groups with acids (70 ° C., 3 hours).

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Verwendung einer erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindung zur Verhinderung von toxischen Amyloid beta-Peptid-Multimeren beziehungsweise Oligomeren.Another object of the invention is a use of a hybrid compound according to the invention for the prevention of toxic amyloid beta-peptide multimers or oligomers.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindung bei der Vorbeugung und/oder Therapie von Krankheiten bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung oder Proteinfehlfaltungen toxisch wirken.Another object of the invention is the use of the hybrid compound of the invention in the prevention and / or treatment of diseases in which an aberrant protein aggregation or -multimerisierung or protein misfolding toxic.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Hybrid-Verbindung zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten, bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung oder Proteinfehlfaltungen toxisch wirken.Another object of the invention is the use of the hybrid compound for the preparation of an agent for the prevention or treatment of diseases in which aberrant protein aggregation or multimerization or protein malformations are toxic.

Zu diesen Krankheiten gehören die Transmissiblen Spongiforme Enzephalopatien (TSE) oder Prion-Erkrankungen, wie die humane Creutzfeld-Jakobs-Krankheit (CJD), die Schafskrankheit Scrapie und die bovine spongiforme Enzephalopatie (BSE) oder die Parkinson-Erkrankung. Ferner zählen auch die Diabetis Typ II und die Congophile Angiopathie dazu.These diseases include transmissible spongiform encephalopathies (TSE) or prion diseases such as human Creutzfeldt-Jakobs disease (CJD), sheep disease scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE) or Parkinson's disease. Also included are type II diabetes and congenital angiopathy.

Ferner ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindung zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung und/oder Therapie von Morbus Alzheimer.The invention further relates to the use of the hybrid compound according to the invention for the production of an agent for the prevention and / or therapy of Alzheimer's disease.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine erfindungsgemäße Hybridverbindung, insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Auflösung oder Verhinderung von toxischen Amyloid-beta-peptidmultimeren oder Aggregation von Peptiden oder Proteinfehlfaltungen, die zu neurodegenerativen Erkrankungen führen.The invention furthermore relates to a pharmaceutical composition comprising a hybrid compound according to the invention, in particular a pharmaceutical composition for dissolving or preventing toxic amyloid beta-peptide multimers or aggregation of peptides or protein misfolding leading to neurodegenerative diseases.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie intravenös, subcutan, intraperitoneal, intrarektal, intravesikal, topisch oder als Aerosol eingesetzt wird.The pharmaceutical composition according to the invention is characterized in that it is used intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intrarectally, intravesically, topically or as an aerosol.

Die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen zeigen synergetische Effekte, die den Einzelmolekülen A und B überlegen sind.
Synergetische Effekte im Sinne der vorliegenden Erfindung werden nachgewiesen durch die Reduktion toxischer A-beta-Oligomere im Überstand A-beta-Oligomer sezernierender Zellen durch Zugabe der erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen. Im Falle synergetischer Effekte ist die Reduktion toxischer A-beta-Oligomere dosisabhängig, bevorzugt signifikant deutlicher als mit jeder der Einzelsubstanzen A und B und/oder einer Kombination aus beiden
Ferner inhibieren die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen die Aggregation von A-beta-Oligomeren in niedrigen Konzentrationen, in denen die einzelnen Verbindungen A und B noch keine Wirkung zeigen.The hybrid compounds of the invention show synergistic effects that are superior to the single molecules A and B.
Synergetic effects in the context of the present invention are demonstrated by the reduction of toxic A beta oligomers in the supernatant of A beta-oligomer-secreting cells by adding the hybrid compounds according to the invention. In the case of synergistic effects, the reduction of toxic A-beta oligomers is dose-dependent, preferably significantly more pronounced than with each of the individual substances A and B and / or a combination of both
Furthermore, the hybrid compounds according to the invention inhibit the aggregation of A-beta oligomers in low concentrations, in which the individual compounds A and B still have no effect.

Toxische Amyloid-beta-peptidmultimere oder Aggregation von Peptiden oder Proteinfehlfaltungen im Sine der vorliegenden Erfindung liegen vor, wenn die Cytotoxizität in einem MTT Test (siehe van Groen et al. 2008) nachgewiesen werden kann.
In einer weiteren Variante wird die Toxizität in einem Langzeit-Potenzierungs-Test nachgewiesen.Toxic amyloid beta-peptide multimers or aggregation of peptides or protein misfoldings in the sine of the present invention are present when cytotoxicity can be detected in an MTT assay (see van Groen et al., 2008).
In another variant, the toxicity is detected in a long-term potentiation test.

Zusätzlicher und/oder alternativer Effekt der erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen ist ein deutlicher Anti-Prion-Effekt. Dies ist ein Effekt auf Prionen, die infektiösen Erreger der oben genanten Prion-Erkrankungen, dergestalt, dass durch die Verhinderung der Multimerisierung beziehungsweise. Das Anlagern der infektiösen Erreger an die Edukte ihre Replikation verhindert wird.Additional and / or alternative effect of the hybrid compounds according to the invention is a distinct anti-prion effect. This is an effect on prions, the infectious agents of the above-mentioned prion diseases, such that by preventing multimerization respectively. The attachment of the infectious agents to the educts prevents their replication.

Ferner bewirken die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen eine Aufhebung synaptischer Pathologien die durch A-beta-Oligomere verursacht werden.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen die durch A-beta-Oligomere verursachte Aufhebung der LTP (Langzeit-Potenzierung), eine Form der synaptischen Plastizität rückgängig machen.Furthermore, the hybrid compounds according to the invention cause a reversal of synaptic pathologies caused by A-beta oligomers.
In addition, the hybrid compounds of this invention can reverse the LTP (long term potentiation) caused by A beta oligomers, a form of synaptic plasticity.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand der Ausführungsbeispiele und der beiliegenden Abbildungen näher beschrieben. In the following the invention with reference to the embodiments and the accompanying drawings will be described in more detail.

BEISPIELEEXAMPLES

Beispiel 1:Example 1:

Herstellung der Hybridverbindung:Preparation of the hybrid compound:

Die Verbindung wurde in einem konvergenten halbautomatischen Verfahren synthetisiert. Zunächst wurde das mit PMB-Schutzgruppen versehende Aminopyrazol-Trimer-OH am C-Terminus mit einem Linker, GABA, TEG, TEG₂, verlängert. Anschließend wurde die Trimer-Linker-OH-Einheit an das D3-Peptid gekoppelt, welches an ein Harz gebunden ist. Dieser Schritt stellt den letzten Schritt einer Peptid-Festphasensynthese dar. Anschließend wurde die Hybridverbindung unter milden Bedingungen bei Raumtemperatur von dem Harz gelöst, gefolgt von der Abspaltung der PMB-Schutzgruppen mit heißer Trifluoressigsäure (TFA).The compound was synthesized in a convergent semi-automatic method. First, the aminopyrazole trimer-OH, which has PMB protecting groups, was extended at the C-terminus with a linker, GABA, TEG, TEG ₂ . Subsequently, the trimer-linker OH unit was coupled to the D3 peptide which is bound to a resin. This step represents the final step of a peptide solid phase synthesis. Subsequently, the hybrid compound was dissolved from the resin under mild conditions at room temperature, followed by cleavage of the PMB protecting groups with hot trifluoroacetic acid (TFA).

Das D3-Peptid wurde mittels einer Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese in einem automatischen Mikrowellenpeptidsynthesizer synthetisiert (CEM, Liberty, Kamp-Lintfort, Deutschland). Ein Wang-Harz wurde als Polymerträger verwendet, beladen mit Fmoc-D-Arg(Pbf) mit einer durchschnittlichen Beladung von 0,51 mmol/g. Jeder Kopplungsschritt wurde durchgeführt mit D-Aminosäuren (0,20 M in DMF) geschützt mit Fmoc (9-Fluoronyl-Metoxycarbonyl). Die Entfernung der Schutzgruppen der Aminosäureseidenkette erfolgte durch eine saure Mischung bestehend aus 93% TFA, 5 % Triisopropylsilan und 2 % Wasser bei Raumtemperatur über 3,5 Stunden. Nach der Filtration wurde die Lösung auf 0 Grad C gekühlt und die mit PMB-Schutzgruppen versehene Hybridverbindung unter Zugabe von kaltem Diethylether präzipitiert und mit kaltem Diethylether gewaschen. Anschließend wurde die feste, farblose Verbindung im Vakuum getrocknet.The D3 peptide was synthesized by Fmoc solid-phase peptide synthesis in an automatic microwave peptide synthesizer (CEM, Liberty, Kamp-Lintfort, Germany). A Wang resin was used as a polymer support loaded with Fmoc-D-Arg (Pbf) with an average loading of 0.51 mmol / g. Each coupling step was performed with D-amino acids (0.20 M in DMF) protected with Fmoc (9-fluoronyl-metoxycarbonyl). The deprotection of the amino acid silk chain was carried out by an acidic mixture consisting of 93% TFA, 5% triisopropylsilane and 2% water at room temperature for 3.5 hours. After filtration, the solution was cooled to 0 ° C and the PMB-protected hybrid compound was precipitated by addition of cold diethyl ether and washed with cold diethyl ether. Subsequently, the solid, colorless compound was dried in vacuo.

Zum Ablösen der PMB-Schutzgruppen wurde die Verbindung unter Argon in TFA für 3 Stunden bei 70 Grad C erhitzt. Das Produkt wurde anschließend unter Zugabe von kaltem Diethylether präzipitiert. Das Präzipitat wurde gefiltert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die so entstandene Hybridverbindung wurde analysiert mittels ESI-TOF und HPLC und als lyophilisiertes Pulver bei minus 18 Grad C gelagert.To dissolve the PMB protecting groups, the compound was heated under argon in TFA for 3 hours at 70 degrees Celsius. The product was then precipitated with the addition of cold diethyl ether. The precipitate was filtered, washed with diethyl ether and dried in vacuo. The resulting hybrid compound was analyzed by ESI-TOF and HPLC and stored as a lyophilized powder at minus 18 degrees C.

Beispiel 2: Wirkung der erfindungsgemäßen Hybrid-Verbindungen auf die A-beta-Oligomerisation Example 2: Effect of the hybrid compounds according to the invention on the A beta oligomerization

Die Experimente wurden gemäß dem Protokoll von Walsh et al. (J Neuro Sci., 25, pp. 2455 - 2462, 2005) durchgeführt. 7PA2-Zellen die APP751 Val717Phe überexprimieren, wurden in DMEM-Medium mit 10% FBS kultiviert. 0,3 x 105 -Zellen wurden in eine 10 cm-Zellkulturschale umgesetzt und kultiviert. Die Zellen wurden mit folgenden Substanzen behandelt: Zugabe der Hybridverbindung gemäß Formel 1 in Konzentrationen von 0,1,5 und 10 µM über 3 Tage. Des Weiteren erfolgte die Zugabe von D3-Peptid, Aminopyrazol-Trimer, sowie D3-Peptid und Aminopyrazol-Trimer zusammen, alle in einer Konzentration von 10 µM.The experiments were carried out according to the protocol of Walsh et al. (J Neuro Sci., 25, pp. 2455-2462, 2005) carried out. 7PA2 cells overexpressing APP751 Val717Phe were cultured in DMEM medium with 10% FBS. 0.3 x 10 5 cells were transferred to a 10 cm cell culture dish and cultured. The cells were treated with the following substances: Addition of the hybrid compound according to formula 1 in concentrations of 0,1,5 and 10 μM for 3 days. Furthermore, the addition of D3 peptide, aminopyrazole trimer, and D3 peptide and aminopyrazole trimer were all together, all at a concentration of 10 μM.

Die einzelnen Verbindungen wie das Peptid, das Aminopyrazol oder beide zusammen zeigten bei dieser Konzentration keinen Effekt auf die Inhibierung der A-’Y-OligoMerisation. Lediglich die erfindungsgemäße Hybridverbindung der Formel 1 zeigte eine deutlich dosisabhängige Inhibierung der A-’Y-Oligo-Merisation.The individual compounds such as the peptide, the aminopyrazole or both together did not show any effect on the inhibition of A-'Y-oligo-merization at this concentration. Only the hybrid compound of the formula 1 according to the invention showed a clearly dose-dependent inhibition of the A-'Y-oligo merization.

1 zeigt den Vergleich von 5 unabhängigen Experimenten wie oben beschrieben mit 7PA2-Zellen, die mit den angegebenen Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Formel 1 behandelt wurden. Die Signifikanz der Ergebnisse wurden mit einem student t-test nachgewiesen. Bei einem Stern ist p = 0,012, 3 Sterne p = 0.0007. 1 shows the comparison of 5 independent experiments as described above with 7PA2 cells, which were treated with the indicated concentrations of the compound according to the invention according to formula 1. The significance of the results was demonstrated with a student t-test. For a star, p = 0.012, 3 stars p = 0.0007.

Diese Ergebnisse belegen deutlich den synergetischen Effekt der erfindungsgemäßen Hybridverbindung. A und B, also D3-Peptid oder Aminopyrazoltrimer sowohl einzeln als auch zusammen in dieser Konzentrationen haben keinen Effekt auf die A-Beta-Oligomer-Bildung. Die Hybridverbindung gemäß Formel 1 jedoch zeigt einen deutlich dosisabhängigen Effekt und belegt somit den synergistischen Effekt der Hybridverbindungen insbesondere im Vergleich zur gleichzeitigen Zugabe von D3-Peptid und Aminopyrazoltrimer.These results clearly demonstrate the synergistic effect of the hybrid compound according to the invention. A and B, ie D3 peptide or aminopyrazole trimer both individually and together at these concentrations have no effect on A-beta oligomer formation. The hybrid compound according to formula 1, however, shows a clearly dose-dependent effect and thus demonstrates the synergistic effect of the hybrid compounds, in particular in comparison to the simultaneous addition of D3-peptide and aminopyrazoltrimer.

Beispiel 3: Aufhebung synaptischer Pathologien verursacht durch A-beta-Oligomere mittels der Hybrid-Verbindung der Formel IExample 3: Abrogation of synaptic pathologies caused by A-beta oligomers by means of the hybrid compound of the formula I.

Die Kultur von C57BL/6J Maus-Fötus-Zellen bis zu Tag 19 der embryonalen Entwicklung wird von Mohrmann et al. (Neuriscience, 17, 7-18, 2003) beschrieben. Die Neuronen wurden in Neurobal A Medium (GIBCO) mit 2% NS-21, 100U/ml Penicilin, 100 µg/ml Streptomycin und GlutaMAX auf mit Poly-L-Ornithin (1mg/ml) beschichteten Objekträgern kultiviert. Nach 8 Tagen wurde die Hälfte des Mediums gegen den Überstand der 7PA2 Zelkultur mit 27.7 nM A-beta-Peptid ausgetauscht und die Verbindung der Formel I in einer Konzentration von 10 µM zugesetzt. Als Kontrolle wurden Neuronen mit den Überstand der 7PA2 Zelkultur mit 27.7 nM A-beta-Peptid ohne die Hybrid-Verbindung verwendet.The culture of C57BL / 6J mouse fetal cells until day 19 of embryonic development is determined by Mohrmann et al. (Neuriscience, 17, 7-18, 2003) described. The neurons were in Neurobal A medium (GIBCO) with 2% NS-21, 100U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and GlutaMAX on poly-L-ornithine (1 mg / ml) coated slides. After 8 days, half of the medium was replaced with the supernatant of the 7PA2 cell culture with 27.7 nM A-beta peptide and the compound of formula I was added at a concentration of 10 μM. As a control, neurons were used with the supernatant of the 7PA2 cell culture with 27.7 nM A-beta peptide without the hybrid compound.

Die mEPSC (miniatur exzitatorischer postsynaptischer Strom) -Aufnahmen erfolgten nach 3 Tagen mittels Ganz-Zellen Voltage-Clamp wie von Jungling et al. (J neurosci 26, 6968-6978, 2006) beschrieben. Um signifikante Ergebnisse zu erhalten wurden jeweils 20-36 Zellen vermessen. Die Ergebnisse wurden mit einem student t Test überprüft (**p=0.001) Die Ergebnisse sind in 2 zusammengefasst.
Daraus geht hervor, dass die erfindungsgemäße Hybridverbindung der Formel I den von A-beta-Oligomeren induzierten Rückgang der mEPSC Frequenz aufhebt.The mEPSC (miniature excitatory postsynaptic current) recordings were made after 3 days using whole cell voltage clamp as of Jungling et al. (J Neurosci 26, 6968-6978, 2006) described. In order to obtain significant results, 20-36 cells were measured in each case. The results were checked with a student t test (** p = 0.001). The results are in 2 summarized.
It can be seen that the hybrid compound of the formula I according to the invention abolishes the decrease in the mEPSC frequency induced by A-beta oligomers.

Beispiel 4: Hybrid-Verbindung der Formel I machen die durch A-beta-Oligomere verursachte Aufhebung der LTP (Langzeit-Potenzierung) rückgängigExample 4: Hybrid compound of the formula I reverse the reversal of LTP (long-term potentiation) caused by A-beta oligomers

Amyloid-Beta-Peptid wurde in DMSO in eine Konzentration von 100 µM aufgelöst und mit Ultraschall behandelt. Die Oligomere erhielt man durch Verdünnen dieser Stammlösung mit F12/DMEM (ohne Glutamin, von Biochrom) auf eine Konzentration von 20 µM und Inkubation bei 4 Grad für 24 Stunden. Die erfindungsgemäße Hybrid-Verbindung der Formel 1 wurde in einer Konzentration von 10 µM dieser Oligomerenpräparation zugesetzt. Die Überprüfung der Oligomergeneration erfolgte mittels SDS-PAGE und anschließend unter Coomassie-Färbung mit Instant Blue Coomassie Stain Kit (Expedion).Amyloid beta peptide was dissolved in DMSO to a concentration of 100 μM and sonicated. The oligomers were obtained by diluting this stock solution with F12 / DMEM (without glutamine, from biochrome) to a concentration of 20 μM and incubating at 4 degrees for 24 hours. The hybrid compound of the formula 1 according to the invention was added at a concentration of 10 .mu.M of this oligomer preparation. The oligomer generation was checked by SDS-PAGE and then under Coomassie staining with Instant Blue Coomassie Stain Kit (Expedion).

Die Mäuse wurden unter konstanten Umgebungsbedingungen gehalten, d.h. bei einer Temperatur von 21 +/- 2 Grad C, einer Luftfeuchte von 40%, eines 12-Stunden Hell/Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und Wasser. Alle Tierexperimente stimmen mit der Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft 86/609/EEC überein.The mice were kept under constant environmental conditions, i. at a temperature of 21 +/- 2 degrees C, a humidity of 40%, a 12-hour light / dark cycle and free access to food and water. All animal experiments comply with European Community Directive 86/609 / EEC.

Hippocampusschnitte (400 µM dick) wurden von einer männlichen 4 Monate alten Maus C 57/BI6 gewonnen. Zunächst wurden beide Hippocampi isoliert in einer Kammer mit künstlicher Gehirnflüssigkeit transferiert. Die A-Beta-Oligomere wurden auf die Schnitte in eine Konzentration von 500 nM für 2 Stunden bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Schnitte wurden in eine Aufnahmekammer überführt und für mindestens 30 Minuten vor dem Experiment stehen gelassen. Die Kammer wurde konstant von der künstlichen Gehirn-Rückenmarkflüssigkeit (ACSF) mit einem Durchfluss von 2,5 ml/Minute bei 33 +/-1 Grad C durchströmt.Hippocampus sections (400 μM thick) were obtained from a male 4-month-old mouse C57 / BI6. First, both hippocampi were transferred isolated in a chamber with artificial brain fluid. The A-beta oligomers were added to the sections at a concentration of 500 nM for 2 hours at room temperature. The sections were transferred to a receiving chamber and allowed to stand for at least 30 minutes prior to the experiment. The chamber was constantly perfused by artificial cerebrospinal fluid (ACSF) at a flow rate of 2.5 ml / minute at 33 +/- 1 ° C.

Die synaptische Antwort erhielt man durch Stimulation der Schafferschen Kollateralen in dem Stratum Radiatum der CA1-Region mittels lackierten Edelstahlstimulierungselektroden. Glaselektroden (gefüllt mit der künstlichen Gehirn-Rückenmarkflüssigkeit, 1-4 M Omega) wurden in die apikal-dentritische Schicht gesetzt, um das fEPSP (Feld exzitatorische postsynaptische Potenzial) aufzunehmen. Die ursprüngliche Steigung des fEPSP wurde verwendet, um dieses Potenzial zu messen. The synaptic response was obtained by stimulation of the Schaffer collaterals in the stratum radiatum of the CA1 region by means of painted stainless steel stimulation electrodes. Glass electrodes (filled with the artificial cerebrospinal fluid, 1-4 M omega) were placed in the apical-dendritic layer to accommodate the fEPSP (field excitatory postsynaptic potential). The original slope of the fEPSP was used to measure this potential.

Der Testpuls wurde auf 30 % des EPSP-Maximums gesetzt. Während der Aufnahme der Basislinie wurden einzelne Stimuli jede Minute von 0,0166 Hz gesetzt und wurden alle 5 Minuten gemittelt. Sobald eine stabile Basislinie erhalten wurde, erfolgte die Induktion der Langzeitpotenzierung durch Applikation starker Stimulierungen von 3 Zügen von 100 Pulsen bei einem Intervall von 10 Minuten zwischen den Zügen und einem Intervall von 10 ms zwischen den einzelnen Pulsen.
Es wurden 7 bis 8 Experimente durchgeführt.The test pulse was set to 30% of the EPSP maximum. During baseline recording, individual stimuli were set at 0.0166 Hz every minute and averaged every 5 minutes. Once a stable baseline was obtained, long-term potentiation was induced by applying strong stimuli to 3 trains of 100 pulses at an interval of 10 minutes between trains and an interval of 10 ms between each pulse.
7 to 8 experiments were carried out.

Die Ergebnisse sind 3 zu entnehmen. Verglichen mit der Kontroll-LCP (Langzeitpotenzierung, gefüllte Kreise) wurde die LCP durch die A-Beta-Oligomere signifikant herabgesetzt (leere Kreise). Diese Herabsetzung wurde überkompensiert durch Zusatz von 10 µM Hybridverbindung der Formel 1 (Dreiecke). Die Daten belegen einen signifikanten Effekt der erfindungsgemäßen Hybridverbindung (*p < 0,05).The results are 3 refer to. Compared to the control LCP (long-term potentiation, filled circles), the LCP was significantly reduced by the A-beta oligomers (open circles). This reduction was overcompensated by the addition of 10 μM hybrid compound of formula 1 (triangles). The data demonstrate a significant effect of the hybrid compound according to the invention (* p <0.05).

BIOSEQUENCE.txt BIOSEQUENCE.txt

SEQUENCE LISTINGSEQUENCE LISTING

• <110> Forschungszentrum Jülich, Uni-Duisburg<110> Forschungszentrum Jülich, Uni-Duisburg
• <120> Hybrid-verbindungen, deren verwendung und verfahren zu deren Herstellung<120> Hybrid compounds, their use and methods for their preparation
• <130> FZJ 1001 DE<130> FZJ 1001 EN
• <160> 12<160> 12
• <170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5
• <210> 1<211> 12<212> PRT<213> Artificial Sequence <220><223> D-Peptid <400> 1
  
  <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> D-Peptide <400> 1
  
• <210> 2<211> 16<212> PRT<213> Artificial Sequence <220><223> D-Peptid <400> 2
  
  <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> D-Peptide <400> 2
  
• <210> 3<211> 8<212> PRT<213> Artificial Sequence <220> <223> D-Peptid<210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D-peptide
• <400> 3
  
  <400> 3
  
• <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence<210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
• <220> <223> D-Peptid<220> <223> D-peptide
• <400> 4
  
  <400> 4
  
• <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence<210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence
• <220> <223> D-Peptid<220> <223> D-peptide
• <400> 5
  
  <400> 5
  
• <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence<210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
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• <400> 6
  
  <400> 6
  
• <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence<210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
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  <400> 7
  
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  <400> 8
  
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  <400> 9
  
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• <400> 10
  
  <400> 10
  
• <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence<210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
• <220> <223> D-Peptid<220> <223> D-peptide
• <400> 11
  
  <400> 11
  
• <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence<210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence
• <220> <223> D-Peptid<220> <223> D-peptide
• <400> 12
  
  <400> 12
  

Claims (13)

Hybrid-Verbindung der Formel A-B wobei A ein Aminopyrazol oder ein Derivat davon ist und B ein Peptid und A und B unmittelbar oder mittels eines Linkers kovalent miteinander verbunden sind dadurch gekennzeichnet, dass B ein D-Peptid ist, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus: 3-Aminopyrazol-5-Carbonsäure, 3-Nitropyrazol-5-Carbonsäure, Derivate davon mit ersetzter heterocyclischer CH-Gruppe gegen –N-, -O- oder -S- sowie 3-Aminopyrazol-5-carbonsäure-Dimer, –Trimer oder -Tetramer; B ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus: D3-Peptid, SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12; der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus: kein Linker, GABA, TEG, TEG-Dimer, PEG, alpha-Aminosäuren, alpha-Amino-omega-carbonsäure.A hybrid compound of the formula AB wherein A is an aminopyrazole or a derivative thereof and B is a peptide and A and B are covalently linked directly or by means of a linker, characterized in that B is a D-peptide, wherein A is selected from the group Compounds consisting of: 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid, 3-nitropyrazole-5-carboxylic acid, derivatives thereof with replaced heterocyclic CH group with respect to -N-, -O- or -S- and 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid Dimer, trimer or tetramer; B is selected from the group of compounds consisting of: D3 peptide, SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12; the linker is selected from the group of compounds consisting of: no linker, GABA, TEG, TEG-dimer, PEG, alpha-amino acids, alpha-amino-omega-carboxylic acid. Verfahren zur Herstellung einer Hybrid-Verbindung gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Schutzgruppen versehenes Aminopyrazol mit einer freien Carboxylgruppe an eine N-terminale Aminogruppe eines mit Schutzgruppen versehenen Peptids gekoppelt wird, wobei das Peptid an eine feste Phase gebunden ist.Process for the preparation of a hybrid compound according to Claim 1 characterized in that a capped aminopyrazole having a free carboxyl group is coupled to an N-terminal amino group of a protected peptide, the peptide being bound to a solid phase. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass zur Kopplung zusätzlich HCTU (2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate) und Diisopropylethylamin eingesetzt wird.Method according to Claim 2 characterized in that for coupling in addition HCTU (2- (6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate) and diisopropylethylamine is used. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass bei Verbindung A Para-Metoxybenzyl als Schutzgruppe eingesetzt wird.Method according to Claim 2 characterized in that in compound A para-methoxybenzyl is used as a protective group. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass bei Verbindung B Fmoc als Schutzgruppen eingesetzt werden.Method according to Claim 2 characterized in that in compound B Fmoc be used as protective groups. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass Verbindung A mit der C-terminalen Carboxylgruppe zunächst an einen Linker gekoppelt wird und anschließend mit dem Peptid.Method according to Claim 2 characterized in that compound A is first coupled with the C-terminal carboxyl group to a linker and subsequently with the peptide. Verwendung der Hybrid-Verbindung nach Anspruch 1 zur Verhinderung von toxischen Amyloidbeta-Peptid-Oligomeren. Use of the hybrid compound according to Claim 1 for the prevention of toxic amyloid beta peptide oligomers. Verwendung der Hybrid-Verbindung nach Anspruch 1 bei der Vorbeugung und/oder Therapie von Krankheiten bei denen eine aberrante Proteinaggregation oder -multimerisierung oder Proteinfehlfaltungen toxisch wirken.Use of the hybrid compound according to Claim 1 in the prevention and / or treatment of diseases in which aberrant protein aggregation or multimerization or protein misfolding is toxic. Verwendung der Hybrid-Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten, bei denen eine aberrrante Proteinaggregation oder -multimerisierung oder Proteinfehlfaltungen toxisch wirken.Use of the hybrid compound according to Claim 1 for the preparation of an agent for the prevention or treatment of diseases in which aberrant protein aggregation or multimerization or protein misfolding is toxic. Verwendung nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Mittels zur Vorbeugung und/oder Therapie von Morbus Alzheimer.Use after Claim 9 for the preparation of an agent for the prevention and / or therapy of Alzheimer's disease. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Hybridverbindung nach Anspruch 1.A pharmaceutical composition containing a hybrid compound according to Claim 1 , Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur Auflösung oder Verhinderung von toxischen Amyloid-beta-peptidmultimeren oder Aggregation von Peptiden oder Proteinfehlfaltungen, die zu neurodegenerativen Erkrankungen führen.Pharmaceutical composition according to Claim 11 for dissolution or prevention of toxic amyloid beta-peptide multimers or aggregation of peptides or protein misfolding leading to neurodegenerative diseases. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie intravenös, subcutan, intraperitoneal, intrarektal, i ntravesikal, topisch oder als Aerosol eingesetzt wird.Pharmaceutical composition according to Claim 11 or 23, characterized in that it is used intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intrarectally, intravesically, topically or as an aerosol.

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