-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abbildung eines Tumorgewebes.
Die Erfindung betrifft ferner Neoepitope, die durch proteolytische
Spaltung von ein Tumorgewebe umgebenden Proteinen durch tumorspezifische
Proteasen erzeugt wurden. Ferner betrifft die Erfindung Proteine
und Peptide zur Erzeugung von Neoepitopen durch tumorspezifische
Proteasen.
-
Krebserkrankungen,
die ein metastatisches Stadium erreichen, haben in der Regel eine
schlechte Prognose und sind oft lebensbedrohlich. Der pathologische
Stoffwechselweg, der zur Metastasenbildung führt, ist durch
zwei kritische Schritte gekennzeichnet: Durchbrechen der Basalmembran,
wodurch die metastasierenden Zellen aus einem Primärtumor
in weitere Gewebe wandern können sowie das Einsetzen der
Tumorangiogenese (vgl. beispielsweise Hanahan, D. and Weinberg,
R. A.: The hallmarks of cancer. Cell 100, 57–70 (2000)).
Beide Schritten beruhen auf einer Dysregulation der komplexen Wechselwirkung
zwischen den zellulären Komponenten eines Gewebes und der
umgebenden Matrix. Es ist nun anerkannt, dass Proteasen, wie zum
Beispiel die Matrixmetalloproteasen (MMPs), die insbesondere von
metastasierenden Tumorzellen sezerniert werden, die Proteolyse von
polymeren und nichtfibrillären Matrixkomponenten bewirken,
was für den Prozess der Metastasierung wesentlich ist (vgl. zum
Beispiel McCawly, L. J., Matrisian, L. M.: Matrix metalloproteases:
They're not just for matrix anymore. Curr. Opin. Cell Biol 13, 534–540
(2001)).
-
Die
pathologische Funktion und die spezifische Expression mehrerer tumorabgeleiteter
Proteasen ist gut beschrieben. Diese sind daher ein attraktives
potentielles Ziel („drug target”) für
neue Chemotherapeutika. Ferner sind die Tumorproteasen attraktive
Targets für die in-vivo-Detektion und die molekulare Abbildung
(„molekulare imaging”) von primären und
metastasierenden Tumoren (vgl. beispielsweise McEntyre, J.
O. und Matrisian L. M.: Molecular imaging of proteolytic activity
in cancer. Journal of Cellular Biochemistry 90, S. 1087–1097
(2003)).
-
Um
die Aktivität von Tumorproteasen in vivo durch bildgebende
Techniken nachzuweisen, wurden neuartige Kontrastmittel, sogenannte
Smart Contrast Agents, bei denen es sich um Konjugate aus einem Peptid
und einem Fluorophor handelt, entwickelt (vgl. zum Beispiel Kurrar,
S. und Richards-Kortum, R.: Optical molecular imaging agents for
cancer diagnostics and therapeutics. Nanomedicine 1, 23–30
(2006)). Diese Mittel sind Substrate für Tumorproteasen
und gehen durch proteolytische Spaltung von dem inaktiven Zustand
(„quenched state”) in den fluoreszierenden Zustand über
(vgl. zum Beispiel Weisleder, R. und Ntziachristos, V.:
Shedding light onto live molecular targets. Nature Med. 9, 123–128
(2003)). Die Vorteile dieser Verfahren sind die gute Zugänglichkeit des
jeweiligen Substrats für die Proteasen, die Tumorspezifität
der Expression der Proteasen und die Tatsache, dass das Signal über
die Zeit durch Spaltung mehrerer Substratmoleküle durch
ein einzelnes Proteasemolekül verstärkt werden
kann. Ein Hauptproblem dieser Methoden liegt jedoch darin, dass
sie auf einer Fluoreszenzdetektion beruhen, und daher mit bildgebenden
Techniken wie zum Beispiel MRI, PET und SPECT, die sehr empfindlich
sind und in der klinischen Praxis häufig verwendet werden,
nicht kompatibel sind. Ferner fanden diese Verfahren wohl aufgrund
der vorstehend beschriebenen Probleme keinen nennenswerten Eingang
in die klinische Praxis. Andere Verfahren beruhen auf der Verwendung von
radioaktiv markierten Inhibitoren von tumorspezifischen Metalloproteasen.
Obwohl die Bindung dieser Inhibitoren mit in der Klinik verwendeten
bildgebenden Verfahren wie PET verfolgt werden kann sind die gemessenen
Signale gering, da ein einzelnes Enzymmolekül nur ein einzelnes
Inhibitormolekül binden kann (vgl. z. B. W P LI
und C J Anderson: Imaging Matrix Metalloproteinase expression in
tumors. Q J Nucl Med 47, 201–208 (2003)).
-
Weiterhin
ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern (mAks)
als Grundlage für hochspezifische Reagenzien in der Darstellung
eines Tumors allgemein akzeptiert (vgl. beispielsweise Stipsanelli, E.
und Valsamaki, P.: Old and new trends in breast cancer imaging and
therapeutic approach. Hell. J. Nucl. med. 8, 103–108 (2005)).
Bei diesen Verfahren werden mAks, die für von einem Tumor
abgeleitete Target-Moleküle spezifisch sind, üblicherweise
mit Radionukliden konjugiert. Nach Verabreichung an den Patienten
reichert sich das Radionuklid-mAk-Konjugat in potentiellen Tumorgeweben
an und kann so beispielsweise durch PET oder SPECT sichtbar gemacht
werden. Ein Hauptproblem bei diesem Verfahren liegt in der niedrigen
Konzentration der meisten Tumorantigene, was einen Nachweis oft sehr
schwierig macht. Ferner sind die meisten tumorspezifischen Antigene
intrazelluläre Proteine, die durch das Radionuklid-mAk-Konjugat
nur schwer zugänglich sind. Eine Ausnahme hierzu ist der
humane Antikörper COU-1, der an prozessiertes intrazelluläres
Cytokeratin 8/18 bindet (vgl. beispielsweise Ditzel H. J.
et al.: Cancer-associated cleavage of cytokeratin 8/18 heterotypic
complexes exposes a neoepitope in human adenocarcinomase. J. Biol.
Chem. 277, 21712–21722 (2002)). Dieser Antikörper
wurde erfolgreich für die Immunszintigraphie verschiedener Adenokarzinome,
wie Kolonkrebs, verwendet. Die Protease, die für das Prozessieren
der intrazellulären Cytokeratine verantwortlich ist, ist
unbekannt, aber es wird vermutet, dass diese nur in apoptotischen Krebszellen
aktiv ist. Die Expression von Cytokeratin 8/18 ist jedoch auf Epithelzellen
beschränkt und COU-1 kann daher nur zum Nachweis eines
Adenokarzinoms verwendet werden. Neben monoklonalen Antikörpern,
die heute hauptsächlich als humanisierte Variante verwendet
werden, eignen sich für dieses Verfahren auch andere spezifisch
an Tumorantigene bindende Moleküle wie z. B. Bindungsproteine
oder Aptamere.
-
Es
besteht daher ein Bedarf nach einem zuverlässigen und empfindlichen
Verfahren für die Darstellung eines metastasierenden Tumorgewebes. Insbesondere
soll das Verfahren leicht durchführbar sein und sich für
Routineverfahren in der allgemeinen medizinischen Praxis eignen.
Ferner soll sich das Verfahren zur Darstellung möglichst
vieler Tumorarten eignen. Des Weiteren soll das Verfahren eine Aussage über
das metastatische Potential bzw. der Ausdehnung der Metastasierung
eines Tumors erlauben. Außerdem soll das Verfahren eine
zuverlässige Diagnose bezüglich Art, Stadium und
metastatischem Potential und Ausdehnung einer Krebserkrankung mit
einer Untersuchung erlauben.
-
Überraschenderweise
wurde gefunden, dass eine Kombination aus einer Tumordiagnostik,
bei der ein oder mehrere Neoepitop(e), das bzw. die durch proteolytische
Spaltung von das Tumorgewebe umgebenden Proteinen durch tumorspezifische
Proteasen erzeugt wurde(n), durch spezifisch an die Neoepitope bindende
Moleküle erkannt und gebunden wird bzw. werden, und einem
bildgebenden Verfahren eine hochspezifische, empfindliche und aussagekräftige
Darstellung eines Tumorgewebes, insbesondere eines metastasierenden
Tumorgewebes, ermöglicht.
-
Die
Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Abbildung eines Tumorgewebes,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) ein Tumorgewebe mit einem
monoklonalen Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment
davon, einem rekombinanten Bindungsprotein, einem Aptamer oder einem
anderen Molekül in Kontakt bringt, der bzw. das mindestens ein
Neoepitop erkennt bzw. daran bindet, das durch proteolytische Spaltung
von ein Tumorgewebe umgebenden Proteinen durch tumorspezifische
Proteasen erzeugt worden ist, und b) die gebildeten Komplexe aus
Neoepitop und monoklonalem Antikörper, Antigen-bindendem
Fragment, rekombinantem Bindungsprotein, Aptamer oder einem anderen
Molekül mit einem bildgebenden Verfahren darstellt.
-
Gegenstand
der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Abbildung eines Tumorgewebes,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein mit einem monoklonalen
Antikörper, einem Antigenbindenden Fragment davon, einem
rekombinanten Bindungsprotein, einem Aptamer oder anderem Bindungsmolekül,
der bzw. das mindestens ein Neoepitop erkennt bzw. daran bindet,
das durch proteolytische Spaltung von das Tumorgewebe umgebenden
Proteinen durch tumorspezifische Proteasen erzeugt worden ist, in Kontakt
gebrachtes Tumorgewebe einem bildgebenden Verfahren unterwirft.
Das Tumorgewebe kann dabei in vivo oder in vitro vorliegen. Der
diesem Verfahren vorausgehende Schritt des Inkontaktbringens des
Tumorgewebes mit einem monoklonalen Antikörper, einem Antigen-bindenden
Fragment davon, einem rekombinanten Bindungsprotein, einem Aptamer
oder einem anderen Molekül, welches bzw. welcher spezifisch
an das nachzuweisende Neoeptitop bindet, kann in vivo oder in vitro
nach an sich bekannten Verfahren erfolgen.
-
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Abbildung eines Tumorgewebes,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Komplex aus mindestens
einem Neoepitop, das durch proteolytische Spaltung von ein Tumorgewebe
umgebenden Proteinen durch tumorspezifische Proteasen erzeugt worden
ist, und mindestens einem monoklonalen Antikörper, einem
Antigenbindenden Fragment davon, einem rekombinanten Bindungsprotein,
einem Aptamer oder anderem Bindungsmolekül, der bzw. das
für das Neoepitop spezifisch ist, mit einem bildgebenden Verfahren
darstellt. Der Komplex aus mindestens einem Neoepitop und einem
monoklonalen Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment
davon, einem rekombinanten Bindungsprotein, einem Aptamer oder anderem
Bindungsmolekül, der bzw. das für das Neoepitop,
das durch proteolytische Spaltung von ein Tumorgewebe umgebenden
Proteinen durch tumorspezifische Protease erzeugt worden ist, spezifisch
ist, kann in in-vivo oder in-vitro in einem Gewebe bzw. einer Gewebeprobe
vorliegen und wird vor der Durchführung des Verfahrens
nach an sich bekannten Verfahren hergestellt.
-
Gegenstand
der Erfindung ist ferner die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers,
eines Antigen-bindenden Fragments davon, eines rekombinanten Bindungsproteins,
eines Aptamers oder anderes Bindungsmoleküls, der bzw.
das mindestens ein Neoepitop erkennt bzw. daran bindet, das durch proteolytische
Spaltung von ein Tumorgewebe umgebenden Proteinen durch tumorspezifische
Proteasen erzeugt worden ist, zusammen mit einem bildgebenden Verfahren
zur Abbildung eines Tumorgewebes. Weiterhin betrifft die Erfindung
die Verwendung der durch proteolytische Spaltung von ein Tumorgewebe
umgebenden Proteinen durch tumorspezifische Proteasen erzeugten
Neoepitope der nachstehenden Formeln zusammen mit einem monoklonalen Antikörper,
einem Antigen-bindenden Fragment davon, einem rekombinanten Bindungsprotein,
einem Aptamer oder anderem Bindungsmolekül, der bzw. das
mindestens eines der nachstehenden Neoepitope erkennt bzw. daran
bindet, zusammen mit einem bildgebenden Verfahren zur Abbildung
eines metastasierenden Tumorgewebes.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der nachstehend genannten
Proteine oder Peptide zur Erzeugung von Neoepitopen durch tumorspezifische
Proteasen zusammen mit einem monoklonalen Antikörper, einem
Antigen-bindenden Fragment davon, einem rekombinanten Bindungsprotein, einem
Aptamer oder anderem Bindungsmolekül, der bzw. das mindestens
ein aus den vorstehenden Proteinen oder Peptiden durch proteolytische
Spaltung von tumorspezifischen Proteasen erzeugtes Neoepitop erkennt,
zusammen mit einem bildgebenden Verfahren zur Abbildung eines metastasierenden
Tumorgewebes.
-
Die
Erfindung betrifft ferner durch proteolytische Spaltung von ein
Tumorgewebe umgebenden Proteinen durch tumorspezifische Proteasen
erzeugte Neoepitope wie beispielsweise die durch Spaltung von MMP-7
erzeugten Epitope mit der C-terminalen Sequenz Lys-Pro-Leu-Glu,
oder die durch Spaltung von MMP-7 erzeugten Epitope mit der C-terminalen Sequenz
Lys-Leu-Pro-Ala.
-
Weiterhin
betrifft die Erfindung ein extrazelluläres Protein oder
Peptid zur Erzeugung von Neoepitopen durch tumorspezifische Proteasen
wie beispielsweise Neoepitope der folgenden Proteine oder daraus
abgeleiteten Peptidsequenzen: Collagen I–IV, Collagen VI–X,
Fibronectin, Laminin, Elastin, Proteoglycan Core Protein, Pro-MMP2,
Pro-MMP9, Aggrecan, Gelatine und ähnlicher Substratmoleküle,
sowie synthetische Substratmoleküle optimiert hinsichtlich der
Erkennung der aus ihrer Spaltung resultierenden Neoepitope durch
kognate Binder, Halbwertzeit im Körper, Bioverfügbarket,
und Pharmakokinetik und -dynamik.
-
Weiterhin
betrifft die Erfindung den Nachweis tumorspezifischer Proteasen
wie beispielsweise MMP-1, -2, -3, -7, -10, -11, -12, -14, -15, -16,
-17, uPA, tPA und weiterer Proteasen.
-
Das
vorstehend beschriebene Verfahren zur Abbildung eines Tumorgewebes
erlaubt auch den Nachweis der an der proteolytischen Spaltung von ein
Tumorgewebe umgebenden Proteinen beteiligten Proteasen. Dabei erlaubt
die Bildung eines Komplexes aus Neoepitop und monoklonalem Antikörper, Antigenbindendem
Fragment davon, rekombinantem Bindungsprotein, Aptamer oder einem
anderen Molekül, der bzw. das spezifisch an ein bestimmtes
Neoepitop bindet, eine Aussage über das Vorliegen einer spezifischen
Protease; daraus ergibt sich ein Hinweis auf die Natur des Tumors.
-
Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Tatsache, dass von einem Tumor
abgeleitete sezernierte Proteasen spezifisch endogene Matrix-Substrate oder
exogen, zum Beispiel intravenös, oral oder inhalativ, verabreichte
Peptid- oder Proteinsubstrate spalten. Die so gespaltenen Peptide
oder Proteine besitzen dann eine neues N-terminales Ende und ein
neues C-terminales Ende, die die sogenannten Neoepitope darstellen.
Derartige Neoepitope kommen in gesundem Gewebe nicht oder in einer
geringeren Konzentration als im Tumorgewebe vor und sind daher charakteristisch
für Gewebe, das einen Tumor und insbesondere einen metastasierenden
Tumor umgibt. Der Begriff „Tumor” umfasst hier
sowohl gutartige als auch bösartige Tumore. Insbesondere
umfasst der Begriff „Tumor” Krebserkrankungen
und insbesondere metastasierende Krebserkrankungen bzw. Karzinome.
-
Der
Begriff „Tumorgewebe” bezeichnet sowohl Gewebe,
von dem bekannt ist, dass es einen Tumor enthält, als auch
Gewebe, von dem vermutet wird, dass es einen Tumor enthält.
Das Tumorgewebe liegt vorzugsweise in einem menschlichen Organismus
vor, kann aber auch in einem tierischen oder pflanzlichen Organismus
vorhanden sein.
-
Die
wie vorstehend beschrieben gebildeten Neoepitope können
von einem zuvor verabreichten bzw. hinzugefügten spezifischen
monoklonalen Antikörper, Antigen-bindenden Fragment davon,
einem spezifischen rekombinanten Bindungsprotein, einem Aptamer
oder anderem Bindungsmolekül erkannt werden. Diese Moleküle
reichern sich dann in der Umgebung eines entsprechenden Tumors and
und bilden mit den vorhandenen Neoepitopen Komplexe. Derartige Moleküle
werden dem zu untersuchenden Patienten vor Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens in Abhängigkeit
von der Natur des vermuteten Tumors und der Art des ein Neoepitop
bindenden Moleküls verabreicht. Diese Verabreichung erfolgt
in an sich bekannter Weise, beispielsweise auf intravenösem,
oralem oder inhalativem Weg. Bevorzugt ist eine intravenöse
oder orale Verabreichung.
-
Monoklonale
Antikörper, die spezifisch an von Proteasen erzeugte Neoepitope
binden, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (beispielsweise in Hughes
C. E. et al.: Monoclonal antibodies recognizing protease-generated
neoepitopes from cartilage proteoglycan degradation. Application
to studies of human link Protein cleavage by stromelysin, J. Biol. Chem.,
267, 23, 16011–16014 (1992)) und werden derzeit
in handesüblichen kommerziellen diagnostischen Tests verwendet
(zum Beispiel der Enygnost Fl + 2mono Test der Firma Siemens). Ebenso
sind Antigen-bindende Fragmente für ein definiertes Epitop oder
ein definiertes Epitop erkennende rekombinante Bindungsproteine,
Aptamere oder sonstige spezifische Bindungsmoleküle dem
Fachgebiet gut bekannt und können nach an sich bekannten
Verfahren hergestellt werden.
-
Der
monoklonale Antikörper, das Antigen-bindende Fragment davon,
ein rekombinantes Bindungsprotein, Aptamere oder sonstige spezifische
Bindungsmoleküle erkennen mindestens ein Neoepitop, das
durch proteolytische Spaltung von das Tumorgewebe umgebenden Proteinen
durch tumorspezifische Proteasen erzeugt wurde. Monospezifische
Antikörper binden spezifisch an das Epitop, gegen das sie
gerichtet sind. Da eine Tumorprotease durch wiederholte Spaltung
mehrfache Neoepitope bildet, und somit multiple Neoepitop-Antikörper-Komplexe
gebildet werden, ergibt sich hierdurch ein Signalamplifikationsschritt.
Anstelle eines monoklonalen Antikörpers kann auch ein geeignetes,
das Antigen auf dem Neoepitop bindendes Fragment des Antikörpers
oder ein spezifisches rekombinantes Bindungsprotein für
das Neoepitop oder ein Aptamer oder ein anderes Molekül,
welches spezifisch an das nachzuweisende Neoepitop bindet, für
das Neoepitop verwendet werden.
-
Zum
Nachweis mit einem bildgebenden Verfahren sind die vorstehend genannten
Moleküle in geeigneter Weise an einen detektierbaren Marker
gekoppelt. Beispiele für einen detektierbaren Marker sind
ein Fluorophor (FITC, GFP), ein radioaktives Isotop (F18, I-124,
C-11), ein Lanthaniden-Chelat (zum Beispiel Gadolinium GTPA), oder
ein Eisenoxid Nanopartikel (USPIO, MION, SPIO).
-
Die
vorstehend genannten an ein Neoepitop bindenden Moleküle
können auch zwei oder mehrere Neoepitope erkennen, d. h.,
es kann sich auch um bispezifische und bivalente Moleküle
handeln. Beispiele hierfür sind bivalente mono- und bispezifische Diabodies
oder Fragmente davon, aber auch Triabodies oder Tetrabodies. Diabodies
umfassen variable Domänen einer schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers
in Bindung an die variable Domäne einer leichten Kette
eines Antikörpers auf der gleichen Polypeptidkette und
sind dabei durch einen Peptid-Linker verknüpft, der zu
kurz ist, um die Paarung zwischen den beiden Domänen auf
der gleichen Kette zu erlauben. Dadurch ergibt sich eine Paarung
mit den komplementären Domänen einer anderen Kette, was
so die Bildung von dimeren Molekülen mit zwei funktionellen
Antigen-Bindungsstellen erzeugt. Die Diabodies können auch
einkettig sein. Durch die Verwendung bispezifischer und bivalenter
Antikörper ergeben sich Verbände aus Aggregaten
zwischen diesen Molekülen und den Neoepitopen. Diese Aggregate
können als solche ohne spezifische Markierung mit einem
bildgebenden Verfahren nachgewiesen werden. Es ist aber auch möglich,
diese Moleküle mit einem detektierbaren Marker zu koppeln.
-
Anstelle
vollständiger Antikörpermoleküle können
auch Antigen-bindende Fragmente, wie zum Beispiel Fab, F(ab')2 oder Fv verwendet
werden.
-
Das
rekombinante Bindungsprotein kann jedes beliebige Bindungsprotein
sein, das ein Neoepitop erkennt. Bevorzugt handelt es sich bei dem
rekombinanten Bindungsprotein um ein sFv-Molekül, einen
humanisierten Antikörper oder ein rekombinantes Protein,
das spezifisch an das Neoepitop bindet. Weiterhin können
Aptamere oder andere Moleküle, die spezifisch an das Neoepitop
binden, verwendet werden. Derartige Moleküle sind einem
Fachmann bekannt und können in an sich bekannter Weise
und in Kenntnis des jeweiligen Epitops hergestellt werden. Es kann
auch eine geeignete Kombination dieser Moleküle eingesetzt
werden.
-
Neoepitope,
an die die erfindungsgemäß verwendeten Moleküle
binden, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Sie sind in ihrer Sequenz
jedoch nur schlecht charakterisiert und werden meist durch daran
bindende Antikörper definiert (z. B.
C E Hughes
et al. Monoclonal antibodies that specifically recognize neoepitope
sequences generated by 'aggrecanase' and matrix metalloproteinase
cleavage of aggrecan: application to catabolism in situ and in vitro.
Biochem J. 1995; 305: 799–804).
-
Des
Weiteren werden erfindungsgemäß folgende Neoepitope
vorteilhafterweise erkannt: Neoepitope hervorgehend aus Collagen
I–IV, Collagen VI–X, Fibronectin, Laminin, Elastin,
Proteoglycan Core Protein, Pro-MMP2, Pro-MMP9, Aggrecan, Gelatine
und weiterer Substratmoleküle.
-
Die
erfindungsgemäß targetierten bzw. gebundenen Neoepitope
werden aus spezifischen, von einem Tumorgewebe sezernierten Proteasen
durch Spaltung endogener Matrixkomponenten gebildet. Beispiele für
entsprechende Proteasen sind MMP-1, -2, -3, -7, -10, -11, -12, -14,
-15, -16, -17, uPA, tPA und weitere Proteasen, die auf dem Fachgebiet
bekannt sind.
-
Ferner
können die Neoepitope auch aus gezielt einem zu untersuchenden
Patienten bzw. Gewebe verabreichten Proteinen bzw. Peptiden oder
anderen Substraten der nachzuweisenden Enzyme gebildet werden. Diese
Proteine oder Peptide können optimiert sein hinsichtlich
der Spaltbarkeit durch die nachzuweisende Tumorprotease oder der
Erkennung der aus ihrer Spaltung resultierenden Neoepitope durch
kognate Binder, aber auch hinsichtlich anderer Kriterien wie z.
B. Halbwertzeit im Körper, Bioverfügbarket, Pharmakokinetik
und -dynamik oder anderen. Die Vorteile der Verwendung solcher exogen
zugefügter Substrate zum Nachweis von Tumorproteasen gegenüber
endogenen Substraten besteht in der verbesserten Nachweisbarkeit
der Spaltung durch Auswahl oder Optimierung der Substratsubstanz
nach oben genannten Kriterien.
-
Die
sich im Tumorgewebe aufgrund der Bindung an die durch tumorspezifische
Proteasen erzeugten Neoepitope angereicherten Antikörper,
Antigen-bindenden Fragmente, rekombinanten Bindungsproteine, Aptamere
oder anderer spezifischer Bindungsmoleküle bzw. die hieraus
resultierenden Komplexe lassen sich durch ein bildgebendes Verfahren
darstellen. Beispiele hierfür sind MRI-, PET-, SPECT-,
CT-PET-, MR-, MR-PET-, US oder IR-Verfahren. Derartige Verfahren
sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Entsprechende Vorrichtungen
sind im Handel erhältlich.
-
Der
Fachmann ist auch in der Lage, das jeweilige Verfahren in Kombination
mit einem in geeigneter Weise markierten Antikörper, Antigen-bindenden
Fragment, rekombinanten Bindungsprotein, Aptamer oder einem anderen
Molekül, welches spezifisch an das nachzuweisende Neoepitop
bindet, auszuwählen.
-
So
können beispielsweise Radionuklidkonjugate von ein Neoepitop
erkennenden monoklonalen Antikörpern mittels PET oder SPECT
detektiert werden, wohingegen nichtkonjugierte bispezifische und bivalente
monoklonale Antikörper, die benachbarte Neoepitope untereinander
verbinden, größere Aggregate bilden und direkt
nachgewiesen werden können. Dabei verändert sich
der T2-Wert des Aggregats, verglichen mit dem T2-Wert der separaten
Epitope, und kann somit leicht mittels MRI gemessen werden.
-
Durch
eine Kombination aus derartigen bildgebenden Techniken mit diagnostischen
Molekülen, die spezifisch durch Tumorproteasen gebildete
Neoepitope binden, können Tumorzellen sehr effizient nachgewiesen
werden. Anhand der Größe des Signals lässt
sich auch eine Aussage über die Aggressivität,
d. h. das metastatische Potential bzw. das Fortschreiten der Metastasierung,
ableiten.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders
zur Abbildung solider Tumorarten wie z. B. Sarkomen, Karzinomen,
Blastomen, malignem Melanom und anderen.
-
Die
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen
Abbildungen von Tumorgewebe können zur Diagnose und Therapie
des jeweiligen Tumors verwendet werden. Die so gewonnene Bildinformation
kann auch Anwendung in Zusammenhang mit chirurgischen Verfahren
und/oder der gezielten Therapie eines Krebsleidens finden, zum Beispiel
als Real-Time-Imaging-Verfahren während eines chirurgischen
Eingriffs. Ferner kann diese Information auch zur Überwachung
des Fortschreitens der Erkrankung oder des Erfolgs einer durchgeführten
Therapie verwendet werden. Die Bildinformation kann dabei sowohl
von einem geschulten Arzt als auch von einem Computer ausgewertet
werden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren besitzt die Vorteile
der aus dem Stand der Technik bekannten Smart Contrast Agents bezüglich
der für die konkrete Anwendung optimierten Eigenschaften
hinsichtlich Spaltbarkeit durch die nachzuweisende Tumorprotease,
Halbwertzeit im Körper, Bioverfügbarket, Pharmakokinetik
und -dynamik, aber auch des Zugangs der Proteasen zum Substrat und
der Signalverstärkung durch Spaltung mehrerer Substratmoleküle durch
ein einzelnes Proteasemolekül, ist aber im Gegensatz zu
derartigen Verfahren mit in der klinischen Praxis vielfach verwendeten
bildgebenden Techniken, wie PET, SPECT und MRI, kompatibel. Zusätzlich
zur Signalamplifikation durch die Proteaseaktivität wird
das Hauptproblem traditioneller bildgebender Verfahren, bei denen
monoklonale Antikörper verwendet werden, überwunden,
nämlich die niedrige Antigenkonzentration. Da die durch
Tumorproteasen erzeugten Neoepitope im extrazellulären
Raum vorhanden sind, sind diese für die verwendeten Antikörper
bzw. Antigen-bindenden Fragmente bzw. rekombinanten Bindungsproteine
leicht zugänglich, was im Gegensatz zu Diagnostiken, die
auf anderen Tumorantigenen, die sich auf oder in der Zelle befinden, beruhen,
ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist.
-
Da
erfindungsgemäß auch extrazelluläre Substrate
verabreicht werden können, kann die Wirkung des kompletten
Spektrums von sezernierten Tumorproteasen nachgewiesen werden, selbst
von solchen, für die im umgebenden Gewebe kein geeignetes
Substrat vorhanden ist. Dadurch kann ein breiteres Neoepitop-Target-Spektrum
berücksichtigt werden – was die Identifizierung
stärkerer Neoepitope ermöglicht, sodass die Einschränkung
auf aus endogen vorhandenen Substraten erzeugte Neoepitope wegfällt.
Somit ist das diagnostische Potential des erfindungsgemäßen
Verfahrens nicht auf Tumorarten, deren Neoepitope bereits bekannt
sind (wie beispielsweise das vorstehend genannte COU-1-Epitop in
Zusammenhang mit einem Nachweis von Adenokarzinomen), beschränkt.
Somit ist erfindungsgemäß jedes beliebige solide
Tumorgewebe abbildbar und dessen metastatisches Potential bzw. Ausdehnung kann
bewertet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt somit eine zuverlässige Diagnose bzw. Prognose
eines metastasierenden Tumors bzw. Krebsgewebes.
-
Die
Erfindung wird anhand des Beispiels eines Mammakarzinoms näher
erläutert. Starke Expression der Metalloprotease MMP-2
von Mammakarzinomen ist verbunden mit einer schlechten Prognose
(z. B. Talvensaari-Mattila A., Matrix metalloproteinase-2
(MMP-2) is associated with survival in breast carcinoma. Br J Cancer
89, 1270–1275, 2003). Für die Therapie
nach Erstdiagnose ist es wichtig zu wissen, ob und in welchem Umfang
ein Mammakarzinom MMP-2 exprimiert, um die Therapie entsprechend
anzupassen, also beispielsweise von Anfang an eine höherdosierte
Chemotherapie oder kombinierte Chemotherapie einzuleiten. Weiterhin
ist es wichtig zu überprüfen, ob bereits MMP-2-sezernierende
Metastasen vorhanden sind, und diese exakt zu lokalisieren. Dazu
wird einer Patientin beispielsweise ein mit einem Radionuklid konjugierter
humanisierter monoklonaler Antikörper intravenös
verabreicht, der spezifisch an Neoepitope von durch MMP-2 gespaltene
Matrixproteine bindet. Alternativ kann der Patientin auch einige
Zeit vor Gabe des Antikörpers ein synthetisches Peptid,
welches spezifisch von MMP-2 gespalten wird, injiziert werden. In beiden
Fällen werden die extrinsisch zugeführten Substrate
oder die intrinsisch vorhandenen Matrixproteine von durch Tumorzellen
sekretierten MMP-2 gespalten, wodurch gegenüber den ungespaltenen Molekülen
Neoepitope gebildet werden. In einem weiteren Schritt wird nun der
Patientin ein mit einem radioaktiven Nuklid konjugiertes Bindungsmolekül appliziert,
das spezifisch an die gebildeten Neoepitope bindet. Dieses kann
anschließend durch PET oder ein anderes bildgebendes Verfahren
nachgewiesen werden. Dadurch kann die Verteilung der an die Neoepitope
gebundenen markierten Bindungsmoleküle im Körper,
und damit indirekt der MMP-2 sezernierenden Tumorzellen, visuell
dargestellt werden. Dadurch kann zum einen nachgewiesen werden,
ob der Primärtumor MMP-2 produziert (dies ist mittels eines Labortests
nicht möglich), zum anderen können eventuell vorhandene
Metastasen lokalisiert werden. Dabei sind auch Konstellationen möglich,
bei denen der Primärtumor kein oder nur wenig MMP-2 sezerniert,
von dem Tumor ausgehende Metastasen jedoch MMP-2 produzieren.
-
Neben
der eingangs erwähnten Erstdiagnose mit (chemo- oder immuno)terapeutischer
Relevanz und diagnostischer Einteilung der Erkrankung dient dieses
Verfahren auch der Lokalisation von Primärtumoren und Metastasen
für chirurgische und/oder nuklearmedizinische Verfahren
bei den Patientinnen. Weiterhin erlaubt die zeitlich wiederholte Anwendung
des Verfahrens eine Aussage über die Änderung
der Ausdehnung des Primärtumors oder von Metastasen während
der chirurgischen, chemo- oder immunotherapeutischen bzw. nuklearmedizinischen
Therapie, und erlaubt daher eine Beurteilung des Erfolges der Therapie,
mit entsprechenden Konsequenzen.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Hanahan, D.
and Weinberg, R. A.: The hallmarks of cancer. Cell 100, 57–70
(2000) [0002]
- - McCawly, L. J., Matrisian, L. M.: Matrix metalloproteases:
They're not just for matrix anymore. Curr. Opin. Cell Biol 13, 534–540
(2001) [0002]
- - McEntyre, J. O. und Matrisian L. M.: Molecular imaging of
proteolytic activity in cancer. Journal of Cellular Biochemistry
90, S. 1087–1097 (2003) [0003]
- - Kurrar, S. und Richards-Kortum, R.: Optical molecular imaging
agents for cancer diagnostics and therapeutics. Nanomedicine 1,
23–30 (2006) [0004]
- - Weisleder, R. und Ntziachristos, V.: Shedding light onto live
molecular targets. Nature Med. 9, 123–128 (2003) [0004]
- - W P LI und C J Anderson: Imaging Matrix Metalloproteinase
expression in tumors. Q J Nucl Med 47, 201–208 (2003) [0004]
- - Stipsanelli, E. und Valsamaki, P.: Old and new trends in breast
cancer imaging and therapeutic approach. Hell. J. Nucl. med. 8,
103–108 (2005) [0005]
- - Ditzel H. J. et al.: Cancer-associated cleavage of cytokeratin
8/18 heterotypic complexes exposes a neoepitope in human adenocarcinomase.
J. Biol. Chem. 277, 21712–21722 (2002) [0005]
- - Hughes C. E. et al.: Monoclonal antibodies recognizing protease-generated
neoepitopes from cartilage proteoglycan degradation. Application
to studies of human link Protein cleavage by stromelysin, J. Biol.
Chem., 267, 23, 16011–16014 (1992) [0020]
- - C E Hughes et al. Monoclonal antibodies that specifically
recognize neoepitope sequences generated by 'aggrecanase' and matrix
metalloproteinase cleavage of aggrecan: application to catabolism
in situ and in vitro. Biochem J. 1995; 305: 799–804 [0026]
- - Talvensaari-Mattila A., Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2)
is associated with survival in breast carcinoma. Br J Cancer 89,
1270–1275, 2003 [0038]