DE102009027754A1 - Verfahren zur Hemmung der Reifung von dendritischen Zellen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren (PI) zur Hemmung der Reifung von Dendritischen Zellen (DZ) und damit zur Behandlung oder Prävention von Allergien, Asthma, Gewebe- oder Transplantatabstoßungen oder Autoimmunerkrankungen. Die Konzentration der Proteasom-Inhibitoren liegt vorzugsweise im Bereich von 10 nM bis 10 μM, bezogen auf das periphere Blut oder das Zytoplasma.

Description

  • Die Erfindung betrifft die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren (PI) zur Hemmung der Reifung von Dendritischen Zellen (DZ) und damit zur Behandlung oder Prävention von Allergien, Asthma, Gewebe- oder Transplantatabstoßungen oder Autoimmunerkrankungen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das menschliche und tierische Immunsystem ist in der Lage, auf eine Vielzahl von fremden Antigenen zu reagieren. Lymphozyten spielen hierbei eine zentrale Rolle, denn sie können Antigene erkennen und das adaptive Immunsystem effektiv stimulieren. Lymphozyten können in zwei generelle Klassen unterteilt werden: B-Lymphozyten, die Antikörper produzieren und die T-Lymphozyten, die weiterhin in CD4+ Helfer-T-Zellen und CD8+ zytotoxische-Zellen unterteilt werden. Weiterhin zählen dazu die sogenannten regulatorischen T-Zellen, welche die beiden anderen T-Zelltypen in ihrer Funktion hemmen/regulieren können. Alle sind in der Lage Antigene, die zusammen mit MHC-Molekülen auf den sogenannten Antigen-Präsentierenden-Zellen (APZ) präsentiert werden, via T-Zellrezeptor (TZR) zu erkennen.
  • Die APZ können in „einfache APZ” unterteilt werden, die nur Antigene präsentieren und in „professionelle APZ”, die zusätzlich zur Antigenpräsentation auch noch stimulatorische Funktionen, auf Grund der Expression spezifischer Moleküle, besitzen. Die besten, zurzeit bekannten APZ sind die „Dendritischen Zellen” (DZ). Sie sind als einzige APZ in der Lage, naive T-Zellen zu stimulieren und werden daher auch als „Natürliches Adjuvant” bezeichnet.
  • Unreife DZ sind darauf spezialisiert, Antigene aufzunehmen, diese zu prozessieren und in die MHC-Komplexe einzubauen. Wesentlich ist hierbei, dass unreife DZ in der Aufrechterhaltung bzw. der Induktion von Toleranzmechanismen involviert sind.
  • Stimuli, wie z. B. TLR-Liganden, TNF, Zytokine, CD40L etc., sind in der Lage, DZ zur Reifung anzuregen, wobei es zu einer massiven Neusynthese von MHC-Molekülen und zur Migration der DZ aus der Peripherie in die drainierenden Lymphknoten kommt. Darüber hinaus wird während der DZ-Reifung und der DZ-Wanderung in den Lymphknoten auch die Expression von ko-stimulatorischen Molekülen, wie z. B. CD80, CD86 oder CD40 sowie von Adhäsionsmolekülen, wie z. B. LFA3, hochreguliert. Nachdem die reifen DZ in die T-Zellreichen Areale der Lymphknoten eingewandert sind, präsentieren sie die MHC-Peptid-Komplexe den spezifischen T-Zellen und regen diese zur Stimulation an. Auf reifen DZ präsentierte MHC-I-Komplexe stimulieren zytotoxische T-Zellen sowie Th17-Zellen während T-Helferzellen via MCH-II-Komplexe stimuliert werden. In Anwesenheit von reifen DZ und u. a. IL-12 differenzieren T-Helferzellen zu Th1 spezifischen T-Helferzellen, welche u. a. IFN-Gamma produzieren. Diese unterstützen anschließend die Differenzierung von zytotoxischen T-Zellen. IL-4 führt hingegen zur Differenzierung von Th2 Zellen, die Eosinophile und B-Zellen aktivieren.
  • Der Phänotyp von reifen DZ kann mittels FACS-Analysen überprüft werden. Hierbei werden typische Moleküle (z. B. CD25, CD80, CD83, CD86, MHC-I, MHC-II, CCR7), welche während der DZ-Reifung hochreguliert werden, nachgewiesen.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Möglichkeiten zur Behandlung/Prävention von Allergien, Asthma, Gewebe- oder Transplantatabstoßungen oder Autoimmunerkrankungen bereitzustellen.
  • Lösung der Aufgabe
  • Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
  • Interessanterweise, wurde im Rahmen der Erfindung festgestellt, dass Proteasom-Inhibitoren die Reifung der DZ blockieren. Dieses konnte insbesondere dadurch gezeigt werden, dass die Expression typischer Oberflächenmoleküle inhibiert wurde (siehe 1 und 2). Funktionell bedeutet dies, dass die DZ in einem unreifen Stadium blockiert werden und dadurch keine potenten Immunantworten weiter induzieren können. Im Gegenteil, es kommt zur Ausbildung von Toleranzmechanismen. Therapeutisch wäre dieses, insbesondere bei Autoimmunerkrankungen, Asthma, Allergien sowie bei der Vermeidung von Gewebe- oder Transplantatabstoßungen, von großem Interesse.
  • Proteasominhibitoren sind natürliche oder chemische Substanzen, welche die Aktivität des Proteasoms hemmen und dem Fachmann prinzipiell bekannt sind. Der erste zugelassene Proteasominhibitor, Bortezomib, ist wirksam gegen das Multiple Myelom, eine maligne Plasmazellerkrankung. Proteasom-Inhibitoren sind sowohl zur Behandlung von Tumorerkrankungen (z. B. US 6,083,903 ) als auch zur Behandlung von Virus-Infektionen beschrieben worden ( WO 02/30455 ).
  • Mittels des sogenannten „Mixed leukocyte reaction”(MLR)-Assays kann die T-Zellstimulatorische Kapazität der reifen DZ in vitro getestet werden. Interessanterweise sind die Proteasom-Inhibitoren (XVL01 und Velcade®) in der Lage, die DZ-vermittelte T-Zellstimulation zu blockieren (siehe 3 und 4). Dieser funktionelle Test spiegelt somit die phänotypischen Auswirkungen der PI-Behandlung – nämlich die Blockade der vollen Ausreifung der DZ – gut wieder.
  • Während der DZ-vermittelten T-Zellstimulation kommt es zur Produktion von Zytokinen (u. a. IFN, IL-2, IL-6, TNF), welche im Kulturüberstand nachgewiesen werden können. Erstaunlicherweise war Velcade® in der Lage diese Zytokinproduktion konzentrationsabhängig zu blockieren (siehe 5 und 6). Dies ist ein weiterer Hinweis/Beweis, dass PI zu einer Blockade der immunstimulatorischen Funktion von DZ führen.
  • Um den Effekt von PI auch in vivo zu testen, wurde Velcade® Mäusen in vivo appliziert, anschließend Knochenmark isoliert und daraus die typischen Knochenmark-DZ generiert. Wie in 7 gezeigt wird, vermindert die Applikation von Velcade® die Population der reifen DZ. Es kommt nämlich zu einem Shift der CD40-, CD25- und CD83-hoch exprimierenden reifen DZ-Population nach unten, d. h. zu einem semi-reifen bzw. unreifen Phänotyp. Dies gilt sowohl für TNF- als auch für LPS- stimulierte DZ.
  • Das Ziel dieser Erfindung ist daher die Inhibition der DZ-Reifung und damit der T- und B-Zellstimulation mittels PI und darüber hinaus in Folge die Induktion von Toleranzmechanismen für die Behandlung und/oder Vorbeugung von Erkrankungen (u. a. Autoimmunität, Asthma, Allergien, Gewebe- oder Transplantatabstoßung), welche durch überschießende Immunreaktionen hervorgerufen werden. PI verhindern die vollständige DZ-Reifung, welches zu einer Blockade der T-Zellproliferation und T-Zellaktivierung führt. Die Erfindung liefert also die Basis zur Behandlung von Erkrankungen, welche durch überschießende Immunreaktionen gekennzeichnet sind. Durch die Behandlung mit PI werden u. a. Toleranzmechanismen induziert.
  • Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Herstellung von Mitteln für die Behandlung oder Prävention von Allergien und/oder Asthma und/oder Gewebe- oder Transplantatabstoßungen und/oder Autoimmunerkrankungen. Die Konzentration der Proteasom-Inhibitoren liegt im nanomolaren Bereich, vorzugsweise im Bereich von 10 nM bis 10 μM, bezogen auf das periphere Blut oder das Zytoplasma.
  • Als Proteasom-Inhibitoren können Substanzen eingesetzt werden, die in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden, durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen oder total-synthetisch hergestellt werden oder durch gentherapeutische Verfahren in vivo synthetisiert oder durch gentechnische Verfahren in vitro oder in Mikroorganismen hergestellt werden. Dazu gehören:
  • a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:
    • • Epoxomicin (Epoxomycin) und Eponemycin,
    • • Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),
    • • Lactacystin und dessen chemisch modifizierte Varianten, insbesondere die Zellmembranpenetrierende Variante ”Clastolactacystein β-Lacton”,
  • b) synthetisch hergestellte Proteasom-Inhibitoren:
    • • modifizierte Peptidaldehyde wie zum Beispiel N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (auch bezeichnet als MG132 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N-carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MG115); N-Acetyl-L-Leuzinyl-L-Leuzinyl-L-Norleuzinal (bezeichnet als LLnL); N-carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (auch bezeichnet als PSI);
    • • Peptide, die C-terminal α,β-Epoxyketone (auch bezeichnet als Epoxomicin/Epoxomycin oder Epoxemycin), Vinyl-sulphone (zum Beispiel Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon oder 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon, auch bezeichnet als NLVS), Glyoxal oder Borsäure-Reste (zum Beispiel Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2), auch bezeichnet als ”PS-431” oder Benzoyl(Bz)-Phe-boroLeu, Phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu); Pinacol-Ester – zum Beispiel Benzyloxycarbonyl(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester – tragen; und
    • • als besonders geeignete Verbindungen werden Peptide und Peptid-Derivate eingesetzt, welche C-terminal Epoxyketon-Strukturen tragen, hierzu zählen beispielsweise Epoxomicin (Molekülformel: C28H86N4O7) und Eponemycin (Molekülformel: C20H36N2O5);
    • • chemisch modifizierte Derivate auf der Basis von natürlich vorkommenden, insbesondere ein β-Lacton-Derivat mit der Bezeichnung PS-519 (1R-[1S,4R,5S]]-1-(1-Hydroxy-2-methylpropyl)-4-propyl-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]heptane-3,7-dione, Molekülformel: C12H19NO4), welches sich von dem natürlichen Proteasom-Inhibitor Lactacystin ableitet;
    • • bestimmte Dipeptidyl-Borsäure-Derivate, insbesondere Verbindungen, welche sich von dem Pyranozyl-Phenyl-Leuzinyl-Borsäure-Derivat mit dem Namen ”PS-341” (N-Pyrazinecarbonyl-L-Phenylalanin-L-leuzin-Borsäure, Molekülformel: C19H25BN4O4) ableiten.
  • Hierzu zählen weiterhin die Verbindungen ”PS-273” (Morpholin-CONH-(CH-Naphtyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) und dessen Enantiomer PS-293, die Verbindung PS-296 (8-Quinolyl-sulfonyl-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH(-CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-303 (NH2(CH-Naphtyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-321 (Morpholin-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-Phenylalanin)-B(OH)2); die Verbindung PS-334 (CH3-NH-(CH-Naphthyl-CONH-(CH-Isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-325 (2-Quinol-CONH-(CH-homo-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-352 (Phenyalanin-CH2-CH2-CONH-(CH-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)1-B(OH)2); die Verbindung PS-383 (Pyridyl-CONH-(CHpF-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2. Alle diese Verbindungen wurden bereits beschrieben, unter anderem in Adams et al. (1999).
  • Als besonders geeignete Verbindungen haben sich, neben Epoxomicin und Eponemycin, die Proteasom-Inhibitoren PS-519, PS-341 und PS-273 (entwickelt von der Firma Millennium Pharmaceuticals Inc., Cambridge, MA 02139, USA) erwiesen. Diese Proteasom-Inhibitoren sind sehr potent, sehr spezifisch für das Proteasom, blockieren keine anderen zellulären Proteasen und haben daher so gut wie keine Nebenwirkungen. Die Proteasom-Inhibitoren PS-341 und PS-519 wurden außerdem sowohl in Tiermodellen für vorklinische als auch in Menschen (Krebspatienten) für klinische Studien getestet.
  • Bei den Autoimmunerkrankungen handelt es sich beispielsweise um Myasthemia gravis oder Multiple Sklerose, Vasculitis, Chronische entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa, HLA B27-assoziierte Autoimmunopathologien wie Morbus Bechterew oder Systemische Lupus Erythematosis (SLE), Hauterkrankungen wie Psoriasis oder Pemphigus beziehungsweise die Rheumatoide Arthritis oder Diabetes mellitus.
  • Eine Fehlfunktion des zellulären Immunsystems, an denen Dendritische Zellen und/oder T-Zellen und/oder Th17-Zellen und/oder B-Zellen beteiligt sind, wird durch Proteasom-Inhibitoren behandelt oder verhindert. Insbesondere wird eine Fehlfunktion des zellulären Immunsystems, an denen T-Zellen des regulatorischen Typs beteiligt sind, durch Proteasom-Inhibitoren behandelt oder verhindert.
  • Bei den T-Zellen des regulatorischen Typs handelt es sich um natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (Treg) und/oder IL-10 produzierende regulatorische T-Zellen des Typs 1.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der Proteasom-Inhibitoren in Kombination mit anderen immunsuppressiven Mitteln, wie z. B. Rapamycin, CsA, Mycophenolate Mofetil (MMF), FK506, sCD83, und ”Immun-modulatorische” Antikörper, jeweils in optimalen und/oder suboptimalen Dosen zum Einsatz. Hierdurch wird erwartet, dass toxische Nebeneffekte der einzelnen Substanzen in der Kombinationstherapie verringert/vermieden werden.
  • Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Zeichnungen näher erläutert werden, ohne sie auf diese Beispiele zu beschränken.
  • Die einzelnen Figuren zeigen:
  • 1 zeigt, dass die Inhibition des Proteasoms die Reifung von murinen Dendritischen Zellen beeinträchtigt.
  • Murine DZ wurden mit verschiedenen Konzentrationen des Proteasom-Inhibitors Velcade® ab Tag 8 bis Tag 10 inkubiert und während der letzten 16 Stunden, in der Gegenwart von LPS, gereift. Um die phänotypische DZ-Reifung, sprich die Erhöhung der Expressionslevels spezifischer Zelloberflächenmoleküle zu bestimmen, wurden die Zellen anschließend mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern und FACS-Analyse charakterisiert. Wie in 1 gezeigt, reduziert Velcade® ganz eindeutig die Oberflächenexpression von CD25, CD40, CD80, CD86 und insbesondere von CD83, welche alle typischerweise während der DZ-Reifung hochreguliert werden. Daraus folgt, dass die Inhibition des Proteasoms mit der DZ-Reifung interferiert. Jedoch nur vollständig gereifte DZ sind in der Lage potente Immunantworten zu induzieren. Die Kontrolle (mock) blieb unbehandelt.
  • 2 zeigt, dass die Inhibition des Proteasoms die Reifung von humanen Dendritischen Zellen beeinträchtigt.
  • Unreife humane DZ wurden am Tag 5 mit zwei verschiedenen Konzentrationen von Velcade® versetzt und anschließend für zwei weitere Tage mit dem Reifungscocktail gereift. Anschließend wurde die Expression der für die Reifung von humanen DZ typischen Oberflächenmoleküle analysiert. Velcade® führt zu einer klaren Reduktion der Expression von CD80, CCR7, CD25, MHC I und im Speziellen von CD83. Die Kontrolle (mock) blieb unbehandelt. Daraus folgt, dass die Inhibition des Proteasoms auch bei humanen DZ die Reifung interferiert.
  • 3 ist zu entnehmen, dass die Inhibition des Proteasoms zu einer verminderten DZ vermittelten T-Zellstimulation führt.
  • Allogene murine T-Zellen wurden mit TNF-gereiften murinen DZ für 72 Stunden, in der Gegenwart von drei unterschiedlichen Konzentrationen von Velcade®, inkubiert. Im Gegensatz zu Kontrollzellen (mock), reduziert Velcade® die DZ-vermittelte T-Zell Proliferation, in einer Dosis-abhängigen Art und Weise.
  • 4 beschreibt, dass die Inhibition des Proteasoms in humanen DZ zu einer verminderten DZ vermittelten T-Zellstimulation führt.
  • Humane DZ wurden mit Velcade® während der Reifung inkubiert und im Anschluss daran wurde die DZ-vermittelte T-Zellstimulation – mittels MLR-Assay – untersucht. Im Gegensatz zu den Kontrollzellen (mock) zeigen Velcade®-behandelte-DZ eine deutliche Reduktion ihrer stimulatorischen Kapazität.
  • Aus 5 ist ersichtlich, dass die Inhibition des Proteasoms zu einer reduzierten Zytokin- und Chemokinproduktion in murinen DZ-T-Zell-Ko-Kulturen führt.
  • Aus Zellkulturüberständen muriner (DC:T) Zell-Ko-Kulturen wurde die Produktion von INFy und MCP-1 bestimmt. Dafür wurden DZ mit allogenen T-Zellen, in der Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von Velcade®, für 72 Stunden inkubiert. Die Inhibition des Proteasoms führt zu einer deutlich verminderten Expression von INFy und MCP-1. Die Kontrolle (mock) blieb unbehandelt.
  • In 6 wird gezeigt, dass die Inhinbition des Proteasoms zu einer reduzierten Zytokinproduktion in humanen DZ-T-Zell-Ko-Kulturen führt.
  • Unreife humane DZ wurden mit Velcade® inkubiert, für 48 Stunden gereift und anschließend zusammen mit allogenen humanen T-Zellen für weitere 72 Stunden kultiviert. Anschließend wurden Zellkulturüberstände abgenommen und die Freisetzung von proinflamatorischen Zytokinen – mittels CBA Technik – analysiert. Die Inhibition des Proteasoms führt zu einer deutlich reduzierten Sekretion von IL-2, IL-6, INFy und TNF. Die Kontrolle (mock) blieb unbehandelt.
  • Die 7a und 7b zeigen, dass die Inhibition des Proteasoms in vivo die Reifung von ex vivo generierten murinen DZ beeinflusst.
  • C57B1/6 Mäusen wurde dreimal i. v. 0.75 mg/kg Velcade® injiziert. Die Injektion erfolgte innerhalb von fünf Tagen, mit jeweils einem Tag Abstand. Eine Stunde nach der letzten Injektion erfolgte, zur Generierung der murinen DZ, die Entnahme des Knochenmarks aus Femur und Tibia. Am Tag 8 der Kultivierung wurden die Zellen mit LPS gereift. Am darauf folgenden Tag wurde die Expression der Oberflächenmoleküle mittels FACS-Analyse untersucht. DZ von unbehandelten Tieren (mock) zeigten die für reife DZ typische Expression der Oberflächenmarker. Im Gegensatz dazu ergab die Analyse der Tiere, welche mit Velcade® behandelt wurden, eine Verminderung der Oberflächenexpression von CD25, CD40, CD80 und CD86 (7a). Darüber hinaus war auch die Expression von MHC Klasse II Molekülen reduziert (7b). Der Prozentsatz von MHC IIhigh exprimierenden Zellen: MHC IIinterm exprimierenden Zellen wurde zu Gunsten der MHC IIinterm exprimierenden Zellen verschoben. Diese Daten zeigen, dass die in vivo Applikation von Proteasom-Inhibitoren die DZ-Reifung beeinträchtigen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • US 6083903 [0010]
    • WO 02/30455 [0010]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Adams et al. (1999) [0017]

Claims (8)

  1. Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Herstellung von Mitteln für die Behandlung oder Prävention von a) Allergien und/oder b) Asthma und/oder c) Gewebe- oder Transplantatabstoßungen und/oder d) Autoimmunerkrankungen
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Proteasom-Inhibitoren im Bereich von 1 nM bis 100 μM liegt, bezogen auf das periphere Blut oder das Zytoplasma.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Autoimmunerkrankungen um a) Myasthemia gravis oder b) Multiple Sklerose oder c) Vasculitis oder d) Chronische entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa oder e) HLA B27-assoziierte Autoimmunopathologien wie Morbus Bechterew oder f) Systemische Lupus Erythematosis (SLE) oder g) Hauterkrankungen wie Psoriasis oder h) Pemphigus oder i) sowie die Rheumatoide Arthritis oder j) Diabetes mellitus handelt.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fehlfunktion des zellulären Immunsystems, an denen Dendritische Zellen und/oder T-Zellen und/oder Th17 Zellen und/oder B-Zellen beteiligt sind, durch Proteasom-Inhibitoren behandelt oder verhindert wird.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fehlfunktion des zellulären Immunsystems, an denen T-Zellen des regulatorischen Typs beteiligt sind, durch Proteasom-Inhibitoren behandelt oder verhindert wird.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den T-Zellen des regulatorischen Typs um natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (Treg) und/oder IL-10 produzierende regulatorische T-Zellen des Typs 1 handelt.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kombination mit anderen immunsuppressiven Mitteln.
  8. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den anderen immunsuppressiven Mitteln um Rapamycin, CsA, Mycophenolate Mofetil (MMF), FK506, sCD83, und ”Immun-modulatorische” Antikörper handelt.
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