DE102009022349B4

DE102009022349B4 - Automatisches Trennen von Gewebeschichten

Info

Publication number: DE102009022349B4
Application number: DE200910022349
Authority: DE
Inventors: Frank Pretzsch; Ulrike Koropp; Andrea Dr.rer.nat. Heymer
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2011-02-03
Anticipated expiration: 2029-05-16
Also published as: WO2010130305A8; EP2430155A1; DE102009022349A1; WO2010130305A1

Abstract

Verfahren zur Trennung einer ersten Gewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischen Gewebeverband, bestehend aus der ersten Gewebeschicht und mindestens einer weiteren mit der ersten Gewebeschicht verbundenen Gewebeschicht, wobei die erste Gewebeschicht im Vergleich zu der weiteren Gewebeschicht mechanisch spröder und die weitere Gewebeschicht im Vergleich zu der ersten Gewebeschicht mechanisch zäher ist, dadurch gekennzeichnet, dass durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes mit einem oder mehreren abrupten Kraftimpulsen (Hacken) in der ersten Gewebeschicht Sprödbruch ausgelöst wird und die dadurch aufgespaltene erste Gewebeschicht von der weiteren Gewebeschicht abgelöst wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum automatischen Abtrennen und Isolieren von Gewebezellen einer Gewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischen Gewebe des tierischen oder menschlichen Körpers, besonders Epithelzellen aus Hautbiopsaten sowie eine Vorrichtung zur automatischen Durchführung dieses Verfahrens.
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft das technische Gebiet des Tissue Engineering. Das Prinzip des Tissue Engineering besteht im Wesentlichen darin, aus biologischem Gewebe, das in einem separaten Verfahrensablauf aus dem menschlichen oder tierischen Körper in Form von Spendergewebe als sogenanntes Biopsat gewonnen werden kann, vitale Zellen oder Zellverbände zu isolieren und daraus neue Gewebe zu konstituieren. Die isolierten Zellen werden vermehrt und im Anschluss zum Aufbau neu konstituierter dreidimensionaler Gewebestrukturen, beispielsweise neu konstituierter Hautäquivalente, aufgebracht. Solche neu konstituierten Gewebe können dann als Testsysteme in der Forschung, insbesondere zur Wirkstofferforschung oder als Transplantate in der Medizin eingesetzt werden, um verlorene Organfunktionen zu ersetzen. Beispielsweise werden zweischichtige Hautmodelle bevorzugt als Testsysteme für Wirkstoffe, Chemikalien und Kosmetika eingesetzt und stellen eine Alternative zum Tierversuch dar.
Es wird erwartet, dass der hohe Bedarf an Hauttestsystemen aus humanen primären Zeilen und die Anforderungen an deren Reproduzierbarkeit kann letztlich nur durch eine Automatisierung des Herstellungsprozesses gewährleistet werden. Für den Aufbau von Hauttestsystemen werden zwei unterschiedliche primäre Zelltypen, und zwar Fibroblasten und Keratinozyten, benötigt, die bekanntermaßen aus mehrschichtigem Hautgewebe (insbesondere Präputiumbiopsate) isoliert werden.
Stand der Technik
Besonders im Zusammenhang mit der regenerativen Medizin besteht der Bedarf, biologische Laborprozesse unter Reinraumbedingungen GMP-konform zu automatisieren. Dadurch soll eine höhere Ausbeute, eine höhere Prozesssicherheit sowie eine standardisierbare Prozessoptimierung und Prozesskontrolle erreicht werden.
Eine Schwierigkeit besteht vor allem darin, die Vielzahl an unterschiedlichen vorbekannten manuellen Schritten und Handlungsabläufen der Gewebeaufbereitung und Zellisolation in zweckmäßig automatisierten Handhabungen umzusetzen. Eine besondere Herausforderung an die Automatisierung solcher Abläufe stellt dabei die Trennung verschiedener Gewebeschichten aus mehrschichtigen Gewebeverbänden dar, insbesondere die Abtrennung von Epithelschichten von Gewebeverbänden wie Hautbiopsaten.
Im Zusammenhang mit der Isolation von Gewebeschichten verschiedener Zelltypen aus Spendergewebe, insbesondere Hautgewebe sind manuelle Verfahren bekannt, worin zur Trennung von Epidermis und Dermis eines Hautbiopsats unmittelbar nach Abtrennung von gegebenenfalls anhaftendem Fettgewebe mit einem Skalpell in circa 2 × 2 mm² kleine Stücke geschnitten und in eine Enzymlösung überführt wird. Diese soll die Verbindung zwischen Epidermis und Dermis, besonders die dazwischen angeordnete Basalmembran auflösen. Das vollständige Zerschneiden des Biopsates ist erforderlich, um dem Enzym eine Angriffsfläche zur Basalmembran zu bieten. Dieses manuelle Verfahren lässt sich nicht automatisieren. In bekannten Verfahren wird davon ausgegangen, dass sich das Biopsat nur durch einen ziehenden Schnitt auf der Epidermisseite zerschneiden lässt. Weiter ist eine für einen definierten Schnitt erforderliche Ausrichtung des Biopsats in reproduzierbarer Weise aufgrund der unterschiedlichen Biopsatgrößen und -beschaffenheit nicht realisierbar. Ein wesentliches Problem ergibt sich vor allem daraus, dass das zerschnittene Biopsatgewebe anschließend manuell in die beiden Gewebeschichten getrennt werden muss. Dies findet in den bekannten manuellen Verfahren an den einzelnen Biopsatstücken mittels einer Pinzette und unter optischer Kontrolle statt, wobei die Epidermisschicht mit der Pinzette von der etwas dickeren Dermisschicht abgezogen wird. Da Hautbiopsate dazu neigen, sich einzurollen, ist die Handhabung zusätzlich erschwert. Aktuell gibt es keine geeignete Technologie, um den qualitativen optischen Unterschied zwischen den beiden Gewebeschichten für ein automatisiertes, robotergestütztes Abziehen der Gewebeschichten voneinander auszuwerten.
In den manuellen Verfahren muss, um einzelne Epithelzellen aus der manuell abgetrennten Epithelschicht zu gewinnen, die Epithelschicht zunächst in einem weiteren Verfahrensschritt homogenisiert werden und im Anschluss einer Trypsinbehandlung unterzogen werden. Hier ist eine hohe Einwirkzeit erforderlich, um eine große Anzahl an vereinzelten Epithelzellen zu gewinnen. Die Inkubationszeit beträgt dabei bekanntermaßen zwischen 15 und 20 Minuten, insbesondere etwa 18 Minuten. Nachteilig ist dabei, dass das Enzym Trypsin schon nach wenigen Minuten einen schädlichen Einfluss auf die Zellvitalität der Epithelzellen, insbesondere Keratinozyten, hat.
Im bekannten Verfahren wird die Enzymreaktion nach Ende der definierten Inkubationsdauer abgestoppt. Die Suspension wird durch ein Zellsieb gegeben, abzentrifugiert, und die Zellen werden in einem spezifischen Nährmedium resuspendiert.
Daneben, findet optional eine Aufbereitung der von der Epithelschicht befreiten weiteren Gewebeschicht, insbesondere der Dermisschicht statt.
Aus der DE 691 28 530 T2 ist ein Verfahren zur Herstellung von Lebendhaut-Äquivalenten bekannt, worin eine Hautprobe bereitgestellt wird, die enzymatisch behandelt wird, um die Epidermis zu trennen, und die Epidermis enzymatisch behandelt wird, um die Keratinozyten freizusetzen. Aus der DE 101 47 950 A1 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Extraktion von Zellmaterial aus einer Gewebeprobe bekannt, worin Gewebeschichten durch Anfrieren von Zellmaterial an eine Probenentnahmevorrichtung getrennt werden. Aus der DE 199 12 798 C1 ist eine Vorrichtung zur Auftrennung einer Gewebeprobe in Gewebefragmente bekannt, wobei eine Gewebeprobe auf eine aufgeraute Schneidplatte gelegt und mittels eines Schneidmesserrahmens durchtrennt wird.
Bisherige Lösungsansätze zur Automatisierung im Bereich der Zellkulturtechnik und des Tissue Engineering beschränken sich hauptsächlich auf die Kultivierung von Einzelzellen: Automatisierte Robotersysteme sind bekannt, die Zellkulturflaschen oder Bioreaktoren, insbesondere im Format standardisierter Multiwellplatten, handhaben können. Alle für die Zellkultur erforderlichen Schritte, Inkubation, Medienwechsel, Passagier- und Ernteprozesse werden automatisiert und gegebenenfalls auch unter GMP-konformen Bedingungen durchgeführt. Weder für die Zellextraktion der zu kultivierenden Zellen, noch für die Weiterverarbeitung der kultivierten Zellen stehen bisher automatisierbare Verfahren oder Mittel bereit.
Aufgabenstellung
Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein automatisierbares Verfahren zum Abtrennen und Isolieren einer Gewebeschicht, besonders einer Epithelzellschicht von anderen Gewebeschichten eines Gewebeverbands bereitzustellen, der aus einer ersten Gewebeschicht, bevorzugt einer Epithelzellen enthaltenden Epithelschicht und mindestens einer weiteren Gewebeschicht besteht, wobei bevorzugt die Epithelschicht mit der mindestens einer weiteren Gewebeschicht über eine Basalmembran verbunden ist, die zwischen der Epithelschicht und der weiteren Gewebeschicht angeordnet ist. Das Verfahren soll vor allem technisch aufwändige und schlecht automatisierbare Handhabungsschritte, wie aus der manuellen Bearbeitung von Gewebestücken bekannt, vermeiden und eine einfache technische Realisierung in automatisierten robotergestützten Systemen ermöglichen. Die Epidermiszellen sollen abgetrennt und insbesondere isoliert werden von einem biologischen Gewebestück, wobei das Gewebestück bevorzugt ein Spendergewebe ist, besonders bevorzugt menschliches oder tierisches Hautgewebe, welches bevorzugt zumindest eine Epidermis und zumindest eine Dermisschicht aufweist.
Ein damit verbundenes technisches Problem ist die Bereitstellung einer speziellen Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Das technische Problem wird gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Trennung einer ersten Gewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischen Gewebeverband, bestehend aus der ersten Gewebeschicht und mindestens einer weiteren mit der ersten Gewebeschicht, insbesondere fest verbundenen Gewebeschicht, wobei die erste Gewebeschicht im Vergleich zu der weiteren Gewebeschicht mechanisch spröder und somit die weitere Gewebeschicht im Vergleich zu der ersten Gewebeschicht mechanisch zäher ist. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes mit einem oder mehreren abrupten Kraftimpulsen (Hacken) in der ersten Gewebeschicht Sprödbruch ausgelöst wird, so dass die dadurch aufgespaltene erste Gewebeschicht von der weiteren Gewebeschicht ablösbar wird. Insbesondere ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren ein Eindringen eines die Gewebeschichten an ihren Verbindungsstellen lösenden Agens durch die durch den Sprödbruch der integrierten erste Gewebeschicht, welche ansonsten ein Vordringen des Agens an die Gewebeverbindungsstellen verhindern würde. Außerdem ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren, dass die durch den Sprödbruch desintegrierte erste Gewebeschicht in „Bruchstücken” von der mindestens einen weiteren Gewebeschicht ablösbar wird, so dass durch einfache nachfolgende Handhabungsschritte ein Trennen der Gewebeschichten ermöglicht wird. Besonders liegen die Gewebebruchstücke der ersten Gewebeschicht in Suspension vor, während die vom Sprödbruch nicht erfassten weiteren Gewebeschichten als weitgehend zusammenhängendes Gewebe intakt bleiben so auf einfache Weise von der Suspension abtrennbar sind.
Das technische Problem wird in bevorzugter Ausgestaltung gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung von Epithelzellen aus einem Gewebeverband, bestehend aus einer die Epithelzellen enthaltenden Epithelzellschicht und mindestens einer mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegende Basalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht, welches gekennzeichnet ist durch die zumindest folgenden Verfahrensschritte:

a) Die Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbandes wird zerstört durch bevorzugt wiederholte Hackbewegungen einer Klinge, das heißt durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes über die Klinge mit einem oder mehreren abrupten Kraftimpulsen, sodass die Epithelzellschicht, besonders an der Stelle des einwirkenden Kraftimpulses, bevorzugt im Wesentlichen, bis zur Basalmembran hin aufgespalten wird, wobei bevorzugt die mindestens eine darunterliegende weitere Gewebeschicht vollständig, oder bevorzugt im Wesentlichen intakt bleibt;
b) Inkontaktbringen des die aufgespaltete Epithelzellschicht aufweisenden Gewebeverbands mit einem die Basalmembran des Gewebeverbands lösenden Agens, sodass sich die Epithelzellschicht von dem Gewebeverband ablöst, wobei ein die mindestens eine weitere Gewebeschicht enthaltendes Restgewebe des Gewebeverbandes vollständig, bevorzugt im Wesentlichen, intakt bleibt;
c) Abtrennen der abgelösten Epithelzellschicht von dem die mindestens eine weitere Gewebeschicht enthaltenden Restgewebe des Gewebeverbandes.

Bevorzugt findet das Hacken, das heißt das Beaufschlagen mit einem abrupten Kraftimpuls des Gewebeverbandes im Schritt a) wiederkehrend statt; die Wiederholfrequenz des Hackens beträgt in Schritt a) von 1 bis 5 Hz, bevorzugt von 3 bis 5 Hz. Andere Wiederholraten sind, je nach den Eigenschaften des zu bearbeitenden Gewebeverbands durch den Fachmann in Kenntnis der erfindungsgemäßen Lösung anpassbar, um gegebenenfalls das Hackergebnis zu verbessern, ohne dass der Erfindungsgedanke verlassen wird.
Die Erfindung sieht also vor, vor einem Auflösen des Gewebeverbands durch ein lösendes Agens die Integrität der Epithelzellschicht durch einen abrupten Kraftimpuls auf den Gewebeverband (Hacken) zu zerstören. Charakteristisch für diese neuartige Desintegrationsmethode ist, dass dabei die mit der Epithelzellschicht verbundene mindestens eine weitere Gewebeschicht nicht oder nicht wesentlich desintegriert wird und daher vollständig oder zumindest im Wesentlichen intakt bleibt. Das heißt, der Gewebeverband bleibt im Anschluss an Schritt a) als solcher mechanisch erhalten, was die automatisierte, insbesondere robotergestützte Weiterverarbeitung erleichtert.
Die Erfindung macht sich die überraschende Erkenntnis zunutze, dass die mechanischen Eigenschaften der Epithelzellschicht sich von den mechanischen Eigenschaften von mit der Epithelzellschicht verbundenen weiteren Gewebeschichten unterscheiden. Insbesondere ist die Epithelzellschicht im Vergleich zu den damit verbundenen weiteren Gewebeschichten vergleichsweise spröde und die an eine Epithelzellschicht anhaftenden weiteren Gewebeschichten sind vergleichsweise zäh. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, verursacht der abrupte Hackimpuls auf das Gewebe einen im Wesentlichen verformungslosen Sprödbruch in der Epithelzellschicht, während vergleichsweise zähe Gewebeschichten im Wesentlichen intakt bleiben. Der abrupte Hackimpuls kann keinen verformungsreichen Zähbruch in einem vergleichsweise zäheren Gewebe erzeugen.
Durch die vorliegende Erfindung wird dem Fachmann ermöglicht, die bisher bekanntermaßen nur durch eine ziehende Schnittführung erreichte Zerteilung des Gewebes durch eine bruchmechanische Beanspruchung zum Auftrennen der Epithelzellschicht im Gewebeverband zu ersetzen und durch die zu erreichbare Desintegration der Epithelzellschicht kann ein Gewebe auflösendes Agens unmittelbar an die der Epithelzellschicht anliegenden Basalmembran einwirken, wodurch diese aufgelöst werden kann, um den Gewebeverband aufzulösen und insbesondere die Epithelzellen an der mindestens einen weiteren Gewebeschicht des Gewebeverbands abzulösen.
Die Erfinder fanden weiter überraschend, dass der vorteilhafte Effekt des abrupt wirkenden Kraftimpulses (Hacken) auf die Zerstörung der Integrität der Epithelzellschicht im Gewebeverband tatsächlich im Wesentlichen unabhängig von der Orientierung des Gewebestücks in Bezug auf die Hackrichtung ist. Es hat sich herausgestellt, dass es nicht, wie zunächst zu erwarten gewesen wäre, erforderlich ist, dass die zu desintegrierende Epithelzellschicht an der der Kraftimpulsrichtung zugewandten Oberfläche des Gewebeverbands angeordnet sein muss, um durch den erfindungsgemäßen Kraftimpuls die Desintegration der Epithelzellschicht zu erwirken. Es hat sich überraschend herausgestellt, dass auch die mit der Epithelzelleschicht im Gewebeverband verbundenen mindestens eine weitere Gewebeschicht die Kraftimpulswirkung auf die Epithelzellschicht leiten kann, um diese zu desintegrieren. Vorteilhafterweise kann so die Epithelzellschicht im Gewebeverband „aufgeschnitten” werden, ohne dass die konkrete Orientierung des Gewebestücks vorher festgelegt, oder bekannt sein muss. Dies ist ein weiterer entscheidender Vorteil gegenüber der bekannten Maßnahme der ziehenden Schnittführung auf dem gezielt orientierten und ausgebreiteten Gewebestück.
Die Erfindung sieht bevorzugt vor, dass das Hacken des Gewebeverbandes in Schritt a) innerhalb des Verfahrens über die im Wesentlichen gesamte Oberfläche des Gewebeverbandes verteilt erfolgt, um möglichst die gesamte Epithelzellschicht zu desintegrieren, das heißt in wesentlichen Teilen im Wesentlichen bis zur Basalmembran hin aufzuspalten. In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird dies erreicht, indem der Gewebeverband in Schritt a) auf einer Trägerfläche aufliegt, die im Wesentlichen senkrecht zur Hackbewegung, das heißt senkrecht zu der von der Klinge ausgeübten Kraftimpulsrichtung, bevorzugt schrittweise, verfahren, das heißt, verschoben wird. Dies erfolgt bevorzugt durch den Einsatz eines Kreuztisches, woraus die Trägerfläche angeordnet ist. Der Kreuztisch weist eine erste horizontale Achse und eine zweite, dazu senkrecht stehende horizontale Achse auf. Die Erfindung sieht bevorzugt vor, dass die Trägerfläche, und damit das darauf aufliegende Gewebestück, zumindest in den Intervallen zwischen den sich wiederholenden Hackbewegungen, vorzugsweise schrittweise in zumindest einer Achsenrichtung verfahren, das heißt verschoben wird, sodass mit jeder Hackbewegung ein anderer Oberflächenabschnitt des auf der Trägerfläche aufliegenden Gewebeverbandes mit dem abrupten Kraftimpuls der Klinge beaufschlagt wird.
In einer ersten Variante erfolgt das schnittweise Verfahren entlang der mindestens einen horizontalen Achse in Form eines regelmäßigen Musters (Scannen). In einer alternativen Variante erfolgt das Verfahren in zumindest einer Achsenrichtung nach ungeordneten, insbesondere quasi-stochastischen Verteilungsmustern. Der Vorteil der quasi-stochastischen Verteilung der Kraftimpulseinwirkung auf die Oberfläche des Gewebeverbandes besteht darin, dass unabhängig von der konkreten Lage des Gewebeverbandes auf der Trägerfläche eine im Mittel gleichgewichtete Desintegrationswirkung erreicht wird.
Die Erfindung sieht bevorzugt vor, dass als die Basalmembran im Gewebeverband lösendes Agens ein Enzym oder eine Enzymmischung eingesetzt wird, die bevorzugt ausgewählt ist aus dem Enzym Dispase, Dispase-ähnlichen Enzymen und Mischungen davon. Bevorzugt wird das Inkontaktbringen des Gewebeverbands mit dem die Basalmembran lösenden Agens in Schritt b) durch eine Inkubation des Gewebeverbands mit diesem Agens realisiert. Bevorzugt erfolgt die Inkubation über einen Zeitraum von 3 bis 5 Stunden, besonders bevorzugt über einen Zeitraum von 4 Stunden.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch ein um mindestens einen weiteren Schritt ergänztes Verfahren, wonach in dem weiteren Schritt d) die in Schritt c) abgetrennte Epithelzellschicht mit einem den Zellverband der Epithelzellschicht lösenden Agens in Kontakt gebracht wird, sodass sich vereinzelte Epithelzellen aus der abgetrennten Epithelzellschicht ablösen.
Bevorzugt ist das den Zellverband der Epithelzellschicht lösende Agens ein Enzym oder Enzymgemisch, welches bevorzugt ausgewählt ist aus dem Enzym Trypsin, Trypsin-ähnlichen Enzymen und Mischungen davon. Vorzugsweise wird das Inkontaktbringen der abgetrennten Epithelzellschicht mit dem den Zellverband der Epithelzellschicht lösenden Agens in Schritt d) durch eine Inkubation der Epithelzellschicht mit diesem Agens realisiert. Bevorzugt findet die Inkubation über einen Zeitraum von etwa 3 bis etwa 10 Minuten, bevorzugt von 4 bis 6 Minuten, besonders bevorzugt von 5 Minuten statt.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein um ein mindestens einen weiteren Schritt erweitertes erfindungsgemäßes Verfahren, wobei in eifern nachfolgenden oder alternativen Schritt e) das die mindestens eine weitere Gewebeschicht aufweisende Restgewebe mit einem den Gewebeverband lösenden Agens in Kontakt gebracht wird, sodass sich vereinzelte Gewebezellen der mindestens einen weiteren Gewebeschicht aus dem Restgewebe lösen.
Vorzugsweise wird das den Zellverband der mindestens einen weiteren Gewebeschicht lösende Agens im Schritt e) ein Enzym oder Enzymgemisch, ausgewählt aus dem Enzym Kollagenase, Kollagenase-ähnlichen Enzymen und Mischungen davon. Bevorzugt wird das Inkontaktbringen der mindestens einen weiteren Gewebeschicht mit dem den Zellverband der Gewebeschicht lösenden Agens in Schritt e) durch eine Inkubation der mindestens einen weiteren Gewebeschicht in dem Agens realisiert. Die Inkubation findet bevorzugt über einen Zeitraum von 1 bis 8 Stunden, besonders bevorzugt über einen Zeitraum von 3 bis 5 Stunden statt. Die Ausbeute der aus dem Zellverband der mindestens einen weiteren Gewebeschicht herausgelösten vereinzelten Gewebezellen hängt von der Inkubationsdauer ab.
Die Erfindung stellt somit ein Gesamtverfahren bereit, womit aus einem mindestens zwei Gewebeschichten enthaltenden Gewebeverband, bevorzugt in Form eines Spendergewebes, welches eine Epithelzellschicht und eine über eine Basalmembran verbundene weitere Gewebeschicht aufweist, bereit, um in automatisierbarer, insbesondere robotergestützter Weise eine einfache, schnelle und zuverlässige Isolation sowohl der Epithelzellen, als auch bevorzugt zusätzlich der Gewebezellen der weiteren Gewebeschicht von dem Gewebeverband ermöglicht. Ein solches Verfahren ist reproduzierbar, genügt High-Throughput-Erfordernissen und kann die Anforderungen an die GMP-Konformität erfüllen.
In einer bevorzugten Ausführung ist der Gewebeverband ein Spendergewebe des menschlichen oder tierischen Körpers; besonders bevorzugt ist der Gewebeverband Hautgewebe, insbesondere in Hautgewebebiopsat. Demgemäß ist die Epithelzellschicht bevorzugt eine Epidermisschicht und die zu isolierenden Epithelzellen sind bevorzugt Keratinozyten, die als solche aus dem Spendergewebe, insbesondere Hautgewebe, isolierbar sind. Ebenso ist die mindestens eine weitere Gewebeschicht des Gewebeverbandes bevorzugt eine Dermisschicht und die aus der mindestens einen weiteren Gewebeschicht isolierbaren Gewebezellen sind bevorzugt Fibroblasten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Schritts a), geeignete Vorrichtung zum Zerstören der Integrität einer Epithelzellschicht in einem Gewebestück eines Gewebeverbandes, bestehend aus einer die Epithelzellen enthaltenen Epithelzellschicht und mindestens einer mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegende Basalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht, durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes über eine Klinge mit einem abrupten Kraftimpuls (Hacken), wobei die Vorrichtung zumindest folgende Komponenten aufweist:

– Trägerfläche (10), welche über eine Kreuztisch-Lagerung an einer Basis (40) angeordnet ist, die zur Aufnahme des Gewebestücks geeignet ist und eine erste horizontale Verfahrachse (42) und eine dazu senkrecht angeordnete zweite horizontale Verfahrachse (44) aufweist;
– Klingenhebel (30), der an der Basis (40) schwenkbar gelagert ist und mindestens einen an dem zur Trägerfläche (10) hingewandten Ende angeordneten Klingenblock (25) aufweist, der mindestens eine Klinge (20) aufnimmt, welche durch Schwenken des Klingenhebels (30) auf die Trägerfläche (10) absenkbar ist;
– Antriebselement (35), welches mit dem Klingenhebel (30) in Kraftverbindung steht, um ein abruptes Absenken der mindestens einen Klinge (20) auf ein auf der Trägerfläche (10) aufgenommenes Gewebestück ermöglicht.

Es ist bevorzugt vorgesehen, dass in dem Klingenblock mehrere Klingen angeordnet sind. In einer bevorzugten Ausführung sind die eingesetzten Klingen Skalpellmesser. Bevorzugt sind dies auswechselbare Skalpellklingen.
Die Vorrichtung ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Klinge im Wesentlichen senkrecht auf die Trägerfläche absenkbar ist. Dies wird bewerkstelligt durch entsprechende Anordnungen des schwenkbar an der Basis gelagerten Klingenhebels. Die Schwenkachse des Klingenhebels liegt bevorzugt oberhalb der Ebene der Trägerfläche.
Das zum Antrieb des Klingenhebels vorgesehene Antriebselement ist ein Kraftantrieb, der bevorzugt ausgewählt ist aus pneumatischen Antrieben, hydraulischen Antrieben und piezoelektrischen Antrieben und elektromagnetischen Antrieben. Dazu analoge Antriebskonzepte sind ebenfalls vom Gegenstand der Erfindung umfasst. Besonders bevorzugt ist der elektromagnetische Antrieb. Ein bevorzugtes Merkmal des Antriebselements ist die Fähigkeit, über die Klinge einen abrupten Kraftimpuls auf ein Gewebestück auszuwirken. In einer bevorzugten alternativen Ausführung wird auf die schwenkbare Lagerung des Klingenhebels verzichtet, um eine direkte Verbindung zwischen Klinge und Antriebselement zu erzeugen. In einer weiteren alternativen bevorzugten Ausführung wird auf den Klingenhebel verzichtet und das Antriebselement unmittelbar mit der Klinge verbunden.
Die Vorrichtung ist außerdem dadurch gekennzeichnet, dass bevorzugt zumindest an einer Stelle der die Klinge über den Klingenhebel mit dem Antriebselement verbindenden Wirkmechanik, ein Endanschlag vorgesehen ist, der die durch das Absenken der Klinge auf die Trägerfläche ausübbare Hubbewegung zur Trägerfläche hin begrenzt. Dadurch wird erreicht, dass sich die Klinge bei der Hubbewegung, das heißt beim erfindungsgemäßen Hacken nicht oder nicht vollständig auf die Trägerfläche herabsenkt. Diese wird vorteilhafterweise dadurch an ihrer Oberfläche geschont und der Verschleiß von Trägerfläche und/oder Klinge minimiert. Gleichzeitig erlaubt der Endanschlag, dass ein vollständiges Durchtrennen des auf der Trägerfläche aufliegenden Gewebestücks aufgrund einer durch die Klinge verursachten Messerschneidwirkung vermieden oder verhindert wird. Im Vordergrund dieser Erfindung steht nicht die durch die herabfahrende Klinge erzeugte Messerschneidwirkung gegen die Trägerfläche, sondern der durch die Klinge im Gewebe erzeugte abrupte Kraftimpuls, welcher zum „Zerspringen” des vergleichsweise spröden Epithelgewebes im Gewebeverband des Gewebestücks führt. Die Vorrichtung ist deshalb derart ausgelegt, dass eine messerschneidende Wirkung der Klinge ausgeschlossen ist. Die Vorrichtung ist daher auch so ausgestaltet, dass ein sogenannter ziehender Schnitt auf dem Gewebestück verhindert wird. Der Fachmann kennt entsprechende geometrische Ausgestaltungen, insbesondere die Anordnung der Schwenkachse des Klingenhebels in Bezug auf die Trägerfläche und den Anstellwinkel der auf die Trägerfläche niederfahrenden Klinge, um entsprechende schneidende Bewegungen, die im Wesentlichen parallel zur Oberfläche des Gewebestücks verlaufen, vermeiden.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung, die weiter eine Steuereinheit, insbesondere geeignet zur Steuerung des Verfahrensablauf in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens aufweist, die mit dem Antriebselement (35) und Effektoren der horizontalen Kreuztisch-Achsen (42, 44) in Verbindung steht, bevorzugt in Wirkverbindung und/oder Steuerverbindung, die speziell ausgebildet ist, die Verschiebung der Trägerfläche (10) entlang der Achsen (42, 44) mit der von der Klinge (20) über die Antriebseinheit (35) ausgeführte Hubbewegung auf die Trägerfläche zu koordinieren, und zwar insbesondere in der Gestalt, dass nach bevorzugt jeder ausgeführten Hubbewegung der Klinge die Trägerfläche in zumindest einer der beiden horizontalen Achsen (42, 44) bevorzugt schrittweise verschiebbar ist.
Die Steuereinheit ist vorzugsweise in Abhängigkeit von der verwendeten Antriebseinheit gewählt. Wird beispielsweise eine pneumatische Antriebseinheit verwendet, wird die Steuereinheit aus pneumatischen Steuerelementen, gegebenenfalls in Verbindung mit programmgesteuerten Ventilen, eingesetzt. Die Steuereinheit kann auch durch eine rein mechanische Wirkverbindung, beispielsweise eine mechanische Rastung oder Schrittfolgesteuerung, die über die Hubbewegung der Klinge getaktet wird, ausgeführt werden. Besonders bevorzugt ist eine über einen Rechner realisierte Steuerung, bevorzugt in Verbindung mit einem dazu geeigneten Computerprogramm, das auf dem Steuerrechner implementiert ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Computerprogrammprodukt zur Steuerung der Koordination der Bewegung der Klinge mit der Bewegung der Trägerfläche.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch eine Anordnung zur automatischen, insbesondere robotergestützten Isolierung von Epithelzellen aus einem Gewebeverband, der aus einer die Epithelzellen enthaltenden Epithelzellschicht und mindestens einer mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegende Basalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht besteht oder diese enthält, wobei die Vorrichtung zumindest die folgenden Komponenten enthält:

– Mittel zum Zerstören der Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbands durch Beaufschlagen des Gewebeverbands über eine Klinge mit einem abrupten Kraftimpuls (Hacken), sodass die Epithelzellschicht im Wesentlichen bis zur Basalmembran hin aufgespalten wird;
– Mittel zum Inkontaktbringen des Gewebeverbands mit der aufgespalteten Epithelzellschicht mit einem die Basalmembran lösenden Agens, sodass sich die Epithelzellschicht von dem Gewebeverband ablöst; und
– Mittel zum Abtrennen der abgelösten Epithelzellschicht von dem die mindestens eine weitere Gewebeschicht enthaltenden Restgewebe des Gewebeverbandes.

In bevorzugter Ausführung ist das Mittel zum Zerstören der Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbands die hierin beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung.
Bevorzugt enthält die Anordnung weiter:

– Mittel zum Abtrennen von Fettgewebe von dem Spendergewebe;
– Mittel zum Resuspendieren der vereinzelten Zellen und zum Abtrennen der Zellen von gegebenenfalls vorliegenden Geweberesten.

Die Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden Figuren sowie das Beispiel näher beschrieben, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären.
1 zeigt eine bevorzugte Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Trägerfläche (10), welche auf der Basis (40) über den Kreuztisch mit den horizontalen Achsen (42, 44) gelagert ist und auf die mindestens eine der Klingen (20) bevorzugt senkrecht und bevorzugt ohne parallel zur Trägeroberfläche (10) verlaufenden Bewegungskomponente absenkbar ist. Die mindestens eine Klinge (20) ist über einen Klingenblock (25) an dem zur Trägerfläche hinweisenden Ende eines an der Basis (40) schwenkbar gelagerten Klingenhebels (30) kraftschlüssig fixiert. Der Klingenhebel (30) wirkt als Umlenkhebel der Kraftwirkung, die vom Antriebselement (35), die hier in Form eines Hubmagneten oder eines Pneumatikkolbens dargestellt ist, erzeugt wird. Durch Ausfahren des Hubkolbens aus dem Antriebselement (35) wird die mindestens eine Klinge (20) auf die Trägerfläche (10) abgesenkt. Die Trägerfläche (10) ist zur Aufnahme des zu bearbeitenden Gewebestücks geeignet. Befindet sich auf der Trägerfläche (10) das Gewebestück, fährt die mindestens eine Klinge (20) bei der Hubbewegung der aus den Elementen (35, 30 und 20) gebildeten Einheit auf das Gewebestück herab und übt auf dieses einen abrupten Kraftimpuls aus, ohne dies durch eine messerschneidende Wirkung zu zerschneiden. Optional ist der Trägerfläche (10) ein Handhabungselement (46) zugeordnet, das den automatischen Austrag und Eintrag der Trägerfläche (10) in die Vorrichtung durch ein rotorgestütztes System ermöglicht.
2 zeigt eine reale Ausführung der Vorrichtung nach 1 mit einer in den Klingenhebel am Klingenblock eingespannten Klinge. Auf der hellen quadratischen Trägerfläche liegt ein Gewebestück auf.
Beispiel: Vollautomatisierte Isolation von Fibroblasten und Keratinozyten aus Epidermis- und Dermisschichten von Hautbiopsaten.
In einem gegebenenfalls vorangehenden separaten Verfahrensablauf, der unabhängig von dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wird, werden bevorzugt manuell operativ Hautgewebestücke (Biopsate) aus dem menschlichen oder tierischen Körper, bevorzugt aus dem lebenden menschlichen Körper, entnommen. Bevorzugt sind dies Präputien.
Die Gewebestücke befinden sich zu Prozessbeginn bevorzugt in einem Transportbecher in ca. 20 ml Transportmedium (bevorzugt DMEM + 1% Gentamycin). Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Biopsat zunächst durch einen Greifer, welcher das Biopsat aus dem Transportbecher nimmt und auf eine Verarbeitungsplattform ablegt, erfasst. Um das Biopsat zum automatisierten Greifen in eine definierte Lage zu bringen, wird der Transportbecher bevorzugt um ca. 40° aus der senkrechten Achse gekippt. Durch die Schwerkraft sinkt das Biopsat in die so entstandene Senke im Transportbecher ab, und damit in eine reproduzierbar definierte Lage. Das Biopsat kann so von einem entsprechend ausgelegten Greifer erfasst werden. Das Biopsat wird mit dem Greifer auf einer Verarbeitungsplattform abgelegt und für die Trennung der Gewebeschichten vorbereitet.
Zur Fettreduktion, das heißt zur Abtrennung von am Biopsat anhaftendem Fettgewebe, wird auf die mechanischen Eigenschaften des Fettgewebes gegenüber dem Dermis- und Epidermisgewebe, insbesondere das Elastizitätsmodul, zurückgegriffen. Das Biopsat wird zunächst bevorzugt mittels Unterdruckansaugung automatisch in eine zylinderförmige Hülse überführt, welche so über dem Boden eines Einweggefäßes (Petrischale) positioniert ist, das zwischen Gefäßboden und Zylinderwand ein Spalt von weniger als 1 mm entsteht. Durch einen in der Zylinderhülse laufenden Kolben oder Stempel, wird das Biopsat auf den Boden gepresst. Dabei kann der enge Spalt zwischen Zylinder und Boden nur von dem zur Seite gepressten Fettgewebe durchdrungen werden, welches so durch den Spalt nach außen gedrückt und vom übrigen Gewebe (Epidermis- und Dermisschicht) räumlich getrennt wird.
Das ausgetretene Fettgewebe wird durch Abschneiden entfernt. Dazu wird an der Außenseite der Zylinderhülse ein Schneidring abgesenkt, der das unter der Zylinderhülse hervorquellende Fettgewebe abschneidet. Der Schneidring rotiert um die Achse der Zylinderhülse, um durch den ziehenden Schnitt die Schneidwirkung zu verbessern.
Der Schneidring ist mit dem im Inneren der Zylinderhülse verlaufenden Stempel mechanisch gekoppelt, sodass zeitlich unmittelbar nach dem Herunterpressen des Biopsats auf den Gefäßboden in einem Arbeitsgang das Schneiden des nach außen hervorquellenden Fettgewebes erfolgt: Das Quetschen und Schneiden wird innerhalb einer einzigen Hubbewegung über eine speziell ausgelegte Mitnehmerhülse, die mit dem Stempel und dem Schneidring gekoppelt ist, realisiert. Zur Beabstandung der Zylinderhülse vom Gefäßboden sind Abstandshalter oder Stege vorgesehen, welche die Breite des Spalts bestimmen. Der Spalt hat eine Breite von ca. 0,8 mm.
Zur automatisierten Aufnahme und Handhabung des Biopsats verfügt der Fettseparator über eine Ansaugleitung zum Anlegen eines Unterdrucks, worüber das Biopsat in der Zylinderhülse festgehalten werden kann. Dadurch kann das Biopsat aus einer defilierten Lage angesaugt werden, bearbeitet werden und durch Positionierung des Fettseparators wieder an einen definierten Ort abgelegt werden. Es zeigt sich, dass durch die erfindungsgemäße Behandlung neben der Reduktion des Fettgewebeanteils im Biopsat eine für die weitere Bearbeitung günstige Abflachung und flächige Ausbreitung des Biopsats erreicht wird. Diese hat einen überraschend positiven Einfluss auf die Effizienz der weiteren Bearbeitung, insbesondere der Trennung der Gewebeschichten (Dermisschicht, Epidermisschicht).
Für die getrennte Isolierung der beiden Zelltypen Keratinozyten und Fibroblasten aus dem Hautbiopsat werden die beiden Hautschichten Epidermis und Dermis voneinander getrennt. Dies geschieht enzymatisch über das Enzym Dispase oder ein analog wirkendes Enzym, welches eine Auflösung der zwischen Epidermis- und Dermisschicht angeordneten Basalmembran bewirkt. Dazu wird das Biopsat so vorbereitet, dass das Enzym bis zur Basalmembran in das Gewebe eindringen kann. Bevorzugt wird dazu ein Gewebehacker eingesetzt, welcher ein Schneiden des flächig ausgebreiteten Biopsats mit definierter Schnitttiefe ermöglicht. Dabei wird die Oberfläche des Biopsats, welches aus der Epidermis besteht, nur bis zum darunterliegenden Dermisgewebe durchtrennt, das heißt, das darunterliegende Dermisgewebe bleibt durch das mechanische Schneiden bevorzugt unbeeinflusst. Aufgrund der vergleichsweise höheren Sprödigkeit der oben liegenden Epidermisschicht gegenüber der zäheren darunterliegenden Dermisschicht wird durch die Hackbewegung der Klinge von oben auf die Epidermis mechanisch mit hohem Impuls eingewirkt, sodass diese quasi „zerspringt” während die tiefer liegende Dermisschicht im Wesentlichen intakt bleibt.
Die Größe der Epidermisstücke wird insbesondere durch das Verhältnis aus Hackfrequenz des Messerkopfs und der Bewegungsgeschwindigkeit des Messerkopfs über dem Biopsat sowie durch die Dauer des Hackvorganges bestimmt.
Die Schneid- oder Hackwirkung des wiederkehrend bevorzugt mit einer Frequenz von ca. 2 bis 5 Hz hackenden Messers wird bevorzugt durch Verschieben des Gewebestücks auf einem Kreuztisch, welcher mit dem Hackmesser gekoppelt betrieben wird, ist auf das gesamte Gewebestück verteilt. Die Schnittführung ist damit regelmäßig, bevorzugt aber quasi-stochastisch auf der gesamten Gewebeoberfläche verteilt, sodass eine bevorzugt enge Verteilung der Größen der geschnittenen Epidermisstücke entsteht.
Anschließend wird für einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37°C in einer Enzymlösung, Dispase (4 U/mL, 20 ml) inkubiert. Das Enzym kann durch die eingeschnittene Epidermisschicht leicht zur Basalmembran vordringen. Durch die enzymatische Zerstörung der Baselmembran löst sich die eingeschnittene Epidermis in Stücken von der darunterliegenden im Wesentlichen intakten zusammenhängenden Dermis. Die Epidermisstücke schwimmen bevorzugt auf.
Die in Dispase suspendierten Epidermisstücke werden in dem nachfolgenden Schritt von der als zusammenhängendes Gewebestück erhaltenen Dermis abgetrennt. Dazu wird zunächst das Volumen der Dispaselösung durch Auffüllen mit Pufferlösung verdoppelt oder verdreifacht (auf 40 bis 60 ml) und die Dermis aus der Suspension der Epidermisstücke mittels eines Gewebegreifers automatisch entnommen und in ein separates Gefäß abgelegt. Epidermisgewebe und Dermisgewebe liegen nun in getrennten Gefäßen vor.
Zur Aufbereitung der Epidermisschicht zu vereinzelten Keratinozyten werden die Epidermisstücke mit Hilfe eines Gewebefilters, welcher an der Unterseite eines automatisierten Pipettenkopfs angebracht ist, abgetrennt, indem die Suspension über den Gewebefilter durch den Pipettenkopf abgesaugt wird, wobei die Epidermisstücke am Gewebefilter haften bleiben. Die Erhöhung des Lösungsvolumens durch das Auffüllen mit Pufferlösung unmittelbar vor der Filtration verbessert die Ausbeute an Epidermis erheblich.
Anschließend werden die am Gewebefilter festgehaltenen Epidermisstücke mittels Puffer (PBS) durch Rückspülen des Gewebefilters über den Pipettenkopf in ein weiteres Gefäß überführt und dort mit einer weiteren Enzymlösung (Trypsin/EDTA, 1 mL, 0,5%) versetzt. Das Trypsin bewirkt, dass sich die Einzelzellen aus dem Gewebeverband der Epidermisstücke lösen. Nach Inkubation liegt (für circa 5 Minuten) eine Einzelzellsuspension aus Epidermiszellen vor.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wird die Enzymreaktion des Trypsins durch Zugabe von 10% FCS gestoppt. Da durch den optionalen Hackprozess bedingt schon kleine Epidermisstücke vorliegen können, kann der im manuellen Verfahren übliche Schritt der Homogenisierung der Gewebestücke vor der enzymatischen Behandlung ausbleiben. Die dadurch erreichte reduzierte mechanische Belastung der Zellen und die Verkürzung der Inkubationszeit in Trypsin auf circa 5 min führen zu einer gesteigerten Zellausbeute und Vitalität im Vergleich zum konventionellen manuellen Prozess.
Zur Unterstützung der Zellisolation wird die erhaltene Suspension in einem nachfolgenden Schritt gegebenenfalls für ca. 20 Sek. mechanisch durchmischt (Vortex). Zur Abtrennung von eventuell vorhandenen Geweberesten wird die Suspension zunächst über dem Gewebefilter mit 100 μm Porengröße, welche die Einzelzellen passieren lässt, abgetrennt. Dazu wird an dem automatisierten Pipettenkopf ein zweiter dem Gewebefilter in Saugströmungsrichtung nachgeschalteter Einzelzellenfilter eingesetzt. Die Suspension wird in den Pipettenkopf gesaugt, wodurch die in der Suspension gegebenenfalls noch enthaltenen Gewebereste am Gewebefilter zurückgehalten und die Einzelzellen am nachgeschalteten Einzelzellenfilter festgehalten werden. Anschließend wird der Gewebefilter zusammen mit den daran anhaftenden Geweberesten von dem automatischen Pipettenkopf abgetrennt und gegebenenfalls verworfen. Die im Einzelzellenfilter im Pipettenkopf verbleibenden Einzelzellen werden durch Rückspülen des Einzelzellenfilters aus dem Pipettenkopf gespült. Dazu wird auf den Pipettenkopf anstelle des Gewebefilters eine Pipettenspitze gesetzt und die Einzelzellen durch Rückspülen des Einzelzellenfilters in die Pipettenspitze verbracht. Optional wird die Zellzahl in der Suspension bestimmt. Dazu wird ein Teil der Einzelzellsuspension aus der Pipettenspitze in eine Zellzählkammer dosiert und aus der in diesem Teilvolumen gefundenen Zellzahl auf die Gesamtzellzahl in der Pipettenspitze geschlossen. Gegebenenfalls wird durch Austausch der Suspendierlösung im Pipettenkopf in Abhängigkeit von der gefundenen Zellzahl neues Medium zudosiert, sodass eine Zellsuspension aus Epidermiszellen mit definierter Zellkonzentration erhalten wird.
Zur Aufbereitung der Dermisschicht zu Fibroblasten wird die Dermisschicht in einer Kollagenaselösung (20 ml) für einen Zeitraum von 1 bis 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellausbeute ist unter anderem abhängig von der Inkubationsdauer. Mit zunehmender Inkubationsdauer steigt der Grad der Auflösung des Dermisgewebes. Die Fibroblasten, die sich bei der Enzymbehandlung aus dem Gewebe herauslösen, werden durch analoge Filtrationsschritte mit Gewebefilter und Einzelzellenfilter, die optional mit dem automatisierten Pipettenkopf, wie vorstehend für die Epidermiszellen dargestellt, abgetrennt. Alternativ werden nicht aufgelöste Dermisgewebeteile bevorzugt mittels eines automatisierten Greifers entnommen. Die Dermiszellen werden anschließend optional mittels des automatisierten Pipettenkopfs auf eine bestimmte Zellkonzentration eingestellt.
Das automatisierte Verfahren ist so ausgelegt, dass es GMP-konform betrieben werden kann. Die Modularität der Einzelautomatisierungsschritte erlaubt eine hohe Flexibilität bezüglich des eingesetzten Gewebes und der gewünschten Anwendung, einschließlich der Möglichkeit einzelne Verarbeitungsschritte manuell auszuführen.

Claims

Verfahren zur Trennung einer ersten Gewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischen Gewebeverband, bestehend aus der ersten Gewebeschicht und mindestens einer weiteren mit der ersten Gewebeschicht verbundenen Gewebeschicht, wobei die erste Gewebeschicht im Vergleich zu der weiteren Gewebeschicht mechanisch spröder und die weitere Gewebeschicht im Vergleich zu der ersten Gewebeschicht mechanisch zäher ist, dadurch gekennzeichnet, dass durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes mit einem oder mehreren abrupten Kraftimpulsen (Hacken) in der ersten Gewebeschicht Sprödbruch ausgelöst wird und die dadurch aufgespaltene erste Gewebeschicht von der weiteren Gewebeschicht abgelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Isolierung von Epithelzellen aus einem Gewebeverband, bestehend aus einer die Epithelzellen enthaltenden Epithelzellschicht und mindestens einer mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegende Basalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht, enthaltend die Schritte: a) Zerstören der Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbandes durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes über eine Klinge mit einem oder mehreren abrupten Kraftimpulsen (Hacken), sodass die Epithelzellschicht zur Basalmembran aufgespalten wird; b) Inkontaktbringen des die aufgespalteten Epithelzellenschicht aufweisenden Gewebeverbands mit einem die Basalmembran lösenden Agens, sodass sich die Epithelzellschicht von dem Gewebeverband ablöst; und c) Abtrennen der abgelösten Epithelzellschicht von dem die mindestens eine weitere Gewebeschicht enthaltenden Restgewebe des Gewebeverbandes.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Hacken des Gewebeverbandes wiederkehrend erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wiederholfrequenz des Hackens 2 bis 5 Hz beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Hacken des Gewebeverbandes über die Oberfläche des Gewebeverbandes verteilt erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Gewebeverband auf einer Trägerfläche aufliegt und die Trägerfläche senkrecht zu der von der Klinge ausgeübten Kraftimpulsrichtung verfahren wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei das die Basalmembran lösende Agens in Schritt b) Dispase, ein Dispaseähnliches Enzym und/oder eine Mischung davon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das Inkontaktbringen des Gewebeverbands mit dem die Basalmembran lösenden Agens in Schritt b) eine Inkubation des Gewebeverbands in dem Agens über einen Zeitraum von 3 bis 5 Stunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, weiter aufweisend den Schritt: d) Inkontaktbringen der abgetrennten Epithelzellschicht mit einem den Zellverband der Epithelzellschicht lösenden Agens, sodass sich vereinzelte Epithelzellen aus der Epithelzellschicht ablösen.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das den Zellverband der Epithelzellschicht lösende Agens in Schritt d) Trypsin, ein Trypsinähnliches Enzym und/oder eine Mischung davon ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Inkontaktbringen der Epithelzellenschicht mit dem den Zellverband lösenden Agens in Schritt d) eine Inkubation der Epithelzellschicht in dem Agens über einen Zeitraum von 4 bis 6 min ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, weiter aufweisend den Schritt: e) Inkontaktbringen der mindestens einen weiteren Gewebeschicht des Restgewebes mit einem den Zellverband lösenden Agens, sodass sich vereinzelte Gewebezellen der mindestens einen weiteren Gewebeschicht aus dem Restgewebe lösen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das den Zellverband der mindestens einen weiteren Gewebeschicht lösende Agens in Schritt e) Kollagenase, ein Kollagenase-ähnliches Enzym und/oder eine Mischung davon ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Inkontaktbringen der weiteren Gewebeschicht mit dem den Zellverband lösenden Agens in Schritt e) eine Inkubation der mindestens einen weiteren Gewebeschicht in dem Agens über einen Zeitraum von 1 bis 8 Stunden ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Gewebeverband ein Spendergewebe aus dem menschlichen oder tierischen Körper ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Gewebeverband Hautgewebe ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die erste Gewebeschicht eine Epidermisschicht ist und die zu isolierenden Epithelzellen Keratinozyten sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die weitere Gewebeschicht eine Dermisschicht ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zellen der mindestens einen weiteren Gewebeschicht Fibroblasten sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine messerschneidende Wirkung der Klinge vermieden wird.
Vorrichtung zum Zerstören der Integrität einer ersten Zellschicht in einem Gewebestück eines Gewebeverbandes durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes mit einem abrupten Kraftimpuls (Hacken), aufweisend: – eine an einer Basis (40) Kreuztisch-gelagerte Trägerfläche (10) zur Aufnahme des Gewebestücks mit erster horizontaler Verfahrachse (42) und dazu senkrechter zweiter horizontaler Verfahrachse (44); – eine an der Basis (40) schwenkbar gelagerter Klingenhebel (30) mit mindestens einer in einem an dem zur Trägerfläche (10) hin gewandten Ende angeordneten Klingenblock (25) aufgenommenen, durch Schwenken des Klingenhebels (30) auf die Trägerfläche (10) absenkbare Klinge (20); – mit dem Klingenhebel (30) in Kraftverbindung stehendes Antriebselement (35) zum abrupten Absenken der mindestens einen Klinge (20) auf ein auf der Trägerfläche (10) aufgenommenes Gewebestück, wobei ein Endanschlag vorgesehen ist, der das Absenken der Klinge (20) auf die Trägerfläche (10) begrenzt, sodass ein vollständiges Durchtrennen des auf der Trägerfläche (10) aufliegenden Gewebestücks vermieden wird.
Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Antriebselement (35) ein pneumatischer Antrieb, ein hydraulischer Antrieb, ein piezo-elektrischer Antrieb und/oder ein elektromagnetischer Antrieb, ist.
Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Klingenblock (25) mehrere Klingen (20) angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Klinge (20) senkrecht auf die Trägerfläche (10) absenkbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest an einer Stelle der die Klinge (20) über den Klingenhebel (30) mit dem Antriebselement (35) verbindenden Wirkmechanik ein Endanschlag vorgesehen ist, der die Absenkbewegung der Klinge (20) zur Trägerfläche (10) hin begrenzt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, weiter aufweisend: – Steuereinheit, die mit dem Antriebselement (35) und Effektoren der horizontalen Kreuztisch-Achsen (42, 44) in Verbindung steht, zur Steuerung der Verschiebung der Trägerfläche (10) entlang der Achsen (42, 44) in Koordination mit einer von der Klinge (20) über die Antriebseinheit (35) ausgeführte Hubbewegung auf die Trägerfläche (10).
Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit speziell ausgestaltet ist, dass nach jeder ausgeführten Hubbewegung der Klinge (20) die Trägerfläche (10) in zumindest einer der horizontalen Achsen (42, 44) schrittweise verschiebbar ist.
Anordnung zur automatischen Isolierung von Epithelzellen aus einem Gewebeverband, enthaltend die Komponenten: – Mittel zum Zerstören der Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbands durch Beaufschlagen des Gewebeverbands über eine Klinge mit einem abrupten Kraftimpuls (Hacken); – Mittel zum Inkontaktbringen des Gewebeverbands mit der aufgespalteten Epithelzellschicht mit einem die Basalmembran lösenden Agens; und – Mittel zum Abtrennen der abgelösten Epithelzellschicht von dem die mindestens eine weitere Gewebeschicht enthaltenden Restgewebe des Gewebeverbandes.
Anordnung nach Anspruch 28, wobei das Mittel zum Zerstören der Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbands die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 27 ist.
Anordnung nach Anspruch 28 oder 29, weiter enthaltend: – Mittel zum Abtrennen von Fettgewebe von dem Spendergewebe; – Mittel zum Resuspendieren der vereinzelten Zellen und zum Abtrennen der Zellen von gegebenenfalls vorliegenden Geweberesten.