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Technisches Feld der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung eines L-Ribozymes zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, eine pharmazeutische Zusammensetzung
enthaltend ein solches L-Ribozym sowie ein Verfahren zur Herstellung
einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung.
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Hintergrund der Erfindung
und Stand der Technik
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Aptamere
sind meist doppelsträngige D-Nukleinsäuren, welche
spezifisch an ein beliebiges Targetmolekül binden, analog
einer Antikörper/Antigen-Reaktion (Ellington, A.
D. et al., Nature 346: 818–822 (1990)). Für
ein vorgegebenes Targetmolekül spezifische Aptamere werden
beispielsweise durch das SELEX-Verfahren aus Nukleinsäurebibliotheken
isoliert (Tuerk, C. et al., Science 249: 505–510 (1990)).
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Aptamere
haben im therapeutischen Bereich den Zweck, u. a. unerwünschte
Stoffwechselprodukte zu binden und dadurch zu inhibieren. Lediglich
beispielsweise seien hierfür onkogene Genprodukte genannt.
Bei der therapeutischen Anwendung von Aptameren nachteilig ist,
dass diese eine unvorteilhafte Pharmakokinetik aufweisen, i. e.
sehr schnell abgebaut werden, beispielsweise durch endogene Nukleasen.
Unabhängig hiervon sind Aptamere ohnehin relativ kleine
Moleküle, welche daher vergleichsweise schnell über
die Niere ausgeschieden werden.
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Spiegelmere
sind im Kern Aptamere, unterscheiden sich davon jedoch dadurch,
dass sie aus L-Nukleotiden gebildet werden. Spiegelmere können einzel-
oder doppelstängig sein. Durch den Einsatz der L-Nukleotiden
wird ein Abbau durch endogene Nukleasen verhindert und so die Pharmakokinetik
erheblich verbessert, i. e. die Verweilzeit im Serum verlängert.
So ist in der Literaturstelle Boisgard, R et al., Eur Journal
of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 32: 470–477 (2005) beschrieben,
dass nicht-funktionelle Spiegelmere metabolisch auch über
einen Zeitraum von 2 Stunden völlig stabil sind. In dieser
Literaturstelle ist auch der diagnostische Einsatz von Spiegelmeren
beschrieben, wobei das Spiegelmer mit einer beispielsweise radioaktiven
Reportersubstanz gekoppelt ist.
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Die
Identifizierung von für ein vorgegebenes Targetmolekül
spezifischen Spiegelmeren kann beispielsweise wie in der Literaturstelle Klussmann,
S. et al., Nat Biotechnol 14: 1112–1115 (1996) beschrieben
erfolgen. Zu den Spiegelmeren und deren therapeutische Anwendungsmöglichkeiten
wird auch auf die Literaturstelle Vater, A. et al., Curr
Opin Drug Discov Devel 6: 253–261 (2003) verwiesen.
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In
der therapeutischen Anwendung von Spiegelmeren ist bislang davon
ausgegangen worden, dass Spiegelmere nicht immunogen sind (Wlotzka
et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 8898–8902 (2002)).
Allerdings zeigen Untersuchungen, die in der vorliegenden Beschreibung
präsentiert werden, dass L-Nukleinsäuren in einem
Organismus durchaus nicht notwendigerweise nebenwirkungsfrei sind.
Hieraus folgt, dass bei dem Einsatz von Spiegelmeren durchaus ein
nicht vernachlässigbares Risiko einer unerwünschten
physiologischen Nebenreaktion, beispielsweise einer Immunreaktion und/oder
einer unerwünschten enzymatischen Reaktion mit endogener
RNA (einschließlich einer regulatorischen RNA), bei Verabreichung
an einen Patienten besteht. Insbesondere im Lichte der in der klinischen
Phase 1 gemachten negativen Erfahrungen mit dem monoklonalen Antikörper
TGN1412 und vor dem Hintergrund, dass die Verweilzeit von Spiegelmeren
aufgrund der vorstehend genannten Zusammenhänge vergleichsweise
sehr hoch ist, wäre es wünschenswert, ein Antidot
für ein einzusetzendes Spiegelmer bei der Gabe des Spiegelmers
bereit zu halten, damit bei Auftreten einer unerwünschten
physiologischen Nebenreaktion unverzüglich das Antidot verabreicht
und so der Spiegelmer-Pegel im Serum kurzfristig gesenkt werden
kann.
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Aus
anderen Zusammenhängen, nämlich der Ribozym-katalysierten
stereoselektiven Diels-Alder Reaktion sind L-Ribozyme bekannt, wozu
auf die Literaturstellen Seelig, B. et al., Angew. Chem.
Int., 39: 4576–4579 (2000) und Seelig,
B. et al., Angew. Chem. 112: 4764–4768 (2000) verwiesen
wird.
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Technisches Problem der Erfindung.
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Der
Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, ein Antidot
für therapeutisch eingesetzte Spiegelmere anzugeben.
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Grundzüge der Erfindung
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Zur
Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung
die Verwendung eines L-Ribozymes zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, wobei das L-Ribozym zur Spaltung einer L-RNA im
Bereich einer Targetsequenz der L-RNA befähigt ist, und
zwar insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur
Behandlung von unerwünschten physiologischen Nebenreaktionen,
insbesondere Immunreaktionen und/oder unerwünschten enzymatischen
Reaktionen der L-RNA mit endogener RNA (einschließlich
einer regulatorischen RNA), aufgrund der Gabe eines therapeutischen
Moleküls enthaltend die L-RNA.
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Die
Erfindung beruht zunächst auf der überraschenden
Erkenntnis, dass Spiegelmere entgegen bisheriger Vermutungen nicht
notwendigerweise frei von Nebenreaktionen sind, sondern vielmehr
in der Lage sein können, natürlicherweise in einem
Organismus vorkommende Nukleinsäuren zu schneiden und so
unvorhersehbare Nebenwirkungen zu erzeugen. Die Erfindung beruht
auf dieser Erkenntnis aufbauend auf der technischen Lehre, L-Ribozyme
zur Verfügung zu stellen, welche spezifisch ein verabreichtes
Spiegelmer schneiden und so deren physiologische Wirksamkeit, insbesondere
in Hinblick auf unerwünschte Nebenreaktionen, zu zerstören.
Durch die Gabe eines solchen Ribozymes in Verfolg der Beobachtung
einer unerwünschten Nebenreaktion bei Gabe eines Spiegelmeres
kann folglich die Ursache der unerwünschten Nebenreaktion
aus dem Stoffwechsel schnell, effektiv und hochselektiv entfernt werden,
und zwar bei wiederum extrem niedrigen Risiko von Nebenwirkungen
der Gabe des L-Ribozymes. Letzteres beruht nicht nur auf dem Aufbau
des L-Ribozymes aus L-Nukleotiden, sondern zusätzlich auf
der hohen Selektivität des L-Ribozymes, nämlich gerichtet
auf die Targetsequenz des Spiegelmeres. Im Ergebnis wird ein hochwirksames
und hochselektives Antidot gegen ein therapeutisch eingesetztes Spiegelmer
erhalten und unerwünschten Nebenreaktionen des Spiegelmeres
kann effektiv, schnell und nebenwirkungsfrei begegnet werden.
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Grundsätzlich
kann gegen jedes RNA Molekül, sei es aus D- oder L-Nukleotiden
aufgebaut, ein spezifisches Ribozym konstruiert werden, welches eine
Targetsequenz des RNA Moleküls schneidet und diese so spaltet.
Eine wesentliche Eigenschaft eines Ribozymes ist also die sequenzspezifische Bindung
des Ribozymes an die Targetsequenz. Dies bedeutet aber auch, dass
für jede beliebige Targetsequenz eine Teilsequenz eines
Ribozymes dadurch erstellt werden kann, dass die Teilsequenz des
Ribozymes, enthaltend die Spaltungsstelle, mit der Targetsequenz
hybridisiert. Daher ist es im Rahmen der Erfindung nicht zweckmäßig
nur bestimmte Ribozym-Teilsequenzen in Bezug auf bestimmte Targetsequenzen
strukturell anzugeben. Die in den Beispielen angegebenen Targetsequenzen
und Ribozym-Teilsequenzen sind daher lediglich beispielhaft und
der Fachmann kann ohne weiteres für jede vorgegeben Targetsequenz
eines Spiegelmeres die passende, nämlich hybridisierende
Ribozym-Teilsequenz bestimmen und das Ribozym auf der Basis der Informationen
zur Ribozym-Teilsequenz mit fachüblichen Mitteln synthetisieren.
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Grundsätzlich
kann das therapeutische Molekül ein Spiegelmer sein, oder
die L-RNA kann mit einem Aptamer covalent gebunden sein. Der letztere Fall
kann beispielsweise im Falle eines gegen Nukleasen stabilisierten
Aptamers vorliegen. Dann liegt der therapeutische Nutzen der Erfindung
darin, dass durch das Schneiden der L-RNA das Aptamer für
Nukleasen zugänglich gemacht wird, wodurch dann letztendlich
die auch ein eventuell Nebenwirkungen verursachendes Aptamer aus
dem Serum vergleichsweise kurzfristig eliminiert werden kann.
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Vorzugsweise
ist das L-Ribozym ein Hammerhead Ribozym. Hammerhead Ribozyme weisen eine
konservierte Region u. a. mit einem Triplett GUH (H ist kein Guanin,
vorzugsweise C) auf. Hierzu wird auf die 1 verwiesen.
Hierin sind die Nukleotide N' und N beliebige Basen, welche im Bereich
der Stems I und III nach Maßgabe der Targetsequenz ausgewählt
werden. Im Kern geht man bei der Konstruktion eines L-Ribozymes
gegen eine Targetsequenz so vor, dass man zunächst eine
Targetsequenz, beispielsweise eines Spiegelmers, vorgibt, wobei
diese Targetsequenz das Triplet GUH enthalten muss. Dann werden
an beiden Enden eines Tripletts GUH typischerweise jeweils 4–10,
insbesondere 6–8 Nukleotide angefügt, deren Sequenzen
den Sequenzen der Targetsequenz entspricht. Man erhält
also eine 11 bis 23 Nukleotide enthaltende Kopie der Targetsequenz
enthaltend das Triplett GUH. Zwischen den beiden Enden der Kopie
wird dann die katalytische Hammerhead-Sequenz, wie in der 1 ersichtlich, eingefügt. Ein
Beispiel für eine geeignete katalytische Hammerhead-Sequenz
ist folglich:
5'-CUGANGAGN'CN'NNNNNGNCGAAAC-3' (N = beliebige
Basen, wobei in 1 sich gegenüberstehende
N und N' zwingend gleiche oder verschiedene Basenpaare bilden)
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Hieran
schließen sich am 3'-Ende Nukleotide in der Sequenz komplementär
zur Targetsequenz 5'-seitig des Tripletts GUH und am 5'-Ende Nukleotide
in der Sequenz entsprechend der Targetsequenz 3'-seitig des Tripletts GUH
an.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform lautet die katalytisch
Hammerhead Sequenz
5'-CUGANGAGNUCGGAAACGACGAAAC-3' (N = beliebige
Basen, wobei in 1 sich gegenüberstehende
N und N' zwingend gleiche oder verschiedene Basenpaare bilden)
auf.
Zusätzlich kann am 5'-Ende der katalytischen Hammerhead-Sequenz
die Sequenz
3'-(N)4-6GGUAUAGAGUGCUGAAUCC-5'
eingerichtet
sein, wodurch ein Hammerhead Ribozym erhalten wird, welches eine
vergleichsweise geringe Mg-Ionen Konzentration benötigt.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung enthält das L-Ribozym in
zumindest der Dosis, welche der Dosis der Gabe der L-RNA entspricht,
vorzugsweise in einer Dosis enthält, welche dem 2- bis 10-fachen,
bezogen auf die Molekülanzahl bzw. Mole, der Dosis der
Gabe der L-RNA entspricht. Eine Überdosierung, im Vergleich
zur Dosis der L-RNA, wird sich empfehlen, um sicher zu gehen, dass
alle zu eliminierende L-RNA abreagiert wird. Die erfindungsgemäß vorgesehenen
absoluten Dosen werden sich dabei streng in den angegebenen relativen Mengenverhältnissen
an den vorgegebenen Dosen der L-RNA richten und können
daher vom Fachmann in Kenntnis der vorgegebenen Dosen für
die L-RNA leicht bestimmt und eingerichtet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält
die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich eine Nukleinsäure,
insbesondere ein 5- bis 20-mer, welches zur Aufschmelzung einer doppelsträngigen
L-RNA im Bereich derer Targetsequenz befähigt ist. Hierbei
handelt es sich um Sequenzen, welche mit Teilsequenzen die der Targetsequenz
benachbart sind, hybridisieren. Dadurch wird erreicht, dass GUC-Regionen
der L-RNA, die normalerweise aus sterischen Gründen nicht
zugänglich sind aufgrund der Tertiärstruktur der
L-RNA, für das L-Ribozym zugänglich gemacht werden.
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Des
Weiteren betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung
enthaltend ein L-Ribozym zur Behandlung von unerwünschten
physiologischen Nebenreaktionen, insbesondere Immunreaktionen, aufgrund
der Gabe eines therapeutischen Moleküls enthaltend die
L-RNA.
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Bezüglich
der pharmazeutischen Zusammensetzung gelten alle vorstehenden und
nachfolgenden Ausführungen analog.
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Schließlich
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer solchen
pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei eine Sequenz aus L-Nukleotiden
erstellt und synthetisiert wird, welche zur Spaltung einer vorgegebenen
Sequenz aus L-Ribonukleotiden, insbesondere enthaltend das Triplett GUC
mit ansonsten beliebigen 5'- und 3'-seitig des Tripletts angefügten
Sequenzen, befähigt ist, und wobei das L-Ribozym in pharmakologisch
wirksamer Dosis zur Darreichung hergerichtet wird. Dabei wird das
L-Ribozym typischerweise mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen
gemischt.
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Grundsätzlich
können ein oder mehrere physiologisch verträgliche
Hilfstoffe und/oder Trägerstoffe mit dem L-Ribozym gemischt
und die Mischung galenisch zur lokalen oder systemischen Gabe, insbesondere
oral, parenteral, zur Infusion bzw. Infundierung in ein Zielorgan,
zur Injektion (z. B. i. v., i. m., intrakapsulär oder intralumbal),
zur Applikation in Zahntaschen (Raum zwischen Zahnwurzel und Zahnfleisch)
und/oder zur Inhalation hergerichtet ist. Die Auswahl der Zusatz-
und/oder Hilfsstoffe wird von der gewählten Darreichungsform
abhängen. Die galenische Herrichtung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung kann dabei in fachüblicher Weise erfolgen.
Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise
Mg++, Mn++, Ca++, CaCl+, Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium, bzw. Cl–, Br–,
Acetat, Trifluoracetat, Propionat, Laktat, Oxalat, Malonat, Maleinat,
Citrat, Benzoat, Salicylat, Putrecin, Cadaverin, Spermidin, Spermin, usw.
in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen
sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-)Kapseln, Suppositorien,
Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder.
Lösungen zur Injektion (i. v., i. p., i. m., s. c.) oder
Vernebelung (Aerosole), Zubereitungsformen zur Trockenpulverinhalation,
transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe,
bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe,
Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel,
Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler,
Verwendung finden. Auch ist es möglich, den Wirkstoff in
vorzugsweise biologisch abbaubaren Nanokapseln zu verkapseln, beispielsweise
zur Herstellung einer Zubereitung zur Inhalation. Als Hilfsstoffe seien
beispielsweise Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und
andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke,
Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle
wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglykole
und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder
mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendete
Substanzkombination in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch
geeigneten und physiologisch verträglichen Träger
und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit
definierter Dosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform
hergerichtet ist. Als Verdünnungsmittel kommen Polyglykole,
Wasser und Pufferlösungen in Frage. Geeignete Puffersubstanzen
sind beispielsweise N,N'-Dibenzylethylendiamin, Diethanolamin, Ethylendiamin,
N-Methylglucamin, N-Benzylphenethylamin, Diethylamin, Phosphat,
Natriumbicarbonat, oder Natriumcarbonat. Es kann aber auch ohne
Verdünnungsmittel gearbeitet werden. Physiologisch verträgliche
Salze sind Salze mit anorganischen oder organischen Säuren,
wie z. B. Milchsäure, Salzsäure, Schwefelsäure,
Essigsäure, Citronensäure, p-Toluolsulfonsäure,
oder mit anorganischen oder organischen Basen, wie z. B. NaOH, KOH,
Mg(OH)2, Diethanolamin, Ethylendiamin, oder
mit Aminosäuren, wie Arginin, Lysin, Glutaminsäure
usw. oder mit anorganischen Salzen, wie CaCl2,
NaCl oder deren freie Ionen, wie Ca2+, Na+, Cl–,
SO4 2– bzw.
entsprechende Salze und freien Ionen des Mg++ oder
Mn++, oder Kombinationen hieraus. Sie werden
nach Standardmethoden hergestellt. Vorzugsweise wird ein pH-Wert
im Bereich zwischen 5 und 9, insbesondere zwischen 6 und 8, eingestellt.
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Von
selbstständiger Bedeutung ist eine Variante der Erfindung,
welche die Verwendung eines L-Ribozymes zur Herstellung einer pharmazeutsichen
Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen,
welche mit einer Überexpression zumindest eines endogenen
Genes einhergehen, wobei das L-Ribozym zur Spaltung einer Targetsequenz
einer für das Gen codierenden endogenen Target-D-RNA befähigt
ist, umfasst. Ansonsten gelten die vorstehenden Ausführungen
analog.
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In
dieser Variante wird genutzt, dass L-Ribozyme auch zur Spaltung
von D-RNA, insbesondere mRNA oder regulatorischer RNA, eingesetzt
werden können. Dadurch können Gene bzw. hierdurch
codierte Proteine inhibiert werden. Dies ist von therapeutischem
Nutzen für alle Erkrankungen, die mit der Überexpression
bestimmter Gene, verglichen mit der Expression des nicht erkrankten
Organismus, einhergehen.
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Diese
Variante hat zum einen den Vorteil, dass die Spaltung der Targetsequenz
mit sehr hoher Spezifität erfolgt und somit auch keine
sonstige Interferenz mit dem regulatorischen System erfolgt. Zudem
werden Nebenwirkungen, wie sie beispielsweise mit dem Einsatz inhibitorischer
D-Nukleinsäuren, wie siRNA, einhergehen, sicher vermieden
werden.
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Im
folgenden wird die Erfindung anhand von Figuren und Beispielen näher
erläutert.
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Es
zeigen:
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1: ein Minimal-Hammerhead-Ribozym vor
(a) und nach Bindung an eine Targetsequenz (b),
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2:
eine vergleichende Analyse der MgCl2-Konzentrationsabhängigkeit
der Reaktion von L-Target mit D-Ribozym einerseits und von R-Target mit
L-Ribozym andererseits,
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3:
eine vergleichende Analyse der Zeitabhängigkeit der Reaktion
von L-Target mit D-Ribozym einerseits und von D-Target mit L-Ribozym
andererseits bei 10 mM MgCl2,
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4:
eine vergleichende Analyse der MgCl2-Konzentrationsabhängigkeit
(1–25 mM) der Reaktion von L-Target mit L-Ribozym einerseits
und von D-Target mit D-Ribozym andererseits bei 10-fachem L-Ribozym-Überschuss,
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5:
eine vergleichende Analyse der MgCl2-Konzentrationsabhängigkeit
(0,1–1 mM) der Reaktion von L-Target mit L-Ribozym einerseits
und von D-Target mit D-Ribozym andererseits bei 10-fachem L-Ribozym-Überschuss,
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6:
eine vergleichende Analyse der Zeitabhängigkeit der Reaktion
von L-Target mit L-Ribozym einerseits und von D-Target mit D-Ribozym
andererseits bei 10 mM MgCl2 und bei 10-fachem
L-Ribozym-Überschuss,
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7:
eine vergleichende Analyse der Zeitabhängigkeit der Reaktion
von L-Target mit L-Ribozym einerseits und von D-Target mit D-Ribozym
andererseits bei 0,1 mM MgCl2 und bei 10-fachem
L-Ribozym-Überschuss,
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8:
eine vergleichende Analyse der Zeitabhängigkeit der Reaktion
von L-Target mit L-Ribozym einerseits und von D-Target mit D-Ribozym
andererseits bei 1 mM MgCl2 und bei 1-fachem
L-Ribozym-Überschuss,
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9:
eine vergleichende Analyse der Zeitabhängigkeit der Reaktion
von L-Target mit L-Ribozym einerseits und von D-Target mit D-Ribozym
andererseits bei 0,1 mM MgCl2 und bei 10-fachem
L-Ribozym-Unterschuss,
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10:
eine vergleichende Analyse der Zeitabhängigkeit der Reaktion
von L-Target mit L-Ribozym einerseits und von D-Target mit D-Ribozym
andererseits bei 1 mM MgCl2 und bei 10-fachem
L-Ribozym-Unterschuss,
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11:
eine vergleichende Analyse der Zeitabhängigkeit der Reaktion
von L-Target mit L-Ribozym einerseits und von D-Target mit D-Ribozym
andererseits bei 5 mM MgCl2 und bei 10-fachem
L-Ribozym-Unterschuss, und
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12:
Versuche zur Spaltung von L-Target durch L-Ribozym in humanem Serum.
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Beispiel 1: Cleavage assay
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Die
Aktivitäten von L-Ribozymen und D-Ribozymen wurden unter
verschiedenen Bedingungen gemessen. Die Basisbedingungen waren wie
folgt. 0,02 μM Target RNA wurden mit 10 μl Reaktionsmischung
in der Gegenwart von 0,002 μM, 0,02 μM und 2 μM
Ribozym in 50 mM Tris-HCL Puffer, pH 7,5, bei 20°C für
2 Stunden inkubiert (Verhältnis Ribozyme/Target folglich
10:1, 1:1 und 1:10). Vor der Reaktion wurden Target RNA und Ribozym
für 2 Minuten bei 70°C denaturiert und langsam
(1°C/min.) in dem Heizblock auf 25°C abgekühlt.
Es wurde der Einfluss der Mg2+-Ionen in
Konzentration von 0,1 bis 25 mM untersucht. Spaltprodukte wurden
auf 20% Polyacrylamid Gelelektrophorese in der Gegenwart von 8 M Harnstoff
in 0,09 M Tris-Borat Puffer, pH 8,3, getrennt. Die Analyse der Fluoreszenz
erfolgte auf Phosphoimager Fuji Film FLA 5100. Die Daten wurden
mit dem Programm Fuji Analysis Program erhalten. Diagramme wurden
mit Excel erstellt.
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Beispiel 2: Herstellung der Targetsequenzen
und der Ribozyme
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Als
Targetsequenzen wurden im Wege der Auftragssynthese durch die Firma
ChemGenes Corporation, Wilmington, USA, hergestellt:
Seq.-ID
1: 5'-FAM-ACAGUCGGUCGCC-3'
(RNA, sowohl mit D-Nukleotiden,
als auch mit L-Nukleotiden) und
Seq.-ID 2: 5'-FAM-ACAGTCGGTCGCC-3'
(DNA,
sowohl mit D-Nukleotiden, als auch mit L-Nukleotiden).
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Die
Syntheseprodukte hatten eine Reinheit von mehr als 90%
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Als
Ribozymsequenzen wurden nach Maßgabe der Targetsequenzen
die variablen Bereiche eines Hammerhead Ribozyms um das Triplett
GUC ausgewählt und die folgenden Ribozymesequenzen durch
die Firma ChemGenes Corporation, Wilmington, USA, hergestellt:
Seq.-ID
3: 5'-FAM-GGCGACCCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACUGU-3' (RNA, sowohl mit
D-Nukleotiden, als auch mit L-Nukleotiden)
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Die
Syntheseprodukte hatten eine Reinheit von über 85%.
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Alle
Syntheseprodukte waren am 5'-Ende mit Fluoreszein markiert.
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Beispiel 3: Wechselwirkungen von L-Nukleinsäuren mit
D-Nukleinsäuren
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In
der 2 ist die Konzentrationsabhängigkeit
der Spaltung eines D-Targets durch ein L-Ribozym sowie umgekehrt
dargestellt. C ist die Kontrolle (L-Target + L-Ribozym), die Spuren
1 bis 5 sind die verschiedenen in dem Diagramm angegebenen MgCl2 Konzentrationen (0–25 mM) für
Target ohne Ribozym, die Spuren 6 bis 9 0,2 μM Target mit
2 μM Ribozym.
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Man
erkennt, dass D-Ribozym zwar nicht L-Target schneidet, aber umgekehrt
durchaus ein beträchtlicher Umsatz stattfindet. Dies bedeutet,
dass beispielsweise Spiegelmere, bestehend aus L-Nukleotiden, neben
Ihrer Wirkung als für eine bestimmte 3-D-Struktur spezifisches
Aptamer, entgegen bisherigen Auffassung durchaus in der Lage sein
könnten weitere physiologische Wechselwirkungen auszuüben,
beispielsweise als Ribozym.
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Hieraus
folgt, dass Spiegelmere die Gefahr einer unerwünschten
Nebenwirkung bei Verabreichung an einen Organismus aufweisen.
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Hieraus
folgt aber auch, dass L-Ribozyme zur Spaltung von endogener D-RNA
eingesetzt werden können, wodurch dann eine therapeutisch
angestrebte Inhibierung des durch die D-RNA, beispielsweise mRNA,
codierten Genes bzw. Proteins erfolgt.
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Die 3 zeigt,
dass der Anteil an Spaltprodukten des D-Targets durch ein L-Ribozym
mit der Zeit anwächst und sich stets signifikant oberhalb
des Anteils an Spaltprodukten des L-Targets beläuft (Spur
C: Kontrolle, wie vorstehend, Spuren 1 bis 10 Zeiten 0 bis 256 min.
des Diagramms).
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Beispiel 4: Spaltung eines L-Targets durch
L-Ribozyme
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Den
Darstellungen der 4 bis 11 ist zu
entnehmen, dass ein L-Ribozym ein L-Target mit entsprechender Targetsequenz
unter allen üblichen Bedingungen effektiv schneidet und
zwar mit Umsatzraten, die jenen eines D-Ribozymes mit einem D-Target
zumindest entsprechen.
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Die 12 belegt,
dass die Spaltung eines L-Targets durch ein L-Ribozym auch unter
den Bedingungen des humanen Serums effektiv funktioniert.
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Ellington,
A. D. et al., Nature 346: 818–822 (1990) [0002]
- - Tuerk, C. et al., Science 249: 505–510 (1990 [0002]
- - Boisgard, R et al., Eur Journal of Nuclear Medicine and Molecular
Imaging 32: 470–477 (2005) [0004]
- - Klussmann, S. et al., Nat Biotechnol 14: 1112–1115
(1996) [0005]
- - Vater, A. et al., Curr Opin Drug Discov Devel 6: 253–261
(2003) [0005]
- - Wlotzka et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 8898–8902
(2002) [0006]
- - Seelig, B. et al., Angew. Chem. Int., 39: 4576–4579
(2000) [0007]
- - Seelig, B. et al., Angew. Chem. 112: 4764–4768 (2000) [0007]