DE102008061866B4 - Use of ionic liquids - Google Patents

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Abstract

Verwendung von ionischen Flüssigkeiten zur Erhöhung der Halbwertzeit der Kofaktoren NADPH und NADH.Use of ionic liquids to increase the half-life of the cofactors NADPH and NADH.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von ionischen Flüssigkeiten nach Anspruch 1.The invention relates to the use of ionic liquids according to claim 1.

Die Bedeutung von biotechnologischen Methoden für die Produktion von Chemikalien nimmt stetig zu. Man kann davon ausgehen, dass in naher Zukunft insbesondere im Bereich der Feinchemikalien und Pharmaka ein erheblicher Anteil der Wertschöpfung durch Methoden der so genannten – weißen Biotechnologie – ermöglicht wird. Die Produkte sind dabei Stoffwechselprodukte der Zellen einerseits, als auch nicht natürliche Produkte anderseits. Für letztere sind Verfahren mit isolierten und/oder partiell aufgereinigten Enzymen als Katalysatoren von besonderer Bedeutung. Dafür gibt es eine Reihe von Gründen. Enzyme können durch molekularbiologische Methoden für nicht natürliche Substrate angepasst werden, was die Verwendung im lebenden System unmöglich macht. Weiterhin können die Substrate oder Produkte toxisch wirken oder im lebenden System unerwünschten Parallel- oder Folgereaktionen unterliegen. Die Aufhebung der Beschränkung auf wässrige Lösemittelsysteme, die für lebende Organismen essentiell ist, und die Verwendung von Mehrphasensystemen, sind weitere Motivation für die Verwendung von isolierten Enzymen.The importance of biotechnological methods for the production of chemicals is steadily increasing. It can be assumed that in the near future, especially in the field of fine chemicals and pharmaceuticals, a significant share of value added will be made possible by methods known as "white biotechnology". The products are thereby metabolic products of the cells on the one hand, as well as non-natural products on the other. For the latter, processes with isolated and / or partially purified enzymes are of particular importance as catalysts. There are a number of reasons for this. Enzymes can be adapted by molecular biological methods for non-natural substrates, making their use in the living system impossible. Furthermore, the substrates or products may be toxic or subject to unwanted parallel or sequential reactions in the living system. The removal of the restriction to aqueous solvent systems, which is essential for living organisms, and the use of multiphase systems are further motivation for the use of isolated enzymes.

Enzyme sind für ihre katalytische Aktivität von bestimmten Kofaktoren abhängig. Dies ist eine relativ geringe Anzahl von organischen Molekülen mit spezifischen Aufgaben und Metallionen. Die Kofaktoren liegen im Komplexgleichwicht mit dem Enzym. Die Gleichgewichtslage kann unterschiedlich stark auf Seiten der gebunden bzw. ungebundenen Form liegen und die Austauschgeschwindigkeit kann in weiten Grenzen variieren. Die Extreme reichen von fest gebundenen Kofaktoren deren Freisetzung die Zerstörung des Enzyms erfordert bis zu lose gebundenen Kofaktoren mit hoher Austauschrate.Enzymes depend on certain cofactors for their catalytic activity. This is a relatively small number of organic molecules with specific tasks and metal ions. The cofactors are in complex equilibrium with the enzyme. The equilibrium position can vary greatly on the side of the bound or unbound form and the exchange rate can vary within wide limits. The extremes range from tightly bound cofactors whose release requires the destruction of the enzyme to loosely bound cofactors with high exchange rates.

Für die Reduktion von Doppelbindungen mit Hydridequivalenten sind die Kofaktoren auf Basis von Nikotinamidadenosindinucleotid von besonderer Bedeutung. Die überwiegende Mehrzahl der industriell relevanten enzymatischen Reduktionen und Oxidationen beruht auf deren Verwendung. Die beiden Varianten unterscheiden sich in einer phosphorylierten Position am Adenosinrest. Die redoxaktive Position ist der Pyridinring des Nikotinamids, der durch Enzymkatalyse regioselektiv durch Hydridübertragung zu 1,4-Diydropyridin reduziert wird. Diese Reaktion ist reversibel und kann zur Reduktion verwendet werden. Die oxidierten Formen werden üblicherweise mit NAD+ bzw. NADP+ (phosphorylierte Form) bezeichnet, die reduzierten Formen werden mit NADH und NADPH abgekürzt.For the reduction of double bonds with hydride equivalents, the cofactors based on nicotinamide adenosine dinucleotide are of particular importance. The vast majority of industrially relevant enzymatic reductions and oxidations are based on their use. The two variants differ in a phosphorylated position on the adenosine residue. The redox-active site is the pyridine ring of nicotinamide, which is regioselectively reduced by enzyme catalysis by hydride transfer to 1,4-dihydropyridine. This reaction is reversible and can be used for reduction. The oxidized forms are usually designated NAD + or NADP + (phosphorylated form), the reduced forms are abbreviated NADH and NADPH.

Hauptsächlich aufgrund der hohen Kosten, insbesondere der reduzierten Kofaktoren und inhibierender Effekte auf die enzymatische Katalyse, werden NAD+ und NADP+ bzw. NADH und NADPH für die Synthese nicht stöchiometrisch für Oxidation und Reduktion eingesetzt. Ein wichtiges Beispiel für den stöchiometrischen Einsatz sind Sensoren und Schnelltests z. B. für Glucosegehalt in Serum. Für die Synthese werden in aller Regel substöchiometrische Mengen als Redoxmediator verwendet. Die Regeneration kann dabei mit einem Enzym oder mit multiplen Enzymen stattfinden. Wichtige Beispiele für die industrielle Anwendung dieses Prinzips sind die Reduktion von Ketonen (Ox1) zu enantiomerenangereicherten bzw. enantiomerenreinen Alkoholen (Red1) unter Verwendung eines zweiten Redoxpaars (Red2/Ox2). Die Oxidation wird beispielsweise für die oxidative kinetische Racematspaltung von Alkoholen angewandt.Mainly due to the high costs, in particular the reduced cofactors and inhibiting effects on the enzymatic catalysis, NAD + and NADP + or NADH and NADPH are not used stoichiometrically for the oxidation and reduction. An important example of the stoichiometric use are sensors and rapid tests z. For glucose content in serum. Sub-stoichiometric amounts are usually used as the redox mediator for the synthesis. The regeneration can take place with one enzyme or with multiple enzymes. Important examples of the industrial application of this principle are the reduction of ketones (Ox1) to enantiomerically enriched or enantiomerically pure alcohols (Red1) using a second redox pair (Red2 / Ox2). The oxidation is used, for example, for the oxidative kinetic resolution of alcohols.

Als Redoxpaar (Red2/Ox2) bzw. als Reduktionsmittel sind entweder dabei Stoffe im Einsatz, die vom gleichen Enzym umgesetzt werden, das die eigentliche Umsetzung katalysiert (substratgekoppelt) oder es kommt ein weiteres Enzym zur Regeneration mit einem geeigneten Redoxpaar zum Einsatz (enzymgekoppelt). Die wichtigsten Beispiele für die substratgekoppelte Variante sind der Einsatz von niedermolekularen Alkoholen, wie 2-Propanol, Ethanol, Methanol u. s. w. Als die wichtigsten Enzymsysteme (Redoxpaare) sind zu nennen die Formiatdehydrogenase (Ameisensäure/Kohlendioxid), Glucosedehydrogenase (Glucose/Glukonsäure) und Äpfelsäuredehydrogenase (Äpfelsäure/Pyruvat).Substances which are reacted by the same enzyme which catalyzes the actual reaction (substrate-coupled) or a further enzyme for regeneration with a suitable redox pair are used as redox couple (Red2 / Ox2) or as reducing agent. (Enzyme-linked) , The most important examples of the substrate-coupled variant are the use of low molecular weight alcohols, such as 2-propanol, ethanol, methanol, and the like. s. w. The most important enzyme systems (redox couples) are the formate dehydrogenase (formic acid / carbon dioxide), glucose dehydrogenase (glucose / gluconic acid) and malic acid dehydrogenase (malic acid / pyruvate).

Andere Verfahren, wie der Einsatz von Hydrogenasen scheitern bislang an der Verfügbarkeit der Enzyme und der Stabilität der Kofaktoren unter den Reaktionsbedingungen [Chenault, H. K.; Whitesides, George M.: Regeneration of nicotinamide cofactors for use in organic synthesis. In: Applied Microbiology and Biotechnology 14 (1987), 10 S. 147–197; Mertens, Rita; Greiner, Lasse; Ban, Eyke C. D. van den; Hacker, Huub B. C. M.; Liese, Andreas: Practical applications of hydrogenase I from Pyrococcus furiosus for NADPH generation and regeneration. In: Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 24–25 (2003), S. 39–52.] Für den industriellen Einsatz ist aufgrund der hohen Kosten der Kofaktoren das molare Verhältnis von erhaltenem Produkt zu eingesetzter Kofaktormenge ein entscheidender Faktor für die Wirtschaftlichkeit eines Verfahrens. Diese Zahl ist die Zyklenzahl (engl. total turnover number TTN) der durchlaufenen Redoxzyklen. Die niedrige Stabilität der Kofaktoren unter relevanten Synthesebedingungen ist problematisch, da diese die maximale Zyklenzahl begrenzt. Die theoretisch erreichbare TTN ist reziprok proportional zur Zerfallsgeschwindigkeit.Other methods, such as the use of hydrogenases, have so far failed due to the availability of enzymes and the stability of the cofactors under the reaction conditions [Chenault, HK; Whitesides, George M .: Regeneration of nicotinamide cofactors for use in organic synthesis. In: Applied Microbiology and Biotechnology 14 (1987), 10 pp. 147-197; Mertens, Rita; Greiner, Lasse; Ban, Eyke CD van den; Hackers, Huub BCM; Liese, Andreas: Practical applications of hydrogenase I from Pyrococcus furiosus for NADPH generation and regeneration. In: Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 24-25 (2003), p. 39-52.] For industrial use, the molar ratio of product obtained to the amount of cofactor used is a decisive factor for the economic efficiency of a cofactor due to the high cost of the cofactors process. This number is the number of cycles (TTN) of the redox cycles undergone. The low stability the cofactors under relevant synthesis conditions is problematic because it limits the maximum number of cycles. The theoretically achievable TTN is reciprocally proportional to the decay rate.

Der Zerfall der Kofaktoren ist ein länger bekanntes Phänomen. Die makrokinetischen Randbedingungen sind bekannt. So ist eine starke Abhängigkeit vom pH-Wert der wässrigen Lösung beschrieben, die für die reduzierte und oxidierte Form gegenläufige Trends aufzeigen (2 nach Chenault, H. K.; Whitesides, George M.: Regeneration of nicotinamide cofactors for use in organic synthesis. In: Applied Microbiology and Biotechnology 14 (1987), 10 S. 147–197 und Greiner, Lasse: Prozessentwicklung für die katalytische Reduktion mit molekularem Wasserstoff, UniBonn, Diss, 2002). Weiterhin zeigt sich, dass vor allem die Stabilität der reduzierten phosphorylierten Form NADPH oft limitierend ist.The decay of cofactors is a well-known phenomenon. The macrokinetic boundary conditions are known. Thus, a strong dependence on the pH of the aqueous solution is described, which shows opposite trends for the reduced and oxidized form ( 2 to Chenault, HK; Whitesides, George M .: Regeneration of nicotinamide cofactors for use in organic synthesis. In: Applied Microbiology and Biotechnology 14 (1987), 10 pp. 147-197 and Greiner, Lasse: Process Development for Catalytic Reduction with Molecular Hydrogen, UniBonn, Diss, 2002). Furthermore, it is shown that above all the stability of the reduced phosphorylated form NADPH is often limiting.

Der genaue Mechanismus des Zerfalls ist weitestgehend ungeklärt, es scheinen mehrere Reaktionen beteiligt zu sein, die je nach pH-Wert unterschiedlich schnell ablaufen. Es handelt sich zum jetzigen Kenntnisstand um irreversible Reaktionen. Es ist auch beschrieben, dass Enzyme durch die Zerfallsprodukte inhibiert werden können, was die Stabilisierung dann besonders vorteilhaft machen würde. Die reduzierten Formen sind aufgrund der aktivierten 5,6-Doppelbindung im Pyridinring anfällig für elektrophile Additionsreaktionen, die zur Deaktivierung führen können. Im Allgemeinen führen Additive zu einer Beschleunigung der Deaktivierung. Dies gilt sogar für anorganische Puffersalze, wie z. B. Phosphatanionen, die in Konzentrationen ab 0,1 mol L–1 merklich destabilisierend wirken. Es sind allgemein keine stabilisierenden Agenzien beschrieben, außer solchen, die gleichzeitig den pH-Wert der Lösung beeinflussen; im besten Fall haben die zugesetzten Stoffe keine Wirkung bezüglich der Stabilität und verhalten sich gegenüber den Kofaktoren unreaktiv.The exact mechanism of the decomposition is largely unclear, it seems to be involved in several reactions that proceed at different rates depending on the pH. It is the current state of knowledge to irreversible reactions. It is also described that enzymes can be inhibited by the decay products, which would then make the stabilization particularly advantageous. The reduced forms are susceptible to electrophilic addition reactions due to the activated 5,6-double bond in the pyridine ring, which can lead to deactivation. In general, additives lead to an acceleration of deactivation. This is true even for inorganic buffer salts, such as. B. phosphate anions, which have a noticeable destabilizing effect in concentrations from 0.1 mol L -1 . There are generally no stabilizing agents described except those which simultaneously affect the pH of the solution; in the best case, the added substances have no effect on the stability and behave unreactive towards the cofactors.

Die EP 1 332 221 B1 offenbart, dass ionische Flüssigkeiten in einzelnen Fällen eine positive Wirkung auf die Enzymstabilität haben.The EP 1 332 221 B1 discloses that ionic liquids in some cases have a positive effect on enzyme stability.

Der Artikel „Sensors for gucose monitoring: technical and clinical aspects” aus Diabetes Metab. Res. Rev. 2001; 17: 113–123 beschreibt konventionelle Testsysteme für den Nachweis von Glucose. Es wird darauf hingewiesen, dass die Haltbarkeit der Sensoren ungenügend ist.The article "Sensors for glucose monitoring: technical and clinical aspects" from Diabetes Metab. Res. Rev. 2001; 17: 113-123 describes conventional test systems for the detection of glucose. It should be noted that the durability of the sensors is insufficient.

Die Veröffentlichung von Lu, X. et. al. „Direct electron transfer of horseradish peroxidiase and its biosensor based an chitosan and room temperature ionic liquid” aus der Zeitschrift Electrochem. Comm., 2006, Vol. 8, S. 874–878 offenbart einen Biosensor, in dem eine filmförmige Schicht aus Meerrettich Peroxidase in einem Verbundmaterial aus Chitosan und der ionischen Flüssigkeit 1-Butyl-3 methyl-imidazolium tetrafluorborat auf einer Elektrode als Trägermaterial vorliegt.The publication of Lu, X. et. al. "Direct electron transfer of horseradish peroxidiase and its biosensor based on chitosan and room temperature ionic liquid" from the journal Electrochem. Comm., 2006, Vol. 8, pp. 874-878 discloses a biosensor in which a film-shaped layer of horseradish peroxidase in a composite material of chitosan and the ionic liquid 1-butyl-3-methyl-imidazolium tetrafluoroborate is present on an electrode as carrier material ,

Die Schrift CN 101 231 260 A offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Biosensors unter Verwendung einer ionischen Flüssigkeit.The font CN 101 231 260 A discloses a method for producing a biosensor using an ionic liquid.

Die WO 2008/058165 A2 offenbart Partikel mit einem Kern als Trägermaterial, der mit einer Schicht überzogen ist, die ein immobilisiertes Enzym, ein Immobilisierungsmaterial und NAD+ oder NADP+ als Elektronenmediator enthält, für deren Herstellung eine ionische Flüssigkeit verwendet wird.The WO 2008/058165 A2 discloses particles having a core as a support material coated with a layer containing an immobilized enzyme, an immobilization material and NAD + or NADP + as an electron mediator, for the production of which an ionic liquid is used.

Die WO 2005/103 700 A1 offenbart eine Zusammensetzung, die ein Testmedium mit einer ionischen Flüssigkeit und ein Enzym als spezifischen Bindungspartner enthält, wobei das Enzym auf der Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert ist.The WO 2005/103 700 A1 discloses a composition containing a test medium with an ionic liquid and an enzyme as a specific binding partner, wherein the enzyme is immobilized on the surface of a solid support.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung die Halbwertzeit bzw. die Haltbarkeit von Kofaktoren und damit ihre Stabilität zu erhöhen. Insbesondere soll die Halbwertzeit von NADPH und NADH erhöht werden. Die Haltbarkeit von chemischen Testsystemen, die von Kofaktoren Gebrauch machen, soll erhöht werden. Die Kosten für die enzymatische Produktion von Verbindungen unter Einsatz vom Kofaktoren sollen gesenkt werden.It is therefore the object of the invention to increase the half-life or the durability of cofactors and thus their stability. In particular, the half-life of NADPH and NADH should be increased. The durability of chemical test systems that use cofactors should be increased. The costs for the enzymatic production of compounds using the cofactor should be reduced.

Die Aufgabe wird überraschenderweise dadurch gelöst, dass zum Zwecke der Erhöhung der Halbwertzeit von Kofaktoren ionische Flüssigkeiten verwendet werden.The object is surprisingly achieved in that ionic liquids are used for the purpose of increasing the half-life of cofactors.

Mit den ionischen Flüssigkeiten ist es nunmehr möglich, die Halbwertzeit von NADPH und NADH signifikant zu erhöhen. Chemische Testsysteme für Schnelltests können haltbarer gemacht werden. Die Kosten für die chemische Umsetzung von Substraten in Enzymreaktionen können gesenkt werden, da die Kofaktoren auf Grund der erhöhten Halbwertezeit nicht mehr oder nicht mehr so oft nachdosiert werden müssen.With the ionic liquids, it is now possible to significantly increase the half-life of NADPH and NADH. Chemical test systems for rapid tests can be made more durable. The costs for the chemical conversion of substrates into enzyme reactions can be reduced, since the cofactors do not have to be replenished any more or not as often because of the increased half-life.

Die Figuren zeigen Zusammenhänge, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, sowie erfindungsgemäße Ergebnisse. The figures show relationships which are known from the prior art, as well as results according to the invention.

Es zeigt:It shows:

1: Schema des Einsatzes von NAD+/NADH als Redoxmediator zwischen den beiden Redoxpaaren Red1/Ox1 und Red2/Ox2 1 Scheme of the use of NAD + / NADH as a redox mediator between the two redox couples Red1 / Ox1 and Red2 / Ox2

2: Reaktionsgeschwindigkeitskonstante des Zerfalls kz für die reduzierte und oxidierte Form der Kofaktoren als Funktion des pH-Wertes 2 : Reaction rate constant of decay kz for the reduced and oxidized form of cofactors as a function of pH

3: Halbwertzeit von NADPH als Funktion des Volumenanteils der ionischen Flüssigkeit 3 : Half-life of NADPH as a function of the volume fraction of the ionic liquid

4: Halbwertzeit von NADH als Funktion des Volumenanteils der ionischen Flüssigkeit 4 : Half-life of NADH as a function of the volume fraction of the ionic liquid

Erfindungsgemäß wird die Halbwertzeit der Kofaktoren dadurch erhöht, dass sie zusammen mit einer ionischen Flüssigkeit verwendet werden. Dazu können die ionischen Flüssigkeiten dem Reaktionsgemisch oder mindestens einer Komponente des Reaktionsgemisches oder dem Lösungsmittel zugegeben werden, das seinerseits den anderen zur Reaktion notwendigen Komponenten zugefügt wird.According to the invention, the half-life of the cofactors is increased by being used together with an ionic liquid. For this purpose, the ionic liquids can be added to the reaction mixture or at least one component of the reaction mixture or the solvent, which in turn is added to the other components necessary for the reaction.

Die Kofaktoren, deren Halbwertzeit erhöht wird, sind NADPH und NADH.The cofactors whose half-life is increased are NADPH and NADH.

Als ionische Flüssigkeiten können Flüssigkeiten aus folgenden Kationen und Anionen eingesetzt werden: As ionic liquids liquids of the following cations and anions can be used:

Kationen:cations:

Anorganische oder organische Kationen,
insbesondere Pyridinium-Kationen der allgemeinen Formel 1:

Figure 00060001
Pyrrolidinium-Kationen der allgemeinen Formel 2:
Figure 00060002
Pyrazolium-Kationen der allgemeinen Formel 3:
Figure 00060003
Quaternäre Ammonium-Ionen der allgemeinen Formel [NR1R2R3R4]+
Phosphonium-Ionen der allgemeinen Formel [PR1R2R3R4]+
Imidazolium-Kationen der allgemeinen Formel 4:
Figure 00060004
wobei die Imidazolium-, Pyridinium- und Pyrazolium Kerne noch mit einem weiteren Substituenten aus der Gruppe C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkoxy-, C1-C6-Aminoalkyl, C5-C12-Aryl oder C5-C12-Aryl-C1-C6-alkyl substituiert sein können
und
wobei R1, R2, R3 und R4 gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe:

  • – Wasserstoff,
  • – Lineare und verzweigte, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder alicyclische Alkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen,
  • – Lineare und verzweigte hydroxy-substituierte oder ether-verbrückte Alkylketten,
  • – Aryl, Aryl-C1-C6-alkyl,
  • – Heteroaryl, Heteroaryl-C1-C6-alkyl mit wenigstens einem Heteroatom ausgewählt aus N, O, S
sein können.

Insbesondere 1-Ethyl-2-methylpyridinium [EMPy]+, 1-Ethyl-3-methylimidazolium [EMIM]+, 1-Butyl-3-methylimidazolium [BMIM]+ oder 1,3 Dimethylimidazolium [MMIM]+ Inorganic or organic cations,
in particular pyridinium cations of the general formula 1:
Figure 00060001
Pyrrolidinium cations of general formula 2:
Figure 00060002
Pyrazolium cations of general formula 3:
Figure 00060003
Quaternary ammonium ions of the general formula [NR 1 R 2 R 3 R 4 ] +
Phosphonium ions of the general formula [PR 1 R 2 R 3 R 4 ] +
Imidazolium cations of the general formula 4:
Figure 00060004
wherein the imidazolium, pyridinium and pyrazolium nuclei with another substituent from the group C 1 -C 6 alkyl, C 1 -C 6 alkoxy, C 1 -C 6 aminoalkyl, C 5 -C 12 aryl or C 5 -C 12 aryl-C 1 -C 6 alkyl
and
where R1, R2, R3 and R4 are identical or different radicals from the group:
  • - hydrogen,
  • Linear and branched, saturated or unsaturated, aliphatic or alicyclic alkyl groups having from 1 to 20 carbon atoms,
  • Linear and branched hydroxy-substituted or ether-bridged alkyl chains,
  • Aryl, aryl-C 1 -C 6 -alkyl,
  • - Heteroaryl, heteroaryl-C 1 -C 6 alkyl having at least one heteroatom selected from N, O, S
could be.

In particular 1-ethyl-2-methylpyridinium [EMPy] + , 1-ethyl-3-methylimidazolium [EMIM] + , 1-butyl-3-methylimidazolium [BMIM] + or 1,3 dimethylimidazolium [MMIM] +

Als Anionen:As anions:

  • Anorganische und organische Anionen, insbesondere Sulfate, Phosphate, Halogenide, Amide, [BF4]–, [PF6]–, Alkylsulfate, Alkylphosphate, insbesondere Methyl- oder Ethyl- sulfat oder phosphat, insbesondere Ethylsulfat (EtSO4 –), Diethylphosphat (Et2PO4 –), Dimethylphosphat (Me2PO4 –), Diethylenglycomonomethylethersulfat (MDEGSO4 –).Inorganic and organic anions, in particular sulfates, phosphates, halides, amides, [BF 4 ] - , [PF 6 ] - , alkyl sulfates, alkyl phosphates, in particular methyl or ethyl sulfate or phosphate, in particular ethyl sulfate (EtSO 4 - ), diethyl phosphate ( Et 2 PO 4 - ), dimethyl phosphate (Me 2 PO 4 - ), diethylene glycol comonomethyl ether sulfate (MDEGSO 4 - ).

Besonders die Verbindungen:Especially the connections:

  • [EMPy]+[EtSO4]–, [EMIM]+[EtSO4]–, [EMIM]+[EtSO4]–, [EMIM]+[MDEGSO4]–, [BMIM]+[MDEGSO4]–, [MMIM]+[Me2PO4]–. [EMPy] + [EtSO 4 ] - , [EMIM] + [EtSO 4 ] - , [EMIM] + [EtSO 4 ] - , [EMIM] + [MDEGSO 4 ] - , [BMIM] + [MDEGSO 4 ] - , [MMIM] + [Me 2 PO 4 ] - .

Tabelle 1 zeigt für die letztgenannten Verbindungen den Faktor für die Steigerung der Halbwertzeit für NADPH (linker Wert) und NADH (rechter Wert) bei Anwesenheit von 10 Volumenprozent der ionischen Flüssigkeit im Vergleich zum Standardpuffer. Tabelle 1: Verwendete Abkürzungen für die ionischen Flüssigkeiten und Stabilisierung als Verhältnis der Halbwertzeiten von NADPH bzw. NADH für die Ionenpaare bei 10 Vol% und Standardpuffer [EtSO4]– [Et2PO4]– [Me2PO4]– [MDEGSO4]– [EMPY]+ 2.9/2.5 [EMIM]+ 2.3/2.1 2.1/– 2.0/1.9 [BMIM]+ 1.5/– [MMIM]+ 2.9/2.1 Table 1 shows for the latter compounds the factor for increasing the half-life for NADPH (left value) and NADH (right value) in the presence of 10 volume percent of the ionic liquid compared to the standard buffer. Table 1: Abbreviations used for the ionic liquids and stabilization as ratio of the half-lives of NADPH or NADH for the ion pairs at 10% by volume and standard buffer [EtSO 4 ] - [Et 2 PO 4 ] - [Me 2 PO 4 ] - [MDEGSO 4 ] - [EMPY] + 2.9 / 2.5 [EMIM] + 2.3 / 2.1 2.1 / - 2.0 / 1.9 [BMIM] + 1.5 / - [MMIM] + 2.9 / 2.1

Aus der Tabelle 1 wird ersichtlich, dass die Halbwertzeit unter den angegebenen Bedingungen der Zugabe von 10 Vol% ionischer Flüssigkeit um den Faktor 1,5 bis 2,9 gesteigert werden kann.It can be seen from Table 1 that the half-life can be increased by a factor of 1.5 to 2.9 under the specified conditions of the addition of 10% by volume of ionic liquid.

Die Beeinträchtigung der Halbwertzeit von Kofaktoren durch organische Komponenten, wie z. B. Lösungsmittel, kann in Anwesenheit von ionischen Flüssigkeiten ebenfalls reduziert werden, so dass die Kofaktoren unter Verwendung von ionischen Flüssigkeiten auch in Lösungen, die organische Komponenten, wie Lösungsmittel oder andere organische Komponenten enthalten, mit erhöhter Halbwertzeit eingesetzt werden können.The impairment of the half-life of cofactors by organic components such. As solvents, can also be reduced in the presence of ionic liquids, so that the cofactors can be used with ionic liquids in solutions containing organic components such as solvents or other organic components, with increased half-life.

Der Zusatz von ionischen Flüssigkeiten zu Reaktionssystemen kann daher eine bessere Anpassung der Reaktionsbedingungen an für die Reaktionsführung optimale Bedingungen ermöglichen, ohne die Halbwertzeit der Kofaktoren durch organische Lösungsmittel und/oder Puffer zu verringern. Die Effizienz des chemischen Verfahrens kann somit verbessert werden. The addition of ionic liquids to reaction systems can therefore allow better adaptation of the reaction conditions to conditions optimum for reaction reaction without reducing the half life of the cofactors by organic solvents and / or buffers. The efficiency of the chemical process can thus be improved.

Die ionischen Flüssigkeiten können beispielsweise für kofaktorabhängige Enzymreaktionen eingesetzt werden.The ionic liquids can be used, for example, for cofactor-dependent enzyme reactions.

Bei den Reaktionsenzymen kann es sich beispielsweise um Oxidoreduktasen (E.C.1.x.x.x.), insbesondere Dehydrogenasen, insbesondere Alkoholdehydrogenasen, Monooxygenasen, Oxidasen oder Dioxygenasen handeln. Weitere Enzyme sind Alkoholoxidase, L-Aminosäureoxidase, Cholesterolesterase oder Cholesteroloxidase, Glucoseoxidase oder Glucosedehydrogenase, Invertase, Urease, Acetylcholinesterase oder Acetylcholinoxidase, Lactatdehydrogenase.The reaction enzymes may be, for example, oxidoreductases (E.C.1.x.x.x.), in particular dehydrogenases, in particular alcohol dehydrogenases, monooxygenases, oxidases or dioxygenases. Further enzymes are alcohol oxidase, L-amino acid oxidase, cholesterol esterase or cholesterol oxidase, glucose oxidase or glucose dehydrogenase, invertase, urease, acetylcholinesterase or acetylcholine oxidase, lactate dehydrogenase.

Bei Enzymreaktionen können Substrate in Anwesenheit von Kofaktoren und ionischen Flüssigkeiten bei pH-Werten von 3–10, 5–9, bevorzugt 6–8 umgesetzt werden.In enzyme reactions, substrates can be reacted in the presence of cofactors and ionic liquids at pHs of 3-10, 5-9, preferably 6-8.

Die Reaktionen können bevorzugt in einem Temperaturbereich von 15–35°C, 20–30°C oder 20–25°C durchgeführt werden.The reactions may preferably be carried out in a temperature range of 15-35 ° C, 20-30 ° C or 20-25 ° C.

Die Reaktionen können in wässriger Lösung durchgeführt werden, es können jedoch auch Zusätze von organischen Lösungsmitteln hinzugefügt werden, um die Löslichkeit einzelner Komponenten zu erhöhen.The reactions may be carried out in aqueous solution, but additions of organic solvents may be added to increase the solubility of individual components.

Beim Zusatz der ionischen Flüssigkeit zur wässrigen Pufferlösung ergibt sich allgemein eine Zunahme der Halbwertzeit in Abhängigkeit des Volumenanteils. Diese Zunahme der Halbwertzeit ist für die üblicherweise inhärent instabilste Komponente, dem NADPH, am stärksten (3). Die Stabilisierung erreicht bei Volumenanteilen von bis zu 10% bereits eine Halbwertzeit, die um bis zu dem 2,9-fachen erhöht ist. Die stabilisierende Wirkung ist eine Funktion des Volumenanteils bzw. der Konzentration und findet sich mit unterschiedlicher starker Ausprägung als genereller Trend für die untersuchten Additive.Addition of the ionic liquid to the aqueous buffer solution generally results in an increase in the half-life as a function of the volume fraction. This increase in half-life is most pronounced for the typically inherently most instable component, NADPH ( 3 ). The stabilization already achieves a half-life with volume fractions of up to 10%, which is increased by up to 2.9 times. The stabilizing effect is a function of the volume fraction or the concentration and can be found with varying degrees of intensity as a general trend for the investigated additives.

Der Anteil der ionischen Flüssigkeit im Reaktionssystem kann von 0,1 bis 99 Vol% betragen. Weiterhin können Konzentrationen von 0,1 bis 50 Vol%, insbesondere 0,1–25 Vol% und 0,1 bis 10 Vol% ionische Flüssigkeit eingesetzt werden.The proportion of the ionic liquid in the reaction system may be from 0.1 to 99% by volume. Furthermore, concentrations of from 0.1 to 50% by volume, in particular from 0.1 to 25% by volume, and from 0.1 to 10% by volume of ionic liquid can be used.

Die stabilisierende Wirkung der ionischen Flüssigkeiten auf die Kofaktoren wurde auch an Hand von Enzymreaktionen belegt.The stabilizing effect of the ionic liquids on the cofactors has also been demonstrated by enzyme reactions.

Die 3 und 4 zeigen Ergebnisse der Messungen der Halbwertzeit:The 3 and 4 show results of half-life measurements:

3 zeigt die Steigerung der Halbwertzeit von NADPH in Anwesenheit von ionischen Flüssigkeiten in Abhängigkeit vom zugegebenen Volumen der ionischen Flüssigkeit IL. 3 shows the increase in the half-life of NADPH in the presence of ionic liquids as a function of the added volume of the ionic liquid IL.

4 zeigt die Steigerung der Halbwertzeit von NADH in Anwesenheit von ionischen Flüssigkeiten in Anhängigkeit vom zugegebenen Volumen der ionischen Flüssigkeit IL. 4 shows the increase in the half-life of NADH in the presence of ionic liquids as a function of the added volume of the ionic liquid IL.

In den Figuren bedeuten die Zeichen folgende Verbindungen: Legende:

Figure 00100001
In the figures, the characters mean the following connections: Legend:
Figure 00100001

Experimentelles VorgehenExperimental procedure

Ermittlung der Stabilität von NADPH:Determination of the stability of NADPH:

Zur Ermittlung der Stabilität von NADPH wurden 1,5 mg des Cofaktors in 2 mL der Mischung aus IL (ionischer Flüssigkeit) und Pufferlösung gelöst und in einem Thermoblock bei 25°C gelagert. Nach definierten Zeitabständen wurden den Lösungen Proben entnommen und deren Absorption bei 340 nm mit dem Multiplattenleser gemessen. Aus der Abnahme der Absorption über die Zeit kann der Zerfall des Cofaktors ermittelt werden. Zusätzlich wurde für einige der Proben die Restmenge an NADPH durch einen Enzymassay bestimmt.To determine the stability of NADPH, 1.5 mg of the cofactor were dissolved in 2 ml of the mixture of IL (ionic liquid) and buffer solution and stored in a thermoblock at 25 ° C. After defined time intervals, samples were taken from the solutions and their absorbance at 340 nm was measured with the multiplate reader. From the decrease in absorption over time, the decay of the cofactor can be determined. In addition, for some of the samples, the residual amount of NADPH was determined by an enzyme assay.

Für den Assay wurden folgende Lösungen in 50 mmol L–1 Kaliumphosphat-Puffer (KPi) (pH 7,0) hergestellt und in eine 1 mL-Küvette pipettiert:

  • • 970 μL 30 mmol L–1 Acetophenon
  • • 10 μL 50 mg L–1 LbADH
For the assay, the following solutions were prepared in 50 mmol L- 1 potassium phosphate buffer (KPi) (pH 7.0) and pipetted into a 1 mL cuvette:
  • • 970 μL 30 mmol L- 1 acetophenone
  • • 10 μL 50 mg L -1 LbADH

Nach Mischen der Lösungen wurden diese auf 25°C temperiert. Anschließend wurden 20 μL der jeweiligen Cofaktorlösung zugegeben und direkt die Absorption bei 340 nm gemessen. Nachdem sich ein stabiler Wert für die Absorption eingestellt hat (±5 mOD), wurde dieser Wert als Endabsorption deklariert. Aus der Differenz der Anfangsabsorption und des Endwerts wurde die Menge an enzymaktiven NADPH berechnet. Mit beiden Ermittlungsmethoden ergaben sich übereinstimmende Ergebnisse.After mixing the solutions, they were heated to 25 ° C. Subsequently, 20 μL of the respective cofactor solution were added and the absorbance at 340 nm was measured directly. After a stable absorption value has been established (± 5 mOD), this value has been declared as final absorption. From the difference of the initial absorption and the final value, the amount of enzyme-active NADPH was calculated. Both methods yielded consistent results.

Ermittlung der Stabilität von NADHDetermination of the stability of NADH

Zur Ermittlung der Stabilität von NADH wurden 1,1 mg des Cofaktors in 2 mL der jeweiligen IL-Puffermischungen gelöst und in einem Thermoblock bei 25°C gelagert. Nach definierten Zeitabständen wurden den Lösungen Proben entnommen und deren Absorption bei 340 nm mit einem Multiplattenleser gemessen. Aus der Abnahme der Absorption über die Zeit kann der Zerfall des Cofaktors ermittelt werden. Zusätzlich wurde für einige der Proben die Restmenge an NADH durch einen Enzymassay bestimmt.To determine the stability of NADH, 1.1 mg of the cofactor were dissolved in 2 ml of the respective IL buffer mixtures and stored in a thermoblock at 25 ° C. After defined time intervals, samples were taken from the solutions and their absorbance at 340 nm was measured with a multiplate reader. From the decrease in absorption over time, the decay of the cofactor can be determined. In addition, for some of the samples, the residual amount of NADH was determined by an enzyme assay.

Für den Assay wurden folgende Lösungen in 50 mmol L–1 KPi pH 7 hergestellt und in eine 1 mL-Küvette pipettiert:
970 μL 50 mmol L–1 Acetaldehyd
10 μL 50 mg mL–1 YADHFor the assay, the following solutions were prepared in 50 mmol L -1 KPi pH 7 and pipetted into a 1 mL cuvette:
970 μL 50 mmol L -1 acetaldehyde
10 μL 50 mg mL -1 YADH

Nach Mischen der Lösungen wurden diese auf 25°C temperiert. Anschließend wurden 20 μL der jeweiligen Cofaktorlösung zugegeben und direkt die Absorption bei 340 nm gemessen. Nachdem sich ein stabiler Wert (±5 mOD) über 30 s für die Absorption eingestellt hat, wurde dieser Wert als Endabsorption deklariert. Aus der Differenz der Anfangsabsorption und des Endwerts wurde die Menge an enzymaktivem NADH berechnet.After mixing the solutions, they were heated to 25 ° C. Subsequently, 20 μL of the respective cofactor solution were added and the absorbance at 340 nm was measured directly. After a stable value (± 5 mOD) has been set for absorption over 30 s, this value has been declared as final absorption. From the difference of the initial absorption and the final value, the amount of enzyme-active NADH was calculated.

Claims (9)

Verwendung von ionischen Flüssigkeiten zur Erhöhung der Halbwertzeit der Kofaktoren NADPH und NADH.Use of ionic liquids to increase the half-life of the cofactors NADPH and NADH. Verwendung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit mindestens ein anorganisches oder organisches Kation und ein anorganisches oder organisches Anion umfasst.Use according to claim 1, characterized in that the ionic liquid comprises at least one inorganic or organic cation and one inorganic or organic anion. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit mindestens eine Komponente aus der Gruppe der Kationen Pyridinium-Kationen der allgemeinen Formel 1:
Figure 00120001
Pyrrolidinium-Kationen der allgemeinen Formel 2:
Figure 00120002
Pyrazolium-Kationen der allgemeinen Formel 3:
Figure 00120003
Quaternäre Ammonium-Ionen der allgemeinen Formel [NR1R2R3R4]+, Phosphonium-Ionen der allgemeinen Formel [PR1R2R3R4]+, Imidazolium- Kationen der allgemeinen Formel 4:
Figure 00130001
wobei die Imidazolium-, Pyridinium- und Pyrazolium Kerne noch mit einem weiteren Substituenten aus der Gruppe C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkoxy-, C1-C6-Aminoalkyl, C5-C12-Aryl oder C5-C12-Aryl-C1-C6-alkyl substituiert sein können und wobei R1, R2, R3 und R4 gleiche oder verschiedene Reste aus der Gruppe Wasserstoff, Lineare und verzweigte, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder alicyclische Alkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Lineare und verzweigte hydroxy-substituierte oder ether-verbrückte Alkylketten, Aryl, Aryl-C1-C6-alkyl, Heteroaryl, Heteroaryl-C1-C6-alkyl mit wenigstens einem Heteroatom ausgewählt aus der Gruppe N, O, S sein können, sowie 1-Ethyl-2-methylpyridinium (EMPy+), 1-Ethyl-3-methylimidazolium (EMIM+),1-butyl-3-methylimidazolium (BMIM+) oder 1,3 Dimethylimidazolium (MMIM+) ist, und das Anion mindestens eine Komponente aus der Gruppe Sulfate, Phosphate, Halogenide, Amide, [BF4]–, [PF6]–, Alkylsulfate, Alkylphosphate, Methyl- oder Ethyl-Sulfat oder Phosphat, Ethylsulfat (EtSO4 –), Diethylphosphat (Et2PO4 –), Dimethylphosphat (Me2PO4 –), Diethylenglycomonomethylethersulfat (MDEGSO4 –) ist.Use according to claim 1, characterized in that the ionic liquid at least one component from the group of cations pyridinium cations of the general formula 1:
Figure 00120001
Pyrrolidinium cations of general formula 2:
Figure 00120002
Pyrazolium cations of general formula 3:
Figure 00120003
Quaternary ammonium ions of the general formula [NR 1 R 2 R 3 R 4 ] + , phosphonium ions of the general formula [PR 1 R 2 R 3 R 4 ] + , imidazolium cations of the general formula 4:
Figure 00130001
wherein the imidazolium, pyridinium and pyrazolium nuclei with another substituent from the group C 1 -C 6 alkyl, C 1 -C 6 alkoxy, C 1 -C 6 aminoalkyl, C 5 -C 12 aryl or C 5 -C 12 -aryl-C 1 -C 6 -alkyl may be substituted and wherein R 1, R 2, R 3 and R 4 are identical or different radicals selected from the group consisting of hydrogen, linear and branched, saturated or unsaturated, aliphatic or alicyclic alkyl groups 1 to 20 carbon atoms, linear and branched hydroxy-substituted or ether-bridged alkyl chains, aryl, aryl-C 1 -C 6 -alkyl, heteroaryl, heteroaryl-C 1 -C 6 -alkyl having at least one heteroatom selected from the group N, O, S, as well as 1-ethyl-2-methylpyridinium (EMPy + ), 1-ethyl-3-methylimidazolium (EMIM + ), 1-butyl-3-methylimidazolium (BMIM + ) or 1,3 dimethylimidazolium (MMIM + ), and the anion is at least one of sulfates, phosphates, halides, amides, [BF 4 ] - , [PF 6 ] - , alkyl sulfates, alk ylphosphate, methyl or ethyl sulfate or phosphate, ethylsulfate (EtSO 4 - ), diethylphosphate (Et 2 PO 4 - ), dimethylphosphate (Me 2 PO 4 - ), diethylene glycol comonomethether sulfate (MDEGSO 4 - ). Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als ionische Flüssigkeit mindestens eine Komponente aus der Gruppe bestehend aus [EMPy]+[EtSO4]–, [EMIM]+[EtSO4]–, [EMIM]+[EtSO4]–, [EMIM]+[MDEGSO4]–, [BMIM]+[MDEGSO4]–, [MMIM]+[Me2PO4]– eingesetzt wird.Use according to one of claims 1 to 3, characterized in that as ionic liquid at least one component from the group consisting of [EMPy] + [EtSO 4 ] - , [EMIM] + [EtSO 4 ] - , [EMIM] + [EtSO 4 ] - , [EMIM] + [MDEGSO 4 ] - , [BMIM] + [MDEGSO 4 ] - , [MMIM] + [Me 2 PO 4 ] - is used. Verwendung nach eine der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit in einer Reaktionslösung zu einem Anteil von 0,1 bis 50 Vol.% eingesetzt wird. Use according to one of claims 1 to 4, characterized in that the ionic liquid is used in a reaction solution to a proportion of 0.1 to 50 vol.%. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Umsetzung von Substraten in Enzymreaktionen.Use according to one of claims 1 to 5 in the reaction of substrates in enzyme reactions. Verwendung der ionischen Flüssigkeit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym aus der Gruppe Oxidoreduktase, Dehydrogenase, Monooxygenase, Oxidase, Dioxygenase, Alkoholdehydrogenase, Alkoholoxidase, L-Aminosäureoxidase, Cholesterolesterase, Cholesteroloxidase, Glucoseoxidase, Glucosedehydrogenase, Invertase, Urease, Acetylcholinesterase oder Acetylcholinoxidase, Lactatdehydrogenase eingesetzt wird.Use of the ionic liquid according to claim 6, characterized in that at least one enzyme from the group oxidoreductase, dehydrogenase, monooxygenase, oxidase, dioxygenase, alcohol dehydrogenase, alcohol oxidase, L-amino acid oxidase, cholesterol esterase, cholesterol oxidase, glucose oxidase, glucose dehydrogenase, invertase, urease, acetylcholinesterase or Acetylcholine oxidase, lactate dehydrogenase is used. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Substrat aus der Gruppe Alkohol, Aminosäure, Cholesterol, Glucose, Saccharose, Harnstoff, Acetylcholin und Lactat umgesetzt wird.Use according to claim 6 or 7, characterized in that at least one substrate from the group alcohol, amino acid, cholesterol, glucose, sucrose, urea, acetylcholine and lactate is reacted. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel mindestens einen Anteil von organischem Lösungsmittel enthält.Use according to one of claims 1 to 8, characterized in that the solvent contains at least a proportion of organic solvent.
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