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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Mikroskop zur Mikroskopie
einer Probe, wobei mehrere in ihrer Auflösung unterschiedliche
Mikroskopieverfahren kombiniert werden.
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Die
Untersuchung von Proben mittels Mikroskopie ist ein weites technisches
Gebiet, für das es vielfältige technische Lösungen
gibt. Ausgehend von der klassischen Lichtmikroskopie haben sich
verschiedenste Mikroskopieverfahren entwickelt.
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Ein
klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung
von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie.
Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore)
zur spezifischen Markierung von Proben, z. B. von Zellteilen, verwendet.
Die Probe wird, wie erwähnt, mit Anregungsstrahlung beleuchtet
und das dadurch angeregte Lumineszenzlicht mit geeigneten Detektoren
erfaßt. Üblicherweise ist dazu im Lichtmikroskop
ein dichroitischer Strahlteiler in Kombination mit Blockfiltern
vorgesehen, die die Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung
abspalten und eine getrennte Beobachtung ermöglichen. Durch
dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile
im Lichtmikroskop möglich. Natürlich können
auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen,
sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates
anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren
bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen,
die per se, also ohne Markierungsstoffzugabe lumineszieren.
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Lumineszenz
wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für
Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfaßt also
beide Prozesse.
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Weiter
ist es zur Probenuntersuchung bekannt, Laser-Scanning-Mikroskopie
(auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die aus einem dreidimensional
ausgeleuchteten Bild mittels einer konfokalen Detektionsanordnung
(dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen
Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene
wiedergibt, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet.
Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer
optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es
anschließend, mit Hilfe einer geeigneten Datenverarbeitungseinrichtung
ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den
verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie
ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet.
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Natürlich
wird auch eine Kombination von Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet,
bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen
mit Hilfe eines LSM abgebildet wird.
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Laser-Scanning-Mikroskope
werden auch als Nachrüstmodule für normale Lichtmikroskope
angeboten, die dann neben einer normalen Mikroskopie auch eine Laser-Scanning-Mikroskopie
von Proben ermöglichen. Die Laser-Scanning-Mikroskopie
und insbesondere die Laser-Scanning-Mikroskopie lumineszierender Proben
ist dabei wie die klassische Mikroskopie auch durch die optische
Auflösungsgrenze des verwendeten Mikroskops geprägt.
Die Laser-Scanning-Mikroskopie erlaubt allerdings eine sehr viel
höhere Tiefenschärfe, obwohl bei beiden Mikroskopen
die optische Auflösung durch die physikalischen Gesetze
beugungsbegrenzt ist.
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Für
Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze wurden in der letzen
Zeit verschiedene Ansätze entwickelt. Diese Mikroskopieverfahren
zeichnen sich dadurch aus, daß sie im Vergleich zum klassischen
Mikroskop dem Anwender eine höhere laterale und/oder axiale
optische Auflösung zur Verfügung stellen. In dieser Beschreibung
werden solche Mikroskopieverfahren als hochauflösende Mikroskopieverfahren
bezeichnet, da sie eine Auflösung jenseits der optischen
Beugungsgrenze erreichen. Beugungsbegrenzte Mikroskope werden hingegen
als klassische Mikroskope bezeichnet. Sie realisieren bekannte optische
Weitfeldmikroskopie oder Laser-Scanning-Mikroskopie.
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Der
Auflösungsgewinn bei der hochaufgelösten Mikroskopie
wird erkauft durch eine geringere Meßgeschwindigkeit, ein
kleineres Meßfeld sowie Begrenzungen hinsichtlich der Eindringtiefe
und der brauchbaren Markierungsstoffe für die Lumineszenzmikroskopie.
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Somit
können hochauflösende Mikroskopieverfahren nur
für bestimmte Untersuchungen aufgrund der unerläßlichen
Kompromisse bezüglich Probenpräparation und Aufnahmeparameter
(insbesondere Aufnahmegeschwindigkeit etc.) verwendet werden. Dies
ist besonders mißlich, wenn man in einer großen
Probe kleinere Bereiche untersuchen möchte oder eine zeitliche
Entwicklung einer Probe verfolgen möchte, die unterschiedlich
schnell verläuft.
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Der
Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop bzw.
ein Verfahren zur Mikroskopie anzugeben, mit dem die bisherigen
Auslegungs- und Anwendungskonflikte, die mit der hochauflösenden
Mikroskopie einhergehen, behoben sind.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit
einem Verfahren zum Erzeugen eines Bildes einer Probe mittels Mikroskopieverfahren,
die unterschiedliche Ortsauflösungen realisieren, wobei
mindestens zwei der folgenden Mikroskopieverfahren kombiniert werden:
ein erstes Mikroskopieverfahren, in dem die Probe durch strukturierte
Linien- oder Weitfeldbeleuchtung zur Lumineszenz angeregt wird,
die Strukturierung gedreht und für jede Drehstellung mehrmals
verschoben wird, wobei mindestens drei Drehlagen und pro Drehlage
mindestens drei Verschiebelagen realisiert werden, jeweils die lumineszierende
Probe mit einer vorbestimmten optischen Auflösung auf einen
Flächendetektor abgebildet wird und aus den so erhaltenden
Bildern durch eine Fourieranalyse umfassende rechnerische Bearbeitung
ein erstes Mikroskopie-Bild mit über die vorbestimmte optische
Auflösung hinaus gesteigerter Ortsauflösung erzeugt
wird, ein zweites Mikroskopieverfahren, in dem die Probe mit Markierungsmolekülen
markiert wird, welche mit einem Umschaltsignal aktivierbar sind,
so daß sie erst dann zur Abgabe bestimmter Lumineszenzstrahlung
anregbar sind, das Umschaltsignals auf die Probe derart aufgebracht
wird, daß nur eine Teilmenge der in der Probe vorhandenen
Markierungsmoleküle aktiviert werden, wobei in der Probe
Teilbereiche bestehen, in denen aktivierte Markierungsmoleküle
zu den ihnen nächst benachbarten aktivierten Markierungsmoleküle
einen Abstand haben, der größer oder gleich der
vorbestimmten optischen Auflösung ist, die aktivierten
Moleküle zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung angeregt werden,
die Lumineszenzstrahlung abgebende Probe mit der vorbestimmten optischen
Auflösung auf den Flächendetektor abgebildet wird,
das Bild analysiert wird und daraus Bilddaten erzeugt werden, welche die
geometrischen Orte der Lumineszenzstrahlung abgebenden Markierungsmoleküle
mit einer über die optische Auflösung gesteigerten
Ortsauflösung angeben, und aus den Bilddaten ein zweites
Mikroskopie-Bild erzeugt wird, ein drittes Mikroskopieverfahren
zur Erzeugung eines dritten Mikroskopie-Bildes mittels Laserscanningmikroskopie,
ein viertes Mikroskopieverfahren, bei dem die Probe mit zur SIED-,
ESA- oder RESOLFT-Technik geeigneten Markierungsmolekülen
markiert wird und mittels SIED, ESA oder RESOLFT ein viertes Mikroskopie-Bild
erzeugt wird, wobei die mindestens zwei erhaltenen Mikroskopie-Bilder
zu einem Komposit-Bild überlagert werden.
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Die
Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Kombinations-Mikroskop,
ausgebildet zur Mikroskopie einer Probe mit mindestens zwei sich
in ihrer Auflösung unterscheidenden Mikroskopieverfahren,
wobei das Mikroskop aufweist: ein Objektiv, das für alle
Mikroskopieverfahren die Probe erfaßt, einen Detektionsstrahlengang und
mindestens einen Beleuchtungsstrahlengang, die zumindest teilweise
zusammenfallen und alle durch das Objektiv laufen, ein an den Detektionsstrahlengang
angebundenes Mikroskopmodul, das eine Tubuslinse und einen Flächendetektor
aufweist und zusammen mit dem Objektiv die Probe auf den Flächendetektor
abbildet, ein an den Beleuchtungsstrahlengang angebundenes Weitfeldbeleuchtungsmodul
zur Weitfeldbeleuchtung der Probe durch das Objektiv, wobei das
Weitfeldbeleuchtungsmodul zur Abgabe von Beleuchtungsstrahlung bei
mindestens zwei verschiedenen Wellenlängenbereichen ansteuerbar
ist, und ein im Beleuchtungsstrahlengang in Beleuchtungsrichtung
dem Weitfeldbeleuchtungsmodul nachgeordneter Beleuchtungsstrahlungsmodulator,
der ansteuerbar im Beleuchtungsstrahlengang aktivier- und deaktivierbar
ist und im aktivierten Zustand der Beleuchtungsstrahlung eine streifenförmige
Modulation aufprägt, wobei der Beleuchtungsstrahlungsmodulator
derart ansteuerbar ist, daß die streifenförmige
Modulation senkrecht zu einer optischen Achse des Beleuchtungsstrahlenganges
verschiebbar ist, und wobei weiter eine ansteuerbare Rotationseinrichtung vorgesehen
ist, mit welcher entweder die streifenförmige Modulation
um die optische Achse des Beleuchtungsstrahlenganges drehbar ist
oder durch den aktivierten Beleuchtungsstrahlungsmodulator gelaufene
und dadurch mit der streifenförmigen Modulation versehenen
Strahlenbündel im Beleuchtungsstrahlengang um die optische
Achse des Beleuchtungsstrahlenganges drehbar sind, und eine Steuereinrichtung,
die mit dem Mikroskopmodul, dem Weitfeldbeleuchtungsmodul, dem Beleuchtungsstrahlungsmodulator
und der Rotationseinrichtung verbunden ist und das Mikroskop in
verschiedene Betriebsmodi steuert, wobei die Steuereinrichtung dazu
ausgebildet ist, in einem ersten Betriebsmodus den Beleuchtungsstrahlungsmodulator
zu aktivieren und zusammen mit der Rotationseinrichtung anzusteuern
sowie den Flächendetektor auszulesen und von diesem gelieferte
Daten zu verarbeiten, um das erste Mikroskopieverfahren des Anspruchs
1 auszuführen, und dazu ausgebildet ist, in einem zweiten
Betriebsmodus den Beleuchtungsstrahlungsmodulator zu deaktivieren
und das Weitfeldbeleuchtungsmodul nacheinander zur Abgabe der Beleuchtungsstrahlung
bei den mindestens zwei verschiedenen Wellenlängenbereichen
anzusteuern sowie den Flächendetektor auszulesen und von
diesem gelieferte Daten zu verarbeiten, um das zweite Mikroskopieverfahren
des Anspruchs 1 auszuführen.
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Der
Erfindung legt also eine bislang noch nicht im Stand der Technik
realisierte oder beschriebene Kombination bestimmter hochauflösender
Mikroskopieverfahren mit klassischen Mikroskopieverfahren vor. Dadurch
ist es möglich, vergleichsweise kleine Probenfeldausschnitte
(im englischen auch als region of interest = ROI bezeichnet) hochauflösend
abzubilden und dennoch diese mit klassischen Mikroskopaufnahmen zu
ergänzen bzw. diese damit aufzufinden. Auch werden Meßabläufe
in der hochauflösenden Mikroskopie durch die Verwendung
von Daten aus dem klassischen Mikroskopieverfahren vereinfacht bzw.
die Qualität der Daten, die mit deren hochauflösenden
Mikrokopieverfahren gewonnen werden, steigen.
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Für
die Erfindung können verschiedene, für sich alleine
bereits im Stand der Technik bekannte hochauflösende Mikroskopieverfahren
mit der Laser-Scanning-Mikroskopie oder untereinander kombiniert
werden.
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Ein
im Rahmen der Erfindung relevantes hochauflösendes Verfahren
ist in
US 5866911 beschrieben, deren
diesbezügliche Offenbarung hier vollumfänglich
einbezogen sei. Dabei wird zur Auflösungssteigerung mit
einer zwei Wellenlängen aufweisenden Lichtstrahlung gearbeitet.
Die Lichtstrahlung der einen Wellenlänge wird als Anregungslichtstrahl
auf die zu messende Probe mittels eines Objektives fokussiert und
regt dort Lumineszenz, hier Fluoreszenz, an. Die Erhöhung
der Ortsauflösung erfolgt nun dadurch, daß ein
Lichtstrahl mit der anderen Wellenlänge in Teilbereichen
den durch den Anregungslichtstrahl angeregten fluoreszierenden Zustand
entvölkert. Man bezeichnet diesen Lichtstrahl deshalb auch
als „Entvölkerungs-Strahlung”. Nun erfolgt
die Einstrahlung z. B. so, daß sich das Hauptmaximum des
Entvölkerungs-Lichtstrahls und das Hauptmaximum des Anregungslichtstrahls
teilweise überdecken. Durch diese „Abregung” der
Probe an den Rändern des mit Anregungsstrahlung beleuchteten
Bereiches, sendet nur noch ein reduziertes Volumen Fluoreszenz aus.
Die Auflösung ist durch diese Volumenreduktion folglich
gesteigert.
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Mehrere
Mechanismen können eine solche Entvölkerung bewirken,
wie beispielsweise wie in der
DE 4416558 C2 ,
US
6633432 oder
DE
10325460 A1 beschrieben. Sie alle können hier
verwendet werden.
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Ein
Beispiel ist die Abregung durch stimulierte Emission (SIED). Eine
Anregungsstrahlung fegt ein Fluorophor an. Eine Entvölkerung
des derart angeregten Niveaus wird in Richtung des Grundniveaus
durch Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge im Bereich der
Fluoreszenzwellenlänge bewerkstelligt. Diese stimulierte
Emission hat eine Wellenlänge, die der der Lumineszenz
fast identisch entspricht. Somit ist die Anregungswellenlänge
um den Betrag des Stokesshiftes kurzwelliger als die der Entvölkerungs-Strahlung.
Die Auflösungssteigerung gemäß dieses
Ansatzes verwendet also zwei unterschiedliche Lichtquellen, wie
auch die
DE 4416558 C2 belegt,
deren dazu relevante Offenbarung hier voll einbezogen sei.
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Ein
weiterer möglicher Prozeß der Entvölkerung
für das angeregte Niveau ist eine Anregung in ein noch
höheres Niveau, das keine Lumineszenz mehr aussenden kann.
Dieses Anheben wird im Englischen als Excited State Absorption bezeichnet,
weshalb dieses Vorgehen auch mit dem Kürzel ESA belegt
ist. Eine entsprechende Schilderung dieses Prozesses findet sich
beispielsweise in der hier ebenfalls eingebundenen
US 6633432 . Da der Abstand der Energieniveaus
in einer Probe bzw. einem Farbstoff zu höheren Niveaus
hin abnimmt, verwendet man zur Entvölkerung bei dem ESA-Prozeß eine
Lichtquelle mit einer geringeren Energie und damit längeren
Wellenlänge, als zur Anregung. Man verwendet wiederum zwei
verschiedene Wellenlängen, also z. B. Lichtquellen.
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Ein
weiteres Verfahren zur Entvölkerung stellt für
die Fluoreszenz die sogenannte Reversible Saturable Optical Fluorescence
Transition (RESOLFT) dar, die z. B. in der auch voll einbezogenen
DE 10325460 A1 beschrieben
ist. Dieses Mikroskopieverfahren verwendet zum räumlich
hochauflösenden Abbilden einen Markierungsstoff, der mit
Hilfe eines Umschaltstrahls wiederholt aus einem ersten Zustand,
in dem Fluoreszenz stattfindet, in einen zweiten Zustand, in dem
der Farbstoff nicht fluoresziert, überführbar
ist, wobei der Farbstoff aus dem zweiten Zustand in den ersten Zustand
zurückkehren kann. Die Probe wird in Teilbereichen mit
dem Umschaltstrahl in den zweiten Zustand überführt,
wobei ein definierter Bereich der Probe ausgelassen wird. Mit einem
Anregungsstrahl wird dann Fluoreszenzlicht angeregt und anschließend
registriert. Das Fluoreszenzlicht stammt dann nur aus Probenvolumina,
die zuvor nicht mit dem Umschaltstrahl beaufschlagt wurden. Durch
geeignete Überlappung von Anregungsstrahl und Umschaltstrahl
ist das Volumen, aus dem Fluoreszenzlicht emittiert wird, kleiner,
als es die Auflösung des Anregungsstrahls und die Schärfe
der Nullstelle des Umschaltstrahls a priori erlaubten. Eine Weiterbildung
dieses hochauflösenden Mikroskopieverfahrens ist in der
EP 1907826 , welche diesbezüglich
hier ebenfalls vollständig eingebunden wird, beschrieben.
Dort gelingt durch Verwendung geeigneter Farbstoffe die Anforderungen
an die nötigen Strahlungsquellen zu vereinfachen. Für
die Entvölkerung wird hier eine Nichtlinearität
des Anregungsverhaltens des Farbstoffes ausgenutzt, wodurch Strahlung
einer Wellenlänge eingespart werden kann.
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In
allen drei genannten hochauflösenden Mikroskopieverfahren
erfolgt also die Verhinderung von Fluoreszenz durch den Einsatz
von Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge, die ungleich
der Wellenlänge zur Anregung ist. Zugleich sollte diese
Lichtstrahlung mindestens eine scharf begrenzte örtliche
Nullstelle der Strahlungsleistung aufweisen, die die endgültige
Auflösung der detektierten Fluoreszenzstrahlung bestimmt.
Für den SIED-Prozeß kann z. B. eine Anregungsstrahlquelle
eine Airy-Verteilung in der Probe erzeugen, mit der die Probe aus
dem Grundniveau in den angeregten Zustand überführt
wird. Die Entvölkerung des angeregten Zustands erfolgt
mittels einer Entvölkerungslichtquelle, die z. B. durch
eine Phasenplatte eine donut- oder torusförmigen Strahlverteilung
in der Probe hat. Die Lumineszenzstrahlung der nicht-entvölkerten
d. h. nicht-abgeregten Farbstoffmoleküle wird mit Hilfe
eines Detektors erfaßt. Durch die Entvölkerung
wird die Auflösung des Mikroskops über die Beugungsbegrenzung,
die sich aus der Airy-Verteilung ergibt, hinaus gesteigert. Dies kommt
durch eine verkleinerte Punktverwaschungsverteilung des hochauflösenden
Mikroskops im Vergleich zum konventionellen Mikroskop zum Ausdruck.
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Ein
weiteres hochauflösendes Mikroskopieverfahren, das im Rahmen
der Erfindung möglich ist, ist in der
EP 1157297 B1 angesprochen.
Dabei werden mittels strukturierter Beleuchtung nichtlineare Prozesse
ausgenützt. Als Nichtlinearität dient die Sättigung
der Fluoreszenz. Durch eine strukturierte Beleuchtung, welche mittels
eines Beleuchtungsstrahlungsmodulators erzeugt wird, erfolgt eine
Verschiebung des Objektraumspektrums relativ zur Übertragungsfunktion
des optischen Systems. Konkret bedeutet die Verschiebung des Spektrums,
daß Objektraumfrequenzen V0 bei einer Raumfrequenz V0–Vm,
wobei Vm die Frequenz der strukturierten Beleuchtung ist, übertragen
werden. Bei gegebener, durch das System maximal übertragbarer
Raumfrequenz ermöglicht dies den Transfer von um die Verschiebefrequenz
Vm über der maximalen Frequenz der Übertragungsfunktion
liegender Raumfrequenzen des Objektes. Dieser Ansatz erfordert einen
Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung
mehrerer Aufnahmen für ein Bild. Die bezüglich
der entsprechenden Beschreibung des auflösenden Mikroskopieverfahrens
ebenfalls voll einbezogene
EP
1157297 B1 verwendet also eine strukturierte Weitfeldbeleuchtung
der Probe, wobei, beispielsweise durch ein Amplituden/Phasen-Gitter,
eine streifenförmige Modulation aufgeprägt wird.
Fluoreszenz in der Probe wird ebenfalls weitfelddetektiert. Die
Modulation wird nun in mindestens drei verschiedene Drehlagen gebracht,
z. B. 0°, 120° und 240°, und in jeder
Drehlage wird die Modulation in mind. drei verschiedene Positionen
verschoben. In jeder Verschiebung der Drehlagen (insgesamt also
mind. 9 Bildpositionen) wird die Probe weitfelddetektiert. Weiter hat
das Gitter Frequenzen möglichst nahe der Grenzfrequenz,
zu deren Übertragung die verwendete optische Anordnung
in der Lage ist. Unter Verwendung einer Fourieranalyse erfolgt dann
die erwähnte Spektrumverschiebung, wobei insbesondere die
0. und +/– 1. Beugungsordnung in den Bildern ausgewertet
wird. Dieses Mikroskopieverfahren wird auch als SIM-Verfahren bezeichnet.
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Eine
Weiterbildung des SIM-Verfahrens kann mit einer linienförmigen
Beleuchtung erreicht werden, die senkrecht zur Streifenrichtung
der Modulation liegt. Man hat dann eine Linienbeleuchtung, wobei
längs der Linie sich die Streifenstruktur wiederfindet.
Die linienförmige Beleuchtung ist ihrerseits durch die
Modulation strukturiert. Die linienförmige Beleuchtung
erlaubt eine konfokale Schlitzdetektion und damit nochmals eine Auflösungssteigerung.
Dieses Verfahren wird auch als SLIM abgekürzt.
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Eine
nochmalige Steigerung der Auflösung erhält man,
wenn die Beleuchtungsstrahlungsmodulation an Beleuchtungsstrahlung
ausgeführt wird, die derart intensiv ist, daß die
Fluoreszenz der Probe in den hellen Bereich der strukturierten Beleuchtung
eine Sättigung erreicht. Dann hat die Modulation auf der
Probe bezüglich der Fluoreszenz keine Sinusverteilung mehr,
sondern aufgrund der Sättigungseffekte noch höhere
Harmonische jenseits der optischen Grenzfrequenz. Dieses Verfahren
wird auch als saturated pattern excitation microscopy (SPEM) abgekürzt.
Diese drei Varianten einer Mikroskopie, die mittels einer strukturierten
Beleuchtung hochauflösend ist, können ebenfalls
in der erfindungsgemäßen Kombination bzw. mit
dem erfindungsgemäßen Mikroskop realisiert werden.
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Ein
weiteres hochauflösendes Verfahren, das unabhängig
von der Laserscanningmikroskopie eine Auflösung jenseits
der Beugungsgrenze erreicht, ist schließlich auch aus der
WO 2006127692 und der
DE 10 2006 021 317 bekannt.
Alle drei Druckschriften werden diesbezüglich hier voll
in die Offenbarung einbezogen. Dieses mit PAL abgekürzte
Mikroskopieverfahren (Photo Activated Light Microscopy) verwendet
eine Markierungssubstanz, welche mittels eines optischen Aktivierungssignals
aktiviert werden kann, so daß sie nur im aktivierten Zustand
mit Anregungsstrahlung zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung
angeregt werden kann. Nicht aktivierte Moleküle der Markierungssubstanz
senden auch nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung keine oder
zumindest keine merkliche Fluoreszenzstrahlung ab. Im PAL-Mikroskopieverfahren
wird nun das Aktivierungssignal so aufgebracht, daß die
dadurch aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten
aktivierten Molekülen so beabstandet sind, daß sie
gemessen an der optischen Auflösung der Mikroskopie getrennt
oder nachträglich trennbar sind. Die aktivierten Moleküle
werden also zumindest weitgehend isoliert. Für diese isolierten
Moleküle wird dann das Zentrum deren auflösungsbegrenzt
bedingter Strahlungsverteilung ermittelt und daraus rechnerisch
die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit
bestimmt, als es die optische Abbildung eigentlich zuläßt.
Diese gesteigerte Auflösung durch rechnerische Schwerpunktbestimmung
der Beugungsverteilung wird in der englischen Fachliteratur auch
als „superresolution” bezeichnet. Sie erfordert, daß in
der Probe zumindest einige der aktivierten Markierungsmoleküle
mit der optischen Auflösung mit der die Lumineszenzstrahlung
detektiert wird, unterscheidbar, also isoliert sind. Dann kann für
solche Moleküle die Ortsangabe mit gesteigerter Auflösung
erreicht werden.
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Zum
Isolieren einzelner Markierungsmoleküle nutzt das PAL-Mikroskopieverfahren
die Tatsache, daß die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Markierungsmolekül
nach Empfang eines Photons der Aktivierungsstrahlung aktiviert wird,
für alle Moleküle gleich ist. Über die
Einstellung der Intensität der Umschaltstrahlung und damit
die Zahl der Photonen, die auf eine Flächeneinheit der
Probe fällt, kann also dafür gesorgt werden, daß die
Wahrscheinlichkeit, in einem Flächenbereich der Probe vorhandene
Markierungsmoleküle zu aktivieren, so gering ist, daß es
ausreichend Bereiche gibt, in denen innerhalb der optischen Auflösung
nur unterscheidbare Markierungsmoleküle Fluoreszenzstrahlung
emittieren. Durch passende Wahl der Intensität, d. h. der
Photonendichte der Umschaltstrahlung, wird erreicht, daß möglichst
nur bezogen auf die optische Auflösung isoliert liegende
Markierungsmoleküle aktiviert werden und nachfolgend Fluoreszenzstrahlung
aussenden. Für diese isolierten Moleküle wird
dann rechnerisch der Schwerpunkt der beugungsbedingten Intensitätsverteilung
und damit die Lage des Markierungsmoleküls mit gesteigerter
Auflösung ermittelt. Zur Abbildung der gesamten Probe wird
die Isolierung der Markierungsmoleküle der Teilmenge durch
Einbringen der Aktivierungsstrahlung, nachfolgende Anregung und
Fluoreszenzstrahlungsabbildung so lange wiederholt, bis möglichst
alle Markierungsmoleküle einmal in einer Teilmenge enthalten
und innerhalb des Auflösung der Abbildung isoliert waren. Zwischen
den aufeinanderfolgenden Schritten des Anregens und der erneuten
Aktivierung werden die Markierungsmoleküle deaktiviert.
Dies kann entweder durch ein zusätzliches (vorzugsweise
optisches) Deaktivierungssignal oder dadurch erreicht werden, daß die
Markierungsmoleküle nach der Anregung und der Aussendung
von Fluoreszenzstrahlung ausbleichen.
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Das
PAL-Mikroskopieverfahren hat den Vorteil, daß weder für
die Aktivierung, noch die für Anregung eine hohe Ortsauflösung
benötigt wird. Statt dessen kann sowohl die Aktivierung
als auch die Anregung in Weitfeldbeleuchtung erfolgen.
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Im
Ergebnis werden die Markierungsmoleküle durch geeignete
Wahl der Intensität der Aktivierungsstrahlung statistisch
in Teilmengen aktiviert. Deshalb muß für die Generierung
eines Gesamtbildes einer Probe, in dem die Positionen aller Markierungsmoleküle
rechnerisch mit z. B. jenseits der Beugungsgrenze liegender Auflösung
bestimmt werden können, eine Vielzahl von Einzelbildern
ausgewertet werden. Die Positionsbestimmung der Moleküle
in den Einzelbildern erfolgt durch rechnerische Prozeduren, wie
sie beispielsweise in Egner et al., Biophysical Journal,
S. 3285–3290, Band 93, November 2007, beschrieben
sind.
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Die
erfindungsgemäße Kombination verschiedener hochauflösender
Mikroskopieverfahren untereinander oder mit der Laserscanningmikroskopie
und gegebenenfalls auch zusätzlich mit normaler Weitfeldmikroskopie
erlaubt es, beim Auftreten eines vorbestimmten Musters im Bild die
Probe dann mit einem der hochauflösenden Mikroskopieverfahren
abzubilden, insbesondere nachdem die Probe zuvor hinsichtlich in
der Probe ablaufender Veränderungen fixiert wurde. Da bei
hochauflösenden Mikroskopieverfahren die Bildaufnahmegeschwindigkeit
reduziert ist, kann eine schnelle Bilderzeugung erreicht werden,
wenn für das hochauflösende Mikroskopieverfahren
ein kleines Probenfeld ausgewählt wird. Zudem können
auf diese Art und Weise dynamische Prozesse untersucht werden, die
bezogen auf die Bildaufnahmegeschwindigkeit des hochauflösenden Verfahrens
eigentlich zu schnell ablaufen, indem erst bei Auftreten des vorbestimmten
Musters, das einen bestimmten Zustand der dynamischen Entwicklung
anzeigt, die Probe fixiert und hochaufgelöst vermessen
wird. Für die Fixierung ist es bevorzugt, eine entsprechende
Probenfixierungseinrichtung, wie z. B. zum Auftropfen einer Fixierlösung
oder zum Schockgefrieren, im Mikroskop integrieren. Alternativ kann
man auch eine, z. B. lebende Probe, in einem Ruhezustand hochauflösend
untersuchen und durch optische, chemische oder andere Stimuli schnelle
dynamische Prozesse initiieren und diese dann mit einem schnelleren
der anderen Mikroskopieverfahren untersuchen, z. B. mit LSM oder
klassischer Weitfeldmikroskopie. Eine solche Beobachtungsfolge (hochauflösende
Erfassung eines Ruhezustandes, Stimulierung einer dynamischen Veränderung,
Betrachtung der dynamischen Veränderung mit einem geringer
auflösenden und damit schnelleren Mikroskopieverfahren)
kann bei Bedarf auch zyklisch wiederholt werden.
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Verwendet
man klassische Verfahren und hochaufgelöste Verfahren simultan
(z. B. LSM und PAL-M), so können beispielsweise sich schnell
veränderte Strukturen mit dem klassischen Verfahren und
statische Objekte hochaufgelöst erfaßt werden.
Es ist also im Rahmen der Erfindung vorgesehen, daß die
unterschiedlichen Mikroskopieverfahren unterschiedliche, gegebenenfalls überlappende
Bildfelder in der Probe simultan erfassen. Beispielsweise kann man
Zellmembranen statisch mittels PAL-M vermessen und zugleich Vesikel hochdynamisch
mittels eines linienscannenden LSM mit klassischer Auflösung
erfassen.
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Die
unterschiedlichen Mikroskopie-Bilder werden erfindungsgemäß kombiniert,
insbesondere zusammengefügt oder überlagert. Dies
kann zweidimensional, dreidimensional und jeweils zusätzlich
auch über der Zeit erfolgen, wobei die Bildfelder, wie
bereits erwähnt, unterschiedliche Größe
haben können. Die Bildfelder können sich voll
oder teilweise überlappen, es ist aber auch möglich,
sie nebeneinander zu legen. Um eine korrekte Relativlage der kombinierten
Bilder zu gewährleisten, werden vorzugsweise Bildmarkierungen
ausgewertet. Diese können erhalten werden, indem die Probe
zuvor mit entsprechenden Strukturen, z. B. Partikeln, insbesondere
Goldpartikeln, versehen wird, die in den verwendeten Mikroskopie-Bildern
erscheinen. Die Lagen dieser Bildmarkierungen werden zur Ausrichtung
und Justage der einzelnen Bilder ausgewertet und von der Steuereinrichtung
berücksichtigt.
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Es
zeigte sich, daß mit dem erfindungsgemäßen
Vorgehen durch die Hinzunahme des klassisch aufgelösten
Bildes ein Zusammenhang zwischen hochaufgelösten Bildelementen
leicht hergestellt werden kann. Auch ist es möglich, teilweise
komplementäre Informationen durch die Anwendung mindestens
zweier Mikroskopieverfahren zu erschließen. Wird beispielsweise
eine TIRF-Beleuchtung für das PAL-Mikroskopieverfahren
verwendet, erfaßt man hochsensible Bildinformationen an
der Grenzfläche zum Deckglas. Die parallele Anwendung der
Laserscanningmikroskopie gewinnt aufgrund der höheren Eindringtiefe
auch Informationen aus anderen Probenebenen und erlaubt es, diese
mit der hochaufgelösten Detailinformation aus dem PAL-Mikroskopieverfahren
in einen Zusammenhang zu stellen. Es wird hierdurch beispielsweise
möglich, bestimmte Abläufe hochaufgelöst
an Membranen zu studieren und gleichzeitig in Bezug zu Vorgängen
innerhalb der Zelle oder eines Zellverbandes zu setzen, die mit
klassischer Auflösung erfaßt wurden.
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Insbesondere
ist es möglich, den Probenausschnitt, der mit einen der
weiteren, insbesondere eines der hochaufgelösten Mikroskopie-Verfahren
abgebildet wird, hinsichtlich Lage und Größe abhängig
von Information aus einem der anderen Mikroskopie-Bilder zu wählen.
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Das
erfindungsgemäße Vorgehen erlaubt aber nicht nur
die obige Kombination unterschiedlicher Mikroskopieverfahren zur
Steigerung der Information über eine Probe, sondern auch
eine Wechselwirkung der Mikroskopieverfahren hinsichtlich ihrer
Durchführung untereinander. Dazu ist es möglich,
in einem der Mikroskopiebilder vor der Kombinierung eine Bildauswertung
vorzunehmen und daraus mindestens eine Steuergröße
für die Aufnahme eines der anderen Mikroskopie-Bilder abzuleiten,
also Steuergrößen für die Durchführung eines
der anderen Mikroskopieverfahren. Als Steuergrößen
sind möglich: Fokuslage, Probentischlage (d. h. Lage der
Probe senkrecht zur optischen Achse des Objektivs), Objektivwahl,
räumliche Verteilung einer Beleuchtungsstrahlung bei STD,
ESA oder RESOLFT, Bildausschnittswahl Einstellung einer Kameraempfindlichkeit,
lokale Beleuchtungsleistung einer Manipulationsstrahlung, welche
zur Beeinflussung der Fluoreszenzeigenschaften der Probe eingebracht
wird, Koordinatenübergabe bezüglich Bildausschnittlage
etc.
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Das
erfindungsgemäße Kombinations-Mikroskop weist
entsprechende Einrichtungen auf, so daß ein Anwender frei
in der Kombination der geschilderten Mikroskopieverfahren ist, die
dann als Betriebsmodi von der Steuereinrichtung am Kombinationsmikroskop
eingestellt werden.
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Insbesondere
ist ein einfaches Einstellen dieser Betriebsmodi möglich,
wenn die Beleuchtungsstrahlungen der einzelnen Module über
aktivierbare Schaltmittel zusammengeführt sind. Diese Schaltmittel
können Klapp- oder Einschwenkspiegel aufweisen, welche
die jeweilige Beleuchtungsstrahlung in den Beleuchtungsstrahlengang
einkoppeln, also den einen Teil-Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops
realisierenden Beleuchtungsstrahlengang des jeweiligen Moduls an
den, dann als Gesamtbeleuchtungsstrahlengang aufzufassenden Strahlengang
ankoppeln.
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Für
den Detektionsstrahlengang ist es vorteilhaft, einen Strahlteiler
vorzusehen, der in der Probe angeregte Fluoreszenzstrahlung zum
Flächendetektor leitet und damit den Detektionsstrahlengang
hinsichtlich der Weitfelddetektion abteilt. Um größtmögliche
Freiheit bei der Ausführung der einzelnen Mikroskopieverfahren
zu haben, ist es vorteilhaft, die einzelnen Klapp- oder Einschwenkspiegel
sowie den Strahlteiler in Form von dichroitischen Strahlteilern
auszuführen, die austauschbar sind, beispielsweise durch
ein bekanntes Teilerrad oder mehrere solche Teilerräder.
Bei geeigneter Wahl deren spektralen Eigenschaften können
hierdurch die erwähnten Mikroskopieverfahren auch simultan
realisiert werden, indem die Probe entsprechend simultan beleuchtet
wird. Hinsichtlich des Laserscanningmoduls bzw. des Manipulationsbeleuchtungsstrahlungsmoduls findet
z. B. ein Einkoppeln eines Punktscanners im Laserscanningmikroskop
bzw. im Manipulationsbeleuchtungsstrahlungsmodul an einen Rest des
Beleuchtungsstrahlengangs statt, der Weitfeld- oder Linienbeleuchtung
führt. Somit ist es möglich, die entsprechenden
Schaltmittel auch als achromatische Strahlteiler auszuführen,
wie beispielsweise in der
US
2008/0088920 beschrieben sind, deren Offenbarung hier diesbezüglich vollumfänglich
einbezogen wird.
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Für
die Mikroskopieverfahren SIM, SLIM und SPEM ist eine Rotation der
Modulation der strukturierten Beleuchtung erforderlich, wie eingangs
bereits geschildert wurde. Die Rotation läßt sich
besonders einfach realisieren, wenn dem Modulator, welcher zur Realisierung
dieser Mikroskopieverfahren im gemeinsamen Abschnitt von zweiten
und dritten Beleuchtungsstrahlengang liegt, ein Bildfeldrotator
nachgeordnet ist. Dieser kann beispielsweise durch ein Abbe-König-Prisma
realisiert sein. Dieser nachgeordnete Bildfeldrotator ist besonders
vorteilhaft für das SLIM-Mikroskopieverfahren, da dann
die senkrechte Lage von streifenförmiger Modulation und
linienförmiger Beleuchtung nur einmal eingestellt werden
muß und eine Nachführung, die ansonsten bei einer
Rotation des Modulators erforderlich wäre, entfällt.
Natürlich kann ach der Modulator selbst gedreht werden,
z. B. durch ein drehbares Streifengitter oder einen geeignet angesteuerten
Modulator (z. B. ein DMD oder LCD).
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Das
erfindungsgemäße Mikroskop ist besonders einfach
aufgebaut, wenn die einzelnen Teil-Beleuchtungsstrahlengänge
der Module kaskadenartig zu einem Gesamt-Beleuchtungsstrahlengang
vereinigt werden, der dann am Strahlteiler für den Detektionsstrahlengang
eingekoppelt wird. In den Gesamt-Beleuchtungsstrahlengang werden
also an verschiedenen Stellen die einzelnen Teil-Beleuchtungsstrahlengänge
eingekoppelt, bevorzugt durch die erwähnten Schaltmittel.
Schaltmittel sind natürlich dann nicht erforderlich, wenn
die Aktivierung bzw. Deaktivierung der einzelnen Teil-Beleuchtungsstrahlengänge
anderweitig erfolgen kann, beispielsweise in den betroffenen Modulen
selbst.
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Es
versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend
noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen
Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar
sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend
wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten
Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren,
noch näher erläutert. Es zeigen:
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1 zeigt
eine schematische Darstellung eines Kombinationsmikroskops,
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2 zeigt
schematisch die Überlagerung verschiedener Bilder, die
mit dem Kombinationsmikroskop der 1 gewonnen
wurden,
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3 zeigt
eine Schemadarstellung zur Steuerung des Kombinationsmikroskops
der 1 und
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4 zeigt
ein weiteres Kombinationsmikroskop ähnlich dem der 1.
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In 1 ist
ein Mikroskop 1 dargestellt, das klassische Mikroskopieverfahren,
d. h. Mikroskopieverfahren deren Auflösung beugungsbegrenzt
ist, mit hochauflösenden Mikroskopieverfahren simultan
ausführen kann, d. h. mit Mikroskopieverfahren deren Auflösung über
die Beugungsgrenze hinaus gesteigert ist. Das Mikroskop 1 ist
modular aufgebaut, und zur besseren Erläuterung der Erfindung
wird es in einer umfangreichen Ausbaustufe beschrieben. Es ist aber
auch eine reduzierte Bauweise mit weniger Modulen möglich.
Auch ist der modulare Aufbau auch nicht zwingend; eine einteilige
oder nicht-modulare Bauform ist ebenfalls möglich. Das
Mikroskop 1 dieses Beispiels der 1 ist auf
Basis eines herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskops aufgebaut
und erfaßt eine Probe 2.
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Es
weist ein Objektiv
3 auf, durch das die Strahlung für
alle Mikroskopieverfahren läuft. Das Objektiv
3 bildet über
einen Strahlteiler
4 die Probe zusammen mit einer Tubuslinse
5 auf
einen CCD-Detektor
6 ab, der ein Beispiel für
einen allgemein möglichen Flächendetektor ist.
Insofern verfügt das Mikroskop
1 über
ein herkömmliches Lichtmikroskopmodul
7, und der
Strahlengang von der Probe
2 durch das Objektiv
3 und
die Tubuslinse
5 zum CCD-Detektor
6 entspricht
einem herkömmlichen Weitfeld-Detektionsstrahlengang
8.
Der Strahlteiler
4 ist, wie durch den Doppelpfeil in
1 angedeutet,
austauschbar, um zwischen Strahlteilern mit verschiedenen dichroitischen
Eigenschaften bzw. achromatischen Strahlteilern gemäß
US 2008/0088920 wechseln
zu können.
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In
den Strahlengang zum Objektiv 3 ist weiter ein Laser-Scanning-Modul 9 angebunden,
dessen LSM-Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang über
einen Schaltspiegel 11, der ebenfalls Strahlteilerfunktionen
hat, in den Strahlengang zum Objektiv 3 eingekoppelt ist.
Der Strahlengang vom Schaltspiegel 11 zum Objektiv 3 durch
den Strahlteiler 4 ist also ein Strahlengang, in dem Beleuchtungsstrahlengang
und Detektionsstrahlengang vereint sind. Dies gilt sowohl hinsichtlich
des Laser-Scanning-Moduls 9 also auch hinsichtlich des
Weitfeld- Detektionsstrahlengangs 8, da, wie noch zu erläutern
sein wird, am Schaltspiegel 11 auch Beleuchtungsstrahlung
eingekoppelt wird, die zusammen mit dem Weitfeld-Detektionsstrahlengang 8,
d. h. dem CCD-Detektor 6, Mikroskopieverfahren realisiert.
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Der
Schaltspiegel 11 und der Strahlteiler 4 sind zu
einem Strahlteilermodul 12 zusammengefaßt, wodurch
die Möglichkeit besteht, den Schaltspiegel 11 und
den Strahlteiler 4 anwendungsabhängig zu wechseln. Dies
ist durch Doppelpfeile veranschaulicht. Weiter ist im Strahlteilermodul 12 ein
Emissionsfilter 13 vorgesehen, das im Weitfeld-Detektionsstrahlengang 8 liegt
und die spektralen Anteile, welche durch den Weitfeld-Detektionsstrahlengang 8 propagieren
können, geeignet filtert. Natürlich ist auch das
Emissionsfilter 13 im Strahlteilermodul 12 austauschbar.
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Das
Laser-Scanning-Modul 9 erhält für den
Betrieb erforderliche Laserstrahlung über eine Lichtleitfaser 14 von
einem Lasermodul 15.
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In
der in 1 dargestellten Bauweise wird am Strahlteilermodul 12,
genauer am Schaltspiegel 14, ein Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16 eingekoppelt,
durch den Beleuchtungsstrahlung für verschiedene Mikroskopieverfahren
läuft. In diesen Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16 sind
verschiedene Teil-Beleuchtungsstrahlengänge einzelner Beleuchtungsmodule
eingekoppelt. Beispielsweise koppelt ein Weitfeldbeleuchtungsmodul 17 über
einen Schaltspiegel 18 Weitfeldbeleuchtungsstrahlung in
den Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16, so daß über
eine Tubuslinse 27 und das Objektiv 3 die Probe 2 weitfeldbeleuchtet
wird. Das Weitfeldbeleuchtungsmodul kann beispielsweise eine HBO-Lampe
aufweisen. Als weiteres Beleuchtungsmodul ist ein TIRF-Beleuchtungsmodul 19 vorgesehen,
das bei geeigneter Stellung des Schaltspiegels 18 eine TIRF-Beleuchtung
realisiert. Das TIRF-Beleuchtungsmodul 19 erhält
dazu Strahlung von Lasermodul 15 über eine Lichtleitfaser 20.
Das TIRF-Beleuchtungsmodul 19 weist einen Spiegel 21 auf,
der längsverschieblich ist. Durch die Längsverschiebung
wird der Beleuchtungsstrahl, der vom TIRF-Beleuchtungsmodul 19 abgegeben wird,
senkrecht zur Hauptausbreitungsrichtung des abgegebenen Beleuchtungsstrahls
verschoben, wodurch im Ergebnis am Objektiv 3 die TIRF-Beleuchtung
unter einem einstellbaren Winkel zur optischen Achse des Objektivs 3 einfällt.
Auf diese Weise kann einfach der nötige Winkel der Totalreflexion
am Deckglas sichergestellt werden. Natürlich sind auch
andere Mittel geeignet, um diese Winkelverstellung zu bewirken.
Auch kann das TIRF-Beleuchtungsmodul 19 als Weitfeldbeleuchtungsquelle
arbeiten, indem der Spiegel 21 so eingestellt wird, daß der
Beleuchtungsstrahl auf der optischen Achse einfällt.
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Weiter
ist an dem Sammel-Beleuchtungsstrahlengang der Beleuchtungsstrahlengang
eines Manipulatormoduls 22 angekoppelt, das ebenfalls über
eine nicht näher bezeichnete Lichtleitfaser Strahlung vom
Lasermodul 15 erhält und eine Punkt- oder linienförmige
Strahlverteilung scannend über die Probe 2 führt.
Das Manipulatormodul 22 entspricht also im wesentlichen
dem Beleuchtungsmodul eines Laserscanningmikroskops, und demzufolge
kann das Manipulatormodul 22 auch mit dem Detektor des
Laser-Scanning-Moduls 9 oder der Weitfeld-Detektion durch
den CCD-Detektor 6 kombiniert betrieben werden.
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Im
Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16 ist weiter als Strahlungsmodulator
ein Streifengitter 23 vorgesehen, das in einer Zwischenbildebene
des Beleuchtungsstrahlenganges liegt und dessen Gitterkonstante unterhalb
der Grenzfrequenz liegt, die mit dem Mikroskop 1 in die
Probe 2 übertragen werden kann. Das Gitter 23 bewirkt
eine streifenförmige Modulation der auf es einfallenden
Beleuchtungsstrahlung. Das Gitter 23 ist quer zur optischen
Achse des Sammel-Beleuchtungsstrahlengangs 16 verschieblich
und kann auch aus dem Strahlengang herausgeschwenkt werden. Hierzu
ist ein entsprechender Verschiebeantrieb 24 vorgesehen.
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In
Beleuchtungsrichtung dem Gitter nachgeordnet sitzt im Sammel-Beleuchtungsstrahlengang 16 weiter
ein Bildfeldrotator 25, der von einem Rotatorantrieb 26 gedreht
wird. Bei dem Bildfeldrotator kann es sich beispielsweise um ein
Abbe-König-Prisma handeln.
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Die
Module und Antriebe sowie Detektoren des Mikroskops 1 sind
alle über nicht näher bezeichnete Leitungen mit
einer Steuereinrichtung 28 verbunden. Diese Verbindung
kann beispielsweise über einen Daten- und Steuerbus erfolgen.
Die Steuereinrichtung 28 steuert das Mikroskop 1 in
verschiedene Betriebsmodi.
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Das
Steuergerät 28 ist ausgebildet, um am Mikroskop 1 klassische
Mikroskopie, d. h. Weitfeldmikroskopie (WF), Laserscanningmikroskopie
(LSM) und auch Fluoreszenzmikroskopie mit totaler interner Reflexion (TIRF)
auszuführen und diese mit hochauflösenden Mikroskopieverfahren,
wie in den eingangs erwähnten PAL-M, SIM, SLIM, SPEM, SIED,
RESOLFT, zu kombinieren und auch diese untereinander zu kombinieren. Das
Mikroskop 1 der 1 weist im wesentlichen zwei
zum Laserscannerbeleuchten geeignete Module auf, nämlich
das Laserscanningmodul 9 sowie das Manipulatormodul 22.
Natürlich sind auch andere Kombinationen möglich.
Diese Module sind über Tubuslinsen mit dem Objektiv 3 auf
die Probe 2 gekoppelt. Das Manipulatormodul 22 beinhaltet
lediglich den Anregungsteil eines Laserscanningmoduls, also ohne
Detektion. Dadurch kann die Probe punktförmig beleuchtet
und der Beleuchtungsspot über die Probe 2 gerastert
werden. Vorzugsweise befindet sich im Manipulatormodul 22 auch
eine Umschalteinheit, z. B. eine Umschaltlinse oder Zylinderlinse,
mit welcher eine Umschaltung zwischen einer punktförmigen
und einer linienförmigen Beleuchtung erfolgt. Diese linienförmige
Beleuchtung ist besonders dann vorteilhaft, wenn das Gitter 23,
welches sich in einem Zwischenbild des Sammel-Beleuchtungsstrahlengangs 16 befindet,
eingeschwenkt ist und senkrecht zur Linie der linienförmigen
Beleuchtung liegt. Dann kann mittels des Manipulatormoduls 22 auf
einfache Weise das SLIM-Mikroskopieverfahren realisiert werden.
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Alternativ
zum Gitter 23 kann auch ein variabel einstellbarer Streifenmodulator
oder ein DMD zur Erzeugung einer strukturierten Beleuchtung in der
Probe 2 eingesetzt werden. Dann ist natürlich
der Verschiebeantrieb 24 sowie die Ein-/Ausschwenkbarkeit
des Gitters 23 nicht mehr erforderlich.
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Der
Bildfeldrotator 25 erlaubt es, die strukturierte Beleuchtung,
die durch das Gitter 23 (oder die dieses ersetzende Elemente)
erzeugt werden, um die optische Achse des Sammel-Beleuchtungsstrahlenganges 16 zu
drehen, so daß die strukturierte Beleuchtung in verschiedenen
Winkeln in der Probe 2 liegt. Somit kann durch Betrieb
des Manipulatormoduls 22 oder des Weitfeldbeleuchtungsmoduls 17,
jeweils in Kombination mit geeigneter Verstellung des Gitters 23 durch
das Steuergerät 28 SIM-, SLIM- oder SPEM-Mikroskopie
mit dem Mikroskop 1 ausgeführt werden. Natürlich
ist der Schaltspiegel 18 dann in die geeignete Stellung
zu bringen.
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Bei
ausgeschwenktem Gitter 23 kann eine klassische Weitfeldbeleuchtung
durch das Weitfeldbeleuchtungsmodul 17 bzw. eine klassische
TIRF-Beleuchtung durch das TIRF-Beleuchtungsmodul 19 erfolgen.
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Zur
Umschaltung zwischen den einzelnen Betriebsarten werden die Schaltspiegel 18 und 11 sowie
der Strahlteiler 4 geeignet eingestellt. Hierzu können
in der Realisierung Klapp- oder Einschenkspiegel verwendet werden,
so daß eine Umschaltung zwischen den Betriebsarten sequentiell
erfolgen kann. Alternativ sind auch dichroitische Spiegel möglich,
welche einen gleichzeitigen Betrieb der verschiedenen Module ermöglichen.
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Der
Strahlteiler 4 ist vorzugsweise als dichroitischer Strahlteiler
ausgeführt, dessen Spektraleigenschaften so einstellbar
sind, daß Spektralanteile von Fluoreszenzemission von Markierungsmolekülen,
die mit Hilfe des CCD-Detektors 6 detektiert werden sollen,
in den Weitfeld-Detektionsstrahlengang 8 gelangen und die übrigen
Spektralkomponenten möglichst transmittiert werden. Zur
Erhöhung der Flexibilität bezüglich der Verwendbarkeit
von Markierungsmolekülen mit verschiedenen Emissionscharakteristiken
sind im Strahlteilermodul 12 mehrere verschiedene Strahlteiler 4 und
Emissionsfilter 13 austauschbar angeordnet, z. B. auf einem Filterrad.
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Im
folgenden wird beispielhaft die Kombination von LSM und PAL-M unter
der Verwendung von dichroitischen Strahlteilern bzw. Schaltspiegeln 4, 11 und 18 beschrieben.
Beispielsweise wird die Probe 2 mit einer Alexa 543-Markierung
versehen, die bei einer Wellenlänge von 543 nm anregbar
ist und Fluoreszenzstrahlung oberhalb von 550 nm absendet. Für
die PAL-Mikroskopie wird eine EOS-FP-Markierung verwendet, die mit Strahlung
von 405 nm aktiviert werden kann, bei 488 nm anregbar ist und deren
Fluoreszenzstrahlung im Bereich zwischen 490 und 540 nm detektiert
wird. Für diese Betriebsart wird das Gitter 23 ausgeschwenkt
und das TIRF-Beleuchtungsmodul 19 wird so eingestellt,
daß TIRF-Beleuchtung mit 488 nm erfolgt.
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Die
Aktivierung des Markierungsstoffes EOS-FP erfolgt mit Hilfe des
Manipulatormoduls
22, der hierzu die Probe
2 mit
Laserstrahlung von 405 nm beleuchtet. Für die einzelnen
Strahlteiler bzw. Schaltspiegel werden folgende Parameter eingestellt.
| Element | 4 | 11 | 18 | 13 |
| Transmission | < 490;
> 550 | < 540 | < 480 | 490–550 |
| Reflexion | 490–550 | > 540 | > 480 | |
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Alle
oben angegebenen Wellenlängenangaben sind in nm.
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In
einer weiteren Betriebsart wird SIM mit PAL-M kombiniert, wobei
die Bildaufnahme sequentiell erfolgt. Dazu wird die Probe 2 beispielsweise
mit einer DAPI-Markierungsstoff versehen, welcher bei 405 nm anregbar
ist und dessen Fluoreszenzstrahlung zwischen 420 und 520 nm liegt.
Für das PAL-M-Verfahren wird eine tdEOS-Markierung der
Probe verwendet, welche bei 488 nm aktivierbar ist, bei 561 nm anregbar
und oberhalb 565 nm detektierbar ist.
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Die
Aktivierung dieses Markierungsstoffes erfolgt über das
TIRF-Beleuchtungsmodul
19. Für die Aufnahme des
PAL-M-Bildes wird das Gitter
23 ausgeschwenkt und das TIRF-Beleuchtungsmodul
19 aktiviert. Zur
Aufnahme des SIM-Bildes wird das Gitter
23 eingeschwenkt
und die Probe aus dem Weitfeldbeleuchtungsmodul
17 weitfeldbeleuchtet.
Die Strahlteiler/Schaltspiegel sind dann wie folgt eingestellt:
| Element | | 4 | 11 | 18 | 13 |
| SIM | Transmission | < 565 | Ausgeschwenkt | Spiegel | > 565 |
| Reflexion | > 565 |
| PAL-M | Transmission | < 420 | > 420 |
| Reflexion | > 420 |
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Alle
oben angegebenen Wellenlängenangaben sind in nm.
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2 zeigt
schematisch die Überlagerung der verschiedenen Mikroskopie-Bilder,
die mit Hilfe des Kombinations-Mikroskops 1 der 1 gewonnen
werden. Das Mikroskopie-Bild 29 stammt dabei aus einem klassischen
Mikroskopieverfahren, beispielsweise aus normaler Fluoreszenzmikroskopie
unter Verwendung der Weitfeld-Beleuchtungsquelle 17 und
der Weitfeld-Detektion. Das Mikroskopie-Bild 30 stammt
hingegeben aus einem hochauflösenden Verfahren, beispielsweise
einer SIM- oder PAL-Mikroskopie. 2 verdeutlicht, daß das
hochauflösende Bild 30 ein sehr viel kleineres
Objektfeld der Probe 2 abdeckt, als das Mikroskopie-Bild 29.
Im Mikroskopie-Bild 29 finden sich Strukturen 31;
Strukturen 32 sind im hochauflösenden Mikroskopie-Bild 30 vorhanden.
Das Steuergerät 28 überlagert nun in
einem durch einen Pfeil symbolisierten Überlagerungsvorgang 33 die
jeweiligen Bilder zu einem Gesamtbild. Die Überlagerung
kann zweidimensional, dreidimensional und für beide Varianten
auch jeweils über die Zeit erfolgen. 2 zeigt
exemplarisch eine zweidimensionale Darstellung. 2 ist
weiter schematisch dafür, daß ein höher
aufgelöstes Mikroskopie-Bild 30 mit einem niedriger
aufgelösten Mikroskopie-Bild 29 kombiniert wird,
d. h. daß die Kombination zweier unterschiedlich auflösender
Mikroskopieverfahren zu einem Gesamtbild führen. Zu erkennen
ist in 2, daß erst mit Hilfe des niedriger aufgelösten
Mikroskopie-Bildes 29 ein Zusammenhang zwischen den hoch
aufgelösten Details des höher aufgelösten
Mikroskopie-Bildes 30 hergestellt werden kann.
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Das
Mikroskopie-Bild 29 kann beispielsweise mittels SIM oder
LSM erzeugt werden, wobei Markierungsmoleküle einer ersten
Art zur Bildgebung beitragen, z. B. FITC oder Alexa. Das höher
aufgelöste Bild kann beispielsweise aus PAL-Mikroskopie
stammen und liefert Detailinformationen eines anderen Markierungsfarbstoffes,
z. B. DRONPA. Der Überlagerungsvorgang erlaubt es, im zusammengesetzten
Bild teilweise komplementäre Informationen der Verfahren
zu kombinieren. Beispielsweise mißt ein PAL-M mit TIRF-Beleuchtung
nur Informationen an der Grenzfläche zum Deckglas der Probe 2.
Wird parallel ein LSM-Mikroskopie-Bild aufgenommen, so kann aufgrund
der höheren Eindringtiefe auch Information aus anderen
Probenebenen gewonnen werden, und man kann diese mit dem hochaufgelösten
Mikroskopie-Bild und dessen Detailinformationen in Zusammenhang
bringen.
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Unter
Steuerung des Steuergerätes 28 ist es somit möglich,
bestimmte Abläufe hochaufgelöst, z. B. an Membranen,
zu studieren und gleichzeitig in Bezug zu anderen Vorgängen,
z. B. innerhalb einer Zelle oder eines Zellverbandes, zu setzen.
Da die Bildaufnahmerate bei hochaufgelösten Verfahren geringer
ist, als bei niedriger aufgelösten oder klassisch auflösenden
Verfahren, sind dynamische Prozesse mit hochaufgelösten Verfahren
nicht oder nur eingeschränkt untersuchbar. Es sind deshalb
auch bestimmte Fixierungen der Probe 2 bekannt, um eine
Verschiebung der Probe oder Diffusionen in der Probe 2 zu
unterbinden. Mit Hilfe des Mikroskops 1 können
nun zuerst dynamische Verläufe in der Probe 2 mittels Mikroskopieverfahren,
die eine vergleichsweise geringere Auflösung haben, aber
dafür schneller sind, untersucht werden, und beim Auftreten
eines bestimmten Ereignisses in der Probe 2, das sich z.
B. durch ein vorbestimmtes Muster im entsprechend erzeugten Mikroskopie-Bild
zeigt, die Probe 2 fixiert und hochaufgelöst vermessen
werden. Es ist dazu bevorzugt, Probenfixierungseinrichtungen in
das Mikroskop 2 zu integrieren, beispielsweise eine Einrichtung
zum Auftropfen einer Fixierlösung oder zum Schockgefrieren
der Probe 2. Auch können lebende Zellen in einem Ruhezustand
hochauflösend untersucht werden und dann durch optische
(z. B. mittels des Manipulatormoduls 22), chemische oder
andere Stimuli schnelle dynamische Prozesse injiziert und diese
mit niederer aufgelösten Mikroskopieverfahren beobachtet
werden (z. B. mit LSM oder WF). Diese Beobachtungsfolge (hochauflösende Mikroskopie
eines Ruhezustandes – Stimulierung eines dynamischen Prozesses – niederere
Auflösung der sich einstellenden dynamischen Veränderung)
kann bei Bedarf auch zyklisch wiederholt werden. Die Mikroskopie-Bilder
werden in einer Ausführungsform von der Steuereinrichtung 28 in
einem vierdimensionalen Komposit-Bild überlagert dargestellt.
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Werden
simultan klassische Verfahren (LSM und WF) und hochauflösende
Verfahren (SIM, SLIM, STEM, PAL-M, SIED, RESOLFT) verwendet, so
kann man beispielsweise Teilbereiche der Probe 2, in denen schnelle
Veränderungen zu erwarten sind, mit niedriger Auflösung
und höherer Bildfrequenz und statische Teilbereiche in
der Probe 2 hochaufgelöst und mit niedrigerer
Bildfrequenz aufnehmen. Die Kombinationen der Mikroskopieverfahren
können also auch in der Probe gleichzeitig stattfinden
und insbesondere unterschiedliche Ausschnitte des Objektfeldes in
der Probe 2 erfassen. Ein Beispiel hierfür ist
die Markierung von statischen Zellmembranen mit EOS-FP und deren
Vermessung mittels PAL-M und die gleichzeitige Rhodamin-Färbung von
Zell-Vesikeln und deren Darstellung mittels eines konfokalen Linienscanners
(linienscannendes LSM). Im Komposit-Bild erscheinen dann die Vesikel
mit hoher Zeitauflösung (z. B. 200 nm räumliche
und 10 ms zeitliche Auflösung) vor einer hochaufgelösten
Zellmembran (z. B. 20 nm Auflösung). Bei der Überlagerung
der Bilder kann dabei grundsätzlich ein Abgleich bzw. eine
Justierung der einzelnen Mikroskopie-Bilder 29 und 30 erfolgen,
indem die Struktur 32 des höher aufgelösten
Bildes 30 zu passenden Strukturen 31 des niederer
aufgelösten Bildes 29 bei der Überlagerung
passen ausgerichtet werden. Hierzu können auch sogenannte
Justierstrukturen in die Probe 2 eingebracht werden, z.
B. fluoreszierende Goldpartikel. Anhand dieser Justierstrukturen
erfolgt dann die Lagejustierung der Mikroskopie-Bilder vor deren Überlagerung
zum Komposit-Bild.
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Soweit
hier die Überlagerung von zwei Mikroskopie-Bildern beschrieben
wird, ist dies natürlich rein beispielhaft zu verstehen.
Natürlich kann auch eine größere Anzahl
an Bildern überlagert werden.
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Die
sequentiell oder simultan ausgeführten, verschiedenen Mikroskopieverfahren
erlauben aber nicht nur eine gesteigerte Bildinformation, sondern
auch eine Verbesserung der Bildaufnahmebedingungen eines Mikroskopieverfahrens
unter Hinzuziehung von Information aus einem weiteren Mikroskopieverfahren. 3 zeigt
schematisch einen Regelkreis, in dem Information aus einem geringer
aufgelösten Mikroskopie-Bild 29 und/oder Information
aus einem höher aufgelösten Mikroskopie-Bild 30 zu
einer Beeinflussung 35 ausgenützt werden. Die
Auswertung des niederer aufgelösten Mikroskopie-Bildes 29 kann
dabei im gesamtem Bild oder auch in einem Bildausschnitt 34 erfolgen,
beispielsweise einem Bildausschnitt 34, der dem Objektfeld,
das im höher aufgelösten Mikroskopie-Bild 30 abgebildet
ist, entspricht. In einem oder beiden der Mikroskopie-Bilder findet
eine Merkmalsanalyse 36 bzw. 37 statt, die in 3 schematisch
abgedeutet ist. Aus dieser Merkmalsanalyse werden Stellgrößen
für den Betrieb des Mikroskops 1 abgeleitet, wobei
die Auswirkungen 39 auf Steuergrößen 38 des
Mikroskops 1 auch eine Querbeeinflussung dahingehend zur
Folge haben können, daß aus dem nieder aufgelösten
Mikroskopie-Bild 29 Änderungen von Steuergrößen 38 abgeleitet
werden, die sich auf die Aufnahme des höher aufgelösten
Mikroskopie-Bildes 30 auswirken und umgekehrt. Beispielsweise
kann aus dem nieder aufgelösten Mikroskopie-Bild 29 der
Kontrast ermittelt werden und daraus eine Korrektur der Fokuslage
z erfolgen. Aus einer Ermittlung der Position einer Struktur der
Probe 2 kann eine Korrektur einer Probendrift xy erfolgen.
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Größen
von Strukturen können dazu verwendet werden, das Objektiv 3 entsprechend
zu wählen. Eine Helligkeitsanalyse der Probe und damit
eine Analyse einer Farbstoffkonzentration kann dazu verwendet werden,
ein passendes Gitter 23 auszuwählen oder die Beleuchtungsleistung
des Manipulators 22 einzustellen. Auch kann eine SLIM-Beleuchtung
realisiert oder die Empfindlichkeit des CCD-Detektors 22 oder
einer Kamera, die den Flächendetektor der Weitfeld-Detektion
realisiert, geregelt werden.
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Die
Festlegung eines interessierenden Bildausschnittes 34 kann
ebenfalls zur Einstellung der lokalen Beleuchtungsleistung des Manipulatormoduls 22 verwendet
werden. Auch kann eine Koordinatenübergabe x, y, z erfolgen,
um das Bildfeld 34 für das hoch auflösende
Mikroskopie-Bild 29 zu erfassen oder vorzugeben.
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Aus
dem höher auflösenden Mikroskopie-Bild 30 kann
wiederum ein Struktur analysiert werden und eine entsprechende Zusatzabbildung
durch das niederer auflösende Mikroskopie-Bild 30 erfolgen
oder die Probe durch das Manipulatormodul 22 an geeigneten
Stellen mit Strahlung zur Manipulation der Fluoreszenzeigenschaften
angeregt werden.
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4 zeigt
schematisch eine weitere Ausführungsform des Kombinations-Mikroskops 1,
wobei bereits geschilderte Module mit den gleichen Bezugszeichen
versehen sind und deshalb hier nicht noch einmal erläutert
werden müssen. Darauf hingewiesen sei aber, daß die
Anordnung der einzelnen Module, insbesondere des Laser-Scanning-Moduls 9,
des Manipulatormoduls 22, des Weitfeldbeleuchtungsmoduls 17 sowie
des TIRF-Moduls 19 auch an anderen Stellen in dem Beleuchtungsstrahlengang
bzw. dem Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang erfolgen werden
kann. In 4 ist dies exemplarisch für
das TIRF-Modul 19 gezeigt, das nun zwischen dem Strahlteiler 4 und
dem Objektiv 3 in einer Pupille 43 die entsprechende
Beleuchtungsstrahlung einkoppelt.
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Weiter
ist in 4 exemplarisch eine Anzeige 40 bzw. ein
entsprechender Computer mit Anzeige 40 dargestellt, der
ebenfalls an ein Daten- und Steuernetzwerk 41 angeschlossen
ist, über das die Steuereinrichtung 28 mit den
einzelnen Modulen des Kombinations-Mikroskops 1 verbunden
ist.
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Auch
ist in 4 ein Probentisch 42 dargestellt, auf
dem die Probe 2 unter Steuerung der Steuereinrichtung 28 verschieblich
ist. Ein solcher Probentisch ist natürlich, wie alle anderen
Details der 4 auch, auch im Mikroskop der 1 möglich.
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Das
Laser-Scanning-Modul 9 der 1 ist in 4 mit
mehreren Komponenten gezeigt. Eine Lasereinrichtung 44 umfaßt
einen Laser 45, der einen von der Steuereinrichtung 28 angesteuerten
Phasenmodulator 46 beaufschlagt. Eine Optik 47 bündelt
die Strahlung dann auf ein DMD 48. Für den Detektionszweig
des LSM-Moduls 9 ist in 4 exemplarisch
ein LSM-Detektor 49 sowie eine in einer Zwischenbildebene 50 befindliche,
konfokale Blende eingezeichnet.
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Mit
Hilfe des Kombinations-Mikroskops 1 der 1 oder 4 ist
es möglich, sequentiell oder simultan LSM-Mikroskopie-Bilder
und PAL-M-Mikroskopie-Bilder aufzuzeichnen und die Aufnahme der
PAL-M-Mikroskopie-Bilder online mittels Informationen, die aus dem
LSM-Mikroskopie-Bild gewonnen wurden, zu regeln.
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Hierzu
wird in einem ersten Schritt ein LSM-Bild der Probe 2 aufgezeichnet
und auf dem Bildschirm 40 dargestellt. Regionen besonderen
Interesses (ROI) können nun aus einem Mirkoskopie-Bild
von einem Nutzer selbst, vom Computer unterstützt oder
automatisch ausgewählt werden und die Steuerung der Aktivierungsstrahlung
aus dem Lasermodul 44 wird entsprechend beeinflußt.
Hierzu wird das DMD 48 eingesetzt, das vollflächig
von Laserstrahlung des Lasers 45 ausgeleuchtet ist. Die
einzelnen Spiegel des DMD werden nun so gestellt, daß nur
die ausgewählten ROI beleuchtet und damit nur in diesen
Regionen eine optische Aktivierung des Farbstoffes (z. B. DRONPA
oder EOS-FP) durchgeführt wird. Die restlichen Spiegel
des DMD verbleiben in einer ausgeschalteten Position, und die darauf
geleitete Strahlung wird in einer (nicht dargestellten) Strahlfalle
absorbiert. Natürlich können die eingeschalteten
Spiegel auch zeitmoduliert werden, um die Aktivierungsleistung kontinuierlich
abzuschwächen. Hierdurch kann, für das PAL-Verfahren
besonders vorteilhaft, die Aktivierungsleistung effizient an die
Molekülkonzentration angepaßt werden, so daß sich
unabhängig von der lokalen Markierungskonzentration die
aktivierten Moleküle in einem Abstand größer
als die optische Auflösung des Mikroskops 1 befinden.
Damit kann die Probe 2 besonders schnell vermessen werden,
insbesondere da durch die zuvor aus dem nieder aufgelösten
Mikroskopie-Bild bekannte oder gleichzeitig dazu im nieder aufgelösten
Mikroskopie-Bild ermittelte Konzentration der Moleküle
in der Probe die Aktivierung passend eingestellt werden kann. Eine
lokale Einstellung ist besonders vorteilhaft, wenn starke lokale
Konzentrationsänderungen auftreten, z. B. helle Bereiche
neben schwach gefärbten Bereichen vorhanden sind. Weiter
kann lokal unterschiedliches Ausbleichen von Markierungsstoffen,
welche z. B. aufgrund von Strukturvariationen in der Probe 2 auftreten
kann, zu lokalen Konzentrationsänderungen führen,
die nun mit der Aktivierungsregelung besonders vorteilhaft ausgeglichen
werden können.
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Alternativ
oder zusätzlich kann bei einer Aktivierung in vordefinierten
ROI mittels des Phasenmodulators 46 das ROI-Muster vorgeformt
auf die gesamte DMD 48 abgebildet werden, welche dann nur
noch eine Feinabstimmung vornimmt. So wird die Leistung des Lasers 45 nahezu
vollständig zur Aktivierung von Markierungsmolekülen
in der Probe 2 eingesetzt. Der Phasenmodulator 46 ist
dazu in einer Pupillenebene vor der DMD 48 (vom Laser 45 aus
betrachtet) angeordnet und befindet sich im Abstand der Brennweite
s der Optik 47 (die auch durch eine Linse realisiert werden
kann). Das DMD 48 ist wiederum im Abstand f nach der Optik 47 lokalisiert.
Alternativ kann man auch auf die DMD 48 verzichten, wenn
beispielsweise die ROI-Auswahl durch den Phasenmodulator 46 erfolgt
und die Intensität der Laserquelle 45 global geregelt
wird, z. B. durch einen dem Laser nachgeschalteten Intensitätsmodulator
oder eine direkte Intensitätsmodulation des Lasers 45.
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Soweit
hier Kombinationen oder Auswertungen von Mikroskopie-Bildern erläutert
wurden, sind diese rein beispielhaft und nicht als Festlegung auf
das den genannten Bildern zugrundeliegende Mikroskopieverfahren
zu verstehen. Vielmehr können die geschilderten Auswertungen,
Kombinationen, Steuerungsbeeinflussungen etc. auch bei anderen der
genannten Mikroskopieverfahren zum Einsatz kommen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - US 5866911 [0016]
- - DE 4416558 C2 [0017, 0018]
- - US 6633432 [0017, 0019]
- - DE 10325460 A1 [0017, 0020]
- - EP 1907826 [0020]
- - EP 1157297 B1 [0022, 0022]
- - WO 2006127692 [0025]
- - DE 102006021317 [0025]
- - US 2008/0088920 [0037, 0047]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Egner et al.,
Biophysical Journal, S. 3285–3290, Band 93, November 2007 [0028]