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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, insbesondere
in Form von Inhibitoren bzw. Repressoren, welche die Genaktivität eines
mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere
Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehenden Gens zu regulieren
imstande sind, im Bereich der Diagnostik und Therapie von Hepatitis,
insbesondere Hepatitis Typ C. Bei dem mit der Vermehrung bzw. Replikation
von Hepatitis-C-Viren im Zusammenhang stehenden Gen handelt es sich
vorzugsweise um das humane interferonstimulierte Gen ISG15.
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Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer die Genaktivität eines
mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere
Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehenden Gens unterbindenden
bzw. inhibierenden oder zumindest herabsetzenden Substanz, insbesondere
Inhibitors bzw. Repressors, zur Herstellung eines Medikamentes bzw.
Arzneimittels zur prophylaktischen bzw. kurativen Behandlung von
Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C.
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Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines interferonstimulierten
Gens, insbesondere ISG15, zur Auffindung bzw. Bereitstellung eines
Arzneimittels zur prophylaktischen bzw. kurativen Behandlung von
Hepatitis, insbesondere Hepatitis Typ C, und/oder zur Vorhersage
von individuellen Arzneimittelwirkungen und/oder zur Vorhersage
von Nebenwirkungen bzw. des Ansprechens von Arzneimitteln.
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Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung
von Substanzen, insbesondere Inhibitoren bzw. Repressoren, welche
die Genaktivität
eines interferonstimulierten, insbesondere im Zusammenhang mit der
Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren,
stehenden Gens, vorzugsweise ISG15, regulieren bzw. ein Verfahren
zur Identifizierung von Substanzen, welche die Aktivität der entsprechenden
Genprodukte bzw. von mit dem Gen im Zusammenhang stehenden Produkten
regulieren. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften dieser Substanzen.
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Schließlich betrifft
die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung,
welche zumindest eine auf Basis der erfindungsgemäßen Verfahren
aufgefundene pharmakologisch aktive Substanz, insbesondere Inhibitor
bzw. Repressor, enthält,
wobei die Substanz die Genaktivität eines mit der Vermehrung bzw.
Replikation von Hepatitis-C-Viren im Zusammenhang stehenden Gens
beeinflußt,
insbesondere hemmt bzw. inhibiert; zudem betrifft die vorliegende
Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die prophylaktische
oder therapeutische Behandlung von Hepatitis-C-Erkrankungen, welche
in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen mindestens
eine siRNA enthält.
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Die
chronische Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) ist mit weltweit
etwa 170 Millionen Infizierten ein globales Gesundheitsproblem.
Bei einer Chronifizierungsrate von etwa 80% stellt die Hepatitis
Typ C eine der Hauptursachen für
Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinome dar.
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Das
Hepatitis-C-Virus gehört
zur Familie der Flaviviridae und ist der einzige Vertreter des Genus
der Hepaciviren. Das Hepatitis-C-Virus wurde ursprünglich den
sogenannten NonA-NonB-Hepatitis-Viren zugeordnet, bis im Jahre 1989
die Sequenzierung des viralen Genoms gelang. Heute sind sechs Genotypen
charakterisiert, die sich wiederum in Subtypen unterteilen. Die
Infektion mit dem Virus erfolgt in den meisten Fällen über eine Transfusion infizierter
Blutkonserven, insbesondere in den siebziger Jahren, bzw. über Kanülenstichverletzungen
beispielsweise beim Krankenhauspersonal. Weitere Übertragungsmöglichkeiten
sind der ungeschützte
Geschlechtsverkehr und die Verwendung gemeinsamer Spritzen unter
Drogenabhängigen.
Die akute Infektion verläuft
meist asymptomatisch. In etwa 70 bis 80% der Fälle kommt es dann zu einer
chronischen Infektion der Leber, die im Verlauf zu einer Leberzirrhose
und hepatozellulärem
Karzinom führen
kann.
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Als
bislang effizienteste Therapie der chronischen Hepatitis Typ C wird
im Stand der Technik Interferon (IFN), insbesondere α-Interferon
(synonym auch als Interferon-alpha oder IFN-α bezeichnet, vorzugsweise pegyliertes
IFN-α, gegebenenfalls
in Kombination mit dem Virustatikum Ribavirin, angewendet. Abhängig vom Genotyp
und anderen Faktoren führt
diese Therapie nur in 50 bis 90% der Patienten zu einer Ausheilung.
Eine der häufigsten
Nebenwirkungen dieser Therapie sind IFN-induzierte schwere Depressionen,
welche neben der Verschlechterung der Lebensqualität zum Therapieabbruch
oder gar zum Suizid führen
können.
Ein Impfstoff gegen das Hepatitis-C-Virus konnte bisher noch nicht
entwickelt werden.
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Interferone
(IFN) sind niedermolekulare Proteine und werden zu den Zytokinen
gezählt.
Es wird zwischen Interferonen vom Typ-I und Interferonen vom Typ-II
unterschieden. Die Interferone vom Typ-I kommen in monomerer Form
vor und lassen sich in Superfamilien unterteilen, deren Hauptunterschied
ihr Entstehungsort ist. Bei den Interferonen vom Typ-I machen IFN-α und IFN-β den größten Teil
aus. Die Gruppe der α-Interferone
läßt sich
wiederum in eine Reihe von Subtypen unterteilen, die von unterschiedlichen
Genen exprimiert werden. Sie entstehen größten Teils in Leukozyten und
Fibroblasten, während
IFN-β hauptsächlich von
Endothelzellen und Fibroblasten produziert wird. Weiterhin zählen IFN-λ und IFN-ω zu den
Interferonen vom Typ-I.
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Die
Expression der Interferone vom Typ-I wird durch die Erkennung von
virilen aber auch bakteriellen pathogenen Muster induziert. Sie
werden von infizierten Zellen sezerniert und wirken sowohl parakrin
auf benachbarte Zellen als auch autokrin auf die IFN-produzierende
Zelle selbst. Die Bindung an den Rezeptor löst eine Signalkaskade aus,
die in der Induktion von interferonstimulierten Genen (ISGs) endet.
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Die
Wirkung von über
150 ISGs wird zusätzlich über eine
Modifikation erhöht
und ihre Leistung gesteigert. Das ISG15, ein 15 kD großes, IFN
induziertes Protein, besitzt eine dem Ubiquitin ähnliche Domäne und wird über ein
Set von Enzymen (E1 = Ube1L, E2 = UbcH8 und E3 = Herc5), wie bei
der Ubiquitinylierung, kovalent an die Zielproteine gebunden. In
der Literatur nennt man diesen Prozeß auch ISGylierung. Die Enzyme E1,
E2 und E3 werden ebenfalls durch Typ-I Interferone hochreguliert,
was zu einer vermehrten ISGylierung führt und die Interferonantwort
verstärkt.
Gleichzeit wird jedoch auch Usp18, die Protease, welche die ISGylierung
wieder rückgängig macht, induziert,
was neben geringen Halbwertzeiten und mit weiteren negativ wirkenden
Regulationsmechanismen zu einer zeitlichen Begrenzung der Wirkung
von IFN führt.
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Was
die Interferone weiterhin anbelangt, so werden diese aufgrund ihrer
Eigenschaften und der Möglichkeit,
eine Vielzahl zellulärer
Abwehrmechanismen zu induzieren und die körpereigene Immunantwort zu unterstützen, zur
Therapie von Tumoren, Autoimmunerkrankungen und Virusinfektionen
(z. B. HBV und HCV) verwendet.
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Wie
zuvor beschrieben, hat sich in der Therapie von Hepatitis Typ C-Erkrankungen bzw.
Infektionen insbesondere der Einsatz von pegyliertem IFN-α2a oder IFN-α2b in Kombination
mit dem Nukleosidanalogon Ribavirin (RBV) etabliert. Das Ansprechen
auf die Therapie ist abhängig
von dem HCV-Genotyp, der Viruslast, dem Alter des Patienten, bereits
aufgetretenen Leberschäden
und Co-Infektionen. Bei der Infektion mit den Genotypen 2 und 3
ist nach 24 Wochen bei bis zu 80% der Patienten ein anhaltender
Virusrückgang
zu verzeichnen, während
bei Infektionen mit Genotyp 1 nur ca. 50% der Patienten auf die
Therapie ansprechen und einen anhaltenden Rückgang der Viruslast nach 48
Wochen bei einer körpergewichtsabhängigen RBV-Dosierung
aufweisen.
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Das
Ansprechen auf die Therapie läßt sich
in zwei Phasen unterteilen. Ein frühes Ansprechen des Virus (engl.
EVR, early viral response) in Abhängigkeit vom Genotyp und der
eingesetzten Dosis an Medikamenten in der ersten Phase wird gefolgt
von einem langsameren, aber anhaltenden Rückgang der Viruslast (engl. SVR,
sustained viral response) in der zweiten Phase. Untersuchungen haben
ergeben, daß,
wenn innerhalb der ersten 12 Wochen nach Therapiebeginn keine EVR
mit einem Rückgang
der Viruslast um mindestens 2log10-Phasen
zu verzeichnen ist, kein anhaltendes Ansprechen zu erwarten ist
und die Therapie abgebrochen werden kann. Unterschiedliche Expressionsmuster
der ISGs sowohl in PBMCs (engl. peripheral blond mononuclear cells)
als auch Leberbiopsien von Patienten ermöglichen ebenfalls die Erstellung
von Prognosen über ein
Ansprechen auf die Therapie.
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Nachteilig
bei der vorgenannten Therapie des Standes der Technik sind somit
deren mitunter starke Nebenwirkungen, insbesondere was die Ausbildung
einer Depression anbelangt, und die Tatsache, daß ein effektiver Therapieerfolg – wie zuvor
beschrieben – nicht
immer gewährleistet
ist.
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Vor
diesem Hintergrund besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
darin, neue und effiziente Therapie- bzw. Behandlungsmöglichkeiten
von Hepatitis-Erkrankungen, insbesondere Hepatitis-C-Erkrankungen,
bereitzustellen, welche gegenüber
den im Stand der Technik bekannten Ansätzen eine höhere Wirksamkeit bei gleichzeitig
verringerter Nebenwirkung aufweisen sollen.
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In
diesem Zusammenhang besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung darin, ein Verfahren zur Ermittlung von Substanzen bzw.
Substanzen als solche bereitzustellen, mit welchen die Genexpression bzw.
Genaktivität
von im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren im Zusammenhang
stehenden Genen, insbesondere ISG15, vermindert bzw. unterbunden
werden kann, um auf diese Weise die Virusvermehrung bzw. -replikation
zumindest zu vermindern.
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Im übrigen besteht
eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren
bereitzustellen, mit welchem konkrete Gene identifiziert werden
können,
welche maßgeblich
an der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren beteiligt
sind, wobei es sich hierbei vorzugsweise um humane bzw. interferonstimulierte
Gene handelt.
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Schließlich besteht
eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe darin, Verfahren, Verwendungen und
Substanzen der vorgenannten Art bereitzustellen, welche die Nachteile
des Standes der Technik zu vermeiden oder aber diese zumindest zu
verringern oder abzuschwächen
imstande sind.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es dem Anmelder in völlig überraschender
Weise gelungen, erstmalig ein spezielles Gen identifiziert zu haben,
welches maßgeblich
im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren
in einem Wirtsystem, insbesondere beim Menschen, steht. In diesem
Zusammenhang hat der Anmelder völlig überraschend
gefun den, daß das
interferonstimulierte Gen ISG15 maßgeblich an der zuvor genannten
Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren beteiligt ist
und eine Induktion bzw. Aktivierung dieses Gens zu einer unerwünschten
Erhöhung
der Virusreplikation führen kann.
Das hinsichtlich seiner Relevanz betreffend die Vermehrung bzw.
Replikation von Hepatitis-C-Viren identifizierte Gen ISG15 kann
somit erfindungsgemäß als Grundlage
für Verfahren
bzw. Medikamente zur Therapie einer Hepatitis-C-Erkrankung bzw.
-Infektion herangezogen werden, wobei diesbezüglich erfindungsgemäß auf eine
Inaktivierung des entsprechenden Gens abgestellt wird.
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Denn
der Anmelder hat in völlig überraschender
Weise gefunden, daß die
gezielte Verwendung eines Inhibitors bzw. Repressors, mit welchem
die (Gen-)Aktivität
des im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren
stehenden Gens, insbesondere ISGl5, und somit eine Beeinflussung
dessen Genaktivität
zu einer signifikanten Verringerung der Hepatitis-C-Virenlast führt, was
maßgeblich
auf eine deutlich verminderte Vermehrung bzw. Replikation der Hepatitis-C-Viren
zurückzuführen ist.
In diesem Zusammenhang konnte der Anmelder – völlig überraschend – insbesondere
zeigen, daß die
gezielte Verwendung einer speziell auf ISG15 abgestimmten bzw. gegen
ISG15 gerichteten sogenannten siRNA bei deren Applikation zu einer
deutlichen Abnahme der Genaktivität von ISG15 und folglich zu
einer signifikant verminderten Synthese bzw. Vermehrung bzw. Replikation
von Hepatitis-C-Viren im Wirtsystem führt. Auf diese Weise ist es
dem Anmelder gelungen, einen völlig
neuartigen und zudem nebenwirkungsarmen therapeutischen Ansatz bereitzustellen,
auf dessen Basis eine Hepatitis-C-Erkrankung effektiv behandelt werden
kann.
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Es
versteht sich von selbst, daß Ausgestaltungen,
Ausführungsformen,
Vorteile und dergleichen, welche nachfolgend zu Zwecken der Vermeidung
von Wiederholungen nur zu einem Erfindungsaspekt ausführt sind,
selbstverständlich
auch in bezug auf die übrigen
Erfindungsaspekte entsprechend gelten.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung – gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist somit die erfindungsgemäße Verwendung
nach Anspruch 1, d. h. also mit anderen Worten die Verwendung eines
Inhibitors und/oder Repressors eines mit der Vermehrung und/oder
Replikation von He patitis-Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren,
im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens und/oder
dessen DNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz und/oder
dessen zugeordneten (Poly-)Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels
zur prophylaktischen. und/oder therapeutischen Behandlung von Hepatitis,
insbesondere Hepatitis Typ C.
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Wie
zuvor angeführt,
liegt die zentrale Idee der vorliegenden Erfindung somit darin,
in spezifischer Weise die Genaktivität eines solchen Gens herabzusetzen
und/oder zu unterbinden, insbesondere zu inhibieren, welches mit
der Vermehrung bzw. Replikation bzw. Synthese von Hepatitis-C-Viren
insbesondere insofern zusammenhängt,
als die Expression bzw. Aktivierung des Gens, welche beispielsweise
aufgrund der Virusinfektion induziert sein kann, zu einer erhöhten Replikation
bzw. Vermehrung von Hepatitis-C-Viren im Wirt führt.
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In
diesem Zusammenhang bezieht sich der erfindungsgemäß verwendete
Begriff ”Inhibitor” und/oder ”Repressor” insbesondere
auf eine die Genaktivität
vermindernde und/oder unterbindende, insbesondere inhibierende Substanz.
Der Inhibitor bzw. der Repressor stellt somit mit anderen Worten
eine die Genaktivität
unterbindende oder zumindest herabsetzende Verbindung dar, wobei
die diesbezügliche
pharmakologische Wirkung des Inhibitors bzw. Repressors sowohl auf
Genebene, d. h. beispielsweise durch eine direkte Interaktion mit
dem Gen bzw. diesem zugeordneten Promotoren und/oder Enhancern,
als auch auf Ebene des bzw. der Genprodukte, wie Transkriptionsprodukte
(z. B. mRNA) und/oder Translationsprodukte (z. B. Proteine), ansetzen
kann. Zudem kann die pharmakologische Wirkung bzw. die die Genaktivität vermindernde
und/oder unterbindende, insbesondere inhibierende Wirkung des Inhibitors
bzw. Repressors auf Ebene von genregulierten Mediatoren bzw. Faktoren
und/oder auf Ebene von genregulierenden Mediatoren bzw. Faktoren
ansetzen. Somit kann der erfindungsgemäß verwendete Inhibitor bzw.
Repressor zu einer Verringerung der Expression bzw. Genaktivität beispielsweise
und in nichtbeschränkender
Weise durch direkte oder indirekte Interaktion mit der DNA-Sequenz
bzw. DNA und/oder dessen zugeordneter RNA-Sequenz bzw. mRNA und/oder
durch direkte bzw. indirekte Beeinflussung bzw. Interaktion mit
dem Genprodukt in Form des von dem Gen bzw. von der DNA- Sequenz codierten
(Poly-)Peptids führen.
Bei dem Inhibitor bzw. Repressor handelt es sich insbesondere um
eine Substanz mit antiviralen Eigenschaften gegenüber Hepatitis-Viren,
insbesondere Hepatitis-C-Viren.
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Mit
anderen Worten zielt die vorliegende Erfindung maßgeblich
auf eine zweckgerichtete Suppression der Genexpression bzw. Genaktivität von im
Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation bzw. Synthese von
Hepatitis-C-Viren stehenden Genen, insbesondere ISG15, was im allgemeinen
auch als gene-knockdown bzw. als gene-silencing bezeichnet werden
kann.
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Was
den erfindungsgemäß verwendeten
Begriff ”Gen” anbelangt,
so ist diesbezüglich
gleichermaßen das
entsprechende Nukleinsäuremolekül bzw. die
entsprechende DNA-Sequenz eingeschlossen. Die vorliegende Erfindung
bezieht sich aber gleichermaßen
auch, wie zuvor angeführt,
auf die dem Gen zugeordnete RNA-Sequenz, insbesondere mRNA, welche
sozusagen als posttranskriptionales Produkt fungiert und sozusagen
komplementär
zum codogenen Strang der DNA des Gens sein kann. Gleichermaßen kann
im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch das von der Nukleinsäure bzw.
dem Gen, insbesondere wie zuvor definiert, codierte (Poly-)Peptid – und somit
gewissermaßen
das Translationsprodukt – verwendet
bzw. als Zielmolekül bzw. ”Target” verwendet
werden. Der Begriff ”Nukleinsäuremolekül” ist gleichbedeutend
mit dem Begriff ”Polynukleinsäure” bzw. ”Polynukleinsäuremoleküle” und kann
sowohl auf DNA als auch auf RNA bezogen sein. Der Begriff ”DNA-Sequenz” bzw. ”RNA-Sequenz” bezieht
sich in diesem Zusammenhang nicht nur auf die vollständige, dem
Gen zugeordnete bzw. entsprechende DNA, sondern auch auf entsprechende
Abschnitte des Gens bzw. nicht nur auf insbesondere im Rahmen der
Transkription synthetisierte vollständige RNA, sondern auch auf
RNA-Abschnitte bzw. RNA-Fragmente.
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Was
das im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung
in Betracht gezogene Gen anbelangt, so handelt es sich vorzugsweise
um ein humanes Gen.
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Insbesondere
kann es sich bei dem im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung in Betracht
gezogenen Gen um ein interferonstimuliertes Gen (ISG) handeln. Diesbezüglich kann
das Gen ein durch Interferone vom Typ 1, vorzugsweise α-Interferon
und/oder β-Interferon,
stimuliertes Gen sein. Wie zu vor beschrieben, handelt es sich hierbei
insbesondere um ein solches Gen, welches infolge einer erhöhten Interferonkonzentration
induziert bzw. aktiviert werden kann, so daß dessen Expression insbesondere
unter Interferoneinfluß – beispielsweise
hervorgerufen durch eine Infektion mit Hepatitis-C-Viren – erhöht wird.
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Diesbezüglich hat
der Anmelder in völlig überraschender
Weise herausgefunden, daß ein
hinsichtlich der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren verantwortliches
bzw. damit im Zusammenhang stehendes Gen durch das Gen ISG15 gebildet
wird. Hierbei handelt es sich gleichermaßen um ein interferonstimuliertes
Gen. Insbesondere handelt es sich bei dem in Rede stehenden Gen
um ISG15, insbesondere mit der Transkript-ID (Lokus) NM_005101 bzw.
insbesondere gemäß Sequenzprotokoll
I und/oder insbesondere gemäß SEQUENCE
LISTING. Diesbezüglich
hat der Anmelder in völlig überraschender
Weise gefunden, daß es
sich bei ISG15, welches auch als sogenannter Homo Sapiens ISG15
Ubiquitin-like Modifier bezeichnet wird, um ein hinsichtlich der
erfindungsgemäßen Verwendung
im Rahmen der Therapie von Hepatitis Typ C besonders effektives
Ziel bzw. Target handelt, dessen Inaktivierung bzw. Suppression
zu einer signifikanten Reduzierung der Hepatitis-C-Viren im Wirtsystem
führt.
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Das
zuvor angegebene Sequenzprotokoll I und das zuvor angeführten SEQUENCE
LISTING beziehen sich auf die DNA-Sequenz zu dem Gen ISG15. Dabei
ist das Sequenzprotokoll I zu dem entsprechenden SEQUENCE LISTING
synonym bzw. inhaltsgleich. Der wesentliche Unterschied zwischen
den Sequenzprotokollen besteht darin, daß das Sequenzprotokoll I auf
Basis einer wissenschaftlich standardisierten Angabe bzw. Darstellung
beruht, während
das SEQUENCE LISTING auf Basis einer patentrechtlich standardisierten Angabe
bzw. Darstellung unter Verwendung der Software PatentIN Version
3.3 erstellt wurde. Hierbei handelt es sich also in bezug auf die
DNA bzw. in bezug auf das Gen um einen rein formal darstellungsgemäßen, nicht aber
um einen inhaltlichen Unterschied.
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Was
den im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung
eingesetzten Inhibitor bzw. Repressor anbelangt, so sollte es sich
diesbezüglich
um eine die Aktivität
des Gens, insbesondere von ISG15, herabsetzende bzw. unterbindende,
insbesondere inhibierende Substanz handeln.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es besonders vorteilhaft,
wenn der Inhibitor bzw. der Repressor eine mit dem Gen, insbesondere
mit ISG15, bzw. mit dessen DNA-Sequenz und/oder mit dessen zugeordneter
RNA-Sequenz und/oder mit dessen zugeordnetem (Poly-)Peptid interagierende
Substanz ist. Diesbezüglich
ist es besonders vorteilhaft, wenn die Substanz die Aktivität des Gens,
insbesondere von ISG15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen
zugeordneter RNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneten (Poly-)Peptids
herabsetzt und/oder unterbindet, insbesondere inhibiert.
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In
diesem Zusammenhang ist der Begriff ”Inhibitor” bzw. ”Repressor” sehr breit zu verstehen,
insbesondere kann es sich hierbei um eine Substanz handeln, welche
direkt und/oder indirekt, beispielsweise über Stoffwechselkaskaden oder
Signaltransduktionen, mit dem entsprechenden Target bzw. Ziel, insbesondere
mit ISG15, interagiert und dabei dessen Genaktivität herabsetzt
bzw. unterbindet, insbesondere inhibiert. Dabei kann die Beeinflussung
des Gens, insbesondere von ISG15, bzw. der dem Gen bzw. ISG15 zugeordneten
Produkte (z. B. Transkriptions- und/oder Translationsprodukte) auch
in Form von Vorläufersubstanzen
hervorgerufen werden, welche beispielsweise erst im Zell- bzw. Wirtsystem
zu der eigentlich interagierenden Substanz beispielsweise über stoffwechselspezifische
Prozesse umgewandelt wird.
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Wie
nachfolgend angeführt,
kann die direkte und/oder indirekte Interaktion der Substanz mit
der Zielstruktur, insbesondere mit dem Gen, wie ISG15, auf vielerlei
Ebenen realisiert sein:
Gemäß einer
ersten erfindungsgemäß bevorzugten
Ausführungsform
kann die interagierende Substanz bzw. der Inhibitor und/oder Repressor
mit dem Promoter und/oder Enhancer des Gens, insbesondere von ISG15, Wechselwirken
und/oder interagieren derart, daß die Bindung von insbesondere
körpereigenen
Transkriptionsfaktoren, insbesondere Aktivatoren, an den Promotor
und/oder Enhancer verhindert oder zumindest gehemmt wird.
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Gleichermaßen ist
es aber auch möglich,
daß die
Substanz bzw. der Inhibitor und/oder Repressor mit einem insbesondere
körpereigenen
Transkriptionsfaktor, insbesondere Aktivator, wechselwirkt derart,
daß die Bindung
des Transkriptionsfaktors, insbesondere Aktivators, an den Promotor
und/oder Enhancer des Gens, insbesondere von ISG15, verhindert oder
zumindest gehemmt wird.
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Gleichermaßen ist
es aber auch möglich,
daß die
Substanz bzw. der Inhibitor und/oder Repressor mit einem insbesondere
körpereigenen
Transkriptionsfaktor, insbesondere Aktivator, wechselwirkt derart,
daß die Bindung
des Transkriptionsfaktors, insbesondere Aktivators, an den Promotor
und/oder Enhancer des Gens, insbesondere von ISG15, verhindert oder
zumindest gehemmt wird. In diesem Zusammenhang kann der Inhibitor
und/oder Repressor mit insbesondere körpereigenen, von dem Gen regulierten
Mediatoren und/oder Faktoren, insbesondere ISG15-regulierten Mediatoren
und/oder Faktoren, und/oder mit insbesondere körpereigenen, das Gen regulierenden
Mediatoren und/oder Faktoren, insbesondere ISG15-regulierenden Mediatoren und/oder
Faktoren, interagieren insbesondere derart, daß die Aktivität des Gens,
insbesondere von ISG15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen
zugeordneter RNA-Sequenz und/oder dessen zugeordneten (Poly-)Peptids
herabgesetzt und/oder unterbunden, insbesondere inhibiert, wird.
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Gleichermaßen ist
es aber auch möglich,
daß die
Substanz bzw. der Inhibitor und/oder Repressor mit den endogenen
bzw. körpereigenen
Transkriptionsaktivatoren selbst reagiert und hierdurch eine Inaktivierung des
Transkriptionsfaktors bzw. -aktivators an sich hervorruft, um auf
diese Weise die Genaktivität,
insbesondere von ISG15, zu verringern bzw. zu unterbinden, insbesondere
zu inhibieren.
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Bei
der im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung
eingesetzten Substanz in Form eines Inhibitors und/oder Repressors
kann es sich zum einen um eine Substanz handeln, welche auf Basis
des nachfolgend noch geschilderten erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung
solcher Substanzen aufgefunden wurde.
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Gemäß einer
erfindungsgemäß besonders
bevorzugten Ausführungsform
kann es sich bei dem Inhibitor und/oder Repressor zum anderen um
eine vorzugsweise mit der dem Gen, insbesondere ISG15, zugeordneten
RNA-Sequenz, insbesondere mRNA-Sequenz, interagierende RNA-Sequenz
handeln. Gemäß dieser
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sollte es sich bei dem Inhibitor bzw.
Repressor um eine RNA bzw. RNA-Sequenz handeln, welche insbesondere
komplementär
zu der dem Gen zugeordneten RNA bzw. mRNA bzw. RNA-Sequenz bzw.
mRNA-Sequenz ist.
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In
diesem Zusammenhang ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung
von besonderem Vorteil, wenn der Inhibitor und/oder Repressor eine
RNA-Sequenz in Form
eine Oligomers, insbesondere mit 15 bis 20 bp (Basenpaare), vorzugsweise
18 bis 25 bp, bevorzugt 21 bis 23 bp, ist.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der mit der
dem Gen, insbesondere ISG15, zugeordneten RNA-Sequenz interagierenden
RNA-Sequenz vorzugsweise
um eine Einzelstrang-RNA, wobei es sich diesbezüglich gemäß einer besonders bevorzugten
Ausführung
um einen sogenannten antisense-Strang insbesondere in bezug auf
die dem Gen zugeordnete RNA, insbesondere mRNA, handeln sollte.
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Gleichermaßen ist
es aber auch möglich,
daß es
sich bei der erfindungsgemäß eingesetzten,
mit der dem Gen, insbesondere ISG15, zugeordneten RNA-Sequenz interagierenden
RNA-Sequenz um eine Doppelstrang-RNA handelt, welche insbesondere
im Rahmen weiterer Modifikationen bzw. Stoffwechselvorgänge zu einer
Einzelstrang-RNA, insbesondere in Form eines antisense-Stranges, wie zuvor
definiert, umgewandelt bzw. modifiziert wird.
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Gemäß einer
erfindungsgemäß besonders
bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem zuvor beschriebenen Inhibitor und/oder Repressor
um eine siRNA (small interfering RNA), insbesondere wobei die siRNA
gegen ISG15, insbesondere gegen ISG15-spezifische mRNA bzw. gegen
ISG15 zugeordneter mRNA, gerichtet ist. Mit anderen Worten sollte
die siRNA ausgestaltet sein derart, daß eine Interaktion mit der mRNA,
insbesondere wie zuvor definiert, möglich ist und in der Folge
zur Deaktivierung bzw. zum Abbau der entsprechenden RNA führt. Beispielsweise
kann die siRNA komplementär zur
mRNA bzw. zu Abschnitten der mRNA sein. In diesem Zusammenhang hat
der Anmelder in völlig überraschender
Weise gefunden, daß eine derartige
siRNA zu besonders guten Ergebnissen hinsichtlich einer Verminderung
bzw. Unterbindung der Genaktivität
des mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren im
Zusammenhang stehenden Gens, insbesondere ISG15, führt.
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Bei
der im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung
eingesetzten siRNA handelt es sich gemäß einer ganz besonders bevorzugten
Ausführung
um eine siRNA gegen ISG15, welche von der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland
unter der Produktnummer bzw. Bestellnummer SI00072387 (human) bzw.
SI01007531 (murin) bezogen werden kann.
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Ohne
sich auf diese Theorie festlegen zu wollen, kann die Wirkweise der
speziellen ISG15-spezifischen siRNA derart verstanden werden, daß zunächst im
Zell- bzw. Wirtsystem ein siRNA/Protein-Komplex gebildet wird, welcher
auch als RNA-induced silencing-Complex (RISC) bezeichnet wird, bei
welchem ein Proteinkomplex den antisense-Strang der siRNA bindet
und die dazu komplementäre
mRNA schneidet. In diesem Zusammenhang weist der RISC-Komplex RNA-Helicase-
und RNA-Nuklease-Aktivitäten
auf. Diese Eigenschaften führen
bei Interaktion mit der mRNA, welche sozusagen das Transkriptionsprodukt
des mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren in
Zusammenhang stehenden Gens, insbesondere ISG15, darstellt, zu dessen
Entwindung und Spaltung. Die mRNA wird folglich abgebaut, was zu
einer Reduktion der Translation dieser mRNA und somit zu einem genesilencing
bzw. einem gene-knockout auf posttranskriptionaler Ebene und somit
zu einer Geninaktivierung führt.
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Erfindungsgemäß kann es
auch vorgesehen sein, daß der
Inhibitor und/oder Repressor ein insbesondere den antisense-Strang
einer siRNA darstellender Inhibitor bzw. Repressor ist. Gleichermaßen kann
es im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch vorgesehen sein, daß der Inhibitor
bzw. Repressor einen Komplex aus einem antisense-Strang der siRNA
und mindestens einer Proteinkomponente darstellt, wobei es sich
bei diesem Komplex insbesondere um einen RISC-Komplex (RISC = RNA-induced
silencing complex) handeln kann.
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Ein
zentrales Konzept der vorliegenden Erfindung gemäß diesem Erfindungsaspekt unter
Verwendung einer siRNA ist darin zu sehen, daß insbesondere synthetisch
hergestellte siRNA mit Spezifität
gegenüber mRNA
als Transkriptionsprodukt insbesondere von ISG15 in das Zell- bzw.
Wirtsystem eingebracht wird, was zu einem Abbau der mRNA des Zielgens,
nämlich
insbesondere ISG15, führt,
was wiederum zu einer Verringerung der Genprodukte und somit zu
einem gene-silencing bzw. gene-knockout führt. Das der Erfindung zugrundeliegende
Prinzip gemäß dieser
Ausführungsform
kann auch als RNA-Interferenz bezeichnet werden, auf deren Basis
die Expression bestimmter (Ziel-)Gene, im vorliegenden Fall insbesondere
ISG15, verringert wird. Dies geschieht insbesondere durch die Interaktion
von speziell gegen ein Gen gerichteter siRNA mit der mRNA des Gens
mit der Folge des Abbaus der mRNA, was einer (Gen-)Inaktivierung
entspricht.
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Die
Applikation bzw. das Einbringen der entsprechenden siRNA in das
Zell- bzw. Wirtsystem
ist dem Fachmann an sich bekannt, so daß es diesbezüglich keiner
weiteren Ausführungen
bedarf. Beispielsweise kann das Einbringen bzw. Transfizieren auch über eine
sogenannte Polyethylenimin-Komplexierung (PEI-Komplexierung)
durchgeführt
werden.
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Der
gemäß der Verwendung
nach der vorliegenden Erfindung eingesetzte Inhibitor bzw. Repressor sollte
bei Anwendung in pharmazeutisch wirksamen Mengen verabreicht werden.
Zudem sollte der Inhibitor bzw. der Repressor systemisch, beispielsweise
intravenös,
verabreicht werden. Auch die diesbezüglichen Maßnahmen sind dem Fachmann als
solche bekannt, so daß es
diesbezüglich
keiner weiteren Ausführungen bedarf.
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Im
Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung
kann es gleichermaßen
vorgesehen sein, daß der Inhibitor
bzw. Repressor, insbesondere wie zuvor beschrieben, gemeinsam mit
mindestens einem Interferon, insbesondere α-Interferon, vorzugsweise pegyliertem α-Interferon,
verabreicht wird. In diesem Zusammenhang ist eine Kombination der
zuvor beschriebenen ISG15-spezifischen
siRNA bzw. gegen ISG15 gerichteten siRNA mit einem Interferon von
besonderem Vorteil. Denn der Anmelder konnte – wie nachfolgend anhand der Ausführungsbeispiele
angeführt – in völlig überraschender
Weise einen synergistischen Effekt im Rahmen der zuvor beschriebenen
Kombinati an von Inhibitor und/oder Repressor einerseits und Interferon
andererseits hinsichtlich der Unterbindung bzw. Verminderung der
Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren in den betroffenen
Wirtsystemen bzw. Zellsystemen beobachten. Gleichermaßen ist
es möglich,
daß der
Inhibitor und/oder Repressor gemeinsam und/oder in Kombination mit
mindestens einer Substanz mit antiviralen Eigenschaften gegenüber Hepatitis-Viren,
insbesondere Hepatits-C-Viren, verabreicht wird.
-
Insgesamt
wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung
gemäß dem hier
vorliegenden Erfindungsaspekt ein neuer Weg zur Behandlung einer
Hepatitis-C-Infektion bzw. -Erkrankungen bereitgestellt, welcher
auf einem völlig
neuen Ansatz basiert, nämlich
der gezielten Inaktivierung eines im Zusammenhang mit der Vermehrung
bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren stehenden Gens, insbesondere
ISG15.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem zweiten Aspekt der
vorliegenden Erfindung – ist
die erfindungsgemäße Verwendung
gemäß Anspruch
15, d. h. also mit anderen Worten die Verwendung mindestens einer
Substanz, insbesondere eines Inhibitors und/oder Repressors, zur
Herstellung eines Medikamentes oder Arzneimittels zur prophylaktischen
und/oder therapeutischen Behandlung von Hepatitis, insbesondere
Hepatitis Typ C, wobei die Substanz die Genaktivität und/oder
Genexpression mindestens eines interferonstimulierten Gens, insbesondere
von ISG15 reguliert, insbesondere zumindest vermindert oder hemmt.
-
Für weitere
Ausführungen
in bezug auf die erfindungsgemäße Verwendung
gemäß dem zweiten
Aspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die vorstehenden Ausführungen
zu dem vorangehenden Aspekt verwiesen werden, welche diesbezüglich entsprechend
gelten.
-
Wiederum
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem dritten Aspekt der
vorliegenden Erfindung – ist
die erfindungsgemäße Verwendung
gemäß Anspruch
17, d. h. also mit anderen Worten eine Verwendung mindestens eines
interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere
Gens, vorzugsweise ISG15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen
zugeordneter RNA-Sequenz und/oder mindestens eines von der Nukleinsäure codierten
(Poly-)Peptids zur Auffindung und/oder Bereitstellung eines Arzneimittels
zur prophylaktischen und/oder kurativen Behandlung von Hepatitis,
insbesondere Hepatitis Typ C, und/oder zur Vorhersage von individuellen
Arzneimittelwirkungen und/oder Arzneimittelnebenwirkungen.
-
Was
die Verwendung gemäß diesem
erfindungsgemäßen Aspekt
anbelangt, so kann das im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation
von Hepatitis-C-Viren stehende Gen, insbesondere ISG15, gewissermaßen als
Ausgangsobjekt zur Auffindung bzw. Bereitstellung von Arzneimitteln
in bezug auf eine Hepatitis-C-Infektion bzw. -Erkrankung eingesetzt
werden. Dabei können
die Arzneimittel dergestalt sein, daß sie – wie zuvor angeführt – direkt
oder indirekt mit dem zuvor definierten Gen bzw. der diesem zugeordneten
RNA, insbesondere mRNA, und/oder dem entsprechenden (Poly-)Peptid
interagieren, um auf diese Weise insbesondere über eine Verringerung bzw.
Unterbindung, insbesondere Inhibierung, der Genaktivität zu einer
Verringerung bzw. Unterbindung der Vermehrung bzw. Replikation von
Hepatitis-C-Viren und somit zu einer Linderung bzw. Ausheilung der
Hepatitis-C-Erkrankung zu führen.
Dabei kann es sich somit um solche Substanzen handeln, die eine
genregulatorische Wirkung aufweisen.
-
Dem
Fachmann sind die Grundlagen in bezug auf das spezifische Anwendungsgebiet
der erfindungsgemäßen Verwendung
gemäß diesem
Erfindungsaspekt maßgeblich
bekannt, so daß es
diesbezüglich
keiner weiteren Ausführungen
bedarf.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem vierten Aspekt der
vorliegenden Erfindung – ist
das erfindungsgemäße Verfahren
gemäß Anspruch
18, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Identifizierung
eines Inhibitors und/oder Repressors eines interferonstimulierten
Nukleinsäuremoleküls, insbesondere
Gens, vorzugsweise von ISG15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder
dessen zugeordneter RNA-Sequenz, wobei das Verfahren die folgenden
Schritte umfaßt:
- (a) Inkontaktbringen des Nukleinsäuremoleküls mit mindestens
einer Testsubstanz unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung, insbesondere
Bindung, der Testsubstanz(en) an das Nukleinsäuremolekül erlauben; und
- (b) Nachweis und/oder Analyse, ob die Testsubstanz(en) die Genaktivität und/oder
Expression des Nukleinsäuremoleküls einschränken oder
unterbinden und/oder ob die Testsubstanz(en) die Vermehrung und/oder
Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren,
einschränken
oder unterbinden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann beispielsweise in vitro durchgeführt werden, wobei gewissermaßen eine
Interaktion der Testsubstanz mit dem Nukleinsäuremolekül bzw. dem Gen untersucht wird
und bei vorliegender Interaktion auf eine resultierende verminderte
Genaktivität
als Folge dieser Interaktion geschlossen werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren
kann gleichermaßen
in einem entsprechenden Wirtsystem durchgeführt werden, wobei der Wirt
ein Träger
des im Zusammenhang mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren
stehenden Gens, insbesondere ISG15, sein sollte und vorteilhafterweise
auch über
einen entsprechendes Expressionssystem verfügt. Der Nachweis der Interaktion
bzw. Wechselwirkung bzw. der Nachweis der Beeinflussung der Genaktivität kann mit
dem Fachmann an sich geläufigen
Verfahren durchgeführt
werden.
-
In
diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung – gemäß einem
fünften
Aspekt der vorliegenden Erfindung – ein Verfahren nach Anspruch
19, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Identifizierung
eines Inhibitors und/oder Repressors eines von einem interferonstimulierten
Nukleinsäuremolekül, insbesondere
Gen, vorzugsweise ISG15, und/oder dessen DNA-Sequenz und/oder dessen
zugeordneter RNA-Sequenz codierten (Poly-)Peptids, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfaßt:
- (a) Inkontaktbringen des (Poly-)Peptids mit
mindestens einer Testsubstanz unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung,
insbesondere Bindung, der Testsubstanz(en) an das (Poly-)Peptid
erlauben; und
- (b) Nachweis und/oder Analyse, ob die Testsubstanz(en) die Aktivität des (Poly-)Peptids
einschränken
oder unterbinden und/oder ob die Testsub stanz(en) die Vermehrung
und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren,
einschränken
oder unterbinden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
gemäß diesem
Aspekt fokussiert somit auf eine Beeinflussung des Genproduktes
insbesondere in Form eines Proteins bzw. (Poly-)Peptids. Das Verfahren
kann in einer dem Fachmann an sich bekannten Art und Weise sowohl
in vitro als auch in vivo in einem Wirtsystem durchgeführt werden,
wobei im letzteren Fall der Wirt vorzugsweise die das zu untersuchende
(Poly-)Peptid codierende Nukleinsäure tragen sollte. Gleichermaßen kann
eine Interaktion aber auch in vitro an isolierten (Poly-)Peptiden durchgeführt werden.
-
Zudem
betrifft die vorliegende Erfindung gleichermaßen ein Verfahren zur Identifizierung
einer mit einem insbesondere körpereigenen
Mediator und/oder Faktor, welcher von einem interferonstimulierten
Nukleinsäuremolekül, insbesondere
Gen, vorzugsweise ISG15 reguliert wird oder welcher ein interferonstimuliertes Nukleinsäuremolekül, insbesondere
Gen, vorzugsweise ISG15 reguliert, interagierenden Substanz, wobei
das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
- (a)
Inkontaktbringen des Mediators und/oder Faktors mit mindestens einer
Testsubstanz unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung, insbesondere
Bindung, der Testsubstanz(en) an den Mediator und/oder Faktor erlauben;
und
- (b) Nachweis und/oder Analyse, ob die Testsubstanz(en) die Aktivität des Mediators
und/oder Faktors beeinflussen und/oder ob die Testsubstanz(en) die
Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere
Hepatits-C-Viren, einschränken
oder unterbinden.
-
Gemäß dem vorgenannten
Verfahren handelt es sich bei der interagierenden Substanz vorzugsweise um
einen Inhibitor und/oder Repressor des Mediators und/oder Faktors,
sofern dieser mit einer Aktivierung des interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere
Gens, vorzugsweise ISG15, in Verbindung steht. Sofern der Mediator
und/oder Faktor selbst mit einer Inaktivierung bzw. Repression des
interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere
Gens, vorzugsweise ISG15, in Verbindung steht, handelt es sich bei der interagierenden
Substanz in bezug auf den Mediator und/oder Faktor um einen Aktivator – hinsichtlich
des interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere Gens, vorzugsweise
ISG15, handelt es sich auf Basis der obigen Definition bei einer
derartigen Substanz jedoch gleichermaßen um einen Inhibitor bzw.
Repressor, da auch in diesem Fall letztendlich eine Inaktivierung
bzw. Repression des interferonstimulierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere
Gens, vorzugsweise ISG15, resultiert.
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
nach dem vierten und fünften
Aspekt der vorliegenden Erfindung können derart durchgeführt werden,
daß mehrere
Testsubstanzen eingesetzt und die folgenden Schritte durchgeführt werden:
- (a) Testung verschiedener Testsubstanzen in
verschiedenen Reaktionsgefäßen, wobei
diejenigen Testsubstanzen, welche die Genaktivität und/oder Expression und/oder
Aktivität
des Nukleinsäuremoleküls (DNA oder
RNA, insbesondere mRNA) nicht einschränken oder nicht unterbinden
und/oder welche die Aktivität des
(Poly-)Peptids nicht einschränken
oder nicht unterbinden und/oder welche die Vermehrung und/oder Replikation
von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, nicht einschränken oder
nicht unterbinden und/oder welche mit dem Mediator und/oder Faktor
nicht interagieren im weiteren Testverfahren nicht mehr berücksichtigt
werden;
- (b) Verteilung von Testsubstanzen aus solchen Reaktionsgefäßen, bei
welchen eine Verringerung oder Unterbindung der Genaktivität und/oder
Expression und/oder Aktivität
des Nukleinsäuremoleküls und/oder
bei welchen eine Verringerung oder Unterbindung der Aktivität des (Poly-)-Peptids und/oder
bei welchen eine Verringerung oder Unterbindung der Vermehrung und/oder
Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren und/oder
bei welchen eine Interaktion mit dem Mediator und/oder Faktor, in
Schritt (a) ermittelt wurde, auf neue Reaktionsgefäße und Wiederholung
von Schritt (a) mit den neuen Reaktionsgefäßen; und
- (c) Wiederholung von Schritt (b), bis eine einzelne Testsubstanz
identifiziert wird, welcher die Verringerung oder Unterbindung der
Genaktivität
und/oder Expression des Nukleinsäuremoleküls und/oder
welcher die Verringerung oder Unterbindung der Aktivität des (Poly-)Peptids
und/oder welcher die Verringerung oder Unterbindung der Vermehrung
und/oder Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatits-C-Viren, zugeordnet
werden kann und/oder welcher die Interaktion mit dem Mediator und/oder
Faktor zugeordnet werden kann.
-
Dabei
ist es gleichermaßen
möglich,
daß die
Verfahren gemäß dem vierten
und fünften
Aspekt der vorliegenden Erfindung derart durchgeführt werden,
daß die
Testsubstanz(en), das Nukleinsäuremolekül (DNA oder
RNA, insbesondere mRNA) und/oder das (Poly-)Peptid an ein Auslesesystem
(readout-System)
gekoppelt sind und/oder daß dem
Testansatz ein Auslesesystem zugesetzt wird und/oder daß das Auslesesystem nach
Bindung der Testsubstanz(en) mit dem Nukleinsäuremolekül und/oder dem (Poly-)Peptid
ein nachweisbares Signal liefert.
-
Im
Rahmen der vorgenannten Verfahren können die Testsubstanzen niedermolekulare
Substanzen, Peptide, Aptamere, Antikörper, DNA, RNA, insbesondere
siRNA und/oder Fragmente oder Derivate davon, sein.
-
Wie
zuvor angeführt,
können
die vorgenannten Verfahren beispielsweise in einem Wirt bzw. Wirtsystem
durchgeführt
werden, wobei der Wirt bzw. das Wirtsystem vorzugsweise die zuvor
definierten Gene umfaßt sowie über ein
entsprechendes Expressionssystem verfügt. Derartige Wirte sind dem
Fachmann an sich geläufig
bzw. der Fachmann ist jederzeit in der Lage, spezifische Wirtsysteme
vor dem Hintergrund der vorliegenden Erfindung auszuwählen, so
daß es
diesbezüglich
keiner weiteren Ausführungen
bedarf. Die erfindungsgemäßen Verfahren
können
gleichermaßen
in Form von Hochdurchsatzverfahren und/oder computerassistiert durchgeführt werden.
-
Für weitere
Einzelheiten in bezug auf die erfindungsgemäßen Verfahren gemäß dem vierten
und dem fünften
Aspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die Ausführungen
zu den übrigen
Aspekten bzw. Gegenständen
der vorliegenden Erfindung verwiesen werden, welche diesbezüglich entsprechend
gelten.
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Wiederum
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem sechsten Aspekt der
vorliegenden Erfindung – ist
das erfindungsgemäße Verfahren
gemäß Anspruch
26, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Verbesserung
der pharmakologischen Eigenschaften der nach dem Verfahren gemäß dem vierten
und/oder fünften
Aspekt der vorliegenden Erfindung identifizierten Testsubstanzen,
wobei man
- (a) die Bindungsstelle der Testsubstanz
an das Nukleinsäuremolekül (DNA oder
RNA, insbesondere mRNA) oder an das (Poly-)Peptid und gegebenenfalls
die Bindungsstelle des Nukleinsäuremoleküls oder des
(Poly-)Peptids an die Testsubstanz identifiziert;
- (b) die Bindungsstelle der Testsubstanz und des Nukleinsäuremoleküls oder
des (Poly-)Peptids durch molekulares Modellieren modifiziert; und
- (c) die Testsubstanz dergestalt modifiziert, daß ihre Bindungsspezifität oder Bindungsaffinität oder Bindungsavidität für das Nukleinsäuremolekül oder das
(Poly-)Peptid erhöht
wird.
-
Diesbezüglich kann
die Bindungsstelle in Schritt (a) durch ortsspezifische Mutagenese
ermittelt werden, wobei die diesbezüglichen Verfahren dem Fachmann
an sich bekannt sind.
-
Wiederum
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem siebten Aspekt der
vorliegenden Erfindung – ist
das erfindungsgemäße Verfahren
gemäß Anspruch
28, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Modifizierung
einer Testsubstanz, die nach den Verfahren gemäß dem vierten und/oder fünften und/oder
sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung identifiziert oder verbessert
ist, wobei die Testsubstanz als Leitstruktur weiter modifiziert
wird, um
- (i) ein modifiziertes aktives Zentrum,
ein modifiziertes Aktivitätsspektrum
und/oder eine modifizierte Organspezifität und/oder
- (ii) eine verbesserte Aktivität und/oder
- (iii) eine verminderte Toxizität (einen verbesserten therapeutischen
Index) und/oder
- (iv) verminderte Nebenwirkungen und/oder
- (v) einen zeitlich versetzten Beginn der therapeutischen Wirksamkeit
und/oder Länge
der therapeutischen Wirksamkeit und/oder
- (vi) veränderte
pharmakokinetische Parameter (insbesondere Resorption, Distribution,
Metabolismus und/oder Exkretion) und/oder
- (vii) modifizierte physikochemische Parameter, insbesondere
Löslichkeit,
hygroskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität und/oder
Zustandsform, und/oder
- (viii) eine verbesserte generelle Spezifität, Organ-/Gewebespezifität, und/oder
- (ix) eine optimierte Verabreichungsform und/oder -route, insbesondere
durch
- (a) Veresterung von Carboxylgruppen und/oder
- (b) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren und/oder
- (c) Veresterung von Hydroxylgruppen, insbesondere zu Phosphaten,
Pyrophosphaten oder Sulfaten und/oder Hemisuccinaten und/oder
- (d) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen und/oder
- (e) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen und/oder
- (f) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren und/oder
- (g) Einführung
von hydrophilen Gruppen und/oder
- (h) Einführung
und/oder Austausch von Substituenten in Aromaten und/oder Seitenketten
und/oder Veränderung
des Substituentenmusters und/oder
- (i) Modifikation durch Einführung
von isosterischen und/oder bioisosterischen Gruppen und/oder
- (j) Synthese von homologen Verbindungen und/oder
- (k) Einführung
von verzweigten Seitenketten und/oder
- (l) Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen
und/oder
- (m) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen und/oder
Acetalen und/oder
- (n) N-Acetylierung zu Amiden und/oder Phenylcarbamaten und/oder
- (o) Synthese von Mannich-Basen und/oder Iminen und/oder
- (p) Umwandlung von Ketonen und/oder Aldehyden in Schiff-Basen,
Oximen, Acetalen, Ketalen, Enolestern, Oxazolidinen, Thiozolidinen
oder deren Kombinationen,
zu erreichen.
-
Dabei
ist es im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, daß die identifizierte,
verbesserte oder modifizierte Testsubstanz, insbesondere der Inhibitor
und/oder Repressor der bzw. des zuvor genannten Gens, durch Peptidomimetika
pharmakologisch weiter verbessert wird.
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Für weitere
Ausführungen
in bezug auf die erfindungsgemäßen Verfahren
gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die Ausführungen
zu den vorangehenden Aspekten der vorliegenden Erfindung verwiesen
werden, welche diesbezüglich
entsprechend gelten.
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Wiederum
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem achten Aspekt der vorliegenden
Erfindung – ist
das erfindungsgemäße Verfahren
gemäß Anspruch
30, d. h. also mit anderen Worten ein Verfahren zur Identifikation
und/oder Ermittlung mindestens eines mit der Replikation von Hepatitis-Viren, insbesondere
Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehenden Nukleinsäuremoleküls, insbesondere
Gens, vorzugsweise humanen und/oder interferonstimulierten Gens,
wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
- (a)
Erstellung eines Genexpressions- und/oder Genaktivitätsprofils
von einer Vielzahl von Probanden eines Probandenkollektivs, wobei
(i) die Probanden einer ersten Gruppe des Probandenkollektivs eine
Infektion mit Hepatitis-Viren, insbesondere Hepatitis-C-Viren, aufweisen
und (ii) die Probanden einer zweiten Gruppe des Probandenkollektivs
keine solche Infektion aufweisen;
- (b) Analyse und Vergleich bzw. Abgleich der jeweiligen Genexpressionsund/oder
Genaktivitätsprofile
von (i) Probanden der ersten Gruppe und (ii) Probanden der zweiten
Gruppe und
- (c) Identifikation mindestens eines Nukleinsäuremoleküls, insbesondere mindestens
eines Gens, welches bei (i) den Probanden der ersten Gruppe im Vergleich
zu (ii) den Probanden der zweiten Gruppe eine erhöhte Genexpression
und/oder Genaktivität
aufweist.
-
Das
Verfahren kann im Anschluß an
Schritt (c) den nachfolgenden Schritt (d) umfassen:
- (d) Zuordnung des in Schritt (c) identifizierten Nukleinsäuremoleküls, insbesondere
Gens, als ein mit der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren,
insbesondere Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehendes Nukleinsäuremolekül, insbesondere
Gen.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise anhand differenzieller
Expression unter Einsatz von sogenannten DNA-Chips eingesetzt werden.
Dabei kann beispielsweise derart verfahren werden, daß zunächst RNA
aus dem Blut eines zu untersuchenden Probanden isoliert und dieses
Isolat auf speziellen Gen-Chips gegeben wird und im Rahmen von dem
Fachmann an sich bekannten Auswerte- bzw. Analyseverfahren der Expressionsgrad
bei Probanden mit Hepatitis-C-Infektion
im Vergleich zu Probanden ohne Hepatitis-C-Infektion für bestimmte
Gene ermittelt wird und einem Gen, insbesondere einem interferonstimulierten
Gen, mit einem erhöhten
Expressionsgrad die Eigenschaften eines im Zusammenhang mit der
Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren im Zusammenhang
stehenden Gens, insbesondere die Vermehrung bzw. Replikation von
Hepatitis-C-Viren fördernden
Gens zugesprochen werden kann.
-
Auf
diese Weise ist es möglich,
weitere Gene, insbesondere interferonstimulierte Gene, zu identifizieren,
welche mit der Vermehrung bzw. Replikation von Hepatitis-C-Viren
im Zusammenhang mit einer Hepatitis-C-Infektion bzw. Hepatitis-C-Erkrankung
stehen.
-
Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung – gemäß einem neunten Aspekt der
vorliegenden Erfindung – eine
pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 32, mit anderen
Worten somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise
für die
prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Hepatitis-C-Erkrankungen,
enthaltend in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen
mindestens eine pharmakolo gisch aktive Substanz, insbesondere einen
Inhibitor und/oder Repressor, für
ein mit der Vermehrung und/oder Replikation von Hepatitis-Viren,
insbesondere Hepatitis-C-Viren, im Zusammenhang stehendes Nukleinsäuremolekül, insbesondere
Gen, vorzugsweise ISG15, und/oder für dessen DNA-Sequenz und/oder
für dessen
zugeordnete RNA-Sequenz, insbesondere für dessen zugeordnete mRNA-Sequenz,
und/oder für
dessen zugeordnete (Poly-)Peptid, wobei die Substanz nach dem Verfahren
gemäß dem vierten
und/oder fünften
und/oder sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung erhältlich ist.
-
Für weitere
diesbezügliche
Einzelheiten im bezug auf die erfindungsgemäße pharmakologisch aktive Substanz
kann auf die übrigen
Ausführungen
zu den weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung verwiesen werden,
welche in diesem Zusammenhang entsprechend gelten.
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Wiederum
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem zehnten Aspekt der
vorliegenden Erfindung – ist
zudem eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 33, mit anderen Worten
somit eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die prophylaktische
oder therapeutische Behandlung von Hepatitis-C-Erkrankungen, enthaltend
in wirksamen, insbesondere pharmazeutisch wirksamen Mengen mindestens
eine siRNA, wobei die siRNA die Genaktivität und/oder Genexpression mindestens
eines interferonstimulierten Gens, insbesondere von ISG15, reguliert,
insbesondere vermindert oder zumindest hemmt.
-
Bei
der im Rahmen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung eingesetzten siRNA handelt es sich gemäß einer
ganz besonders bevorzugten Ausführungsform
um eine siRNA gegen ISG15, welche von der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland
unter der Produktnummer bzw. Bestellnummer SI00072387 bezogen werden
kann.
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Für weitere
Einzelheiten in bezug auf die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung
gemäß diesem
Erfindungsaspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die Ausführungen
zu den übrigen
vorgenannten Aspekten der vorliegenden Erfindung verwiesen werden,
welche in diesem Zusammenhang entsprechend gelten.
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Weitere
Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen der vorliegenden Erfindung
sind für
den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar
und realisierbar, ohne daß er
dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.
-
Die
vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele
veranschaulicht, welche die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls
beschränken.
-
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE:
-
Methoden und Untersuchungsergebnisse:
-
1. Isolierung von Gesamt-RNA
-
Zur
Extraktion der Gesamt-RNA wurden die Zellen mit 500 μl Trizol überschichtet.
Die adhärenten
Zellen wurden mit einem Plastikschaber vom Grund gelöst und in
ein Reaktionsgefäß überführt. Es
wurden 0,1 ml Chloroform/1 ml Trizol hinzugegeben und durch Schütteln vermischt.
Zentrifugieren bei 12.000 g und bei 2 bis 8°C für 15 min führte zur Phasentrennung des
Phenol/Chloroform-Gemisches. Die wäßrige Phase wurde abgenommen
und die gelöste
RNA durch 0,5 ml Isopropanol/1 ml Trizol ausgefüllt. Das Pellet wurde dann
mit 75% Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und abschließend in
RNase-freiem Wasser gelöst.
Im Anschluß wurde
die RNA mit Hilfe des „RNeasy
Mini” Kits
(Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend den Herstelleranweisungen
aufgereinigt und bis zur weiteren Analyse bei –20°C gelagert.
-
2. Quantitative realtime-PCR:
-
Die
reverse Transkription von RNA, gefolgt von einer Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR), ist eine sensitive Methode zur Quantifizierung
spezifischer mRNAs. In einem Ein-Schritt-RT-PCR-Verfahren (one-step RT-PCR)
wird durch den Einsatz spezifischer Primer zuerst die mRNA des gesuchten
Gens in komplementäre DNA
(cDNA) umgeschrieben, welche wiederum das Template bzw. die Vorlage
für die
folgende PCR liefert.
-
Um
eine quantitative Aussage über
die eingesetzte Menge an mRNA machen zu können, wurde der LightCycler
Rotor-Gene 2000 von Corbett (Mortlake, Australien) verwendet. Der
LightCycler erfaßt über eine Fluorimeterkomponente
die Fluoreszenz des Fluorophoren nach Bindung an doppelsträngige DNA.
Eingesetzt wurde das QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit von QIAGEN,
ein 25-μl-Ansatz
wurde wie folgt zusammenpipettiert: 5,25 μl H2O
(RNase-frei), 12,5 μl
SYBR Green RT-PCR Master Mix, 0,25 μl QuantiTect RT-Mix, 2,5 μl jedes Primers
(0,5 mM) und 2 μl
Gesamt-RNA (100 ng bis 200 ng). Das verwendete LightCycler-Programm startete
mit einem 30minütigen
RT-Schritt bei 55°C,
gefolgt von einer 15minütigen
Hitze-Inaktivierung
der RT-Polymerase mit dem Anschluß eines herkömmlichem PCR-Schemas,
d. h. pro Zyklus 5 s Denaturierung bei 95°C, 10 s Annealingtemperatur
(55°C) und
30 s Elongation bei 72°C.
Die Produktbildung wurde nach jedem Replikationszyklus über den
Fluoreszenzanstieg bestimmt. Nach im Durchschnitt 40 Replikationszyklen wurden
die Schmelzkurven der gebildeten Produkte erfaßt, um so die Spezifität der PCR-Reaktion
zu überprüfen. Aufgrund
des Schmelzverhaltens von DNA nimmt die Fluoreszenz mit steigender
Temperatur ab. Die maximale Fluoreszenzänderung pro Temperaturerhöhung ergibt
ein Maximum in der Schmelzkurve, welches charakteristisch für jedes
PCR-Produkt ist. Die vom LightCycler kalkulierten Kopienzahlen der
gemessenen Gene wurden gegen das housekeeping Gen bzw. Haushaltsgen β-Aktin abgeglichen
und analysiert.
-
3. Suppression der Genexpression von ISG15
mittels siRNA:
-
Die
Expression von ISG15 wurde auf Zellkulturebene im HCV-Replikon-System ausgeschaltet,
um die direkte Wirkung auf die HCV-Replikation zu untersuchen. Die
Suppression der Genexpression, auch gene-knockdown bzw. gene-knockout
genannt, erfolgt mittels siRNA über
einen zellulären
Mechanismus des Prozessierens. Der Dicer-Enzymkomplex spaltet zelluntypische
dsRNA in 21 bis 23 bp große
Oligomere, die sogenannten small interfering RNAs (siRNA). Die siRNA
kann mit einem Proteinkomplex den RNA-induced silencing complex
(RISC) ausbilden; dieser bindet den antisense-Strang der siRNA und
schneidet die dazu komplementäre
mRNA. Die Degradation der mRNA führt
zu einer Reduktion der Translation dieser mRNAs und somit zu einem
gene-silencing auf posttranskriptionaler Ebene.
-
Ein
auf der humanen Hepatomzelllinie HuH-7 basierendes con1-Replikon-System sowie die
murinen MH1-Zellen, die ebenfalls ein HCV-Replikon enthalten, wurden
im 96er Lochplattenformat mit siRNAs gegen ISG15 (Qiagen) transfiziert
(human: Best.-Nr. S100072387, murin: Best.-Nr. SI01007531). Dann
wurde der Effekt der Gensuppression auf die HCV-Replikation untersucht.
-
Hierzu
wurden in einem reversen Transfektionsansatz zuerst 12,5 ng der
siRNAs (5 nM) in 3 μl
Susspensionspuffer gelöst
und in die Vertiefungen der Lochplatte vorpipettiert. In einem weiteren
Ansatz wurden jeweils 2,5 ng der siRNAs für ein gleichzeitiges Ausschalten
weiterer Gene eingesetzt (nicht graphisch dargestellt). Als Kontrolle
wurde eine nichtcodogene siRNA einge setzt. Anschließend wurden
pro Ansatz 0,75 μl
des Transfektionsreagenz Hi-PerFectTM (Qiagen, Hilden, Deutschland) in 24,25 μl serumfreies
Kulturmedium überführt, gemischt
und zu den vorgelegten siRNAs gegeben. Der Transfektionsansatz wurde
nun 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden
1·104 Zellen zu den Transfektionsansätzen gegeben
und das Volumen mit Kulturmedium auf 200 μl aufgefüllt und für 12 Stunden bei 37°C, 5% CO2-Gehalt und gesättigter Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Die RNA wurde wie bereits beschrieben extrahiert und der Rückgang der
Genexpression von ISG15 sowie die HCV-Replikation mittels quantitativer
RT-PCR bzw. Westernblot untersucht.
-
4. Hemmung der HCV-Replikation im Dauerversuch über 3 Monate – fehlende
Induktion resistenter Mutanten:
-
Murine
MH1-HCV-Replikon-Zellen wurden über
19 Zellpassagen mit nichtkodierender siRNA bzw. gegen ISG15 gerichteter
siRNA kultiviert. Zur Zellpassage 1, 7, 11, 15 und 19 wurde die
HCV-Kopienzahl/100.000 Kopien β-Aktin
bestimmt und jeweils gegen die unbehandelte Kontrolle (100%) abgeglichen.
Da die gegen ISG15 gerichtete siRNA während der gesamten Dauer des
Versuchs ihre anti-HCV-Aktivität
behielt, ist davon auszugehen, daß keine gegen diesen Ansatz
resistenten Mutanten entstanden sind oder selektioniert wurden. 1A und 1B veranschaulichen
die erhaltenen Ergebnisse (mit siNC = non silencing control, siISG15
= ISG15-spezifische si-RNA).
In 1A ist die HCV-Kopienzahl gegen die unbehandelte
Kontrolle (MH1) normiert und abgeglichen, und in 1B ist
die HCV/ISG15-Kopienzahl
gegen die siNC-Kontrolle normiert und abgeglichen. 1A und 1B zeigen
den erheblichen Rückgang
der HCV-Kopienzahl bei Behandlung mit ISG15-spezifischer siRNA (siISG15).
Folglich ist auch die Vermehrung bzw. Replikation unter Einfluß von siISGI5
verringert.
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5. Hemmung der HCV-NS5A-Proteinexpression
mittels siRNA-Knockdown von ISG15 – Synergismus mit IFN-α:
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Die
murinen MH1- und die humanen con1-HCV-Replikonzellen wurden in 6-Lochplatten
ausgesät
und bis zu einer Konfluenz von 30 bis 40% bei 37°C und einem CO2-Luftgehalt
von 5% inkubiert. Die Transfektion mit 5 nM siRNA (siNC = non silencing
control, siISG15 = ISG15-spezifische humane sowie murine siRNA)
erfolgte mittels „HiPerFectTM Transfection Reagent” (Qiagen, Hilden, Deutschland).
Nach 8 h Inkubation (37°C, 5%
CO2) wurden die Zellen gewaschen und wieder
in Kulturmedium sowie mit IFN-α versetztem
Medium aufgenommen und für
weitere 64 h inkubiert. Im Anschluß wurden die Zellen lysiert
und eine Proteinextraktion durchgeführt. Mittels Westernblot konnten
das virale Proteine NS5A sowie das housekeeping Gen β-Aktin nachgewiesen
werden.
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2A und 2B zeigen
im Rahmen eines Westernblots, daß eine Behandlung mit gegen
ISG15 gerichteter siRNA sowohl in murinen als auch in humanen HCV-Replikonsystemen
zu einer deutlichen Suppression des HCV-NS5A-Proteins führt. Ferner zeigen 2A und 2B,
daß ein
Synergismus mit IFN-α besteht,
da die zusätzliche
Gabe von IFN-α (vgl. 2A und 2B:
+IFN-α)
zu einer signifikanter Verringerung der NS5A-Synthese im Vergleich
zu dem nicht mit IFN-α behandelten
Ansatz (vgl. 2A und 2B: –IFN-α) führt.
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1A zeigt
die Hemmung der HCV-Replikation und die fehlende Induktion resistenter
Mutanten bei Behandlung mit ISG15-spezifischer siRNA (siISGl5) gegenüber einer
Behandlung mit siNC, wobei die HCV-Kopienzahl gegen die unbehandelte
Kontrolle (MH1) normiert und abgeglichen ist.
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1B zeigt
die Hemmung der HCV-Replikation und die fehlende Induktion resistenter
Mutanten bei Behandlung mit ISG15-spezifischer siRNA (siISGl5) gegenüber einer
Behandlung mit siNC, wobei die HCV/ISG15-Kopienzahl gegen die siNC-Kontrolle
normiert und abgeglichen ist.
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2A zeigt
anhand eines Westernblots die Ergebnisse einer an humanen conl-HCV-Replikonzellen durchgeführten Behandlung
mit gegen ISG15 gerichteter siRNA ohne zusätzliche Applikation von IFN-α einerseits
(–IFN-α) und mit
zusätzlicher
Applikation von IFN-α andererseits
(+IFN-α).
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2B zeigt
anhand eines Westernblots die Ergebnisse einer an murinen MH1-HCV-Replikonzellen durchgeführten Behandlung
mit gegen ISG15 gerichteter siRNA ohne zusätzliche Applikation von IFN-α einerseits
(–IFN-α) und mit
zusätzlicher
Applikation von IFN-α andererseits
(+IFN-α).
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3 zeigt
einen Vergleich der Replikation von Hepatitis-C-Viren in MH1-Zellen
für verschiedene
Passagen, wobei die HCV-Kopienzahl auf 100.000 β-Aktin-Moleküle bezogen ist (MH1 = unbehandelte
Kontrolle, NC = non silencing control, ISG15 = ISG15-spezifische
si-RNA). Für
sämtliche
Passagen ist unter Einsatz von ISG15-spezifischer si-RNA im Vergleich zu
MH1 und NC ein deutlicher Rückgang
der HCV-Kopienzahl und somit eine Verminderung der Virussynthese
bzw. -replikation zu beobachten. Sequenzprotokoll
I
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
