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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kalibrieren eines Detektors
eines Laser-Scanning-Mikroskops (LSM).
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Hochempfindliche
Lichtdetektoren wie Photovervielfacher (engl. „photomultiplier”;
PMT), insbesondere aus GaAsP, oder Lawinenphotodioden (engl. „avalanche
photodiode”; APD) weisen nur eine begrenzte Lebensdauer
auf. Mit zunehmender Betriebsdauer nimmt ihre Empfindlichkeit ab.
Aufgrund des Rückgangs der Detektorempfindlichkeit mit
der Detektorbetriebsdauer sind gleichartige Messungen (beispielsweise
an derselben Probe), die zu unterschiedlichen Zeiten mit demselben
Detektor durchgeführt werden, nicht mit ausreichender Genauigkeit quantitativ
vergleichbar.
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Auch
an sich gleichartige Messungen, die jedoch mit verschiedenen LSM
derselben Baureihe (also mit verschiedenen Detektoren) durchgeführt
werden, sind aufgrund von produktionsbedingten Schwankungen der
Empfindlichkeit zwischen den Detektoren nicht mit ausreichender
Genauigkeit quantitativ vergleichbar. Das gilt auch für
Messungen mit mehreren Detektoren in demselben LSM, sei es in mehreren
Detektionskanälen oder mittels eines ortsauflösenden
Detektors, der mehrere Detektionselemente in demselben Detektionskanal
aufweist. Darüber hinaus können äußere
Einflüsse, beispielsweise unterschiedliche Umgebungsbedingungen,
die Empfindlichkeit der Detektoren und damit die Vergleichbarkeit
zweier Messungen (sowohl mit demselben LSM zu verschiedenen Zeitpunkten
als auch mit zwei unterschiedlichen LSM oder Detektoren) beeinträchtigen.
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Wäre
die tatsächliche Detektorempfindlichkeit während
einer Messung bekannt, so könnten die Messwerte durch eine
entsprechend Korrektur normalisiert werden. Dadurch würden
verschiedene Messungen (desselben oder verschiedener Detektoren)
miteinander vergleichbar. Es ist jedoch aufwendig, die tatsächlich
vorliegende Empfindlichkeit bei einem in einem LSM eingebauten Detektor
zu messen.
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Um
eine bessere Vergleichbarkeit der Messergebnisse zu erreichen, ist
es bekannt, einen LSM-Detektor mittels einer Referenzprobe bekannter Beschaffenheit
zu kalibrieren, beispielsweise aus
WO
98/49537 . Die Referenzprobe wird mittels eines Lasers des
LSM mit einer grob definierten Lichtintensität bestrahlt.
Am Detektor wird währenddessen ein detektorspezifisches
Referenzsignal aufgenommen. Aus einer Relation zwischen der Stärke
des Referenzsignals und der eingestrahlten Lichtintensität
in Verbindung mit der Probenbeschaffenheit kann die derzeitige Empfindlichkeit
des Detektors ermittelt werden. Anhand dieses Empfindlichkeitswerts
können die Messwerte des Detektors korrigiert werden. Dadurch
sind zwar Messwerte verschiedener Detektoren oder auch desselben
Detektors von verschiedenen Messzeitpunkten vergleichbar. Diese
Art der Kalibrierung ist jedoch aufwendig und fehleranfällig. Zudem
kann sie nicht automatisch durchgeführt werden.
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Eine
andere Möglichkeit zur Kalibrierung eines LSM-Detektors
ist aus
EP 1 089 061
B1 bekannt. In einem LSM ist neben einem Beleuchtungsstrahlengang
und einem Detektionsstrahlengang mit einem Detektor zusätzlich
ein zur Referenzmessung dienender Referenzstrahlengang vorgesehen.
Aus dem Beleuchtungsstrahlengang kann Referenzlicht in den Referenzstrahlengang
eingekoppelt und von dort wieder auf den Detektor im Detektionsstrahlengang
geleitet werden. Zur Kalibrierung muss das Referenzlicht gleichzeitig
sowohl durch den regulären Detektor als auch durch eine
besondere Referenz-Detektionseinrichtung im Referenzstrahlengang aufgenommen
werden. Der Referenzstrahlengang ist dementsprechend komplex. Entsprechend
aufwendig ist auch der Kalibriervorgang.
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Eine
bessere Vergleichbarkeit zwischen den einzelnen lichtempfindlichen
Elementen eines Photosensors hat
EP 1 821 509 A2 zum Ziel. Zu diesem Zweck
wird vorgeschlagen, die lichtempfindlichen Elemente mittels einer
Referenzlichtquelle, beispielsweise einer Leuchtdiode, zu beleuchten
und dabei die Varianzen zwischen den einzelnen lichtempfindlichen
Elementen zu bestimmen. Die Varianzen stellen relative Empfindlichkeitswerte
zwischen den einzelnen Sensorelementen dar. Dadurch können
die Empfindlichkeitsunterschiede zwischen den Elementen des Photosensors
korrigiert werden. Eine genügende Vergleichbarkeit zwischen
zu verschiedenen Zeitpunkten (und unter verschiedenen Umgebungsbedingungen)
durchgeführten Messungen wird durch dieses Verfahren jedoch
nicht erreicht.
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Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Kalibrierung eines
LSM-Detektors mit geringem Aufwand zu ermöglichen, wobei
unterschiedliche Messungen mit hoher Genauigkeit miteinander vergleichbar
sein sollen.
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Die
Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die in
Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein LSM, welches
die in Anspruch 10 angegebenen Merkmale aufweist.
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Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen
angegeben.
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Erfindungsgemäß ist
vorgesehen, dass der zu kalibrierende Detektor mittels einer hinsichtlich
ihrer optischen Ausgangsleistung langzeitstabilen Referenzlichtquelle
beleuchtet und währenddessen ein Messsignal des Detektors
als referenzlichtquellenspezifischer und detektorspezifischer Referenzwert aufgenommen
und gespeichert wird. Die Erfindung wird vorzugsweise zur Kalibrierung
von Photovervielfachern und Lawinenphotodioden eingesetzt.
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Im
Sinne der Erfindung ist eine Lichtquelle langzeitstabil, wenn sie
eine langfristige Schwankung der optischen Ausgangsleistung von
maximal 3% aufweist. Der Begriff der langfristigen Schwankung bezieht
sich dabei auf Zeiträume von Jahren oder Jahrzehnten.
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Die
Verwendung einer langzeitstabilen Lichtquelle ermöglicht
die Bestimmung eines aktuellen Empfindlichkeitswerts, ohne dass
deren Intensität/Leistung bekannt zu sein braucht. Die
Empfindlichkeit wird durch die Signalstärke des Detektors
relativ zur quasi konstanten Lichtintensität der Referenzlichtquelle
wiedergegeben. Die nahezu konstante Lichtintensität der
Referenzlichtquelle am Ort des Detektors (gewährleistet
durch die Langzeitstabilität der Lichtquelle) dient dabei
gleichsam als Maßstab für die Detektorempfindlichkeit.
Voraussetzung für die Vergleichbarkeit ist lediglich, dass
bei jeder Referenzmessung derselbe Messzustand des Detektors und
dieselbe Referenzlichtquelle verwendet werden und dass der Strahlengang, über
den der Detektor mit der Referenzlichtquelle beleuchtet wird, immer identisch
ist.
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Ein
besonderer Referenzstrahlengang ist nicht erforderlich, das Kalibrierverfahren
selbst ist außerdem einfach. Beispielsweise kann die Referenzlichtquelle
mit geringem Aufwand anstelle einer Probe in einer definierten Position
vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet werden, um den Detektor durch das
Objektiv und den weiteren Detektionsstrahlengang zu beleuchten,
und die automatische Referenzmessung ausgelöst werden.
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Die
Kalibrierung kann auch vollständig automatisch durchgeführt
werden, beispielsweise zu festgelegten Zeitpunkten vor und/oder
nach einer regulären Messung, wenn das Licht der Referenzlichtquelle entweder
im Verlauf des regulären Detektionsstrahlengangs zum Detektor
eingekoppelt wird, beispielsweise mittels eines Strahlvereinigers,
oder wenn die Referenzlichtquelle neben einem Ende des Detektionsstrahlengangs
im Bereich des Detektors so angeordnet ist, dass sie den Detektor
unter einem kleinen Winkel zum Detektionsstrahlengang beleuchtet.
Die letztgenannte Alternative hat zusätzlich den Vorteil, dass
die Kalibrierung unabhängig von der aktuellen Konfiguration
des Detektionsstrahlengangs ist, beispielsweise hinsichtlich der
Position von Filtern. Die Referenzlichtquelle kann dabei fest im
LSM platziert oder in einem externen Lichtmodul angeordnet sein, das über
einen Lichtwellenleiter nach Bedarf oder permanent an das LSM anschließbar
ist.
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Besonders
bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen die hinsichtlich
ihrer optischen Ausgangsleistung langzeitstabile Referenzlichtquelle hinsichtlich
ihrer optischen Ausgangsleistung auch kurzzeitstabil ist. Die Kurzzeitstabilität
hat den Vorteil, dass die Referenzmessung nur wenig Zeit beansprucht,
beispielsweise 0,1 s oder weniger, da sie dann nicht durch kurzzeitige
Schwankungen der Lichtintensität beeinträchtigt
wird. Außerdem sind die Referenzmessung und in der Folge
die Empfindlichkeitskorrektur der Messwerte dadurch mit hoher Genauigkeit
möglich.
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Im
Sinne der Erfindung ist eine Lichtquelle kurzzeitstabil, wenn sie
eine kurzfristige Schwankung der optischen Ausgangsleistung von
maximal 0,5% aufweist. Der Begriff der kurzfristigen Schwankung bezieht
sich dabei auf Zeiträume von Sekunden oder Minuten.
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Der
referenzlichtquellenspezifische und detektorspezifische Referenzwert
wird beim regulären Messen verwendet, indem der Detektor
in einem Messzustand, der in einem Bereich eines bei der Ermittlung
des Referenzwerts verwendeten Messzustands liegt, betrieben (beispielsweise
wird im Falle eines PMT bei der Referenzmessung dieselbe Hochspannung
angelegt wie bei den regulären Messungen), ein Messwert
aufgenommen, anhand des Referenzwerts korrigiert und gespeichert
wird. Die Korrektur kann unmittelbar während der Messung
geschehen, beispielsweise durch analoge oder digitale Signalverarbeitung,
oder im Nachhinein, beispielsweise mittels Software. Die korrigierten
Messwerte sind dann mit hoher Genauigkeit miteinander vergleichbar,
auch wenn sie aus Messungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten und
mit unterschiedlichen Umgebungsbedingungen stammen, weil sie alle
auf dasselbe Referenzniveau normalisiert sind, nämlich
auf die Antwort des Detektors auf die kurz- und langzeitkonstante
Lichtintensität der Referenzlichtquelle.
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Der
referenzlichtquellenspezifische und detektorspezifische Referenzwert
erlaubt es auch, einen Austauschzeitpunkt für den Detektor
zu ermitteln. Dazu ist es zweckmäßig, den Referenzwert
mit einem vorgegebenen Schwellwert zu vergleichen, und bei Unterschreiten
des Schwellwerts eine Warnung oder Aufforderung zum Austausch auszugeben.
Es ist auch möglich, mehrere in genügenden zeitlichen
Abständen ermittelte Referenzwerte in die Zukunft zu extrapolieren.
Auf diesem Wege kann prognostiziert werden, wann die Empfindlichkeit
des Detektors den Schwellwert unterschreiten wird. Dies kann dazu
dienen, rechtzeitig einen Wartungstermin zu planen.
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Als
lang- und kurzzeitstabile Lichtquelle wird vorzugsweise eine temperaturstabilisierte
und entweder stromstabilisierte oder lichtgeregelte Leuchtdiode
verwendet. Leuchtdioden weisen eine deutlich höhere Lebensdauer
auf als übliche LSM-Detektoren. Ihre Lichtintensität
unterliegt dabei sowohl kurz- als auch langfristig nur geringen
Schwankungen. Sie können daher über die gesamte
Lebensdauer eines LSM-Detektors als Referenzlichtquelle verwendet werden.
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Zudem
sind Leuchtdioden kostengünstig verfügbar und
weisen einen hohen Wirkungsgrad auf. Anstelle von Leuchtdioden kann
als Referenzlichtquelle auch jede andere hinsichtlich ihrer optischen
Ausgangsleistung lang- und kurzzeitstabile Lichtquelle verwendet
werden. Beispielsweise kann anstelle einer Leuchtdiode auch eine
temperaturstabilisierte und entweder stromstabilisierte oder lichtgeregelte
Laserdiode verwendet werden, wenn diese hinsichtlich ihrer optischen
Ausgangsleistung lang- und kurzzeitstabil ist und entsprechende
Abschwächungsmittel vorgesehen sind, um eine Schädigung des
Detektors durch die hohe Lichtintensität zu vermeiden.
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In
besonderen Ausführungsformen kann die Leuchtdiode als Mehrfarbenleuchtdiode
ausgebildet sein. Das ermöglicht eine Kalibrierung mit
mehreren Referenzwellenlängen bei geringem Platzbedarf
der Referenzlichtquelle.
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Vorteilhafterweise
ist eine Emissionswellenlänge der Leuchtdiode an eine Empfindlichkeitskurve des
Detektors angepasst. Dadurch ist die Bestimmung des Referenzwerts
und damit die spätere Messwertkorrektur mit hoher Genauigkeit
möglich.
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Um
verschiedene Arbeitspunkte auf der Kennlinie des Detektors nutzen
zu können ist es von Vorteil, die Folge der Verfahrensschritte
mehrfach durchzuführen, wobei der Detektor bei jeder Durchführung
in einem unterschiedlichem Messzustand betrieben wird und für
jeden Messzustand ein separater referenzlichtquellenspezifischer
und detektorspezifischer Referenzwert aufgenommen und gespeichert
wird. An Arbeitspunkten, die zwischen den Messzuständen
der separaten Referenzwerte liegen, können die Referenzwerte
zur Korrektur interpoliert werden. Diese Art der Kalibrierung ist
vorteilhaft, wenn die Kalibrierung in kurzen zeitlichen Intervallen von
beispielsweise einer Stunde wiederholt durchgeführt wird.
Es ist dann nicht erforderlich, bei der eigentlichen Messung genau
denselben Messzustand des Detektors zu verwenden wie bei der Referenzmessung.
Auch braucht bei den wiederholten Referenzmessungen nicht immer
exakt dieselbe Menge von Messzuständen eingestellt zu werden.
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Das
erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop weist
zweckmäßigerweise einen Detektor, einen Laser
und daneben eine langzeitstabile und vorzugsweise auch kurzzeitstabile
Referenzlichtquelle auf, die zur Beleuchtung des Detektors während
eines Kalibrierdurchgangs angeordnet ist. Der Laser dient als reguläre
Messlichtquelle. Es können auch mehrere Laser als reguläre
Messlichtquellen vorhanden sein. Die Referenzlichtquelle ist von
allen Messlichtquellen verschieden. Zweckmäßigerweise
ist das LSM mit einer Steuereinheit ausgerüstet, die zur Durchführung
eines erfindungsgemäßen Kalibrier- und eines erfindungsgemäßen
Betriebsverfahrens eingerichtet ist. Der Benutzer hat somit die
Wahl, welches Verfahren durchgeführt werden soll. Insbesondere
kann die Kalibrierung vorteilhafterweise vor und/oder nach jeder
Messung oder im Zeitintervall eingestellt werden.
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Die
Erfindung umfasst auch ein Computerprogramm, das zur Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet
ist sowie eine ebensolche Steuereinheit.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher
erläutert.
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In
den Zeichnungen zeigen:
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1 ein
Laser-Scanning-Mikroskop mit Referenzlichtquelle,
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2 ein
Ablaufdiagramm des Kalibrierverfahrens,
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3 ein
Ablaufdiagramm des Messverfahrens,
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4 eine
alternative Anordnung von Referenzlichtquelle und Detektor und
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5 eine
weitere mögliche Anordnung von Referenzlichtquelle und
Detektor.
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In
allen Zeichnungen haben übereinstimmende Teile gleiche
Bezugszeichen.
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1 zeigt
ein Laser-Scanning-Mikroskop 1 in einer schematischen Darstellung.
Es besteht aus einer Mikroskopeinheit M und einer Scaneinheit S, die
eine gemeinsame optische Schnittstelle über eine Zwischenabbildung
Z aufweisen, sowie aus einem Lasermodul L. Die Scaneinheit S kann
sowohl an den Phototubus eines aufrechten Mikroskops als auch an einen
seitlichen Ausgang eines inversen Mikroskops angeschlossen werden.
Die Mikroskopeinheit M weist ein Objektiv 4 und eine Tubuslinse 9 zum
Beobachten einer Probe 5 auf.
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Die
Scaneinheit S enthält eine Kollimationsoptik 16,
einen Umlenkspiegel 17, ein Scanning-Objektiv 22,
einen Scanner 23, einen Hauptstrahlteiler 24 und
eine Abbildungsoptik 25 für die Detektion. Mittels
eines teildurchlässigen Spiegels 18 wird ein Überwachungsstrahlengang
in Richtung einer Monitordiode 19, der ein Neutralfilter 20 vorgeordnet
ist, ausgeblendet. Ein Umlenkspiegel 27 hinter der Abbildungsoptik 25 spiegelt
die von der Probe 5 kommende Strahlung in Richtung der
senkrecht zur optischen Achse verstellbaren und in ihrem Durchmesser
veränderbaren Lochblende 29, der ein Emissionsfilter 30 und
einen geeigneten Detektor 31, beispielsweise ein Photovervielfacher,
nachgeordnet sind. Eine externe Steuereinheit 34 ist mit
lokalen Ansteuerungseinheiten 10, 35 und 38 für
die Monitordiode 19, eine Referenzlichtquelle 11 beziehungsweise
die verstellbare Lochblende 29 verbunden. Die Referenzlichtquelle 11 ist
eine Leuchtdiode, deren Emissionsspektrum mit der Empfindlichkeitskurve
des Detektors 31 nahezu übereinstimmt. Leuchtet
sie, wird ihr Licht durch eine Optik 12 kollimiert und über
den Hauptstrahlteiler 24 in den Detektionsstrahlengang
zum Detektor 31 eingekoppelt. Die Referenzlichtquelle 11 ist
mit einer Temperaturstabilisierung (nicht abgebildet) versehen und
wird von der Ansteuerungseinheit 10 stromgeregelt. Dadurch
weist ihre optische Ausgangsleistung nahezu keine kurz- oder langfristigen Schwankungen
auf. Die Referenzlichtquelle 11 kann von der Steuereinheit 34 aus
ein- und ausgeschaltet werden.
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Das
separate Lasermodul L enthält einen Laser 13 als
Messlichtquelle, dessen Laserstrahl nach dem Austreten aus dem Diodenlaser 13 zunächst
frei propagiert und durch ein akustooptisches Bauelement 32,
beispielsweise ein AOTF, hindurchtritt. Der Laserstrahl wird dann
durch eine Koppeloptik 33 und eine Lichtleitfaser 14 in
den Beleuchtungsstrahlengang der Scaneinheit S eingekoppelt. Zweckmäßigerweise
werden die Referenzlichtquelle 11 und die Messlichtquelle 13 nur
alternativ eingeschaltet. Zu diesem Zweck kann der Laserstrahl mittels
des akustooptischen Bauelements 32 ausgeblendet werden.
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Die
Steuereinheit 34 führt eine Kalibrierung des Detektors 31 auf
manuelle Anweisung des Benutzers oder automatisch vor einem Messdurchgang aus.
Es ist auch denkbar, die Kalibrierung stattdessen nach einem Messdurchgang
oder davor und danach auszuführen. Alternativ oder zusätzlich
kann die Kalibrierung intervallweise erfolgen, beispielsweise stündlich.
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Der
Detektor 31 gibt ein elektrisches Signal IMess,
dass für eine gegebene Hochspannung proportional zur einfallenden
Lichtleistung PMess ist. Hinzukommt ein
Dunkelstrom I0: IMess = I0 + k·PMess.
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Der
Faktor k hängt von der Hochspannung, mit welcher der beispielhafte
PMT-Detektor 31 betrieben wird, und der Nutzungsdauer sowie
den Umgebungsbedingungen und der Vorgeschichte des Detektors 31 ab.
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Im
Fall der erfindungsgemäße Referenzmessung mit
der zwar unbekannten, aber quasi konstanten optischen Leistung PLED der Referenzlichtquelle 11 ergibt
sich: ILED = I0 + k·PLED.
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Der
unbekannte Faktor k kann anhand der Referenzmessung ersetzt werden,
so dass sich für eine kalibrierte Messung ergibt: PMess = PLED·(IMess – I0)/(ILED – I0).
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Ist
der absolute Wert der optischen Leistung nicht relevant, kann PLED beispielsweise willkürlich auf
den Wert Eins gesetzt werden, so dass sich für einen individuellen
Detektor über alle Zeiten vergleichbare Messungen ergeben.
Um Messungen zwischen unterschiedlichen Detektoren vergleichen zu
können, wird PLED einmalig bestimmt,
beispielsweise bei der Produktion des LSM 1. Dadurch ist
eine absolute Empfindlichkeitskorrektur möglich. Die normalisierten
Messwerte mehrerer auf diese Weise kalibrierter Detektoren 31 sind
dadurch mit hoher Genauigkeit quantitativ vergleichbar.
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Die
Referenzmessung (Kalibrierung) kann beispielsweise unmittelbar vor
und/oder nach jedem Messzyklus, oder aber auch nur in bestimmten
Abständen erfolgen, beispielsweise einmal pro Stunde oder
jeweils nur beim Anschalten des Gerätes. Zur Referenzkorrektur
werden am zweckmäßigerweise der Dunkelstrom I0 sowie das Referenzsignal ILED (also
die Antwort des Photodetektors auf das bekannte Referenzsignal der
LED) bestimmt. Das Referenzsignal sollte dabei möglichst
für die gleiche Hochspannung am PMT wie bei der späteren
eigentlichen Messung aufgenommen werden. Alternativ (beispielsweise,
wenn nur einmal pro Stunde kalibriert werden soll) kann die Referenz
auch für eine begrenzte Anzahl verschiedener Hochspannungen
bestimmt werden. Für die Zwischenwerte wird dann der Referenzwert
durch eine geeignete Formel (linear, quadratisch oder vorzugsweise
exponentiell) interpoliert. Um über einen großen
Bereich von Hochspannungen die Referenzmessung zu ermöglichen,
ohne den sinnvollen Messbereich des Detektors 31 zu verlassen, kann
man auch mit einer der jeweiligen Hochspannung angepassten Referenzlichtleistung
eine Referenzmessung durchführen.
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In 2 sind
die Schritte des Kalibrierverfahrens schematisch dargestellt. Zur
Referenzmessung wird der Detektor 31 mit dem Licht der
temperaturstabilisierten Referenzleuchtdiode 11 beleuchtet.
Der Strom durch die LED 11 wird von der Ansteuerungseinheit 10 mittels
einer geeigneter elektronischen Schaltung konstant gehalten, und
die Antwort des Detektors 31 auf dieses bekannte Lichtsignal
wird bestimmt und als referenzlichtquellen- und detektorspezifischer
Referenzwert gespeichert. Dies kann für mehrere Arbeitspunkte
auf der Kennlinie des Detektors 31 erfolgen, beispielsweise
im Hochspannungsbereich von 500 V bis 1000 V in Schritten von 50
V oder 100 V. An jedem Arbeitspunkt wird ein referenzlichtquellen-
und detektorspezifischer Referenzwert ermittelt und gespeichert.
Die Kalibrierung kann zusätzlich auch mit einer oder mehreren
anderen Lichtintensitäten der Referenzlichtquelle 11 durchgeführt
werden. Es liegen dann mehrere Lichtintensitäts-/Antwortsignal-Wertepaare
für jeden Arbeitspunkt vor.
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3 zeigt
die Schritte einer regulären Messung. Mit dem im Kalibrierdurchgang
erhaltenen, referenzlichtquellen- und detektorspezifischen Referenzwert
ILED (oder auch mehreren Lichtintensitäts-/Antwortsignal-Wertepaaren)
können die Messwerte IMess des
Detektors 31 entsprechend der jeweiligen, den derzeitigen äußeren
Umständen (Temperatur, Alter des Detektors usw.) entsprechenden Empfindlichkeit
des Detektors 31 normalisiert werden. Damit die Messungen
des LSM 1 untereinander vergleichbar sind, erfolgt die
Normalisierung gemäß: PMess = (IMess – I0)/(ILED – I0).
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In 4 ist
eine alternative Ausführungsform dargestellt. Die Referenzlichtquelle 11 ist
neben einem Ende des Detektionsstrahlengangs im Bereich des Detektors 31 so
angeordnet, dass sie den Detektor 31 unter einem kleinen
Winkel zum Detektionsstrahlengang von beispielsweise 10° beleuchtet.
Bis zu 30° sind alternativ möglich. Die Optik 12 bildet
die Referenzlichtquelle 11 auf den Detektor 31 ab.
In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann
auf eine Optik 12 verzichtet werden, wenn sich (wie bei
einer LED) die Abstrahlcharakteristik der Referenzlichtquelle 11 mit
zunehmendem Betriebsalter nicht ändert.
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5 zeigt
eine weitere Ausführungsform, bei welcher die Referenzlichtquelle 11 in
die Scaneinheit S integriert ist. Hier wird der permanent schräggestellte
Emissionsfilter 30 benutzt, um das Licht der Referenzlichtquelle 11 unter
den gleichen Bedingungen wie das Probenlicht auf den Detektor 31 zu
lenken. Dadurch werden mögliche Fehler aufgrund verschiedener
Einfallswinkel von Probenlicht und Referenzlicht ausgeschlossen.
Zweckmäßigerweise muss der Emissionsfilter das
gesamte Spektrum der LED reflektieren, um Messfehler aufgrund leichter spektraler Änderungen
des Referenzlichts auszuschließen.
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In
alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) kann
die Referenzlichtquelle 11, beispielsweise einschließlich
ihrer Ansteuerungseinheit 10, in einem separaten Modul
(nicht abgebildet) angeordnet sein, das mittels eines Lichtwellenleiters
an die Scaneinheit S angebunden ist. Das Referenzlicht kann dann
entweder durch Einkopplung in den Detektionsstrahlengang, beispielsweise
wie in 1 und 5, oder direkt, beispielsweise
wie in 4, zum Detektor 31 geleitet werden.
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Es
ist auch denkbar, dass die Referenzlichtquelle 11 in einem
Spezialaufsatz für das Mikroskopobjektiv 4 angeordnet
ist. Durch einen solchen Aufsatz sind die Position der Referenzlichtquelle 11 und damit
der Strahlengang des Referenzlichts zum Detektor 31 mechanisch
definiert und daher mit geringem Aufwand genau rekonstruierbar.
Allerdings ist ein solcher Aufsatz nur zur manuellen Kalibrierung geeignet.
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In
weiteren Ausführungsformen (nicht dargestellt) kann das
Licht der Referenzlichtquelle 11 über einen ein-
und ausklappbaren Spiegel auf den Detektor 31 geleitet
werden (ähnlich wie in 4, aber ohne
spektrale Änderungen durch den Emissionsfilter 30).
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Anstelle
einer einzelnen Referenzlichtquelle 11 können
auch mehrere verwendet werden, beispielsweise verschiedenfarbige
Leuchtdioden. Da beispielsweise Photovervielfacher spektral unterschiedlich
altern (die Empfindlichkeit sinkt beispielsweise am stärksten
im roten Spektralbereich), kann der Detektor 31 nacheinander
mit den einzelnen Farben beleuchtet werden. Dies kann auch für
mehrere Arbeitspunkte und/oder mehrere Lichtintensitäten durchführt
werden. Anstelle mehrerer Leuchtdioden mit verschiedenen Emissionswellenlängen
kann auch eine Mehrfarbenleuchtdiode verwendet werden.
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Die
Erfindung ist nicht nur für GaAsP-Photovervielfacher geeignet,
sondern für alle PMT in allen LSM-Systemen, also auch Multialkali-PMT
usw. Sie ist auch für andere Detektoren, beispielsweise CCD-Kameras
geeignet, um beispielsweise das System zu bewerten und Koppeleffizienzen
zu überwachen.
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- 1
- Laser-Scanning-Mikroskop
- 4
- Objektiv
- 5
- Probe
- 9
- Tubuslinse
- 10
- Ansteuerungseinheit
für Referenzlichtquelle 11
- 11
- Referenzlichtquelle
- 12
- Optik
- 13
- Laser
- 14
- Lichtleitfaser
- 15
- Lichtmodulationssektion
- 16
- Kollimationsoptik
- 17
- Umlenkspiegel
- 18
- Teildurchlässiger
Spiegel
- 19
- Monitordiode
- 20
- Neutralfilter
- 22
- Scanning-Objektiv
- 23
- Scanner
- 24
- Hauptstrahlteiler
- 25
- Abbildungsoptik
- 27
- Umlenkprisma
- 29
- Lochblende
- 30
- Emissionsfilter
- 31
- Empfängerelement
- 32
- Akustooptisches
Bauelement
- 33
- Einkoppeloptik
- 34
- Zentrale
Steuereinheit
- 35
- Ansteuerungseinheit
für Monitordiode 19
- 38
- Ansteuerungseinheit
für Lochblende 29
- M
- Mikroskopeinheit
- S
- Scaneinheit
- L
- Lasermodul
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 98/49537 [0005]
- - EP 1089061 B1 [0006]
- - EP 1821509 A2 [0007]