DE102008025328B4 - Compositions and methods for amplifying HIV by multiplex PCR in multiple genome regions - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Detektion von HIV-1 und HIV-2 in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben, b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben, c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution, d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c), e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region und gag-Region der HIV-1-Genotypen abgeleitet werden, wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22, und für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region der HIV-2-Genotypen abgeleitet werden, wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist, und weiter umfassend eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die erste, zweite und dritte Sonde mit jeweils mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, und wobei die vierte Sonde mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet, f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, wobei vor der Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix eine reverse Transkription der viralen RNA und der internen Kontroll-Nukleinsäure erfolgt, und g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.A method of detecting HIV-1 and HIV-2 in blood-derived samples comprising a) providing blood-derived samples, b) concentrating the blood-derived samples, c) extracting the viral nucleic acids using a lysis reagent Buffer comprising an internal control nucleic acid and using heated nuclease-free water for elution, d) obtaining the viral nucleic acid extracts from step c), e) preparing a PCR master mix comprising for the detection of HIV 1 comprises a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids comprising at least two pairs each of a sense primer and an antisense primer and at least two pairs each of a first probe and a second probe, the nucleotide sequences of the primers and probes are derived from the conserved 5 'LTR region and gag region of the HIV-1 genotypes, the following pairs each consisting of a sense primer and an An Tisense primer is selected: nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 1 and 2, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 3 and 4, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 5 and 7, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 6 and 7; and nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs are selected from the following pairs each of a first probe and a second probe. 19 and 20, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 21 and 22, and for the detection of HIV-2, a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids and each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, wherein the nucleotide sequences of the primers and probes are derived from the conserved 5 'LTR region of the HIV-2 genotypes, wherein a sense primer comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 8, an antisense primer comprising a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 9 and a third probe comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 23, and further comprising a fourth probe specific for the internal control nucleic acid, wherein the first, second and third probes are each labeled with at least one first fluorescent dye, and wherein the fourth probe is labeled with at least one second fluorescent dye, f) adding the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix and performing the nucleic acid amplification, wherein prior to the addition of the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix a reverse Transcription of the viral RNA and the internal control nucleic acid is carried out, and g) detection of the amplified viral nucleic acids and the amplified internal control nucleic acid.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Zusammensetzungen und Testkits für die Amplifikation und Detektion von humanem Immundefizienzvirus (HIV). Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Multiplex-PCR-Verfahren, welches durch die Anwendung von multiplen Primersets/Sondensets alle bisher bekannten Subtypen von HIV-1, einschließlich der Gruppe M- und der Gruppe O-Isolate, sowie alle Subtypen von HIV-2 amplifizieren kann. Dabei erfolgt die Amplifikation der HIV-1 Subtypen bevorzugt in zwei konservierten Genomregionen, um das Risiko einer falsch negativen Reaktion durch spontane Mutationen des HIV signifikant gegenüber bisher beschriebenen HIV-Nachweisverfahren zu reduzieren.The present invention relates to methods, compositions and test kits for the amplification and detection of human immunodeficiency virus (HIV). In particular, the present invention relates to a multiplex PCR method which, by the use of multiple primer sets / sets of probes, detects all hitherto known subtypes of HIV-1, including the group M and the group O isolates, as well as all subtypes of HIV-1. 2 can amplify. The amplification of the HIV-1 subtypes is preferably carried out in two conserved genome regions in order to reduce the risk of a false negative reaction by spontaneous mutations of HIV significantly compared to previously described HIV detection methods.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Das erworbene Immundefizienzsyndrom (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) wird durch das humane Immundefizienzvirus (HIV) verursacht. Das HI-Virus kann in zwei Gruppen differenziert werden: HIV-1 und HIV-2. Beide Gruppen zeigen eine genetische Verwandtschaft, jedoch eine Variabilität in der Erbinformation. Gegenwärtig werden in der Literatur 10 Subtypen von HIV-1 (Gruppe M umfassen die Subtypen A-I und Gruppe O umfasst den Subtyp O1 und O2) identifiziert. Diese große genetische Variabilität unter den HIV-Isolaten macht es extrem schwierig, Verfahren, umfassend die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), sowie Primer und Sonden zu entwerfen, welche alle Subtypen von HIV-1 und alle HIV-2-Subtypen effizient detektieren. Ferner muss damit gerechnet werden, dass aufgrund der fehlenden „Proof-Reading” Funktion der reversen Transkriptase weitere Mutationen bei HI-Viren auftreten werden und somit die Anzahl der Subtypen zunehmen wird.The Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) is caused by the human immunodeficiency virus (HIV). The HIV virus can be differentiated into two groups: HIV-1 and HIV-2. Both groups show a genetic relationship, but a variability in genetic information. Currently, the literature identifies 10 subtypes of HIV-1 (group M includes subtypes A-I and group O includes subtypes O1 and O2). This large genetic variability among the HIV isolates makes it extremely difficult to design methods comprising the polymerase chain reaction (PCR) as well as primers and probes which efficiently detect all subtypes of HIV-1 and all HIV-2 subtypes. Furthermore, it must be expected that due to the lack of "proof-reading" function of the reverse transcriptase further mutations in HI viruses will occur and thus the number of subtypes will increase.

Gegenwärtig beschriebene Methoden basierend auf Multiplex-PCR beschreiben die Amplifikation in jeweils einer Genomregion pro Virus ( EP 0 727 497 B1 , EP 0 630 973 A2 oder DE 698 33 160 T2 ). Kommt es in der beschriebenen Amplifikationsregion zu Mutationen im Bereich der Primerbindungsstellen oder der Sondenbindungsstellen, so ist mit einer verminderten Amplifikationseffizienz bzw. einem falsch negativen Ergebnis zu rechnen. Handelt es sich dabei um ein Blutprodukt, so besteht die Gefahr einer Übertragung von HIV auf einen Empfänger. Trotz gesetzlicher Einführung der Realtime PCR in das Spenderscreening kam es im Frühjahr 2007 zu einer transfusionsbedingten Übertragung von HIV-1 auf einen Empfänger. Mitverantwortlich für die Übertragung waren Mutationen in der Sondenbindungsregion und im Bereich des Antisense-Primers des verwendeten PCR-Screening Verfahrens.Currently described methods based on multiplex PCR describe the amplification in one genome region per virus ( EP 0 727 497 B1 . EP 0 630 973 A2 or DE 698 33 160 T2 ). If mutations in the region of the primer binding sites or of the probe binding sites occur in the described amplification region, a reduced amplification efficiency or a false negative result can be expected. If it is a blood product, there is a risk of transmission of HIV to a recipient. Despite the legal introduction of real-time PCR into donor screening, transfusion-related transmission of HIV-1 to a recipient occurred in the spring of 2007. Contributing factors for the transfer were mutations in the probe binding region and in the region of the antisense primer of the PCR screening method used.

Vet et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(11): 6394–6399) beschreiben ein Multiplex-Verfahren zur gleichzeitigen Detektion von 4 Retroviren, HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II. Dabei werden zugleich jeweils ein Virus-spezifisches Primerpaar und ein Molecular Beacon als eine Sonde verwendet, wobei für HIV-1 und HIV-2 ein Primerpaar aus der gag-Region von HIV-1 und ein Primerpaar aus der env-Region von HIV-2 eingesetzt werden. Es können die HIV-1 Subtypen A-G und die HIV-2 Subtypen A, D und SD detektiert werden.Vet et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96 (11): 6394-6399) describe a multiplex method for the simultaneous detection of 4 retroviruses, HIV-1, HIV-2, HTLV-I and HTLV-II. In each case, a virus-specific primer pair and a molecular beacon are used as a probe, wherein for HIV-1 and HIV-2 a primer pair from the gag region of HIV-1 and a primer pair from the env region of HIV-2 be used. The HIV-1 subtypes A-G and the HIV-2 subtypes A, D and SD can be detected.

Drosten et al. (Clin Chem. 2006; 52(7): 1258–1266) beschreiben ein RT-PCR-Nachweisverfahren für HIV-1. Es werden ein aus der LTR-Domäne von HIV-1 abgeleitetes Primerpaar, zwei Sonden, eine interne Kontroll-Nukleinsäure und eine dafür spezifische Sonde eingesetzt.Drosten et al. (Clin Chem. 2006; 52 (7): 1258-1266) describe a RT-PCR detection method for HIV-1. A primer pair derived from the LTR domain of HIV-1, two probes, an internal control nucleic acid and a probe specific for this purpose are used.

Drosten et al. (J Clin Microbiol. 2001; 39(12): 4302–4308) offenbaren einen HT-RT-PCR-Assay zum Nachweis von HIV-1, der ein Primerpaar aus der gag-Region von HIV-1 und eine interne Kontrollsonde, die in einen MS2-Coliphagen verpackt ist („armored RNA”), verwendet.Drosten et al. (J Clin Microbiol. 2001; 39 (12): 4302-4308) disclose an HT-RT PCR assay for the detection of HIV-1 comprising a primer pair from the gag region of HIV-1 and an internal control probe is packaged in an MS2 coliphage ("armored RNA").

MacNeil et al. (J Virol. 2006; 80(15): 7316–7321) offenbaren das Mapping von 202 HIV-2 Integrationsstellen in das humane Genom. O'Connell (Appl Environ Microbiol. 2006; 72(1): 478–83) offenbaren real-time fluorogene RT-PCR-Assays zur Detektion des Bacteriophagen MS2. Dreier et al. (J Clin Microbiol. 2005; 43(9): 4551–4557) offenbaren die Verwendung des Bacteriophagen MS2 als interne Kontrolle in viralen RT-PCR-Assays.MacNeil et al. (J Virol., 2006; 80 (15): 7316-7321) disclose the mapping of 202 HIV-2 integration sites into the human genome. O'Connell (Appl Environ Microbiol. 2006; 72 (1): 478-83) disclose real-time fluorogenic RT-PCR assays for the detection of bacteriophage MS2. Dreier et al. (J Clin Microbiol. 2005; 43 (9): 4551-4557) disclose the use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral RT-PCR assays.

Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Methoden für die Detektion aller bekannten HIV-1 Subtypen und HIV-2 Subtypen zur Verfügung zu stellen, um insbesondere im Blutspendewesen das Risiko für falsch negative Ergebnisse, wie verursacht durch Spontanmutationen in einer Genomregion von HIV, zu reduzieren.Therefore, it is an object of the present invention to provide means and methods for the detection of all known HIV-1 subtypes and HIV-2 subtypes, especially in blood donation, for the risk of false negative results, such as caused by spontaneous mutations in a genome region of Reduce HIV.

Zusammenfassung der Erfindung Summary of the invention

Die vorliegende Erfindung überwindet die oben aufgeführten Probleme und stellt Mittel zur Amplifikation und Detektion von hoch divergenten HIV-1 und HIV-2 Isolaten zur Verfügung.The present invention overcomes the above problems and provides means for amplification and detection of highly divergent HIV-1 and HIV-2 isolates.

Die oben aufgeführte Aufgabe wird durch die Erfindung, wie in den Patentansprüchen beansprucht, gelöst.The above object is achieved by the invention as claimed in the claims.

Die oben aufgeführte Aufgabe wird gelöst durch das zur Verfügung stellen von Verfahren für die Detektion aller bekannten HIV-1 Subtypen und/oder HIV-2 Subtypen in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend eine parallele Amplifikation in zwei konservierten Genombereichen des HIV. Somit wird das Risiko für falsch negative Ergebnisse durch Spontanmutationen in einer Genomregion von HIV reduziert. Die Erfindung stellt weiterhin Zusammensetzungen und Testkits zur Verfügung, die insbesondere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.The above object is achieved by providing methods for the detection of all known HIV-1 subtypes and / or HIV-2 subtypes in blood-derived samples comprising parallel amplification in two conserved genomic regions of HIV. Thus, the risk of false negative results is reduced by spontaneous mutations in a genome region of HIV. The invention further provides compositions and test kits that are particularly suitable for the methods of the invention.

Verschiedene andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung offensichtlich.Various other objects and advantages of the present invention will become apparent from the detailed description of the invention.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Amplifikation von HIV-Nukleinsäuren. Die Verfahren umfassen das in Kontaktbringen einer Probe, von der angenommen wird, dass sie HIV-Nukleinsäuren enthält, mit vier verschiedenen NTPs, einer reversen Transkriptase sowie ggf. RNase-Inhibitoren, einer thermostabilen DNA-Polymerase in der Gegenwart von Oligonukleotiden für die Amplifikation von HIV-1 Nukleinsäuren, von Oligonukleotiden für die Amplifikation von HIV-2 Nukleinsäuren sowie in Gegenwart von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotiden als Sonden für die Amplifikation von HIV-1 Zielnukleinsäuren, Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotiden als Sonden für die Amplifikation von HIV-2 Zielnukleinsäuren sowie in Gegenwart von Oligonukleotiden für die Amplifikation/Detektion einer internen Kontrolle sowohl in der Ausführungsform einer kompetitiven internen Kontrolle (z. B. HIV-1 interne Kontrolle) sowie in der Ausführungsform einer nicht kompetitiven internen Kontrolle (z. B. Bacteriophage MS2).The present invention relates to methods for amplifying HIV nucleic acids. The methods include contacting a sample suspected of containing HIV nucleic acids with four different NTPs, a reverse transcriptase, and optionally RNase inhibitors, a thermostable DNA polymerase in the presence of oligonucleotides for the amplification of HIV-1 nucleic acids, oligonucleotides for the amplification of HIV-2 nucleic acids and in the presence of fluorescent dye-labeled oligonucleotides as probes for the amplification of HIV-1 target nucleic acids, fluorescent dye-labeled oligonucleotides as probes for the amplification of HIV-2 target nucleic acids and in Presence of oligonucleotides for the amplification / detection of an internal control in both the embodiment of a competitive internal control (e.g., HIV-1 internal control) and in the embodiment of a non-competitive internal control (e.g., bacteriophage MS2).

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

Erfindungsgemäße Detektions- und ScreeningverfahrenInventive detection and screening method

Wie oben ausgeführt, wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Detektion von HIV-1 und HIV-2 in aus Blut abgeleiteten Proben gelöst.As stated above, the object of the invention is achieved by providing a method for detecting HIV-1 and HIV-2 in blood-derived samples.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
In einem ersten Schritt (a) werden aus Blut abgeleitete Proben zur Verfügung gestellt.The method according to the invention comprises the following steps:
In a first step (a) blood-derived samples are provided.

Im nächsten Schritt (b) werden die aus Blut abgeleiteten Proben konzentriert.In the next step (b), the blood-derived samples are concentrated.

Im nächsten Schritt (c) erfolgt die Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine erste interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution.In the next step (c), the extraction of the viral nucleic acids is carried out using a lysis buffer comprising a first internal control nucleic acid and using heated nuclease-free water for elution.

Im nächsten Schritt (d) werden die viralen Nukleinsäure-Extrakte aus dem vorhergehenden Schritt (c) erhalten.In the next step (d), the viral nucleic acid extracts from the previous step (c) are obtained.

Im nächsten Schritt (e) wird ein PCR-Mastermix hergestellt.In the next step (e), a PCR master mix is prepared.

Der PCR-Mastermix umfasst für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst. Dabei werden die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von zwei verschiedenen konservierten Regionen, der HIV-1-Genotypen (5'-LTR-Region und gag-Region) abgeleitet.The PCR master mix comprises, for the detection of HIV-1, a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and at least two pairs of one sense primer and one antisense primer and at least two pairs of each a first probe and a second probe. The nucleotide sequences of the primers and probes are derived from two different conserved regions, the HIV-1 genotypes (5'-LTR region and gag region).

Wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22.The following pairs are selected from a sense primer and an antisense primer: nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 1 and 2, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 3 and 4, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 5 and 7, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 6 and 7; and from the following pairs each of a first probe and a second probe Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs are selected. 19 and 20, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 21 and 22.

Der PCR-Mastermix umfasst weiterhin für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst.The PCR master mix further comprises for the detection of HIV-2 a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids, each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe.

Dabei werden die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region der HIV-2-Genotypen abgeleitet.The nucleotide sequences of the primers and probes are derived from the conserved 5 'LTR region of the HIV-2 genotypes.

Wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist.Wherein a sense primer is a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 8, an antisense primer comprising a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 9 and a third probe comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 23 is.

Der PCR-Mastermix umfasst weiterhin eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist. Die Sonden sind mit jeweils mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die erste, zweite und dritte Sonde ist dabei jeweils mit mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert und die vierte Sonde ist mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet.The PCR master mix further comprises a fourth probe specific for the internal control nucleic acid. The probes are each labeled with at least one fluorescent dye. The first, second and third probe are each labeled with at least one first fluorescent dye and the fourth probe is labeled with at least one second fluorescent dye, which differs from the first fluorescent dye.

Im nächsten Schritt (f) werden die viralen Nukleinsäure-Extrakte (aus Schritt d) zum PCR-Mastermix zugegeben und die Nukleinsäuren amplifiziert, wobei vor der Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix eine reverse Transkription der viralen RNA und der internen Kontroll-Nukleinsäure erfolgt.In the next step (f), the viral nucleic acid extracts (from step d) are added to the PCR master mix and the nucleic acids amplified, wherein prior to the addition of the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix reverse transcription of the viral RNA and the internal control nucleic acid occurs.

Im nachfolgenden Schritt (g) erfolgt die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren, d. h. der viralen Nukleinsäuren (wenn vorhanden) und der internen Kontroll-Nukleinsäure.In the subsequent step (g), the detection of the amplified nucleic acids, d. H. the viral nucleic acids (if any) and the internal control nucleic acid.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:

• a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
• b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
• c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
• d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
• e) Herstellen eines PCR-Mastermixes,

umfassend
für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst,
wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region und gag-Region der HIV-1-Genotypen abgeleitet werden,
wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22,
und
für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst,
wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region der HIV-2-Genotypen abgeleitet werden,
wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist,
und weiter umfassend
eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist,
wobei die erste, zweite und dritte Sonde mit jeweils mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert sind,
und wobei die vierte Sonde mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet,

• f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, wobei vor der Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix eine reverse Transkription der viralen RNA und der internen Kontroll-Nukleinsäure erfolgt, und
• g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.

The method of the present invention comprises the following steps:

• a) providing blood-derived samples,
• b) concentrating the blood-derived samples,
• c) extraction of the viral nucleic acids using a lysis buffer comprising an internal control nucleic acid and using heated nuclease-free water for elution,
• d) obtaining the viral nucleic acid extracts from step c),
• e) preparing a PCR master mix,

full
for the detection of HIV-1, a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids comprising at least two pairs each of a sense primer and an antisense primer and at least two pairs each of a first probe and a second probe,
wherein the nucleotide sequences of the primers and probes are derived from the conserved 5 'LTR region and gag region of the HIV-1 genotypes,
wherein in each case one sense primer and one antisense primer are selected from the following pairs: nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 1 and 2, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 3 and 4, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 5 and 7, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 6 and 7; and nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs are selected from the following pairs each of a first probe and a second probe. 19 and 20, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 21 and 22,
and
for the detection of HIV-2, a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids, each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe,
wherein the nucleotide sequences of the primers and probes are derived from the conserved 5 'LTR region of the HIV-2 genotypes,
wherein a sense primer comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 8, an antisense primer comprising a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 9 and a third probe comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 23,
and further comprising
a fourth probe specific for the internal control nucleic acid,
wherein the first, second and third probes are each labeled with at least one first fluorescent dye,
and wherein the fourth probe is labeled with at least one second fluorescent dye different from the first fluorescent dye,

• f) adding the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix and performing the nucleic acid amplification, wherein prior to the addition of the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix, a reverse transcription of the viral RNA and the internal control -Nucleic acid takes place, and
• g) detection of the amplified viral nucleic acids and the amplified internal control nucleic acid.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben oder um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere handelt es sich um Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben. Die zelluläre Blutbestandteile enthaltenden Proben sind dabei ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Erythrozyten, Thrombozyten oder Plasmaprodukten.According to the invention, the samples derived from blood are blood samples or samples containing components of the blood, in particular samples containing whole blood, plasma, serum or cellular blood components. The cellular blood components containing samples are selected from the group consisting of erythrocytes, platelets or plasma products.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl zum Screening von Einzelproben als auch zum Screening von gepoolten Proben. In einer Ausführungsform werden die aus Blut abgeleiteten Proben zu mindestens einem Probenpool zusammengeführt. Von jeder für das Screening vorgesehenen Probe bzw. Probenpool werden bevorzugt mindestens 3000 μl (3 ml) Probe bzw. Probenpool benötigt. Untersucht werden bevorzugt Plasmaproben mit einem Mindestvolumen von 100 μl. Hierbei können Minipools bevorzugt von einer Poolgröße zwischen 3 und 96 Proben hergestellt und untersucht werden.The method according to the invention is suitable both for the screening of individual samples and for the screening of pooled samples. In one embodiment, the blood-derived samples are pooled into at least one sample pool. Of each sample or sample pool intended for the screening, preferably at least 3000 μl (3 ml) of sample or sample pool are required. Plasma samples with a minimum volume of 100 μl are preferred. Minipools can preferably be prepared and analyzed from a pool size of between 3 and 96 samples.

Der Begriff „Oligonukleotide” bezieht sich insbesondere auf ein Molekül, welches eines oder mehrere Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfasst, wie z. B. Primer, Sonden und Nukleinsäurefragmente, die detektiert werden sollen.The term "oligonucleotides" refers in particular to a molecule comprising one or more deoxyribonucleotides or ribonucleotides, such as e.g. B. primers, probes and nucleic acid fragments to be detected.

Der Begriff „Primer” bezieht sich insbesondere auf ein Oligonukleotid, welches entweder natürlich vorkommt oder synthetisch hergestellt wird und welches in der Lage ist, als ein Ausgangspunkt der Synthese zu agieren, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, unter welchen die Synthese eines Primer-Extensionsprodukts komplementär zu einem Nukleinsäurestrang induziert wird. Dabei werden geeignete Reaktionsbedingungen (Temperatur, pH-Werte) für eine Amplifizierungs-Reaktion gewählt.More particularly, the term "primer" refers to an oligonucleotide which is either naturally occurring or synthetically produced and which is capable of acting as a starting point of the synthesis when brought under conditions which include the synthesis of a primer extension product is induced to complement a nucleic acid strand. Suitable reaction conditions (temperature, pH values) are selected for an amplification reaction.

Um HIV-Zielnukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren, werden bevorzugt Primersets aus folgenden Oligonukleotiden ausgewählt:

To amplify HIV target nucleic acids according to the present invention, primer sets are preferably selected from the following oligonucleotides:

Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure mindestens eine Region, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann. Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure außerdem Regionen, an denen sich Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, spezifisch anlagern können, so dass die interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert werden kann.According to the invention, an internal control nucleic acid comprises at least one region to which a probe can hybridize or specifically attach. In accordance with the invention, an internal control nucleic acid also includes regions to which primers, such as sense primers and antisense primers, can specifically attach so that the internal control nucleic acid can be amplified.

Erfindungsgemäß ist die mindestens eine Region der internen Kontroll-Nukleinsäure, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann, unterschiedlich zu Sequenzen des Zieltargets, der Nukleinsäuren der HI-Viren, HIV-1 und HIV-2, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt eine Sonde, die spezifisch für die viralen Nukleinsäuren ist, wird nicht an die interne Kontroll-Nukleinsäure hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine weitere (vierte) Sonde verwendet, deren Sequenz von der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wurde.According to the invention, the at least one region of the internal control nucleic acid to which a probe can hybridize or attach specifically, different from sequences of the target, the nucleic acids of HIV viruses, HIV-1 and HIV-2, with the inventive method to be detected. That is, a probe that is specific for the viral nucleic acids is not linked to the internal control Nucleic acid hybridize or attach specifically. Therefore, in the method according to the invention, a further (fourth) probe is used whose sequence was derived from the internal control nucleic acid.

Es wird bevorzugt, dass die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz ist bzw. eine Nukleinsäure ist, die eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz umfasst.It is preferred that the internal control nucleic acid is a competitive or non-competitive nucleotide sequence, or a nucleic acid comprising a competitive or non-competitive nucleotide sequence.

Erfindungsgemäß zeichnet sich eine kompetitive Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure dadurch aus, dass sich die Regionen, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, nicht unterscheiden von den respektiven Regionen der Nukleinsäuren der HI-Viren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt dieselben Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, führen zur Amplifikation der nachzuweisenden viralen Nukleinsäuren und zur Amplifikation der internen kompetitiven Kontroll-Nukleinsäure.According to the invention, a competitive nucleotide sequence or nucleic acid is characterized in that the regions on which primers can attach specifically for amplification do not differ from the respective regions of the nucleic acids of the HI viruses which are to be detected by the method according to the invention. That is, the same primers as sense primers and antisense primers result in the amplification of the viral nucleic acids to be detected and in the amplification of the internal competitive control nucleic acid.

Dahingegen sind die Regionen einer nicht kompetitiven Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, verschieden zu den respektiven Regionen der viralen Nukleinsäuren. Das heißt die Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, die zur Amplifikation der nachzuweisenden viralen Nukleinsäuren führen, amplifizieren nicht zugleich die interne nicht kompetitive Kontroll-Nukleinsäure.On the other hand, the regions of a non-competitive nucleotide sequence or nucleic acid on which primers can attach specifically for amplification are different to the respective regions of the viral nucleic acids. That is, the primers, such as sense primers and antisense primers, which result in the amplification of the viral nucleic acids to be detected, do not simultaneously amplify the internal non-competitive control nucleic acid.

Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz, deren Zuckerbestandteil Desoxyribose oder Ribose ist. Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz aus DNA, RNA oder modifizierten Nukleotiden, aber auch um DNA- oder RNA-Konstrukte, insbesondere synthetisierte DNA- oder RNA-Konstrukte.More preferably, an internal control nucleic acid is a nucleotide sequence whose sugar constituent is deoxyribose or ribose. More preferably, an internal control nucleic acid is a nucleotide sequence of DNA, RNA or modified nucleotides, but also DNA or RNA constructs, in particular synthesized DNA or RNA constructs.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz. Für den Nachweis von HIV, insbesondere von HIV-1, hat die interne Kontroll-Nukleinsäure bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 16 oder ein Komplementär davon.In a further preferred embodiment, the internal control nucleic acid is a competitive nucleotide sequence. For the detection of HIV, in particular of HIV-1, the internal control nucleic acid preferably has the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 16 or a complement thereof.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz. Für den Nachweis von HIV, insbesondere von HIV-2, hat die interne Kontroll-Nukleinsäure bevorzugt eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz und ist ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2.In another preferred embodiment, the internal control nucleic acid is a non-competitive nucleotide sequence. For the detection of HIV, in particular HIV-2, the internal control nucleic acid preferably has a non-competitive nucleotide sequence and is selected from the nucleotide sequence of bacteriophage MS2.

Für den Nachweis einer solchen Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 umfasst der PCR-Mastermix in den erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für MS2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer und einen Antisense-Primer umfasst.For the detection of such a nucleotide sequence of bacteriophage MS2, the PCR master mix in the method according to the invention further comprises a set of oligonucleotides which is specific for MS2 nucleic acids and in each case comprises at least one sense primer and one antisense primer.

Bevorzugt ist dabei der Sense-Primer ausgewählt ist aus SEQ ID NOs. 10, 12 und 14 und der Antisense-Primer ist bevorzugt ausgewählt aus SEQ ID NOs. 11, 13 und 15, wobei bevorzugt aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird SEQ ID NOs. 10 und 11, SEQ ID NOs. 12 und 13, SEQ ID NOs. 14 und 15. Für die entsprechenden Sonden, siehe unten.The sense-primer is preferably selected from SEQ ID NOs. 10, 12 and 14 and the antisense primer is preferably selected from SEQ ID NOs. 11, 13 and 15, wherein preferably selected from the following pairs of one sense primer and one antisense primer SEQ ID NOs. 10 and 11, SEQ ID NOs. 12 and 13, SEQ ID NOs. 14 and 15. For the corresponding probes, see below.

Unter einer Multiplex-PCR versteht man die Amplifikation von mindestens zwei Nukleinsäuresequenzen in einem Amplifikationsschritt. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nukleinsäuren von HI-Viren, insbesondere HIV-1 und/oder HIV-2, durch eine geeignete Wahl der Primer- und Sonden-Sequenzen amplifiziert, sofern sie (die Viren) in der Untersuchungsprobe vorhanden sind. Ferner wird die zugegebene interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert und überwacht damit die Amplifikation, vor allem in negativen Untersuchungsproben, in denen keine Amplifikation viraler Nukleinsäuren stattfindet. A multiplex PCR is understood to mean the amplification of at least two nucleic acid sequences in one amplification step. In the method according to the invention, the nucleic acids of HIV viruses, in particular HIV-1 and / or HIV-2, are amplified by a suitable choice of the primer and probe sequences if they (the viruses) are present in the test sample. Furthermore, the added internal control nucleic acid is amplified and thus monitors the amplification, especially in negative test samples in which no amplification of viral nucleic acids takes place.

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet einen PCR-Mastermix.The method according to the invention uses a PCR master mix.

Für jede Zielnukleinsäure wird im allgemeinen ein Set von mindestens 2 Primern verwendet. Eine Vielzahl von Sets an Primern kann simultan verwandt werden, um eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren zu amplifizieren.For each target nucleic acid, a set of at least 2 primers is generally used. A variety of sets of primers can be used simultaneously to amplify a variety of target nucleic acids.

Für den gleichzeitigen Nachweis von HIV-1 und HIV-2 umfasst der PCR-Mastermix

• – für den Nachweis von HIV-1: einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von verschiedenen konservierten Regionen der bekannten HIV-1-Genotypen abgeleitet werden,
• – für den Nachweis von HIV-2: einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, und weiterhin
• – eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist.

For simultaneous detection of HIV-1 and HIV-2, the PCR master mix includes

• For the detection of HIV-1: a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and at least two pairs of one sense primer and one antisense primer and at least two pairs each of a first probe and a second probe whereby the nucleotide sequences of the primers and probes are derived from different conserved regions of the known HIV-1 genotypes,
• For the detection of HIV-2: a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids, each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, and further
• A fourth probe specific for the internal control nucleic acid.

Methoden für die Präparation und Verwendung von Sonden und Primern werden zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Vol. 1–3, Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (mit periodischen Aktualisierungen) und Innis et al., PCR-Protokolle. A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. PCR-Primer-Paare können von einer bekannten Sequenz zum Beispiel unter der Verwendung von Computerprogrammen, welche für diesen Zweck entwickelt wurden, wie zum Beispiel PRIMER3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) abgeleitet werden.Methods for the preparation and use of probes and primers are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (with periodic updates), and Innis et al., PCR Protocols. San Diego, 1990. PCR primer pairs may be of a known sequence, for example, using computer programs developed for this purpose, such as PRIMER3 (http: // frodo .wi.mit.edu / cgi-bin / primer3 / primer3_www.cgi).

Die Anmelder begannen die Entwicklung ihres PCR-Amplifikationssystems für HI-Viren durch die Identifikation von hoch konservierten Sequenzregionen von HIV-1 sowie HIV-2. Primer wurden für konservierte Regionen unter Zuhilfenahme der aktuellen Literatur (C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258–1266), (C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302–4308), (Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316–7321), (Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478–483) und (J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551–4557) untersucht. Primer der publizierten Arbeiten wurden anhand der Los Alamos Gendatenbank bezüglich des Auftretens von Mutationen überprüft sowie geringfügige Modifikationen durchgeführt.Applicants began to develop their PCR amplification system for HIV viruses by identifying highly conserved sequence regions of HIV-1 as well as HIV-2. Primers were prepared for conserved regions using current literature (C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258-1266), (C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302-4308), (Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316-7321), (Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478-483), and (J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551- 4557). Primers of the published work were checked for the occurrence of mutations using the Los Alamos gene database and minor modifications were made.

Die erfindungsgemäßen Sätze Oligonukleotide aus je mindestens einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und mindestens einer Sonde sind spezifisch für die Nukleinsäuren von HIV-1 bzw. HIV-2. Die Sequenzen des Sense-Primers, des Antisense-Primers und der Sonden werden bevorzugt abgeleitet von in den Gendatenbanken veröffentlichen Nukleotidsequenzen von HIV-1 und HIV-2.The sets of oligonucleotides according to the invention each comprising at least one sense primer, an antisense primer and at least one probe are specific for the nucleic acids of HIV-1 or HIV-2. The sequences of the sense primer, the antisense primer and the probes are preferably derived from nucleotide sequences of HIV-1 and HIV-2 published in the gene databases.

Eine wesentliche Innovation der vorliegenden Erfindung besteht in der simultanen Amplifikation der HIV-1 Zielnukleinsäure in den konservierten Regionen 5' LTR sowie gag. In der vorliegenden Erfindung wurden somit Primersets für HIV-1 und HIV-2 entwickelt, welche miteinander kompatibel sind und daher kombiniert werden können. Die Primer und Fluoreszenz markierten Oligonukleotide (Sonden) wurden dabei so gewählt, dass alle bisher bekannten Isolate von HIV-1 und HIV-2 detektiert werden können. Aufgrund der fehlenden Proof-Reading Funktion der reversen Transkriptase besteht bei Retroviren eine höhere Gefahr für das Auftreten von neuen Mutationen sowie neuen Genotypen bzw. Subtypen. Die Anmelder haben dieses Hindernis dahingehend überwunden, dass der Nachweis der HIV Zielnukleinsäure in mehreren Regionen erfolgt.An essential innovation of the present invention is the simultaneous amplification of the HIV-1 target nucleic acid in the conserved regions 5 'LTR and gag. In the present invention, therefore, primer sets for HIV-1 and HIV-2 have been developed which are compatible with each other and therefore can be combined. The primer and fluorescence-labeled oligonucleotides (probes) were chosen so that all previously known isolates of HIV-1 and HIV-2 can be detected. Due to the lack of proof reading function of reverse transcriptase, retroviruses are more likely to have new mutations as well as new genotypes or subtypes. Applicants have overcome this obstacle by detecting HIV target nucleic acid in multiple regions.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nukleotidsequenzen der Oligonukleotide, die spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren sind, von konservierten Regionen der (bekannten) HIV-1-Genotypen/Isolate, nämlich der 5'-LTR-Region und der gag-Region, abgeleitet.In the method of the invention, the nucleotide sequences of the oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids are derived from conserved regions of the (known) HIV-1 genotypes / isolates, namely the 5'-LTR region and the gag region.

Dabei ist:

• – der Sense-Primer ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 1, 3, 5 und 6 oder Komplementären davon,
• – der Antisense-Primer ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 2, 4 und 7 oder Komplementären davon,
• – die erste Sonde ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 19 und 21 oder Komplementären davon und
• – die zweite Sonde ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 20 und 22 Komplementären davon,

wobei SEQ ID NOs. 1–4, 19 und 20 von der HIV-1 gag Region abgeleitet wurden
wobei SEQ ID NOs. 5–7, 21 und 22 von der HIV-1 5'-LTR-Region abgeleitet wurden
Hier wird das Verfahren zum Nachweis von HIV-1 verwendet. Where:

• The sense primer selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 1, 3, 5 and 6 or complements thereof,
• The antisense primer selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 2, 4 and 7 or complements thereof,
• The first probe selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 19 and 21 or complementary ones and
• The second probe selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 20 and 22 complementary ones,

wherein SEQ ID NOs. 1-4, 19 and 20 were derived from the HIV-1 gag region
wherein SEQ ID NOs. 5-7, 21 and 22 were derived from the HIV-1 5 'LTR region
Here, the method is used to detect HIV-1.

Dabei wird dabei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt SEQ ID NOs. 1 und 2, SEQ ID NOs. 3 und 4, SEQ ID NOs. 5 und 7, SEQ ID NOs. 6 und 7;
und wird aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt SEQ ID NOs. 19 und 20, SEQ ID NOs. 21 und 22.In this case, the following pairs of one sense primer and one antisense primer each are selected from SEQ ID NOs. 1 and 2, SEQ ID NOs. 3 and 4, SEQ ID NOs. 5 and 7, SEQ ID NOs. 6 and 7;
and is selected from the following pairs of each a first probe and a second probe SEQ ID NOs. 19 and 20, SEQ ID NOs. 21 and 22.

Weiter bevorzugt werden folgende Kombinationen der Paare verwendet: Region Sense und Antisense Primer erste und zweite Sonde gag SEQ ID NOs. 1 und 2 SEQ ID NOs. 19 und 20 gag SEQ ID NOs. 3 und 4 SEQ ID NOs. 19 und 20 5'-LTR SEQ ID NOs. 5 und 7 SEQ ID NOs. 21 und 22 5'-LTR SEQ ID NOs. 6 und 7 SEQ ID NOs. 21 und 22 More preferably, the following combinations of the pairs are used: region Sense and antisense primer first and second probe gag SEQ ID NOs. 1 and 2 SEQ ID NOs. 19 and 20 gag SEQ ID NOs. 3 and 4 SEQ ID NOs. 19 and 20 5'-LTR SEQ ID NOs. 5 and 7 SEQ ID NOs. 21 and 22 5'-LTR SEQ ID NOs. 6 and 7 SEQ ID NOs. 21 and 22

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nukleotidsequenzen der Oligonukleotide, die spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren sind, von konservierten Regionen der (bekannten) HIV-2-Genotypen/Isolate, nämlich der 5'-LTR-Region, abgeleitet.In the method of the invention, the nucleotide sequences of the oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids are derived from conserved regions of the (known) HIV-2 genotypes / isolates, namely the 5'-LTR region.

Dabei hat der Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 8 oder ein Komplementär davon, der Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9 oder ein Komplementär davon und die dritte Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 23 oder ein Komplementär davon. Hier wird das Verfahren zum Nachweis von HIV-2 verwendet.In this case, the sense primer has the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 8 or a complement thereof, the antisense primer has the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 9 or a complementary thereof and the third probe the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 23 or a complement thereof. Here, the method for the detection of HIV-2 is used.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Nukleotidsequenz der vierten Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, von der Sequenz der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the nucleotide sequence of the fourth probe, which is specific for the internal control nucleic acid, is derived from the sequence of the internal control nucleic acid.

Aufgrund der genetischen Diversität und dem Vorhandensein von multiplen Genotypen und Subtypen, stellt die Entwicklung eines Co-Amplifikationssystems für die simultane Detektion von HIV-1 und HIV-2 eine extreme erfinderische Herausforderung dar. Zentrale Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Primerinteraktionen zwischen mindestens 11 Primer (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 1–9) sowie 7 fluoreszenz-markierten Oligonukleotidsonden (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 19–23) zu minimieren, sowie Nebenproduktbildungen, welche sowohl die Assay-Sensitivität als auch möglicherweise die Spezifität reduzieren können, zu vermeiden. Ferner war es notwendig, eine interne Kontrolle („Interna”) zu den Amplifikationsprimern zuzufügen. Dabei gibt es zwei bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Zum einen besteht die Möglichkeit, eine kompetitive interne Kontrolle zu verwenden (wie SEQ ID NO. 16), die für die Amplifikation die Primer von HIV-1 verwendet und für die Detektion ein spezielles Fluoreszenz-markiertes Oligonukleotid (Sonde, wie SEQ ID NO. 24) verwendet. Zum anderen besteht eine Ausführungsform in der Verwendung einer nicht kompetitiven internen Kontrolle (z. B. Bacteriophage MS2) unter Verwendung von Oligonukleotidprimern (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 10–15) und eines Fluoreszenz-markierten Oligonukleotides (Sonde, ausgewählt aus SEQ ID NOs. 25–27).Due to genetic diversity and the presence of multiple genotypes and subtypes, the development of a co-amplification system for the simultaneous detection of HIV-1 and HIV-2 is an extremely inventive challenge. Central to the present invention was to facilitate primer interactions between at least 11 Primers (selected from SEQ ID Nos. 1-9) as well as 7 fluorescently-labeled oligonucleotide probes (selected from SEQ ID Nos. 19-23) as well as by-product formations which may reduce both assay sensitivity and possibly specificity avoid. Furthermore, it was necessary to add an internal control ("internals") to the amplification primers. There are there are two preferred embodiments of the invention. On the one hand, it is possible to use a competitive internal control (such as SEQ ID NO: 16) which uses the primers of HIV-1 for the amplification and for the detection of a specific fluorescence-labeled oligonucleotide (probe, such as SEQ ID NO. 24) used. On the other hand, one embodiment is the use of a non-competitive internal control (eg bacteriophage MS2) using oligonucleotide primers (selected from SEQ ID NOs. 10-15) and a fluorescently-labeled oligonucleotide (probe selected from SEQ ID NOs 25-27).

Ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz und hat die Sequenz SEQ ID NO. 16, dann hat die vierte Sonde bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 24.If the internal control nucleic acid is a competitive nucleotide sequence and has the sequence SEQ ID NO. 16, then the fourth probe preferably has the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 24th

Ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz und hat insbesondere eine Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 hat, dann hat die vierte Sonde bevorzugt eine Nukleotidsequenz ausgewählt von SEQ ID NOs. 25, 26 oder 27.If the internal control nucleic acid is a non-competitive nucleotide sequence and in particular has a nucleotide sequence of bacteriophage MS2, then the fourth probe preferably has a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs. 25, 26 or 27.

Hier werden folgende Kombinationen der Primer-Paare mit der vierten Sonde bevorzugt: Sense und Antisense Primer vierte Sonde SEQ ID NOs. 10 und 11 SEQ ID NOs. 25 SEQ ID NOs. 12 und 13 SEQ ID NOs. 26 SEQ ID NOs. 14 und 15 SEQ ID NOs. 27 Here, the following combinations of the primer pairs with the fourth probe are preferred: Sense and antisense primer fourth probe SEQ ID NOs. 10 and 11 SEQ ID NOs. 25 SEQ ID NOs. 12 and 13 SEQ ID NOs. 26 SEQ ID NOs. 14 and 15 SEQ ID NOs. 27

Bei einer „Sonde” handelt es sich um ein Oligonukleotid, welches an den Enden mit bestimmten Fluorochromen markiert/gelabelt wurde. Nach dem physikalischen Prozess des Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET-Prinzip), welches 1946 von Theodor Förster beschrieben wurde, wird die einströmende Energie vom Reporter Molekül auf ein Quenchermolekül übertragen. Nach dem spezifischen Anlagern der Oligonukleotide an die Nukleinsäure-Zielsequenz, wird durch die Exonukleasefunktion der Polymerase die Distanz zwischen dem Reporter und dem Quencher vergrößert, so dass der so genannte Förster Radius (r) zunimmt und anschließend der Energietransfer vom Reporter auf den Quencher nicht mehr erfolgen kann. In diesem Fall wird eine zunehmende Emission der Fluoreszenzwellenlänge des Reportermoleküls detektiert. Unter der Verwendung bekannter Verfahren des Standes der Technik können die Sonden mit einem spezifischen Bindungsliganden (z. B. Biotin), einem Enzym (z. B. Glukoseoxidase, Peroxidasen, Originase oder alkalischer Phosphatase), Radioisotopen, elektronendichten Reagenzien, Chromogenen, Fluorogenen, phosphoreszierenden Resten oder Pheritin markiert werden. Bevorzugt dabei ist die Markierung mittels spezifischer Fluochrome.A "probe" is an oligonucleotide labeled / labeled at the ends with certain fluorochromes. After the physical process of the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET principle), which was described in 1946 by Theodor Förster, the incoming energy from the reporter molecule is transferred to a quencher molecule. After specific attachment of the oligonucleotides to the nucleic acid target sequence, the exonuclease function of the polymerase increases the distance between the reporter and the quencher so that the so-called Förster radius (r) increases and subsequently the energy transfer from the reporter to the quencher ceases can be done. In this case, an increasing emission of the fluorescence wavelength of the reporter molecule is detected. Using known methods of the art, the probes may be probed with a specific binding ligand (e.g., biotin), an enzyme (e.g., glucose oxidase, peroxidases, originase, or alkaline phosphatase), radioisotopes, electron dense reagents, chromogens, fluorogens, phosphorescent residues or pheritin. Preference is given to the marking by means of specific Fluochrome.

Die Sonden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind bevorzugt mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, insbesondere solche, die für Realtime-PCR geeignet sind. Dabei handelt es sich bevorzugt um einen Fluoreszenzdonor oder -reporter und einen Fluoreszenzakzeptor oder -quencher sind. Eine Sonde ist bevorzugterweise mit einem Paar aus jeweils einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher (einem FRET-Paar bzw. Fluoreszenzfarbstoffpaar) markiert.The probes used in the method according to the invention are preferably labeled with fluorescent dyes, in particular those which are suitable for real-time PCR. It is preferably a fluorescence donor or reporter and a fluorescence acceptor or quencher. A probe is preferably labeled with a pair of each of a fluorescent donor or reporter and a fluorescence acceptor or quencher (a FRET pair).

Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-Hexachlor-Fluorescein (HEX), 3-(5,6,4',7'-Tetrachlor-5'-Methyl-3',6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl)-Propanamidohexyl-1-O-(2-Cyanoethyl)-(N,N-Diisopropyl)-Phosphoramidit (Yakima Yellow), Boron-dipyrromethen (BDP), Tetramethylrhodamin (TMR), 5'-Tetrachlor-Fluorescein (TET), und Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas Red) oder vergleichbaren Fluoreszenzdonoren/-reportern.Fluorescence donors or reporters suitable according to the invention are selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-hexachloro-fluorescein (HEX), 3- (5,6,4 ', 7'-tetrachloro-5' -Methyl-3 ', 6'-dipivaloylfluorescein-2-yl) -propanamidohexyl-1-O- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) -phosphoramidite (Yakima Yellow), boron-dipyrromethene (BDP), tetramethylrhodamine (TMR), 5'-tetrachloro-fluorescein (TET), and sulforhodamine 101 sulfonyl chloride (Texas Red) or similar fluorescent donors / reporters.

Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Dihydrocyclopyrroloindol-Tripeptid Minor Groove Binder (MGB), 4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-di-isopropyl)-phosphoramidit (BHQ-1), 4'-(4-Nitro-phenyldiazo)-2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-2), 4,4-Difluor-5-Styryl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionsäure-Succinimidyl-Ester (BodiPy 564/570), und 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[6-(9-[4-nitro-2',5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo]-julolidin-8-oxy)-hexylamidoethyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyano-ethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (BBQ), oder vergleichbaren Fluoreszenzakzeptoren/-quenchern.Fluorescence acceptors or quenchers suitable according to the invention are selected from the group consisting of carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove Binder (MGB), 4 '- (2-nitro-4-toluyldiazo) -2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4 "- (N-ethyl) -N-ethyl-2-cyanoethyl- (N , N-di-isopropyl) -phosphoramidite (BHQ-1), 4 '- (4-nitrophenyldiazo) -2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''- (N-ethyl) -N- ethyl 2-cyanoethyl (N, N-diisopropyl) phosphoramidite (BHQ-2), 4,4-difluoro-5-styryl-4-borora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl Ester (BodiPy 564/570), and 5'-dimethoxytrityloxy-5- [6- (9- [4-nitro-2 ', 5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo] -julolidine-8-oxy) - hexylamidoethyl-3-acrylimido] -2'-deoxy-uridines-3 '- [(2-cyano-ethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidites (BBQ), or comparable fluorescence acceptors / quenchers.

Weitere geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind Cyan 500, VIC, NED, LightCycler^® Red 610 (LC610), Cyanin-Farbstoff Cy5 und LightCycler^® Red 670 (LC670); weitere geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind Deep Dark Quencher (DDQ) und Cyanin-Farbstoff Cy5.Other suitable Fluoreszenzdonoren or reporter are cyan 500, VIC, NED, LightCycler ^® Red 610 (LC610), cyanine dye Cy5 and LightCycler ^® Red 670 (LC670); other suitable fluorescence acceptors or quenchers are deep dark quencher (DDQ) and cyanine dye Cy5.

Es wird bevorzugt, dass die erste und die zweite und die dritte Sonde jeweils mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert ist.It is preferred that the first and second and third probes are each labeled with the same fluorescent dye pair.

Für die erste, zweite und dritte Sonde: wird eine einheitliche Fluoreszenzmarkierung am 5'-Ende der Sonden bevorzugt und am 3'-Ende wird ein Blackhole-Quencher bevorzugt.For the first, second and third probe: a uniform fluorescent label at the 5 'end of the probes is preferred and at the 3' end a blackhole quencher is preferred.

Es wird weiterhin bevorzugt, dass sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten, zweiten und dritten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde unterscheidet.It is further preferred that the fluorescent dye pair of the first, second and third probe differs from the fluorescent dye pair of the fourth probe.

Die Fluoreszenzmarkierung kann sich am 5'-Ende unterscheiden, wie 6-FAM für die erste, zweite und dritte Sonde (HIV-Nukleinsäureamplifikation) und Cy5 für die vierte Sonde (interne Kontrolle).The fluorescent label may differ at the 5 'end, such as 6-FAM for the first, second and third probe (HIV nucleic acid amplification) and Cy5 for the fourth probe (internal control).

Wenn HIV-1 und HIV-2 gleichzeitig nachgewiesen werden, kann sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten und zweiten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der dritten Sonde unterscheiden, welche sich wiederum von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde unterscheiden.When HIV-1 and HIV-2 are detected simultaneously, the fluorescent dye pair of the first and second probes may be different from the fluorescent dye pair of the third probe, which in turn is different from the fluorescence dye pair of the fourth probe.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten, zweiten und dritten Sonde 6-FAM und TAMRA. Das Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde kann VIC und TAMRA sein. Alternativ werden Kombinationen von 6-FAM und Black Hole Quenchern sowie VIC und Black Hole Quenchern bevorzugt.In a preferred embodiment, the fluorescent dye pair of the first, second and third probes is 6-FAM and TAMRA. The fluorescent dye pair of the fourth probe may be VIC and TAMRA. Alternatively, combinations of 6-FAM and black hole quenchers as well as VIC and black hole quenchers are preferred.

Der Vorteil einer geeigneten Wahl der Paare der Fluoreszenzfarbstoffe ist es, dass aufgrund der unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen gleichzeitig zwei Fluoreszenz-Emissionen (z. B. von FAM und VIC) oder auch mehrere (z. B. 3) Fluoreszenz-Emissionen beobachtet werden können und damit jeweils auf die An- bzw. Abwesenheit von HI-Viren, insbesondere HIV-1 und/oder HIV-2, und interner Kontroll-Nukleinsäure rückgeschlossen werden kann. Dabei ist zu beachten, daß sich die Anregungs- und Emissionswellenlängen jeweils nicht überlappen bzw. interagieren.The advantage of a suitable choice of the pairs of fluorescent dyes is that, due to the different excitation and emission wavelengths, two fluorescence emissions (eg of FAM and VIC) or even several (eg 3) fluorescence emissions are observed simultaneously can be and thus in each case on the presence or absence of HI viruses, in particular HIV-1 and / or HIV-2, and internal control nucleic acid can be deduced. It should be noted that the excitation and emission wavelengths each do not overlap or interact.

Es liegt im Können des Fachmanns, jeweils geeignete Fluoreszenzfarbstoffpaare auszuwählen. Dabei sollen die unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt werden, dass eine gegenseitige Überstrahlung bzw. Überlagerung der Fluoreszenzemissionen (bzw. sogenanntes „bleed through”) vermieden wird.It is within the skill of the art to select appropriate fluorescent dye pairs. In this case, the different fluorescent dyes should be chosen so that a mutual overshoot or superposition of fluorescence emissions (or so-called "bleed through") is avoided.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere der Sonden Hydrolyse-Sonden oder Molecular Beacons.In a preferred embodiment, one or more of the probes are hydrolysis probes or molecular beacons.

Bevorzugterweise umfasst das Konzentrieren der Proben in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens Zentrifugieren. Dabei werden bevorzugterweise, die in der Probe enthaltenen Bestandteile, wie Zellen und Viren, angereichert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mit Barcode etikettierte Gefäße, die die Proben enthalten, zunächst 15 Minuten bei mind. 5000 × g und anschließend 1 Stunde bei mindestens 48.000 × g zentrifugiert. Anschließend wird jeweils der Überstand verworfen.Preferably, concentrating the samples in step b) of the method according to the invention comprises centrifuging. In this case, preferably, the components contained in the sample, such as cells and viruses enriched. In a preferred embodiment, vessels labeled with barcode and containing the samples are first centrifuged for 15 minutes at at least 5,000 × g and then for 1 hour at at least 48,000 × g. Subsequently, the supernatant is discarded.

Die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) ist bevorzugt ausgewählt aus Multiplex-PCR, insbesondere Multiplex-Realtime-PCR, Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA, Transcription mediated amplification), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) und Strang-Ablöse-Amplifikation (strand displacement amplification, SDA).The nucleic acid amplification in step f) is preferably selected from multiplex PCR, in particular multiplex real-time PCR, transcription-mediated amplification (TMA), ligase chain reaction (LCR), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) and Strand displacement amplification (SDA).

Die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) ist bevorzugt eine Multiplex-PCR, weiter bevorzugt eine Multiplex-Realtime-PCR. Dabei erfolgt zunächst eine reverse Transkription, bei der die vorhandene virale RNA und die interne Kontroll-RNA in eine cDNA umgeschrieben wird. Im weiteren erfolgt dann die Amplifikation der cDNA durch eine DNA-Polymerase.The nucleic acid amplification in step f) is preferably a multiplex PCR, more preferably a multiplex real-time PCR. First, there is a reverse transcription, in which the existing viral RNA and the internal control RNA is transcribed into a cDNA. In addition, then the amplification of the cDNA by a DNA polymerase.

Die Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren erfolgt bevorzugt mittels des Realtime-Prinzips. Bindet/hybridisiert dabei eine Sonde an ihrer Zielsequenz, wird der Reporter der Sonde durch die Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase, wie Taq-Polymerase, im Verlauf der Amplifikation abgespalten. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) vom Reporter zum Quencher kann somit aufgrund der räumlichen Distanz nicht mehr erfolgen. Die emittierte Energie des Reporters wird als positives Signal aufgezeichnet. Da der Reporter der für die viralen Nukleinsäuren spezifischen Sonde (z. B. FAM-markierte Sonde) Fluoreszenz in einem anderen Wellenbereich emittiert als der Reporter der weiteren Sonde, die für die interne Kontroll-Nukleinsäure spezifisch ist (z. B. VIC-markierte Sonde), können beide Amplifikationen voneinander unterschieden werden.The detection of the amplified viral nucleic acids is preferably carried out by means of the real-time principle. In this case, if a probe binds / hybridizes to its target sequence, the reporter of the probe is cleaved by the exonuclease function of the DNA polymerase, such as Taq polymerase, in the course of the amplification. The fluorescence resonance energy transfer (FRET) from the reporter to the quencher can thus no longer occur due to the spatial distance. The emitted energy of the reporter is recorded as a positive signal. Since the reporter of the viral nucleic acid-specific probe (eg, FAM-labeled probe) emits fluorescence in a different wavelength range than the reporter of the other probe specific for the internal control nucleic acid (eg, VIC-labeled Probe), both amplifications can be distinguished from each other.

Die generellen Prinzipien und Bedingungen für die Amplifikation und die Detektion von Nukleinsäuren unter der Verwendung von der Polymerase Kettenreaktion (PCR) sind sehr gut bekannt, wobei die Details davon in zahlreichen Referenzen zur Verfügung gestellt werden, einschließlich US Patent Nr. US 4,683,195 A (Mullis et al.), US 4,683,202 A (Mullis) und US 4,965,188 A (Mullis et al.), welche alle hiermit durch Referenz eingefügt werden. Daher sollte ein Fachmann angesichts der zur Verfügung gestellten Lehren auf dem Gebiet keine Schwierigkeiten beim Gebrauch der vorliegenden Erfindung haben, um alle bekannten Subtypen von HIV-1 und HIV-2 zu detektieren.The general principles and conditions for amplification and detection of nucleic acids using polymerase chain reaction (PCR) are well known, the details of which are provided in numerous references, including: US Pat. No. 4,683,195 A (Mullis et al.), US 4,683,202 A (Mullis) and US 4,965,188 A (Mullis et al.), All of which are hereby incorporated by reference. Therefore, in view of the teachings provided in the art, one skilled in the art should have no difficulty in using the present invention to detect any known subtypes of HIV-1 and HIV-2.

Erfindungsgemäße Zusammensetzungen und TestkitsCompositions and test kits according to the invention

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Zusammensetzungen, die zum Nachweis von HI-Viren, HIV-1 und–HIV-2, geeignet sind, gelöst. Diese erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden bevorzugt in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.The object is further achieved by providing compositions suitable for the detection of HIV, HIV-1 and HIV-2. These compositions according to the invention are preferably used in the process according to the invention.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 1 bis 9 sowie Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 23.A composition according to the invention comprises oligonucleotides having the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 1 to 9 and oligonucleotides with the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 19 to 23.

Wobei die Zusammensetzung für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird:
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7;
und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird:
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22,
und wobei die Zusammensetzung für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist.Wherein the composition for the detection of HIV-1 is a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and at least two pairs of one sense primer and one antisense primer and at least two pairs each of a first probe and a second Probe selected from the following pairs of each a sense primer and an antisense primer:
Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 1 and 2,
Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 3 and 4,
Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 5 and 7,
Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 6 and 7;
and is selected from the following pairs of a first probe and a second probe:
Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 19 and 20,
Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 21 and 22,
and wherein the composition for the detection of HIV-2 comprises a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids and each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, wherein a sense primer comprises a nucleic acid the sequence of SEQ ID NO. 8, an antisense primer comprising a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 9 and a third probe comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 23 is.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt eine vierte Sonde, die spezifisch für eine interne Kontroll-Nukleinsäure ist.A composition of the invention further preferably comprises a fourth probe specific for an internal control nucleic acid.

Bei einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann es sich um einen PCR-Mastermix handeln, wie er in Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt und für die Amplifizierung der viralen Nukleinsäuren und der internen Kontroll-Nukleinsäure verwendet wird.A composition according to the invention may be a PCR master mix as prepared in step e) of the method according to the invention and used for the amplification of the viral nucleic acids and the internal control nucleic acid.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfassen.A composition of the invention may further comprise an internal control nucleic acid.

Die Auswahl der Nukleotidsequenzen für Primer, Sondern und interne Kontroll-Nukleinsäuren etc. wurde bereits oben bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt.The selection of the nucleotide sequences for primers, but and internal control nucleic acids etc. has already been described above in the description of the method according to the invention.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 24 oder ein Komplementär davon. A composition according to the invention furthermore preferably comprises an oligonucleotide having the nucleotide sequence SEQ ID NO. 24 or a complement thereof.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt

• – mindestens zwei Oligonukleotide, die ausgewählt sind aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 10 bis 15, bevorzugt ausgewählt aus den Paaren SEQ ID NOs. 10 und 11, SEQ ID NOs. 12 und 13, SEQ ID NOs. 14 und 15; oder deren Komplementäre und
• – mindestens ein Oligonukleotid ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 25 bis 27 oder deren Komplementäre.

A composition of the invention further comprises preferred

• At least two oligonucleotides selected from nucleotide sequences SEQ ID NOs. 10 to 15, preferably selected from the pairs SEQ ID NOs. 10 and 11, SEQ ID NOs. 12 and 13, SEQ ID NOs. 14 and 15; or their complements and
• - At least one oligonucleotide selected from the nucleotide sequences SEQ ID NO. 25 to 27 or their complementaries.

Die Sonden einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind bevorzugt jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Die zwei Fluoreszenzfarbstoffe sind bevorzugt ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher. Der Fluoreszenzdonor oder -reporter ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-Hexachlor-Fluorescein (HEX), 3-(5,6,4',7'-Tetrachlor-5'-Methyl-3',6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl)-Propanamidohexyl-1-O-(2-Cyanoethyl)-(N,N-Diisopropyl)-Phosphoramidit (Yakima Yellow), Boron-dipyrromethen (BDP), Tetramethylrhodamin (TMR), 5'-Tetrachlor-Fluorescein (TET), und Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas Red). Der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Dihydrocyclopyrroloindol-Tripeptid Minor Groove Binder (MGB), 4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-di-isopropyl)-phosphoramidit (BHQ-1), 4'-(4-Nitro-phenyldiazo)-2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-2), 4,4-Difluor-5-Styryl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionsäure-Succinimidyl-Ester (BodiPy 564/570), und 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[6-(9-[4-nitro-2',5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo]-julolidin-8-oxy)-hexylamidoethyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyano-ethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (BBQ). Die Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe etc. wurde bereits oben bei der Beschreibung der erfindungsgemäßen Verfahren ausgeführt.The probes of a composition according to the invention are preferably each labeled with two fluorescent dyes. The two fluorescent dyes are preferably a pair consisting of a fluorescent donor or reporter and a fluorescence acceptor or quencher. The fluorescent donor or reporter is selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-hexachloro-fluorescein (HEX), 3- (5,6,4 ', 7'-tetrachloro-5'- Methyl 3 ', 6'-dipivaloylfluorescein-2-yl) -propanamidohexyl-1-O- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) -phosphoramidite (Yakima Yellow), boron-dipyrromethene (BDP), tetramethylrhodamine ( TMR), 5'-tetrachloro-fluorescein (TET), and sulforhodamine 101 sulfonyl chloride (Texas Red). The fluorescence acceptor or quencher is selected from the group consisting of carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder (MGB), 4 '- (2-nitro-4-toluyldiazo) -2'-methoxy-5'-methyl Azobenzene 4 '' - (N-ethyl) -N-ethyl-2-cyanoethyl- (N, N-di-isopropyl) -phosphoramidite (BHQ-1), 4 '- (4-nitro-phenyldiazo) -2 '-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4' '- (N-ethyl) -N-ethyl-2-cyanoethyl- (N, N-diisopropyl) phosphoramidite (BHQ-2), 4,4-difluoro- 5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BodiPy 564/570), and 5'-dimethoxytrityloxy-5- [6- (9- [4-nitro -2 ', 5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo] -julolidine-8-oxy) -hexylamidoethyl-3-acrylimido] -2'-deoxyuridine-3' - [(2-cyano-ethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidites (BBQ). The selection of the fluorescent dyes etc. has already been carried out above in the description of the inventive method.

Weitere geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind Cyan 500, VIC, NED, LightCycler^® Red 610 (LC610), Cyanin-Farbstoff Cy5 und LightCycler^® Red 670 (LC670); weitere geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind Deep Dark Quencher (DDQ) und Cyanin-Farbstoff Cy5.Other suitable Fluoreszenzdonoren or reporter are cyan 500, VIC, NED, LightCycler ^® Red 610 (LC610), cyanine dye Cy5 and LightCycler ^® Red 670 (LC670); other suitable fluorescence acceptors or quenchers are deep dark quencher (DDQ) and cyanine dye Cy5.

In einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 27 oder deren Komplementäre mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert.In a composition according to the invention, the oligonucleotides having the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 19 to 27 or their complementaries labeled with two fluorescent dyes.

Bevorzugt sind Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 23 mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 24 bis 27 markiert sind, unterscheidet.Preference is given to oligonucleotides having the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 19 to 23, each labeled with a fluorescent dye pair, which is different from the fluorescent dye pair, with the oligonucleotides with the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 24 to 27 are marked, different.

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Testkits zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von HI-Viren in aus Blut abgeleiteten Proben.The object is further provided according to the invention by the provision of test kits for carrying out a method according to the invention for the detection of HIV viruses in blood-derived samples.

Ein erfindungsgemäßer Testkit umfasst

• – mindestens eine der erfindungsgemäßen hierin beschriebenen Zusammensetzungen,
• – Reagenzien und Hilfsstoffe für die Extraktion viraler Nukleinsäuren aus aus Blut abgeleiteten Proben und für die Nukleinsäure-Amplifizierung.

A test kit according to the invention comprises

• At least one of the compositions according to the invention described herein,
• - Reagents and excipients for the extraction of viral nucleic acids from blood-derived samples and for nucleic acid amplification.

Ein PCR-Reagenz bezieht sich auf irgendeines der Reagenzien, die als essentiell für die PCR angesehen werden, nämlich ein Set an Primern für eine Zielnukleinsäure, eine DNA Polymerase, eine reverse Transkriptase, PCR-Puffer und ein oder mehrere Desoxyribonukleosid-5-Triphosphate (dNTPs).A PCR reagent refers to any of the reagents considered essential for PCR, namely a set of primers for a target nucleic acid, a DNA polymerase, a reverse transcriptase, PCR buffers, and one or more deoxyribonucleoside 5-triphosphates ( dNTPs).

Eine DNA-Polymerase ist ein Enzym, welches Desoxynukleosid-Monophosphat-Moleküle an das 3'-Hydroxylende des Primers in einem Komplex von Primer und Matrize addiert.A DNA polymerase is an enzyme that adds deoxynucleoside monophosphate molecules to the 3'-hydroxyl end of the primer in a complex of primer and template.

Bevorzugt sind thermostabile DNA-Polymerasen, von denen eine Zahl im Stand der Technik einschließlich derjenigen, die im Detail in US Patent Nr. US 4,965,188 A (Mullis et al.) und US 4,889,818 A (Gelfand et al.) berichtet wurden, welche beide hier durch Referenz eingefügt werden. Einige nützliche thermostabile Polymerasen sind kommerziell erhältlich wie z. B. Amplitaq, Tth, UITMA, Pfu von Stratagene und VENT von New England Biolabs. Ein DNA-Polymerase Co-Faktor bezieht sich auf eine Nicht-Proteinverbindung, von welcher das Enzym in Bezug auf seine Aktivität abhängig ist. Daher ist das Enzym ohne die Anwesenheit des Co-Faktors katalytisch inaktiv. Eine Reihe von Materialien sind bekannte Co-Faktoren, einschließlich aber nicht limitiert auf Mangan- und Magnesiumsalze, sowie z. B. Chloride, Sulfate, Acetate und Salze von Fettsäuren. Magnesiumchloride und -sulfate werden bevorzugt. Für die PCR werden außerdem zwei oder mehrere Desoxyribonukleid-5-Triphosphate benötigt wie z. B. zwei oder mehrere dATP, dCTP, dGTP, dTTP und/oder dUTP.Preferred are thermostable DNA polymerases, a number of which are known in the art including those detailed in U.S. Pat US Patent No. US 4,965,188 A (Mullis et al.) And US 4,889,818 A (Gelfand et al.), Both of which are incorporated herein by reference. Some useful thermostable polymerases are commercially available such. Amplitaq, Tth, UITMA, Pfu from Stratagene and VENT from New England Biolabs. A DNA polymerase cofactor refers to a non-protein compound on which the enzyme is dependent in its activity. Therefore, without the presence of the cofactor, the enzyme is catalytically inactive. A number of materials are known co-factors, including but not limited to Manganese and magnesium salts, and z. As chlorides, sulfates, acetates and salts of fatty acids. Magnesium chlorides and sulfates are preferred. For the PCR, two or more Deoxyribonukleid-5 triphosphates are also required such. Two or more dATP, dCTP, dGTP, dTTP and / or dUTP.

Die PCR-Reagenzien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden in der PCR in geeigneten Konzentrationen zur Verfügung gestellt und verwendet, um die Amplifikation der Zielnukleinsäure(n) zu ermöglichen. Die minimale Menge der DNA-Polymerase ist im Allgemeinen mindestens ungefähr 0,5 Einheiten pro 100 Mikroliter Lösung, wobei ungefähr 2–25 Einheiten pro 100 Mikroliter Lösung bevorzugt werden und von ungefähr 7–20 Einheiten pro 100 Mikroliter Lösung weiter bevorzugt werden. Die minimale Menge jedes Primers, der bei der Amplifikation verwendet wird, ist mindestens ungefähr 0,075 Mikromolar, wobei ungefähr 0,1–2 Mikromolar bevorzugt werden, aber andere Mengen sind im Stand der Technik bekannt. Die PCR-Reagenzien können individuell oder in zahlreichen Kombinationen oder alle in einer gepufferten Lösung, die einen pH-Wert im Bereich von ungefähr pH 7–pH 9 aufweist, unter der Verwendung irgendeines geeigneten Puffers, wovon viele im Stand der Technik bekannt sind, bereitgestellt werden. Die amplifizierten Nukleinsäuren können auf einer Reihe von bekannten Wegen detektiert werden, wie z. B. denjenigen, die im US Patent Nummer US 4,965,188 A (Mullis et al.) beschrieben werden. Zum Beispiel können die amplifizierten Nukleinsäuren unter der Verwendung von Southern Blotting, Dot-Blot-Techniken oder nicht-isotopischer Oligonukleotide mit einer markierten Sonde detektiert werden. In der bevorzugten Ausführungsform wird die amplifizierte Zielnukleinsäure unter der Verwendung einer Oligonukleotidsonde detektiert, welche für die Detektion markiert ist und direkt oder indirekt mit dem amplifizierten Ziel hybridisiert werden kann.The PCR reagents used in the present invention are provided in the PCR in appropriate concentrations and used to allow amplification of the target nucleic acid (s). The minimum amount of DNA polymerase is generally at least about 0.5 units per 100 microliters of solution, with about 2-25 units per 100 microliters of solution being preferred, and further preferred being about 7-20 units per 100 microliters of solution. The minimum amount of each primer used in the amplification is at least about 0.075 micromolar, with about 0.1-2 micromolar being preferred, but other amounts are known in the art. The PCR reagents may be provided individually or in numerous combinations or all in a buffered solution having a pH in the range of about pH 7-pH 9 using any suitable buffer, many of which are known in the art become. The amplified nucleic acids can be detected in a number of known ways, such as. B. those in the US Patent Number US 4,965,188 A (Mullis et al.). For example, the amplified nucleic acids can be detected using Southern blotting, dot blot techniques or non-isotopic oligonucleotides with a labeled probe. In the preferred embodiment, the amplified target nucleic acid is detected using an oligonucleotide probe which is labeled for detection and can be hybridized directly or indirectly to the amplified target.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen illustriert.The present invention is illustrated in the following examples.

In der vorliegenden Erfindung, wie z. B. in den beschriebenen Beispielen, kann gezeigt werden, dass die Verwendung von unterschiedlichen Primersets und Sondensets die gleichzeitige Amplifikation von HIV-1 Nukleinsäuren sowie HIV-2 Nukleinsäuren ermöglicht. Somit existiert ein neues Verfahren sowohl für das Screening von Blutspenden in Pools von bis zu 96 Einzelproben als auch für das Screening von Einzelproben. Der Vorteil der gemeinsamen Amplifikation in einem Reaktionsansatz liegt im geringeren Materialverbrauch an Reagenzien, Enzymen, Primern sowie in einer Reduzierung der Amplifikationsgeräte (Thermocycler). Ferner reduziert sich durch die vorliegende Erfindung das Risiko von falsch negativen Ergebnissen durch spontane Mutationen im Primer-/Sondenbereich des HIV-1 Virus. Bezugnehmend auf die Prävalenz von HIV-1 für Deutschland stellt gerade dieses Virus eine besondere Situation dar, die in den 90ziger Jahren zum AIDS Skandal führte und seitdem der besonderen Aufmerksamkeit verdient.In the present invention, such as. As in the examples described, it can be shown that the use of different primer sets and sets of probes allows the simultaneous amplification of HIV-1 nucleic acids and HIV-2 nucleic acids. Thus, a new method exists for the screening of blood donations in pools of up to 96 individual samples as well as for the screening of individual samples. The advantage of the common amplification in a reaction mixture is the lower material consumption of reagents, enzymes, primers and a reduction of the amplification devices (thermocycler). Further, the present invention reduces the risk of false negative results due to spontaneous mutations in the primer / probe region of the HIV-1 virus. Referring to the prevalence of HIV-1 in Germany, this virus represents a special situation that led to the AIDS scandal in the 90's and deserves special attention since then.

BeispieleExamples

Materialien und MethodenMaterials and methods

In der bevorzugten Ausführungsform ist als PCR-Puffer QuantiTect Multiplex PCR Mastermix (QTMP, Qiagen, Hilden, Deutschland) zu verwenden. Der optimierte PCR Puffer enthält eine Magnesiumchlorid-Konzentration von 11 Millimolar sowie eine HotStarTaq DNA-Polymerase (rekombinierte 94 kDa DNA-Polymerase, isoliert aus Thermus aquaticus und kloniert in E. Coli), dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP/dUTP) Ultrapur Rox (passive Referenz Fluoreszenzfarbstoff) sowie RNase freies Wasser.In the preferred embodiment, QuantiTect Multiplex PCR Master Mix (QTMP, Qiagen, Hilden, Germany) is to be used as the PCR buffer. The optimized PCR buffer contains a magnesium chloride concentration of 11 millimolar and a HotStarTaq DNA polymerase (recombined 94 kDa DNA polymerase isolated from Thermus aquaticus and cloned in E. Coli), dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP / dUTP ) Ultrapur Rox (passive reference fluorescent dye) and RNase-free water.

An weiteren Enzymen werden in der bevorzugten Ausführungsform die SuperScript III der Firma Invitrogen (MMLV RT mit RNase H-Aktivität; 200 IU/μl) verwandt. Als weiteres Enzym zur Vermeidung von einer Kontamination mit RNasen wird RNasin der Firma Promega (Ribonuklease Inhibitor; 40 IU/μl) verwandt.Other enzymes in the preferred embodiment are the SuperScript III from Invitrogen (MMLV RT with RNase H activity, 200 IU / μl). Another enzyme used to prevent contamination with RNases is RNasin from Promega (ribonuclease inhibitor, 40 IU / μl).

Als Primer werden die Oligonukleotide mit den SEQ ID NO. 1–11 sowie als Sonden die Oligonukleotide mit den SEQ ID NO. 19–23 sowie die Sonde (SEQ ID NO 24) für eine kompetitive interne Kontrolle sowie bevorzugt die Sonde (SEQ ID NO 25, 26 oder 27) für eine nicht-kompetitive interne Kontrolle verwendet.As primers, the oligonucleotides having the SEQ ID NO. 1-11 and as probes the oligonucleotides having the SEQ ID NO. 19-23 and the probe (SEQ ID NO 24) for a competitive internal control, and preferably the probe (SEQ ID NO 25, 26 or 27) for a non-competitive internal control.

Die Amplifikation erfolgt mittels Realtime-PCR mit speziellen Oligonukleotiden, die am 5'-Ende mit verschiedenen Fluorochromen (Reporter-Fluochrom) gelabelt sind und am 3'-Ende einen Quencher (Quencher-Fluochrom) aufweisen. Es sind folgende Fluorochrome geeignet: Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, TET, NET, Texas Red, LC610, Cy5, LC670. Für die Amplifikation von HIV-Zielnukleotidsequenzen (HIV-1 Nukleinsäuren und HIV-2 Nukleinsäuren) wird für die Oligonukleotide (Sonden) mit den SEQ ID NOs. 19–23 eine einheitliche Fluoreszenz-Markierung am 5'-Ende empfohlen. Am 3' Ende wird ein Blackhole-Quencher empfohlen.The amplification is carried out by means of real-time PCR with special oligonucleotides which are labeled at the 5 'end with different fluorochromes (reporter fluochrome) and have a quencher (quencher fluorochrome) at the 3' end. The following fluorochromes are suitable: Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, TET, NET, Texas Red, LC610, Cy5, LC670. For the amplification of HIV target nucleotide sequences (HIV-1 nucleic acids and HIV-2 nucleic acids), the oligonucleotides (probes) having SEQ ID NOs. 19-23 recommended a uniform fluorescence label at the 5 'end. At the 3 'end a blackhole quencher is recommended.

Die Fluoreszenzfarbstoff-gelabelten Oligonukleotide (Sonden) für die interne Kontrolle weisen am 5'-Ende einen Fluoreszenzfarbstoff auf, der sich von den Fluoreszenzfarbstoff-gelabelten Oligonukleotide (Sonden) für die Detektion der HIV-Nukleinsäuren unterscheidet (z. B. 6-FAM für HIV-Nukleinsäureamplifikation und Cy5 für interne Kontrollen). Erfindungsgemäß können folgende Sonden als interne Kontrollen verwandt werden: SEQ ID NO 24 für die kompetitive interne Kontrolle und SEQ ID NO. 25, 26 oder 27 für die nicht kompetitive interne Kontrolle. The internal control fluorescent dye-labeled oligonucleotides (probes) have a fluorescent dye at the 5 'end which differs from the fluorescent dye labeled oligonucleotides (probes) for the detection of HIV nucleic acids (e.g., 6-FAM for HIV nucleic acid amplification and Cy5 for internal controls). According to the invention, the following probes can be used as internal controls: SEQ ID NO 24 for the competitive internal control and SEQ ID NO. 25, 26 or 27 for non-competitive internal control.

Als interne positive Kontrolle wurde eine kompetitive Kontrollsequenz zur HIV-1 Zielnukleinsäurensequenz mit Hilfe einer in vitro Transkription hergestellt sowie eine nicht-kompetitive interne Kontrollsequenz aus dem Bacteriophagen MS2 verwandt.As an internal positive control, a competitive control sequence for the HIV-1 target nucleic acid sequence was made by in vitro transcription and a non-competitive internal control sequence from the bacteriophage MS2 was used.

Für die Herstellung der kompetitiven internen Kontrolle wurde folgendes DNA Oligonukleotid synthetisiert.For the preparation of the competitive internal control, the following DNA oligonucleotide was synthesized.

Es erfolgt eine Amplifikation mit folgenden Primern:

There is an amplification with the following primers:

Nach erfolgter Amplifikation sowie der Darstellung des Amplifikats im Agarose-Gel erfolgte eine Gelextraktion mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskits sowie eine anschließende in vitro Transkription mit Hilfe des in-Vitro-Transkriptions Kit der Firma Ambion. Nach erfolgter Aufreinigung mit Mega Clear (Firma Ambion) sowie dem Poly(A)Purist mRNA wird die interne Kontrolle in Konzentrationen zu 3000 Kopien/μl aliquotiert.After amplification and the amplification in the agarose gel, gel extraction was performed using the Qiagen gel extraction kit and subsequent in vitro transcription using the in vitro transcription kit from Ambion. After purification with Mega Clear (Ambion) and the poly (A) Purist mRNA, the internal control is aliquoted in concentrations of 3000 copies / μl.

Für die nicht-kompetitive interne Kontrolle wurde der Bacteriophage MS2 von der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig bezogen. Die Analyse erfolgte an Realtime Cycler der Firma ABI (ABI PRISM 7000, ABI PRISM 7300, ABI PRISM 7500).For non-competitive internal control, bacteriophage MS2 was purchased from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures in Braunschweig. The analysis was carried out on real-time cyclers from ABI (ABI PRISM 7000, ABI PRISM 7300, ABI PRISM 7500).

Für die Amplifikation zum Nachweis der Zielnukleinsäure wurde folgendes Cyclerprogramm verwendet.The following cycler program was used for the amplification for the detection of the target nucleic acid.

• 1. 55°C 1–60 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 20 Minuten einmal1. 55 ° C 1-60 minutes with a preferred time of 20 minutes once
• 2. 95°C 1–30 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 15 Minuten einmal2. 95 ° C 1-30 minutes with a preferred time of 15 minutes once
• 3. 95°C 1–30 Sekunden gefolgt von 62°C 10 Sekunden – 5 Minuten mit bevorzugten Zeiten von 10 Sekunden, 95°C und 30 Sekunden bei 62°C. Insgesamt 2–20 Wiederholungen3. 95 ° C for 1-30 seconds followed by 62 ° C for 10 seconds - 5 minutes with preferred times of 10 seconds, 95 ° C and 30 seconds at 62 ° C. A total of 2-20 repetitions
• 4. 95°C 2 Sekunden – 2 Minuten gefolgt von 56°C 10 Sekunden – 2 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 93°C 10 Sekunden und 56°C 40 Sekunden mit 50 Wiederholungen4. 95 ° C 2 seconds - 2 minutes followed by 56 ° C 10 seconds - 2 minutes with a preferred time of 93 ° C 10 seconds and 56 ° C 40 seconds with 50 repetitions

Experimenteexperiments

Die Anmelder begannen die Entwicklung ihres PCR-Amplifikationssystems für HI-Viren durch die Identifikation von hoch konservierten Sequenzregionen von HIV-1 sowie HIV-2. Primer wurden für konservierte Regionen unter Zuhilfenahme der aktuellen Literatur (C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258–1266), (C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302–4308), (Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316–7321), (Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478–483) und (J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551–4557) untersucht. Primer der publizierten Arbeiten wurden anhand der Los Alamos Gendatenbank bezüglich des Auftretens von Mutationen überprüft sowie geringfügige Modifikationen durchgeführt.Applicants began to develop their PCR amplification system for HIV viruses by identifying highly conserved sequence regions of HIV-1 as well as HIV-2. Primers were prepared for conserved regions using current literature (C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258-1266), (C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302-4308), (Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316-7321), (Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478-483), and (J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551- 4557). Primers of the published work were reviewed for the occurrence of mutations using the Los Alamos gene database and minor modifications made.

Des Weiteren wurden die einzelnen Primersysteme bezüglich ihrer gegenseitigen Verträglichkeit in einem geeigneten Puffersystem überprüft.Furthermore, the individual primer systems were tested for mutual compatibility in a suitable buffer system.

– Analytische Sensitivität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Analytical sensitivity of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach

Anschließend wurde die formulierte Entwicklung bezüglich der analytischen Sensitivität bezogen auf HIV-1 sowie HIV-2 mit Hilfe einer Probitanalyse untersucht. Die Probitanalyse wurde mit dem Programm SPSS 12.0 (nicht log-converted) durchgeführt.Subsequently, the formulated development with respect to the analytical sensitivity to HIV-1 and HIV-2 was investigated by probit analysis. The probit analysis was performed with the program SPSS 12.0 (not log-converted).

Diesbezüglich wurden jeweils im Multiplex-Mix je Verdünnungsstufe 24 Replikate in 8 unterschiedlichen Verdünnungsstufen in Minipools (96 Proben pro Pool) untersucht.In this regard, 24 replicates in 8 different dilution stages in minipools (96 samples per pool) were examined in each case in the multiplex mix per dilution stage.

Für HIV-1: wurden am WHO Standard NIBSC 97/650 HIV-1 folgende Konzentrationen untersucht: 2000 IU/ml, 1000 IU/ml, 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 3,13 IU/ml und 0,31 IU/ml.For HIV-1, the following concentrations were tested on the WHO standard NIBSC 97/650 HIV-1: 2000 IU / ml, 1000 IU / ml, 500 IU / ml, 250 IU / ml, 125 IU / ml, 62.5 IU / ml, 3.13 IU / ml and 0.31 IU / ml.

Für HIV-2: wurden anhand einer quantifizierten Plasmakonserve HIV-2 folgende Konzentrationen untersucht: 2000 IU/ml, 1000 IU/ml, 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 3,13 IU/ml und 0,31 IU/ml.For HIV-2, the following concentrations were assayed from a quantitated plasma HIV-2 conservative serum: 2000 IU / ml, 1000 IU / ml, 500 IU / ml, 250 IU / ml, 125 IU / ml, 62.5 IU / ml, 3 , 13 IU / ml and 0.31 IU / ml.

Die Extraktion erfolgte mittels QIAamp ViralRNA Kit, die Analyse mittels ABI PRISM^® 7000 SDS).The extraction was carried out using QIAamp Kit ViralRNA, analysis by ABI PRISM ^® 7000 SDS).

Es zeigte sich eine analytische Sensitivität bezogen auf 1 ml Einzelspende von 434,7 IU/ml für HIV-1 und von 795 IU/ml für HIV-2. Die maximale analytische Sensitivität pro prozessiertes Volumen beträgt 4,5 IU/ml für HIV-1 und 8,3 Kopien/ml für HIV-2.There was an analytical sensitivity of 1 ml single donation of 434.7 IU / ml for HIV-1 and 795 IU / ml for HIV-2. The maximum analytical sensitivity per processed volume is 4.5 IU / ml for HIV-1 and 8.3 copies / ml for HIV-2.

– Analytische Spezifität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Analytical specificity of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach

Bezüglich der analytischen Spezifität wurden Untersuchungen mit potentiell kreuzreaktiven Erregern (Poliovirus Typ 1, Typ 2, Typ 3, Echovirus Typ 6, Typ 7, Typ 9, Typ 11, Typ 30, Coxsackievirus A9, B1, B2, B3, B4, B5, CMV, Humanes Herpes Virus A1, Humanes Herpes Virus A2, Adenovirus, Staphylococcus aureus, Escherichia Coli, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca, Bacillus cereus, Hepatitis B Genotyp A, B, C, D, E, F; Hepatitis C Genotyp 1A, 1B, 2A, 2B, 2C, 2I, 3, 4, 5) durchgeführt. Dabei zeigte sich keine Kreuzreaktivität mit potentiell kreuzreaktiven Erregern, sondern eine HIV-1 spezifische Amplifkation (Tabelle 1) bzw. eine HIV-2 spezifische Amplifkation (Tabelle 2). Bezüglich HIV-1 wurde eine Untersuchung an Genotypen Panels mit den Subtypen der Gruppe M, A, B, C, D, E, F, G und H sowie der Gruppe O durchgeführt. Es zeigte sich eine Amplifikation aller bekannter Subtypen. Tabelle 1 Spezifitätstestung des DRK HIV-1 PCR Kits mit potentiell kreuzreaktiven Erregern Erreger HIV-1 (6-FAM) Interne Kontrolle (VIC, nicht beansprucht) Poliovirus Typ 1 – + Poliovirus Typ 2 – + Poliovirus Typ 3 – + Echovirus Typ 6 – + Echovirus Typ 7 – + Echovirus Typ 9 – + Echovirus Typ 11 – + Echovirus Typ 30 – + Coxsackievirus-A9 – + Coxsackievirus-B1 – + Coxsackievirus-B2 – + Coxsackievirus-B3 – + Coxsackievirus-B4 – + Coxsackievirus-B5 – + CMV – + Humanes Herpesvirus 1 (Herpes-simplex-Virus 1) – + Humanes Herpesvirus 2 (Herpes-simplex-Virus 2) – + Adenovirus – + Staphylococcus aureus – + Escherichia coli – + Staphylococcus epidermidis – + Pseudomonas aeruginosa – + Klebsielle oxytoca – + Bacillus cereus – + Hepatitis B Genotyp A – + Hepatitis B Genotyp B – + Hepatitis B Genotyp C – + Hepatitis B Genotyp D – + Hepatitis B Genotyp E – + Hepatitis B Genotyp F – + HCV-Genotyp 1a – + HCV-Genotyp 1b – + HCV-Genotyp 2a – + HCV-Genotyp 2b – + HCV-Genotyp 2c – + HCV-Genotyp 2i – + HCV-Genotyp 3 – + HCV-Genotyp 4 – + HCV-Genotyp 5 – + HIV-1 Subtyp A + + HIV-1B + + HIV-1C + + HIV-1 D1 + + HIV-1 D2 + + HIV-1 D3 + + HIV-1 E1 + + HIV-1 E2 + + HIV-1 F1 + + HIV-1 F2 + + HIV-1 G + + HIV-1 H + + HIV-1 O1 + + HIV-1 O2 + + Tabelle 2 Spezifitätstestung des DRK HIV-2 PCR Kits mit potentiell kreuzreaktiven Erregern Erreger HIV-2 (6-FAM) Interne Kontrolle (VIC, nicht beansprucht) Poliovirus Typ 1 – + Poliovirus Typ 2 – + Poliovirus Typ 3 – + Echovirus Typ 6 – + Echovirus Typ 7 – + Echovirus Typ 9 – + Echovirus Typ 11 – + Echovirus Typ 30 – + Coxsackievirus-A9 – + Coxsackievirus-B1 – + Coxsackievirus-B2 – + Coxsackievirus-B3 – + Coxsackievirus-B4 – + Coxsackievirus-B5 – + CMV – + Humanes Herpesvirus 1 (Herpes-simplex-Virus 1) – + Humanes Herpesvirus 2 (Herpes-simplex-Virus 2) – + Adenovirus – + Staphylococcus aureus – + Escherichia coli – + Staphylococcus epidermidis – + Pseudomonas aeruginosa – + Klebsielle oxytoca – + Bacillus cereus – + Hepatitis B-Genotyp A – + Hepatitis B-Genotyp B – + Hepatitis B-Genotyp C – + Hepatitis B-Genotyp D – + Hepatitis B-Genotyp E – + Hepatitis B-Genotyp F – + HCV-Genotyp 1a – + HCV-Genotyp 1b – + HCV-Genotyp 2a – + HCV-Genotyp 2b – + HCV-Genotyp 2c – + HCV-Genotyp 2i – + HCV-Genotyp 3 – + HCV-Genotyp 4 – + HCV-Genotyp 5 – + HIV-2 + + Concerning analytical specificity, studies with potentially cross-reactive pathogens (poliovirus type 1, type 2, type 3, echovirus type 6, type 7, type 9, type 11, type 30, coxsackievirus A9, B1, B2, B3, B4, B5, CMV, Human Herpes Virus A1, Human Herpes Virus A2, Adenovirus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca, Bacillus cereus, Hepatitis B genotype A, B, C, D, E, F, Hepatitis C genotype 1A, 1B, 2A, 2B, 2C, 2I, 3, 4, 5). There was no cross-reactivity with potentially cross-reactive pathogens, but an HIV-1-specific amplification (Table 1) or an HIV-2-specific amplification (Table 2). Concerning HIV-1, a study was conducted on genotype panels with subtypes of group M, A, B, C, D, E, F, G and H as well as group O. It showed an amplification of all known subtypes. Table 1 Specificity testing of the DRK HIV-1 PCR Kit with potentially cross-reactive pathogens pathogen HIV-1 (6-FAM) Internal control (VIC, unclaimed) Poliovirus type 1 - + Poliovirus type 2 - + Poliovirus type 3 - + Echovirus type 6 - + Echovirus type 7 - + Echovirus type 9 - + Echovirus type 11 - + Echovirus type 30 - + Coxsackievirus A9 - + Coxsackievirus B1 - + Coxsackievirus B2 - + Coxsackievirus B3 - + Coxsackievirus B4 - + Coxsackievirus B5 - + CMV - + Human herpesvirus 1 (herpes simplex virus 1) - + Human herpesvirus 2 (herpes simplex virus 2) - + adenovirus - + Staphylococcus aureus - + Escherichia coli - + Staphylococcus epidermidis - + Pseudomonas aeruginosa - + Klebsielle oxytoca - + Bacillus cereus - + Hepatitis B genotype A - + Hepatitis B genotype B - + Hepatitis B genotype C - + Hepatitis B genotype D - + Hepatitis B genotype E - + Hepatitis B genotype F - + HCV genotype 1a - + HCV genotype 1b - + HCV genotype 2a - + HCV genotype 2b - + HCV genotype 2c - + HCV genotype 2i - + HCV genotype 3 - + HCV genotype 4 - + HCV genotype 5 - + HIV-1 subtype A + + HIV-1B + + HIV-1C + + HIV-1 D1 + + HIV-1 D2 + + HIV-1 D3 + + HIV-1 E1 + + HIV-1 E2 + + HIV-1 F1 + + HIV-1 F2 + + HIV-1G + + HIV-1 H + + HIV-1 O1 + + HIV-1 O2 + + Table 2 Specificity testing of the DRK HIV-2 PCR Kit with potentially cross-reactive pathogens pathogen HIV-2 (6-FAM) Internal control (VIC, unclaimed) Poliovirus type 1 - + Poliovirus type 2 - + Poliovirus type 3 - + Echovirus type 6 - + Echovirus type 7 - + Echovirus type 9 - + Echovirus type 11 - + Echovirus type 30 - + Coxsackievirus A9 - + Coxsackievirus B1 - + Coxsackievirus B2 - + Coxsackievirus B3 - + Coxsackievirus B4 - + Coxsackievirus B5 - + CMV - + Human herpesvirus 1 (herpes simplex virus 1) - + Human herpesvirus 2 (herpes simplex virus 2) - + adenovirus - + Staphylococcus aureus - + Escherichia coli - + Staphylococcus epidermidis - + Pseudomonas aeruginosa - + Klebsielle oxytoca - + Bacillus cereus - + Hepatitis B genotype A - + Hepatitis B genotype B - + Hepatitis B genotype C - + Hepatitis B genotype D - + Hepatitis B genotype E - + Hepatitis B genotype F - + HCV genotype 1a - + HCV genotype 1b - + HCV genotype 2a - + HCV genotype 2b - + HCV genotype 2c - + HCV genotype 2i - + HCV genotype 3 - + HCV genotype 4 - + HCV genotype 5 - + HIV-2 + +

– Diagnostische Sensitivität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Diagnostic sensitivity of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach

Zur Analyse der diagnostischen Sensitivität wurden jeweils 100 Positivkontrollen mit einer Konzentration des Dreifachen der 95% Nachweisgrenze (1800 IU/ml HIV-1; 2400 Kopien/ml HIV-2) analysiert. Dabei zeigte sich eine diagnostische Sensitivität größer 99,9%.

für HIV-1: Getestete Positivkontrolle Positiv Negativ Diagnostische Sensitivität 100 100 0 > 99,0% für HIV-2: Getestete Positivkontrolle Positiv Negativ Diagnostische Sensitivität 100 100 0 > 99,0% To analyze the diagnostic sensitivity, 100 positive controls each at a concentration three times the 95% detection limit (1800 IU / ml HIV-1, 2400 copies / ml HIV-2) were analyzed. This showed a diagnostic sensitivity of greater than 99.9%.

for HIV-1: Tested positive control positive negative Diagnostic sensitivity 100 100 0 > 99.0% for HIV-2: Tested positive control positive negative Diagnostic sensitivity 100 100 0 > 99.0%

– Diagnostische Spezifität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Diagnostic specificity of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach

Zur Untersuchung der diagnostischen Spezifität wurden jeweils 500 negative Poolproben analysiert. Untersucht wurden jeweils 500 Pool-Proben im Zeitraum von Januar bis März 2008. Es zeigte sich eine diagnostische Spezifität größer 99,8%.

für HIV-1: Getestete Pools Negative Pools Positive Pools Falsch positive Pools Diagnostische Spezifität 500 500 – – 100% für HIV-2: Getestete Pools Negative Pools Positive Pools Falsch positive Pools Diagnostische Spezifität 500 500 – – 100% To examine the diagnostic specificity, 500 negative pool samples were analyzed. In each case, 500 pool samples were examined in the period from January to March 2008. A diagnostic specificity of greater than 99.8% was found.

for HIV-1: Tested pools Negative pools Positive pools False positive pools Diagnostic specificity 500 500 - - 100% for HIV-2: Tested pools Negative pools Positive pools False positive pools Diagnostic specificity 500 500 - - 100%

– Robustheit von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Robustness of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach

Die Robustheit wurde alternierend an 8 Reihen von HIV-1 positiven Proben (10⁶ IU/ml) und negativen Proben analysiert, ein identisches Verfahren wurde anschließend für HIV-2 Proben durchgeführt. Es zeigte sich ein robustes Verfahren. Eine Kontamination konnte ausgeschlossen werden.Robustness was analyzed alternately on 8 rows of HIV-1 positive samples (10 ⁶ IU / ml) and negative samples, and an identical procedure was subsequently performed for HIV-2 samples. It showed a robust process. Contamination could be excluded.

SEQUENCE LISTING

SEQUENCE LISTING

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.This is followed by a sequence protocol according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can be downloaded from the official publication platform of the DPMA.

Claims (29)

Verfahren zur Detektion von HIV-1 und HIV-2 in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben, b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben, c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution, d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c), e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region und gag-Region der HIV-1-Genotypen abgeleitet werden, wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22, und für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region der HIV-2-Genotypen abgeleitet werden, wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist, und weiter umfassend eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die erste, zweite und dritte Sonde mit jeweils mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, und wobei die vierte Sonde mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet, f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, wobei vor der Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix eine reverse Transkription der viralen RNA und der internen Kontroll-Nukleinsäure erfolgt, und g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.A method of detecting HIV-1 and HIV-2 in blood-derived samples, comprising a) providing blood-derived samples, b) concentrating the blood-derived samples, c) extracting the viral nucleic acids using a lysis reagent Buffer comprising an internal control nucleic acid and using heated nuclease-free water for elution, d) obtaining the viral nucleic acid extracts from step c), e) preparing a PCR master mix comprising for the detection of HIV 1 comprises a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids comprising at least two pairs each of a sense primer and an antisense primer and at least two pairs each of a first probe and a second probe, the nucleotide sequences of the primers and probes are derived from the conserved 5 'LTR region and gag region of the HIV-1 genotypes, the following pairs each consisting of a sense primer and an An Tisense primer is selected: nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 1 and 2, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 3 and 4, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 5 and 7, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 6 and 7; and nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs are selected from the following pairs each of a first probe and a second probe. 19 and 20, nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 21 and 22, and for the detection of HIV-2, a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids and each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, wherein the nucleotide sequences of the primers and probes are derived from the conserved 5 'LTR region of the HIV-2 genotypes, wherein a sense primer comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 8, an antisense primer comprising a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 9 and a third probe comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 23, and further comprising a fourth probe specific for the internal control nucleic acid, wherein the first, second and third probes are each labeled with at least one first fluorescent dye, and wherein the fourth probe is labeled with at least one second fluorescent dye, which differs from the first fluorescent dye, f) adding the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix and performing the nucleic acid amplification, wherein prior to the addition of the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix, a reverse transcription of the viral RNA and the internal control Nucleic acid, and g) detection of the amplified viral nucleic acids and the amplified internal control nucleic acid. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive oder eine kompetitive Nukleinsäure ist.The method of claim 1, wherein the internal control nucleic acid is a non-competitive or a competitive nucleic acid. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleinsäure ist und die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 16 hat.The method of claim 1 or 2, wherein the internal control nucleic acid is a competitive nucleic acid and the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 16 has. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleinsäure ist und eine Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 ist.The method of claim 1 or 2, wherein the internal control nucleic acid is a non-competitive nucleic acid and a nucleotide sequence of bacteriophage is MS2. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der PCR-Mastermix weiterhin umfasst: für den Nachweis einer Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für MS2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer und einen Antisense-Primer umfasst, wobei der Sense-Primer ausgewählt ist aus Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10, 12 und 14 und der Antisense-Primer ausgewählt ist aus Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 11, 13 und 15.The method of claim 4, wherein the PCR master mix further comprises: for the detection of a nucleotide sequence of bacteriophage MS2, a set of oligonucleotides which is specific for MS2 nucleic acids and in each case comprises at least one sense primer and one antisense primer, wherein the sense primer is selected from nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 10, 12 and 14 and the antisense primer is selected from nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 11, 13 and 15. Verfahren nach Anspruch 5, wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10 und 11, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 12 und 13, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 14 und 15.The method of claim 5, wherein the following pairs are selected from a sense primer and an antisense primer, respectively Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 10 and 11, Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 12 and 13, Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 14 and 15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben, insbesondere Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben handelt.Method according to one of the preceding claims, wherein the blood-derived samples are samples containing blood samples, in particular whole blood, plasma, serum or cellular blood components. Verfahren einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die in Schritt a) zur Verfügung gestellten aus Blut abgeleiteten Proben zu mindestens einem Probenpool zusammengeführt werden.Method according to one of the preceding claims, wherein the blood-derived samples provided in step a) are combined to form at least one sample pool. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Konzentrieren der Proben in Schritt b) Zentrifugieren umfasst.The method of any one of the preceding claims, wherein concentrating the samples in step b) comprises centrifuging. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz der vierten Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, von der Sequenz der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wird.The method of any one of the preceding claims, wherein the nucleotide sequence of the fourth probe specific for the internal control nucleic acid is derived from the sequence of the internal control nucleic acid. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleinsäure ist und die vierte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 24 ist.The method of claim 10, wherein the internal control nucleic acid is a competitive nucleic acid and the fourth probe is a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 24 is. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleinsäure ist, insbesondere die Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 hat, und die vierte Sonde ausgewählt ist aus Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 25, 26 oder 27.The method of claim 10, wherein the internal control nucleic acid is a non-competitive nucleic acid, in particular has the nucleotide sequence of bacteriophage MS2, and the fourth probe is selected from nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 25, 26 or 27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine oder mehrere der Sonden Hydrolyse-Sonden oder Molecular Beacons sind.A method according to any one of the preceding claims, wherein one or more of the probes are hydrolysis probes or molecular beacons. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 12, wobei die Sonden mit jeweils zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, und die zwei Fluoreszenzfarbstoffe bevorzugt ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher, sind.Method according to one of the preceding claims 1 to 12, wherein the probes are labeled with two fluorescent dyes, and the two fluorescent dyes are preferably a pair consisting of a fluorescence donor or reporter and a fluorescence acceptor or quencher. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Fluoreszenzdonor oder -reporter ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-Hexachlor-Fluorescein (HEX), 3-(5,6,4',7'-Tetrachlor-5'-Methyl-3',6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl)-Propanamidohexyl-1-O-(2-Cyanoethyl)-(N,N-Diisopropyl)-Phosphoramidit (Yakima Yellow), Boron-dipyrromethen (BDP), Tetramethylrhodamin (TMR), 5'-Tetrachlor-Fluorescein (TET), und Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas Red).The method of claim 14, wherein the fluorescent donor or reporter is selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-hexachloro-fluorescein (HEX), 3- (5,6,4 ', 7'-tetrachloro-5-methyl-3', 6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl) -Propanamidohexyl-1-O- (2-cyanoethyl) - (N, N- Diisopropyl) phosphoramidite (Yakima Yellow), boron-dipyrromethene (BDP), tetramethylrhodamine (TMR), 5'-tetrachloro-fluorescein (TET), and sulforhodamine 101 sulfonyl chloride (Texas Red). Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Dihydrocyclopyrroloindol-Tripeptid Minor Groove Binder (MGB), 4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-1), 4'-(4-Nitro-phenyldiazo)-2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-2), 4,4-Difluor-5-Styryl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionsäure-Succinimidyl-Ester (BodiPy 564/570), und 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[6-(9-[4-nitro-2',5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo]-julolidin-8-oxy)-hexylamidoethyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (BBQ).The method of claim 14, wherein the fluorescent acceptor or quencher is selected from the group consisting of Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), Dihydrocyclopyrroloindole tripeptide Minor Groove Binder (MGB), 4 '- (2-nitro-4-toluyldiazo) -2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4' '- (N-ethyl) -N-ethyl-2-cyanoethyl (N, N-diisopropyl) phosphoramidite (BHQ-1), 4 '- (4-nitro-phenyldiazo) -2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4' '- (N-ethyl) -N-ethyl-2-cyanoethyl (N, N-diisopropyl) phosphoramidite (BHQ-2), 4,4-Difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BodiPy 564/570), and 5'-Dimethoxytrityloxy-5- [6- (9- [4-nitro-2 ', 5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo] -julolidine-8-oxy) -hexylamidoethyl-3-acrylimido] -2'- deoxyuridine-3 '- [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] phosphoramidite (BBQ). Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erste, zweite und dritte Sonde mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert sind, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem die vierte Sonde markiert ist, unterscheidet.A method according to any one of the preceding claims, wherein the first, second and third probes are each labeled with a pair of fluorescent dyes different from the pair of fluorescent dyes with which the fourth probe is labeled. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) ausgewählt ist aus Multiplex-PCR, Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) und Strang-Ablöse-Amplifikation (strand displacement amplification, SDA).Method according to one of the preceding claims, wherein the nucleic acid amplification in step f) is selected from Multiplex PCR, Transcription mediated amplification (TMA), ligase chain reaction (LCR), Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) and Strand Displacement Amplification (SDA). Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Multiplex-PCR eine Multiplex-Realtime-PCR ist.The method of claim 18, wherein the multiplex PCR is a multiplex real-time PCR. Zusammensetzung zum Nachweis von HIV-1 und HIV-2, umfassend Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 1 bis 9 sowie Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 23, wobei die Zusammensetzung für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22, und wobei die Zusammensetzung für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist.Composition for the detection of HIV-1 and HIV-2, comprising oligonucleotides having the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 1 to 9 and oligonucleotides with the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 19 to 23, wherein the composition for the detection of HIV-1 is a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and at least two pairs each of a sense primer and an antisense primer and at least two pairs each of a first probe and a second Probe selected from the following pairs of each a sense primer and an antisense primer: Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 1 and 2, Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 3 and 4, Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 5 and 7, Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 6 and 7; and is selected from the following pairs of a first probe and a second probe: Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 19 and 20, Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 21 and 22, and wherein the composition for detection of HIV-2 comprises a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids and each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, wherein a sense primer comprises a nucleic acid the sequence of SEQ ID NO. 8, an antisense primer comprising a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 9 and a third probe comprises a nucleic acid having the sequence of SEQ ID NO. 23 is. Zusammensetzung nach Anspruch 20, weiterhin umfassend ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 24.The composition of claim 20, further comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 24th Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 und 21, weiterhin umfassend – mindestens zwei Oligonukleotide, die ausgewählt sind aus den Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10 bis 15; und – mindestens ein Oligonukleotid ausgewählt aus den Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NO. 25 bis 27.A composition according to any one of claims 20 and 21, further comprising - at least two oligonucleotides selected from the nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 10 to 15; and At least one oligonucleotide selected from the nucleic acids having the sequence of SEQ ID NO. 25 to 27. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die zwei Oligonukleotide, die ausgewählt sind aus den Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10 bis 15, ausgewählt sind aus den Paaren Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10 und 11, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 12 und 13, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 14 und 15.The composition of claim 22, wherein the two oligonucleotides selected from the nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 10 to 15, are selected from the pairs Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 10 and 11, Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 12 and 13, Nucleic acids having the sequence of SEQ ID NOs. 14 and 15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 19 bis 27 mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.A composition according to any one of claims 20 to 23, wherein the oligonucleotides are linked to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 19 to 27 are labeled with two fluorescent dyes. Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei die zwei Fluoreszenzfarbstoffe ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher, sind.The composition of claim 24, wherein the two fluorescent dyes are a pair consisting of a fluorescent donor or reporter and a fluorescence acceptor or quencher. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der Fluoreszenzdonor oder -reporter ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-Hexachlor-Fluorescein (HEX), 3-(5,6,4',7'-Tetrachlor-5'-Methyl-3',6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl)-Propanamidohexyl-1-O-(2-Cyanoethyl)-(N,N-Diisopropyl)-Phosphoramidit (Yakima Yellow), Boron-dipyrromethen (BDP), Tetramethylrhodamin (TMR), 5'-Tetrachlor-Fluorescein (TET), und Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas Red).The composition of claim 25, wherein the fluorescent donor or reporter is selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-hexachloro-fluorescein (HEX), 3- (5,6,4 ', 7'-tetrachloro-5-methyl-3', 6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl) -Propanamidohexyl-1-O- (2-cyanoethyl) - (N, N- Diisopropyl) phosphoramidite (Yakima Yellow), Boron dipyrromethene (BDP), Tetramethylrhodamine (TMR), 5'-tetrachloro-fluorescein (TET), and Sulforhodamine 101 sulfonyl chloride (Texas Red). Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Dihydrocyclopyrroloindol-Tripeptid Minor Groove Binder (MGB), 4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-1), 4'-(4-Nitro-phenyldiazo)-2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-2), 4,4-Difluor-5-Styryl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionsäure-Succinimidyl-Ester (BodiPy 564/570), und 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[6-(9-[4-nitro-2',5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo]-julolidin-8-oxy)-hexylamidoethyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (BBQ).The composition of claim 26, wherein the fluorescent acceptor or quencher is selected from the group consisting of Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), Dihydrocyclopyrroloindole tripeptide Minor Groove Binder (MGB), 4 '- (2-nitro-4-toluyldiazo) -2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4' '- (N-ethyl) -N-ethyl-2-cyanoethyl (N, N-diisopropyl) phosphoramidite (BHQ-1), 4 '- (4-nitro-phenyldiazo) -2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4' '- (N-ethyl) -N-ethyl-2-cyanoethyl (N, N-diisopropyl) phosphoramidite (BHQ-2), 4,4-Difluoro-5-styryl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid succinimidyl ester (BodiPy 564/570), and 5'-Dimethoxytrityloxy-5- [6- (9- [4-nitro-2 ', 5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo] -julolidine-8-oxy) -hexylamidoethyl-3-acrylimido] -2'- deoxyuridine-3 '- [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] phosphoramidite (BBQ). Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 19 bis 23 mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert sind, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 24 bis 27 markiert sind, unterscheidet.A composition according to any one of claims 25 to 27, wherein oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 19 to 23 are each labeled with a fluorescent dye pair, which is different from the fluorescent dye pair, with the oligonucleotides with the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 24 to 27 are marked, different. Testkit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von HI-Viren in aus Blut abgeleiteten Proben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, umfassend – mindestens eine der Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 20 bis 28, – Reagenzien und Hilfsstoffe für die Extraktion viraler Nukleinsäuren aus aus Blut abgeleiteten Proben und für die Nukleinsäure-Amplifizierung.A test kit for performing a method of detecting HIV in blood-derived samples according to any one of claims 1 to 18, comprising At least one of the compositions according to any one of claims 20 to 28, - Reagents and excipients for the extraction of viral nucleic acids from blood-derived samples and for nucleic acid amplification.