DE102008022609B4

DE102008022609B4 - Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von Nierensteinen und/oder Entzündungen der ableitenden Harnwege

Info

Publication number: DE102008022609B4
Application number: DE102008022609A
Authority: DE
Inventors: Werner Prof. Dr. 39120 Hoffmann
Original assignee: Otto Von Guericke Universitaet Magdeburg
Current assignee: Otto Von Guericke Universitaet Magdeburg
Priority date: 2008-05-05
Filing date: 2008-05-05
Publication date: 2011-07-28
Anticipated expiration: 2028-05-06
Also published as: US20110117583A1; DE102008022609A1; WO2009135463A1; EP2277051A1

Abstract

Verfahren zum Nachweis von entzündlichen Erkrankungen der ableitenden Harnwege und/oder zum Nachweis von Nierensteinen eines Patienten bei dem eine Urinprobe des Patienten einer quantitativen Bestimmung der TFF2-Konzentration unterzogen und dieses Vorgehen in zeitlichen Abständen von Tagen wiederholt wird, wobei gegenüber den Kontrollwerten gesunder Personen deutlich erhöhte TFF2-Werte des Patienten eine Entzündung im Bereich der ableitenden Harnwege und/oder Nierensteine anzeigen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von Nierensteinen und/oder Entzündungen der ableitenden Harnwege gemäß der Gattung der Patentansprüche. Es ist zur Detektion spezifischer Erkrankungen geeignet.
Verschiedene Erkrankungen der ableitenden Harnwege [bspw. verschiedene Nierensteine oder Harnwegsinfekte (HWI)] lassen sich zur Zeit nur mit relativ teuren Methoden und auch oft nicht sicher diagnostizieren (z. B. Ultraschall, Anlegen von Kulturen). Besonders bei Steinen ist eine sichere Diagnose oft problematisch und erfordert teure Geräte und sehr erfahrene Ärzte.
DE 696 19 416 T2 offenbart ein Verfahren und Reagenzien zum immunologischen Nachweis von Cortisol im Urin.
Aus DE 695 23 707 T2 ist ein Verfahren zum Nachweis von Kreatinin und von in Urin enthaltenen Proteinen bekannt.
DE 44 44 533 A1 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung eines Tests zum Nachweis von Partikeln im Urin (Test zur Bestimmung der Anfälligkeit einer Testperson für Nierensteine).
Aus DE 38 87 314 T2 sind eine Methode zum Nachweis basischer fötaler Proteine im Urin und ein dafür geeigneter Analysesatz bekannt.
DE 18 12 584 offenbart einen schnellen und empfindlichen Nachweis von Bakterien in Blutprodukten, Urin und anderen Flüssigkeiten.
DE 38 38 718 A1 offenbart ein Verfahren zum Aufspüren von Krankheiten, die in Verbindung mit Stoffwechselabnormalitäten von L-Fucose, wie Magengeschwüren, Leberzirrhosen und Karzinomen in Menschen, in Verbindung stehen. Dieses Verfahren besteht in einem Vergleich der Konzentrationen an freier L-Fucose mit ihrem normalen Wert in einer Probe aus dem Subjekt.
Die Publikation ”Williams, G. R.; Wright, N. A.: Trefoil factor family domain peptides. Virchows Archiv (1997), Vol. 431, Nr. 5, Seiten 299–304” offenbart die prognostische Bedeutung der pathologischen Expression von TFF-Peptiden bei verschiedenen Karzinomen, u. a. auch bei Tumoren der ableitenden Harnwege (speziell der Blase).
Die Publikation „Vestergaard, E. M.: Plasma Levels of Trefoil Factors are Increased in Patients with Advanced Prostate Cancer. Clinical Cancer Research (2006), Vol. 12, Nr. 3, Seiten 807–812” offenbart ein ELISA-Immunoassay zum TFF-Nachweis im Zusammenhang mit der Diagnose von Prostatakrebs.
Gemäß dieser beiden voranstehend aufgeführten Publikationen erfolgt der TFF-Nachweis an per Biopsie entnommenen Zellen oder im Blut vermittels herkömmlicher bioanalytischer Nachweismethoden, d. h. es muss immer invasiv vorgegangen werden, um Zellen oder Blut des betroffenen Patienten zu entnehmen.
TFF(Trefoil Factor Family)-Peptide stellen eine Familie von luminalen Schutzpeptiden dar, die u. a. eine Schlüsselrolle für den Schutz, die Regeneration und die Reparatur muköser Epithelien spielen.
Beim Menschen wurden bis jetzt die Peptide TFF1, TFF2 und TFF3 beschrieben. Das physiologische Vorkommen von TFF1 (frühere Namen: pS3, BCEI, pNR-2, pNR-105) und TFF2 ist vor allem auf den Magen beschränkt, während TFF3 (frühere Namen: Intestinal Trefoil Factor/ITF, hPl. B) von vielen mukösen Epithelien synthetisiert wird. So ist TFF2 (frühere Namen: Pancreatic Spasmolytic Polypeptide/PSP, Spasmolytic Polypeptide/SP, human Spasmolytic Polypeptide/hSP) ein Bestandteil des Magensafts und kommt da sowohl in einer glykosylierten als auch in einer nichtglykosylierten Form vor.
Außerdem ist gastrales TFF2, im Unterschied zu TFF1, an Muzine gebunden (Kouznetsova et al. (2007) Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908).
Eine Überexpression von TFF3 ist im Zusammenhang mit Prostata-Krebs bekannt.
Im normalen menschlichen Urin sind TFF-Peptide nur in sehr geringer Konzentration vorhanden. So sind in der Regel weder TFF1 noch TFF2 noch TFF3 über Westernblot-Analysen nachweisbar.
Die Publikation von Chutipongtanate, S. u. a. „Identification of human urinary trefoil factor 1 as a novel calcium oxalate crystal growth inhibitor.” in: The Journal of Clinical Investigation (2005), Vol. 115, Nr. 12, Seiten 3613–3622 offenbart die Identifikation von TFF-1 in Urinproben als Indikator für die Inhibierung der Bildung von Nierensteinen, wobei der Nachweis des Peptids durch Western-Blot oder ELISA-Assays erfolgt.
Aus WO 2008/005375 A2 ist der Zusammenhang einer Nierenschwäche und einem verringerten TFF-3-Gehalt in Urinproben bekannt. Der TFF-3-Marker wird dabei durch ELISA-Assays bestimmt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege anzugeben, das nichtinvasiv durchführbar ist und dabei relativ schnell und kostengünstig erste Hinweise z. B. bezüglich des Vorkommens von Nierensteinen und/oder Entzündungen (z. B. nach HWI) der ableitenden Harnwege ermöglicht, um u. a. durch Entzündungen hervorgerufene Mikrohämaturien schnell und kostengünstig abzuklären.
Gemäß der Erfindung wird die Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des ersten Patentanspruchs gelöst. In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindungen angegeben.
Es wurde festgestellt, dass TFF2 (und in geringerem Maße auch TFF1 sowie mitunter auch TFF3) im Urin von Nierensteinträgern und Patienten mit HWI gegenüber gesunden Personen in stark erhöhter Konzentration vorliegt und nachweisbar ist.
Dabei ist die TFF2-Konzentration in HWI-Patienten gegenüber Nierensteinträgern erhöht, so dass dadurch eine Differentialdiagnostik möglich ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt der semiquantitative Nachweis von TFF2 durch Westernblotanalysen von Urinproben nach Acetonfällung und nachfolgender Detektion mit Hilfe der Chemilumineszenz (ECL-System) sowie digitaler Auswertung gemäß dem Stand der Technik.
Dies stellt eine Kombination von biochemischen Standardmethoden dar (siehe z. B. Kouznetsova et al. (2007) Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908). Dadurch wird sichergestellt, dass nur glykosyliertes TFF2 in die Analyse einbezogen wird, das im Urin dieser Patienten vorliegt.
Neben diesem hochspezifischen quantitativen Nachweisverfahren für TFF2 im Urin, können auch andere Detektionsmethoden im erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden, wie bspw. ELISA, Streifentest, RIA, IRMA oder verschiedene chromatographische Verfahren.
Ein entsprechender Immunoassay für TFF2 gehört zum Stand der Technik (Vestergaard et al. (2004) Scand. J Clin. Lab. Invest. 64: 146–156).
Der Vorteil des erfindungsgemäßen, biochemischen Verfahrens besteht darin, dass es einen kostengünstigen Schnelltest darstellt, dessen Ergebnisse eine Entscheidungsgrundlage hinsichtlich ggf. weiterer erforderlicher Anwendungen/Untersuchungen, die oft teuer und für den Patienten belastend sind, liefern. Dadurch ist eine ökonomische Verwendung der z. Zt. besonders begrenzten finanziellen Ressourcen auf dem Gesundheitssektor möglich, wobei gleichzeitig unnötige und für den Patienten belastende Untersuchungen vermieden werden können.
Die Erfindung soll nachfolgend an Hand der Ausführungsbeispiele näher erläutert werden, ohne dadurch auf diese beschränkt zu sein.
1. Ausführungsbeispiel
Bestimmung der TFF2-Konzentration im Urin von Patienten mit vermutetem HWI
1 Volumen (z. B. 500 μL) einer Urinprobe (z. B. morgendlicher Mittelstrahlurin) eines Patienten mit vermutetem HWI wird mit 4 Volumina (z. B. 2000 μL) kaltem Aceton (–20°C) versetzt und die Proteine bei –20°C für mindestens 2 Stunden gefällt. Dann werden die gefällten Proteine für 10 Minuten bei 4°C und 12.000 × g abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen; das Pellet wird an der Luft getrocknet und dann in 0.5% SDS aufgenommen (in der Hälfte des ursprünglichen Urinvolumens, z. B. in 250 μL).
Anschließend werden 15 μL dieser so vorbereiteten Probe mit 5 μL 4-fach Probenpuffer für die Gelelektrophorese versetzt, 4 Minuten im kochenden Wasserbad erhitzt und sofort einer SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE; 15%) unterzogen. Alle nachfolgend aufgeführten Schritte erfolgen dann analog Kouznetsova et al. (Kouznetsova I, Laubinger W, Kalbacher H, Kalinski T, Meyer F, Roessner A, Hoffmann W (2004) Biosynthesis of gastrokine-2 in the human gastric mucosa: restricted spatial expression along the antral gland axis and differential interaction with TFF1, TFF2 and mucins. Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908):
Nach der SDS-PAGE werden die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, mit 0.1% Glutaraldehyd fixiert und in PBS mit einem affinitätsgereinigten polyklonalen Antiserum gegen TFF2 (z. B. anti-hTFF2-1; Jagla W, Wiede A, Dietzmann K, Rutkowski K, Hoffmann W (2000) Co-localization of TFF3 peptide and oxytocin in the human hypothalamus. FASER J. 14: 1126–1131) inkubiert. Die TFF2-enthaltenden Banden werden mit einem kommerziellen ECL-Detektionssystem (z. B. GE Healthcare) sichtbar gemacht. Das Bild dieser Westernblotanalyse wird dann elektronisch gespeichert (GeneGnome System, Syngene). Die semi-quantitative Auswertung der Banden erfolgt mit der GeneTools Gel-Analyse-Software (Syngene).
Dabei können entweder die glykosylierten oder die nicht-glykosylierten TFF2-Formen getrennt ausgewertet werden.
Die Eichung kann über rekombinantes TFF2 erfolgen. Deutlich erhöhte TFF2-Werte gegenüber den Kontrollwerten gesunder Personen sind ein Hinweis auf eine Entzündung, z. B. durch HWI.
2. Ausführungsbeispiel
Bestimmung der TFF2-Konzentration im Urin von Patienten mit Mikrohämaturie
10 mL einer Urinprobe (z. B. morgendlicher Mittelstrahlurin) eines Patienten mit ungeklärter Mikrohämaturie werden für 15 Minuten bei 5.000 × g zentrifugiert und ein Aliquot des Überstands wird dann einem spezifischen ELISA zur quantitativen Bestimmung der TFF2-Konzentration unterzogen. Dabei werden entsprechende Verdünnungen entsprechend dem Protokoll von Vestergaard et al. (Vestergaard EM, Brynskov J, Ejskjaer, Clausen JT, Thim L, Nexo E, Poulsen SS (2004) Immunoassays of human trefoil factors 1 and 2: measured an serum from patients with inflammatory bowel disease. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 64: 146–156) behandelt.
Deutlich erhöhte TFF2-Werte gegenüber den Kontrollwerten gesunder Personen sind ein Hinweis auf eine Entzündung im Bereich der ableitenden Harnwege (z. B. durch HWI oder Nierensteine) und könnten die Mikrohämaturie erklären. Bei Vorliegen von Daten aus einem größeren Patientenkollektiv könnte in Zukunft über die Bestimmung der TFF2-Konzentration auch eine Differentialdiagnose zur Unterscheidung von HWI bzw. Nierensteinen möglich sein.
3. Ausführungsbeispiel
Bestimmung der TFF2-Konzentration im Urin von Patienten mit Nephrolithiasis nach extrakorporaler Stoßwellenlithotripsie (ESWL)
Die Behandlung von hochgradiger Nephrolithiasis erfolgt heute zunehmend durch extrakorporale Stoßwellenlithotripsie (ESWL). Dadurch werden die Steine zerkleinert und dann ausgespült. Allerdings kommt es dadurch auch zu Läsionen des Nierenepithels bzw. der ableitenden Harnwege sowie zu temporären Entzündungen. Deshalb wird in der Regel nach einer ESWL-Behandlung ein Anstieg der TFF2-Konzentration im Urin beobachtet. Dieser Anstieg spiegelt den Grad der Entzündung wider und erreicht normalerweise nach einigen Tagen wieder einen Basalwert. Mitunter kommt es aber auch zu Komplikationen durch nachfolgende Entzündungen.
Durch wiederholte Messung des TFF2-Spiegels (z. B. im Abstand von 2 Tagen mit Hilfe eines ELISA; siehe 2. Ausführungsbeispiel) kann nun die Abheilung nach ESWL-Behandlung verfolgt werden und so bei Bedarf rechtzeitig einer Infektion vorgebeugt werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis von entzündlichen Erkrankungen der ableitenden Harnwege und/oder zum Nachweis von Nierensteinen eines Patienten bei dem eine Urinprobe des Patienten einer quantitativen Bestimmung der TFF2-Konzentration unterzogen und dieses Vorgehen in zeitlichen Abständen von Tagen wiederholt wird, wobei gegenüber den Kontrollwerten gesunder Personen deutlich erhöhte TFF2-Werte des Patienten eine Entzündung im Bereich der ableitenden Harnwege und/oder Nierensteine anzeigen.
Verfahren zum Nachweis von entzündlichen Erkrankungen der ableitenden Harnwege und/oder zum Nachweis von Nierensteinen eines Patienten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung durch Westernblot-Analyse, ELISA; Streifentest, RIA oder IRMA erfolgt.