DE102008019957B4 - A method of irradiating a sample with light and fluorescent light microscope with a lighting unit for irradiating a sample with light - Google Patents

Abstract

Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, – wobei ein erster Eingangslichtstrahl mit einem Strahlteiler in zwei erste Teilstrahlen aufgeteilt wird, – wobei die beiden ersten Teilstrahlen mit je einem Objektiv in einen selben Fokuspunkt in einer gemeinsamen Fokalebene der Objektive fokussiert werden, – wobei die optischen Weglängen der beiden ersten Teilstrahlen zwischen dem Strahlteiler und den Objektiven so zueinander eingestellt werden, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase interferieren, – wobei ein zweiter Eingangslichtstrahl mit demselben Strahlteiler in zwei zweite Teilstrahlen aufgeteilt wird, und – wobei im Bereich der gemeinsamen Fokalebene keine Interferenz der ersten Teilstrahlen mit den zweiten Teilstrahlen stattfindet, dadurch gekennzeichnet, dass als Strahlteiler ein Polarisationsstrahlteiler (24) verwendet wird, – wobei die Polarisationen der beiden ersten Teilstrahlen und die Polarisationen der beiden zweiten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler (24) und den Objektiven (28, 29) so zueinander eingestellt werden, dass im Bereich der gemeinsamen Fokalebene (30) die ersten Teilstrahlen interferieren und die zweiten Teilstrahlen interferieren, – wobei eine erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und eine sich von der ersten Polarisation unterscheidende Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so auf den Polarisationsstrahlteiler (24) abgestimmt werden, dass die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) mit einer zu der ersten relativen Phase um π verschobenen zweiten relativen Phase interferieren.A method for irradiating a sample with light, - wherein a first input light beam is split with a beam splitter into two first partial beams, - wherein the two first partial beams are focused with a lens in a same focal point in a common focal plane of the lenses, - Path lengths of the two first partial beams between the beam splitter and the lenses are set to each other such that the two first partial beams in the common focus point with a first relative phase interfere - a second input light beam is split with the same beam splitter into two second partial beams, and - in the region of the common focal plane no interference of the first partial beams with the second partial beams takes place, characterized in that a polarization beam splitter (24) is used as the beam splitter, - wherein the polarizations of the two first partial beams and the polarizations the two second partial beams between the polarization beam splitter (24) and the lenses (28, 29) are adjusted to one another such that in the region of the common focal plane (30) the first partial beams interfere and the second partial beams interfere, - wherein a first polarization of the first input light beam (13) and a polarization of the second input light beam (14) that differs from the first polarization are matched to the polarization beam splitter (24) in such a way that the two second partial beams in the common focus point (22) are shifted by π relative to the first relative phase interfere with the second relative phase.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNGTECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 12 aufweist.The invention relates to a method for irradiating a sample with light having the features of the preamble of independent claim 1. Furthermore, the invention relates to a fluorescent light microscope with a lighting unit for irradiating a sample with light having the features of the preamble of independent claim 12.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist in der Fluoreszenzlichtmikroskopie, insbesondere bei Techniken der STED-, GSD- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie einsetzbar. Es sind aber auch andere Anwendungen möglich, beispielsweise beim räumlich hoch aufgelösten Schreiben von Daten in einen Datenträger. Verwiesen sei hierzu beispielhaft auf die Verfahren, die aus der WO 2004/090950 A2 hervorgehen.A method according to the invention can be used in fluorescence light microscopy, in particular in techniques of STED, GSD or RESOLFT fluorescence light microscopy. But there are also other applications possible, for example, the spatially high-resolution writing data in a disk. Reference is made here by way of example to the method, which from the WO 2004/090950 A2 emerge.

STAND DER TECHNIKSTATE OF THE ART

In der aus der DE 40 40 441 A1 bekannten, sogenannten 4Pi-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird eine Probe über zwei Objektive, die eine gemeinsame Fokalebene im Bereich der Probe aufweisen, aus entgegen gesetzten Richtungen mit kohärentem, d. h. interferenzfähigem Licht bestrahlt, das in einen selben Fokuspunkt in der gemeinsamen Fokalebene fokussiert wird. Dabei bildet sich um den Fokuspunkt ein Interferenzmuster aus, das in dem Fokuspunkt ein Intensitätsmaximum aufweist. Das aus den entgegen gesetzten Richtungen kommende Licht wird mit einem Strahlteiler aus einem kohärenten Eingangslichtstrahl generiert und auf das Anregen eines Fluorophors in der Probe abgestimmt. Das von dem Fluorophor im Bereich des Intensitätsmaximums am Fokuspunkt emittierte Fluoreszenzlicht kann zwar aufgrund der Beugungsgrenze selbst mit einem konfokal zu dem Fokuspunkt angeordneten Detektor nicht getrennt von Fluoreszenzlicht gemessen werden, dass von dem Fluorophor im Bereich von Intensitätsmaxima zweiter Ordnung des Interferenzmusters auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene der Objektive emittiert wird, diese Anteile des Fluoreszenzlicht können aber aus der räumlichen Verteilung der Fluoreszenzlichtintensität herausgerechnet werden.In the from the DE 40 40 441 A1 known so-called 4Pi fluorescence microscopy, a sample is irradiated from opposite directions with coherent, ie interfering light via two lenses having a common focal plane in the region of the sample, which is focused into a same focal point in the common focal plane. In this case, an interference pattern forms around the focal point, which has an intensity maximum in the focal point. The light coming from the opposite directions is generated with a beam splitter from a coherent input light beam and tuned to the excitation of a fluorophore in the sample. Although the fluorescent light emitted by the fluorophore in the region of the intensity maximum at the focal point can not be measured separately from fluorescent light due to the diffraction limit even with a confocal to the focal point that of the fluorophore in the range of second order intensity maxima of the interference pattern on both sides of the common Focusing plane of the lenses is emitted, but these portions of the fluorescent light can be excluded from the spatial distribution of the fluorescent light intensity.

Aus der US 5 671 085 A sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur dreidimensionalen optischen Fluoreszenzmikroskopie bekannt. Gemäß einer Ausführungsform wird eine Probe über zwei Objektive, die eine gemeinsame Fokalebene im Bereich der Probe aufweisen, aus entgegengesetzten Richtungen mit kollimiertem Licht bestrahlt, welches im Bereich der gemeinsamen Fokalebene durch Anpassung der optischen Wege zur konstruktiven Interferenz gebracht wird. Das aus den entgegengesetzten Richtungen kommende Licht wird mit einem Strahlteiler aus einem Eingangslichtstrahl generiert. Mit dem Licht wird ein Fluorophor in der Probe nur dann zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, wenn er sich im Bereich der gemeinsamen Fokalebene befindet. Das von dem angeregten Fluorophor emittierte Fluoreszenzlicht wird auf eine Kamera abgebildet. Durch eine Verschiebung der Probe in Richtung der optischen Achse kann so ein dreidimensionales Bild der Probe mit gegenüber einem konventionellen Verfahren erhöhter Auflösung in Richtung der optischen Achse generiert werden. Gemäß einer anderen in der US 5 671 085 A vorgeschlagenen Ausführungsform wird die Probe nur über eines der beiden Objektive mit dem Licht, mit dem der Fluorophor angeregt wird, bestrahlt. Eine erhöhte Auflösung in Richtung der optischen Achse wird gemäß dieser Ausführungsform über die Ausnutzung der Interferenzfähigkeit des Fluoreszenzlichts erreicht, welches von einem im Bereich der Fokalebene der Objektive angeregten Fluorophor emittiert wird. Dazu werden ein erster Teil des Fluoreszenzlichts, welcher durch eines der beiden Objektive und entlang eines ersten optischen Wegs propagiert, und ein zweiter Teil des Fluoreszenzlichts, welcher durch das andere Objektiv und entlang eines zweiten optischen Wegs propagiert, mit einem Strahlteiler zusammengeführt und durch Anpassung der optischen Wege auf einer Kamera zur konstruktiven Interferenz gebracht. Gemäß einer dritten Ausführungsform werden beide Vorgehensweisen kombiniert, d. h. es wird sowohl die Interenzfähigkeit des Lichts, mit dem die Fluorophore angeregt werden, als auch diejenige des Fluoreszenzlichts genutzt. Dabei kann das Aufteilen des Eingangslichtstrahls für die Bestrahlung der Probe und das Zusammenführen der beiden Teile des Fluoreszenzlichts über ein und denselben Strahlteiler erfolgen.From the US 5 671 085 A For example, a method and apparatus for three-dimensional optical fluorescence microscopy are known. According to one embodiment, a sample is irradiated from opposite directions with collimated light via two objectives which have a common focal plane in the region of the sample, which is brought to constructive interference in the region of the common focal plane by adaptation of the optical paths. The light coming from the opposite directions is generated by a beam splitter from an input light beam. With the light, a fluorophore in the sample is only excited to emit fluorescent light when it is in the region of the common focal plane. The fluorescent light emitted by the excited fluorophore is imaged onto a camera. By shifting the sample in the direction of the optical axis, a three-dimensional image of the sample can be generated with increased resolution in the direction of the optical axis compared to a conventional method. According to another in the US 5 671 085 A In the proposed embodiment, the sample is irradiated only via one of the two objectives with the light with which the fluorophore is excited. An increased resolution in the direction of the optical axis is achieved in accordance with this embodiment by exploiting the interference capability of the fluorescent light which is emitted by a fluorophore excited in the region of the focal plane of the objectives. For this purpose, a first part of the fluorescent light, which propagates through one of the two lenses and along a first optical path, and a second part of the fluorescent light, which propagates through the other lens and along a second optical path, are combined with a beam splitter and adjusted by adjusting the optical paths on a camera for constructive interference. According to a third embodiment, both approaches are combined, that is, both the ability to interfere with the light with which the fluorophores are excited and that of the fluorescent light are utilized. In this case, the splitting of the input light beam for the irradiation of the sample and the merging of the two parts of the fluorescent light can be effected via one and the same beam splitter.

Ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 12 sind als Variante der 4Pi-Fluoreszenzlichtmikroskopie aus der WO 03/040706 A1 bekannt. Bei dieser sogenannten 4Pi-STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird das Anregungslicht für den Fluorophor nur durch eines der beiden Objektive in die Probe fokussiert. Die sich dabei von dem Fokuspunkt auf beide Seiten der Fokalebene erstreckenden Bereiche erhöhter Intensität des Anregungslichts werden mit einem Interferenzmuster überlagert, das sich durch Interferenz von aus beiden Objektiven kommenden Anteilen wieder abregenden Lichts ausbildet. Dieses Interferenzmuster des wieder abregenden Lichts weist am Fokuspunkt ein Intensitätsminimum, vorzugsweise eine Nullstelle der Intensität auf, um am Fokuspunkt selbst die Anregung des Fluorophors in der Probe zur Emission von messbarem Fluoreszenzlicht nicht zu unterdrücken. Die Wellenfronten des wieder abregenden Lichts sind aber derart aberriert, dass die Intensitätsmaxima erster und zweiter Ordnung auf beiden Seiten der Fokalebene ineinander übergehen, um den Fluorophor dort möglicht lückenlos wieder abzuregen.A method comprising the features of the preamble of independent claim 1 and a fluorescent light microscope having the features of the preamble of independent claim 12 are shown as a variant of the 4Pi fluorescence light microscopy of WO 03/040706 A1 known. In this so-called 4Pi-STED fluorescence light microscopy, the excitation light for the fluorophore is focused into the sample only by one of the two objectives. The regions of increased intensity of the excitation light extending from the focal point on both sides of the focal plane are superimposed with an interference pattern which is formed by the interference of portions of light that diffuses again from both objectives. This interference pattern of the redressing light has at the focal point an intensity minimum, preferably a zero point of the intensity, at the focal point itself, the excitation of the fluorophore in the sample for the emission of measurable Not to suppress fluorescent light. However, the wavefronts of the redressing light are aberrated in such a way that the intensity maxima of the first and second order merge into one another on both sides of the focal plane in order to allow the fluorophore to be completely depleted there again.

Um die zueinander kohärenten Anteile des wieder abregenden Lichts, die durch die beiden Objektive in denselben Fokuspunkt fokussiert werden, bereitzustellen, ist auch gemäß der WO 03/040706 A1 der Einsatz eines Strahlteilers vorgesehen, der einen kohärenten Eingangslichtstrahl in zwei Teilstrahlen aufteilt. Diese Teilstrahlen sind, wenn sie im Rahmen der Kohärenzlängen des Eingangslichtstrahls gleich lange optische Wege von dem Strahlteiler zu der gemeinsamen Fokalebene der Objektive zurücklegen, grundsätzlich miteinander interferenzfähig. Ob sie dabei am Fokuspunkt konstruktiv oder destruktiv interferieren, hängt davon ab, ob sich die Längen ihrer optischen Wege um ein ganzzahliges Vielfaches ihrer Wellenlänge, das auch null sein kann, unterscheiden oder ob der Unterschied ein ganzzahliges Vielfaches ihrer Wellenlänge plus eine halbe Wellenlänge beträgt. Hieraus ergibt sich, dass es nicht ohne Weiteres möglich ist, einen einzigen Strahlteiler sowohl für einen Eingangslichtstrahl zu verwenden, der in zwei Teilstrahlen aufgespalten werden soll, die in dem Fokuspunkt konstruktiv interferieren, als auch für einen Eingangslichtstrahl derselben Wellenlänge, der in Teilstrahlen aufgespalten werden soll, die in dem gemeinsamen Fokuspunkt destruktiv interferieren. Vielmehr müssen die optischen Wege zwischen dem Strahlteiler und den beiden Objektiven für die Teilstrahlen des einen Eingangslichtstrahls anders gestaltet werden als für die Teilstrahlen des anderen Eingangslichtstrahls. Dies ist in jedem Fall aufwändig und verlangt ausreichende Unterschiede zwischen den Teilstrahlen der beiden Eingangslichtstrahlen, die in derselben Richtung von dem Strahlteiler abgehen. Solche Unterschiede können zum Beispiel bei der Polarisationsrichtung dieser Teilstrahlen vorliegen. Polarisationsrichtungsunterschiede erlauben es, die Teilstrahlen der beiden Eingangslichtstrahlen unterschiedliche optische Wege laufen zu lassen oder relativ zueinander zu verzögern. Es versteht sich aber, dass dies nicht nur einen großen apparativen Aufwand sondern auch aufgrund der sich überschneidenden optischen Wege, die getrennt einzustellen sind, einen größeren Justageaufwand zur Folge hat. Zudem leidet die Abbildungsqualität des optischen Aufbaus.In order to provide the mutually coherent portions of the redressing light, which are focused by the two lenses in the same focal point, is also according to the WO 03/040706 A1 the use of a beam splitter, which divides a coherent input light beam into two partial beams. These partial beams, if they cover the same length of optical paths from the beam splitter to the common focal plane of the lenses in the context of the coherence lengths of the input light beam, are basically capable of interfering with each other. Whether they constructively or destructively interfere at the focal point depends on whether the lengths of their optical paths differ by an integer multiple of their wavelength, which may also be zero, or whether the difference is an integer multiple of their wavelength plus one half wavelength. As a result, it is not readily possible to use a single beam splitter for both an input light beam to be split into two sub-beams that constructively interfere in the focal point and for an input light beam of the same wavelength split into sub-beams which destructively interfere in the common focal point. Rather, the optical paths between the beam splitter and the two lenses for the sub-beams of an input light beam must be designed differently than for the sub-beams of the other input light beam. This is complicated in any case and requires sufficient differences between the partial beams of the two input light beams, which depart in the same direction from the beam splitter. Such differences may be present, for example, in the direction of polarization of these partial beams. Polarization direction differences make it possible to run the partial beams of the two input light beams different optical paths or to delay relative to each other. It goes without saying, however, that this not only results in a great outlay in terms of equipment, but also because of the overlapping optical paths which have to be adjusted separately, resulting in greater adjustment effort. In addition, the imaging quality of the optical structure suffers.

Aus der allgemeinen STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie ist es bekannt, die Wellenfronten eines kohärenten Abregungslichtstrahls, der mit demselben Objektiv wie eine Anregungslichtstrahl in eine Probe fokussiert wird, mit einer eine zentrale Singularität aufweisenden helikalen Phasenrampe zu aberrieren. Das hieraus resultierende Interferenzmuster des abregenden Lichts weist eine Intensitätsnullstelle am Fokuspunkt auf, die in der Fokalebene des Objektivs von einem Doughnut-förmigen Intensitätsmaximum umgeben ist. Mit einer derartigen Intensitätsverteilung des abregenden Lichts ist die laterale Auflösung bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie erhöht, während bei der 4Pi-(STED-)Fluoreszenzlichtmikroskopie die axiale Auflösung erhöht ist. Gewünscht wäre natürlich sowohl eine axiale als auch eine laterale Auflösungserhöhung.From general STED fluorescence light microscopy, it is known to aberrate the wavefronts of a coherent excitation light beam, which is focused into a sample with the same objective as an excitation light beam, with a helical phase ramp having a central singularity. The resulting interference pattern of the exciting light has an intensity zero point at the focal point, which is surrounded in the focal plane of the lens by a donut-shaped intensity maximum. With such an intensity distribution of the exciting light, the lateral resolution in STED fluorescence light microscopy is increased, while in 4Pi (STED) fluorescent light microscopy, the axial resolution is increased. Of course, both an axial and a lateral increase in resolution would be desired.

Eine spezielle Form von Strahlteilern sind Polaristationsstrahlteiler, die auch als polarisierende Strahlteiler bezeichnet werden. Ein Polarisationsstrahlteiler teilt einen linear polarisierten Eingangslichtstrahl in zwei Teilstrahlen auf, deren Polarisationsrichtungen senkrecht zueinander verlaufen. Dabei ist die relative Intensität der Teilstrahlen von der Polarisationsrichtung des Eingangslichtstrahls, d. h. deren Winkel zu der strahlteilenden Ebene des Strahlteilers, abhängig. Diese Abhängigkeit wird ausgenutzt, um die Intensität der beiden Teilstrahlen, in die ein Eingangslichtstrahl aufgeteilt wird, genau gleich groß einzustellen, indem die Polarisationsrichtung des Eingangslichtstrahls variiert wird. Damit die beiden Teilstrahlen eines derart mit einem Polarisationsstrahlteiler aufgeteilten Eingangslichtstrahls miteinander interferieren können, muss ihre Polarisation wieder zur Übereinstimmung gebracht werden. Dies kann dadurch geschehen, dass in einem Teilstrahl eine Lambda/2-Verzögerungsplatte angeordnet wird, so dass sich bei beiden Teilstrahlen lineare Polarisierungen in die gleiche Richtung ergeben, oder dass in beiden Teilstrahlen Lambda/4-Verzögerungsplatten angeordnet werden, die die beiden aus einander entgegen gesetzten Richtungen aufeinander treffenden Teilstrahlen gegensinnig zirkular polarisieren.A special form of beam splitters are polarization beam splitters, also referred to as polarizing beam splitters. A polarization beam splitter divides a linearly polarized input light beam into two partial beams whose polarization directions are perpendicular to one another. Here, the relative intensity of the partial beams of the polarization direction of the input light beam, d. H. their angle to the beam splitting plane of the beam splitter, depending. This dependence is exploited to set the intensity of the two partial beams, in which an input light beam is divided, exactly the same size by the polarization direction of the input light beam is varied. In order for the two sub-beams of an input light beam thus split with a polarization beam splitter to interfere with each other, their polarization must be brought to coincidence again. This can be done by arranging a lambda / 2-retardation plate in a sub-beam so that linear polarizations in the same direction result in both sub-beams or lambda / 4-retardation plates are arranged in both sub-beams, the two of them out of each other polarize opposite directions in opposite directions circular beams in opposite directions.

AUFGABE DER ERFINDUNGOBJECT OF THE INVENTION

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist, und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 12 aufweist, aufzuzeigen, mit denen mit geringem apparativen und Justieraufwand Teilstrahlen beliebiger Wellenlängen im Bereich der gemeinsamen Fokalebene sowohl destruktiv als auch konstruktiv überlagert werden können.The invention is based on the object, a method for irradiating a sample with light, having the features of the preamble of independent claim 1, and a fluorescent light microscope with a lighting unit for irradiating a sample with light, having the features of the preamble of independent claim 12 show, with those with low equipment and Justieraufwand partial beams of any wavelengths can be superimposed both destructively and constructively in the area of the common focal plane.

LÖSUNGSOLUTION

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist, und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, das die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs 12 aufweist, gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 11 betreffen bevorzugte Ausführungsbeispiele des neuen Verfahrens, während die abhängigen Patentansprüche 13 bis 22 bevorzugte Ausführungsbeispiele des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops betreffen.According to the invention the object is achieved by a method for irradiating a sample with light, which has the features of independent claim 1, and a fluorescent light microscope with a lighting unit for irradiating a sample with light, having the features of independent claim 12 solved. The dependent claims 2 to 11 relate to preferred embodiments of the new method, while the dependent claims 13 to 22 relate to preferred embodiments of the new fluorescent light microscope.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDESCRIPTION OF THE INVENTION

Bei dem neuen Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht wird ein erster kohärenter Eingangslichtstrahl einer ersten Polarisation mit einem Polarisationsstrahler in zwei erste Teilstrahlen aufgeteilt. Diese beiden ersten Teilstrahlen werden mit je einem Objektiv in einen selben Fokuspunkt in einer gemeinsamen Fokalebene der beiden Objektive fokussiert. Dabei wird die erste Polarisation so auf den Polarisationsstrahlteiler abgestimmt und werden die optischen Wellenlängen und die Polarisation der beiden ersten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahler und den Objektiven so zueinander eingestellt, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase, beispielsweise konstruktiv, interferieren. Weiter wird bei dem neuen Verfahren ein zweiter kohärenter Eingangslichtstrahl einer zweiten, sich von der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls unterscheidenden Polarisation mit demselben Polarisationsstrahlteiler in zwei zweite Teilstrahlen aufgeteilt. Diese beiden zweiten Teilstrahlen werden mit denselben Objektiven wie die beiden ersten Teilstrahlen in denselben gemeinsamen Fokuspunkt fokussiert. Dabei wird die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls so auf den Polarisationsstrahlteiler abgestimmt, dass, obwohl die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden zweiten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und den Objektiven in derselben Weise wie bei den beiden ersten Teilstrahlen zueinander eingestellt werden, die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer gegenüber der ersten relativen Phase der ersten Teilstrahlen um n verschobenen zweiten relativen Phase, d. h. im schon angesprochenen Beispiel destruktiv, interferieren. Es versteht sich, dass bei dem neuen Verfahren zusätzlich dafür zu sorgen ist, dass die ersten Teilstrahlen und die zweiten Teilstrahlen im Bereich der gemeinsamen Fokalebene nicht miteinander interferieren.In the new method for irradiating a sample with light, a first coherent input light beam of a first polarization is split with a polarization emitter into two first partial beams. These two first partial beams are each focused with one objective into a same focal point in a common focal plane of the two objectives. In this case, the first polarization is tuned to the polarization beam splitter and the optical wavelengths and the polarization of the first two partial beams between the polarization emitter and the lenses are adjusted to each other such that the first two partial beams in the common focal point with a first relative phase, for example constructive, interfere. Further, in the new method, a second coherent input light beam of a second polarization different from the first polarization of the first input light beam is split into two second sub-beams with the same polarization beam splitter. These two second partial beams are focused with the same lenses as the first two partial beams in the same common focus point. In this case, the second polarization of the second input light beam is tuned to the polarization beam splitter that, although the optical path lengths and the polarizations of the two second partial beams between the polarization beam splitter and the lenses in the same manner as in the two first partial beams are set to each other, the two second partial beams in the common focus point with a second relative phase shifted relative to the first relative phase of the first sub-beams by n, d. H. in the already mentioned example destructive, interfere. It is understood that in the new method it must additionally be ensured that the first partial beams and the second partial beams in the region of the common focal plane do not interfere with one another.

Das neue Verfahren erfordert für das Erreichen des gewünschten Ziels, ein Paar der Teilstrahlen des einen Eingangslichtstrahls in dem gemeinsamen Fokuspunkt konstruktiv zur Interferenz zu bringen, während das andere Paar der Teilstrahlen des anderen Eingangslichtstrahls in dem gemeinsamen Fokuspunkt zu destruktiver Interferenz gebracht wird, nur einen Polarisationsstrahlteiler und unterschiedliche Polarisationen der beiden Eingangslichtstrahlen. Konkret geht es um derart unterschiedliche Polarisationen der beiden Eingangslichtstrahlen, dass der eine erste Teilstrahl und der eine zweite Teilstrahl eine gleiche Polarisationsebene und gleiche Phasen aufweisen, während der andere erste Teilstrahl und der andere zweite Teilstrahl eine gleiche Polarisationsebene und um 180° verschobene Phasen aufweisen. Dabei ist die Polarisationsebene der Teilstrahlen, die an dem Polarisationsstrahlteiler reflektiert werden, ebenso wenig beeinflussbar wie die Polarisationsebene der Teilstrahlen, die von dem Polarisationsstrahlteiler transmittiert werden. Beeinflussbar ist jedoch die Phasenbeziehung der reflektierten bzw. der transmittierten Teilstrahlen zueinander. Je nachdem welche unterschiedlichen Richtungen die Polarisationsebenen der Eingangslichtstrahlen zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers aufweisen, die von den Eingangslichtstrahlen und deren Teilstrahlen aufgespannt wird, ergibt sich bei den transmittierten oder den reflektierten Teilstrahlen die Gleich- oder Gegenphasigkeit. Bei Betrachtung der relativen ersten Phase der ersten Teilstrahlen und der relativen Phase der zweiten Teilstrahlen an jedem beliebigen Ort ergibt sich hieraus eine Verschiebung zwischen den relativen Phasen um π. Bei dem neuen Verfahren wird gezielt ausgenutzt, dass diese Verschiebung zwischen den relativen Phasen um π einem Längenunterschied der optischen Weglängen von Lambda/2 entspricht. Trotz sich an den Polarisationsstrahlteiler anschließender identischer optischer Wege für den einen ersten Teilstrahl und den einen zweiten Teilstrahl einerseits und den anderen ersten Teilstrahl und den anderen zweiten Teilstrahl andererseits resultieren hieraus zum Beispiel einmal eine konstruktive Interferenz und einmal eine destruktive Interferenz der jeweiligen aus einander entgegen gesetzten Richtungen kommenden Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt.The new method requires only one polarization beam splitter to achieve the desired goal of constructively interfering with a pair of the sub-beams of the one input light beam in the common focus point while the other pair of sub beams of the other input light beam in the common focus point are destructively interfered and different polarizations of the two input light beams. Specifically, it is about such different polarizations of the two input light beams, that a first partial beam and a second partial beam have a same plane of polarization and equal phases, while the other first partial beam and the other second partial beam have a same plane of polarization and shifted by 180 ° phases. In this case, the polarization plane of the partial beams, which are reflected at the polarization beam splitter, as little influenced as the polarization plane of the partial beams, which are transmitted by the polarization beam splitter. However, it is possible to influence the phase relationship of the reflected or the transmitted partial beams relative to one another. Depending on which different directions the polarization planes of the input light beams to the beam splitter plane of the polarization beam splitter, which is spanned by the input light beams and their sub-beams, results in the transmitted or the reflected sub-beams, the DC or antiphase. Considering the relative first phase of the first partial beams and the relative phase of the second partial beams at any location, this results in a shift between the relative phases by π. The new method makes deliberate use of this shift between the relative phases by π corresponding to a difference in length of the optical path lengths of lambda / 2. Despite identical optical paths for the first partial beam and the second partial beam and the other second partial beam following the polarization beam splitter, this results, for example, in a constructive interference and once in a destructive interference of the respective opposing ones Directions coming partial beams in the common focus point.

Bei dem neuen Verfahren ist es nicht zwingend, dass die zweite relative Phase, mit der die beiden zweiten Teilstrahlen in dem Fokuspunkt interferieren, um genau 180° gegenüber der ersten relativen Phase, mit der die ersten Teilstrahlen in dem Fokuspunkt interferieren, verschoben ist. Es sind sogar relativ deutliche Abweichungen bei der Verschiebung der relativen Phasen von 180° möglich. Eine Verschiebung der relativen Phasen von 180° ergibt sich bei jeweils linear polarisierten Eingangslichtstrahlen oder bei jeweils zirkular polarisierten Eingangslichtstrahlen mit entgegen gesetzter Drehrichtung des Lichtfeldes. Wenn aber beispielsweise ein zirkular polarisierter Eingangslichtstrahl und ein linear polarisierter Eingangslichtstrahl miteinander kombiniert werden, resultiert eine zweite relative Phase, die gegenüber der ersten relativen Phase um 90° bzw. 270° verschoben ist, weil die in dem Polarisationsstrahlteiler einlaufenden Anteile der Eingangslichtstrahlen mit p- bzw. n-Polarisation bereits einen Phasenversatz zueinander aufweisen. Auch diese Fälle sollen hier mit der Formulierung der um π gegenüber der ersten relativen Phase der ersten Teilstrahlen verschobenen zweiten relativen Phase der zweiten Teilstrahlen abgedeckt sein.In the new method, it is not mandatory that the second relative phase, with which the two second partial beams interfere in the focal point, be shifted by exactly 180 ° with respect to the first relative phase with which the first partial beams interfere in the focal point. There are even relatively clear deviations in the displacement of the relative phases of 180 ° possible. A shift of the relative phases of 180 ° results in each case linearly polarized input light beams or in each case circularly polarized input light beams with opposite direction of rotation of the light field. However, if, for example, a circularly polarized input light beam and a linearly polarized input light beam are combined, a second relative phase results, which is shifted by 90 ° or 270 ° relative to the first relative phase, because the portions of the input light beams entering the polarization beam splitter are p- or n-polarization already have a phase offset to each other. These cases are also here be covered with the formulation of the second relative phase of the second partial beams shifted by π with respect to the first relative phase of the first partial beams.

Es versteht sich, dass auch bei dem neuen Verfahren die Polarisationen der Teilstrahlen, die in unterschiedlichen Richtungen von dem Polarisationsstrahlteiler abgehen, noch aufeinander abgestimmt werden müssen, damit es überhaupt zu einer Interferenz im Bereich der gemeinsamen Fokalebene der Objektive kommen kann. Diese Abstimmung mit einer Lambda/2-Platte im Strahlengang zwischen den Polarisationsstrahlteiler und einem der Objektive führt bei gleichen Weglängen bis zu dem gemeinsamen Fokuspunkt zum Beispiel bei den ersten Teilstrahlen zu in dem Fokuspunkt gleichphasigen Lichtfeldern und bei den zweiten Teilstrahlen zu in dem Fokuspunkt gegenphasigen Lichtfeldern, die mit einem Weglängenunterschied von Lambda/2 gleichwirkend sind. Jeweils eine Lambda/4-Platte in beiden Strahlengängen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und beiden Objektiven führt zum Beispiel zu gegensinnigen und in dem Fokuspunkt gleichphasigen zirkular polarisierten Lichtfeldern der beiden ersten Teilstrahlen und zu gegensinnigen und in der Fokalebene gegenphasigen zirkular polarisierten Lichtfeldern der beiden zweiten Teilstrahlen, was ebenfalls gleichwirkend mit einem Weglängenunterschied von Lambda/2 ist, und damit zu dem entgegen gesetzten Interferenzverhalten in dem gemeinsamen Fokuspunkt.It is understood that even in the new method, the polarizations of the partial beams, which depart in different directions from the polarization beam splitter, still need to be coordinated so that it can even come to an interference in the common focal plane of the lenses. This matching with a lambda / 2 plate in the beam path between the polarization beam splitter and one of the lenses leads to the common focal point for the same path lengths, for example, in the first sub-beams in the focal point in-phase light fields and in the second sub-beams in the focal point in antiphase light fields which are equivalent to a path length difference of lambda / 2. In each case, a lambda / 4 plate in both beam paths between the polarization beam splitter and two lenses leads, for example, to opposite and in the focal point in-phase circularly polarized light fields of the first two partial beams and in opposite directions and in the focal plane antiphase circularly polarized light fields of the two second partial beams, which is also the same effect with a path length difference of lambda / 2, and thus to the opposite interference behavior in the common focus point.

Konkret wird bei dem neuen Verfahren die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls zumindest im Wesentlichen orthogonal zu der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls ausgerichtet. Dabei bedeutet orthogonal bei linearen Polarisierungen, dass sie senkrecht zueinander verlaufen, und bei zirkularen Polarisierungen der Eingangslichtstrahlen, dass sie gegensinnig sind. Eine Abweichung von einer exakt orthogonalen Ausrichtung der Polarisierung der Eingangslichtstrahlen kann sich dadurch ergeben, dass sowohl die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls als auch die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls so zu der strahlteilenden Ebene des Polarisationsstrahlteiler ausgerichtet wird, dass die beiden ersten Teilstrahlen und die beiden zweiten Teilstrahlen an der gemeinsamen Fokalebene jeweils gleiche Intensitäten aufweisen.Specifically, in the new method, the second polarization of the second input light beam is aligned at least substantially orthogonal to the first polarization of the first input light beam. In the case of linear polarizations, orthogonal means that they are perpendicular to one another, and in the case of circular polarizations of the input light beams, they are opposite. A deviation from an exactly orthogonal alignment of the polarization of the input light beams may result from aligning both the first polarization of the first input light beam and the second polarization of the second input light beam to the beam splitting plane of the polarization beam splitter such that the two first partial beams and the two second partial beams at the common focal plane each have the same intensities.

Wenn die Wellenfronten des ersten Eingangslichtstrahls so aberriert werden, dass sich aus Interferenz bei gleichen Phasen der beiden ersten Teilstrahlen in dem Fokuspunkt ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt ausbildet, das in der Fokalebene von Intensitätsmaxima umgeben ist, wozu eine helikal lineare Phasenrampe einsetzbar ist, weisen die Interferenzmuster beider Paare von Teilstrahlen an dem Fokuspunkt ein Intensitätsminium auf, und die Intensitätsmaxima der Interferenzmuster beider Eingangslichtstrahls schließen den Fokuspunkt von allen Raumrichtungen her ein. Dabei können der erste Eingangslichtstrahl und der zweite Eingangslichtstrahl, solange sie nicht miteinander interferieren können, identische Wellenlängen aufweisen.If the wavefronts of the first input light beam are aberrated so that an intensity minimum is formed at the focal point surrounded by interference at the same phases of the first two partial beams in the focal point, which is surrounded in the focal plane by intensity maxima, for which purpose a helically linear phase ramp can be used Interference patterns of both pairs of partial beams at the focal point on an intensity minium, and the intensity maxima of the interference pattern of both input light beam include the focal point from all spatial directions. In this case, the first input light beam and the second input light beam, as long as they can not interfere with each other, have identical wavelengths.

Überdies können die Wellenfronten des zweiten Eingangslichtstrahls so aberriert werden, dass sich aus Interferenz bei entgegen gesetzten Phasen der zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt ausbildet, das auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene von ineinander übergehenden Intensitätsmaxima 1. und 2. Ordnung umgeben ist. Auf diese Weise ist der gesamte Erfassungsbereichs eines konfokal zu dem Fokuspunkt angeordneten Detektors bis auf den Fokuspunkt selbst vollständig mit Intensität des Lichts des ersten und des zweiten Eingangslichtstrahls abdeckbar.In addition, the wavefronts of the second input light beam can be aberrated so that an intensity minimum at the focal point is formed from interference in opposite phases of the second partial beams in the common focus point, on both sides of the common focal plane of merging intensity maxima 1st and 2nd order is surrounded. In this way, the entire detection range of a confocal to the focal point detector arranged except for the focal point itself completely with intensity of the light of the first and the second input light beam can be covered.

Ein dritter Eingangslichtstrahl, der eine andere Wellenlänge als der erste Eingangslichtstrahl und der zweite Eingangslichtstrahl aufweist, kann mit demselben Polarisationsstrahlteiler in zwei dritte Teilstrahlen aufgespalten werden, wobei die beiden dritten Teilstrahlen mit denselben Objektiven in denselben gemeinsamen Fokuspunkt fokussiert werden und wobei die optischen Wellenlängen und die Polarisation der beiden dritten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler und den Objektiven so zueinander eingestellt werden, dass sich aus einer konstruktiven Interferenz der dritten Teilstrahlen in dem Fokuspunkt ein Intensitätsmaximum an dem Fokuspunkt ausbildet, das überall außerhalb des Fokuspunkts selbst durch die Intensitätsmaxima aus dem Licht des ersten und des zweiten Eingangslichtstrahls überlagert wird. Damit sind die Voraussetzungen für ein die räumliche Auflösung sowohl in lateraler als auch in axialer Richtung verbesserndes STED-, GSD- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopieverfahren gegeben. Zu dessen Umsetzung ist die Wellenlänge des dritten Eingangslichtstrahls auf eine Anregung eines Fluorophors zur Emission von Fluoreszenzlicht abzustimmen, während die Wellenlängen des ersten Eingangslichtstrahls und des zweiten Eingangslichtstrahls auf die Verhinderung von spontaner Emission von Fluoreszenzlicht durch den angeregten Fluorophor abzustimmen sind.A third input light beam having a different wavelength than the first input light beam and the second input light beam can be split with the same polarization beam splitter into two third sub-beams, the two third sub-beams are focused with the same lenses in the same common focus point and wherein the optical wavelengths and Polarization of the two third partial beams between the polarization beam splitter and the lenses are set to each other, that forms from a constructive interference of the third partial beams in the focal point, an intensity maximum at the focal point, anywhere outside the focal point itself by the intensity maxima from the light of the first and of the second input light beam is superimposed. Thus, the prerequisites for a spatial resolution in both the lateral and in the axial direction improving STED, GSD or RESOLFT fluorescence light microscopy method are given. To implement this, the wavelength of the third input light beam is to be tuned to excite a fluorophore to emit fluorescent light, while the wavelengths of the first input light beam and the second input light beam are to be tuned to prevent spontaneous emission of fluorescent light by the excited fluorophore.

Es ist aber auch möglich, das Anregungslicht nur durch eines der Objektive in den gemeinsamen Fokuspunkt zu fokussieren und den anderen dritten Teilstrahl mit einem wellenlängenselektiven optischen Element, wie beispielsweise einem Farbfilter abzublocken. Das Anregungslicht kann auch erst hinter dem Polarisationsstrahlteiler, beispielsweise über einen dichroitischen Spiegel in den Strahlengang zu einem der Objektive eingekoppelt werden.But it is also possible to focus the excitation light only through one of the lenses in the common focus point and block the other third part of the beam with a wavelength-selective optical element, such as a color filter. The excitation light can also be coupled into the beam path to one of the objectives only behind the polarization beam splitter, for example via a dichroic mirror.

Bei Anwendung des neuen Verfahrens in der Fluoreszenzlichtmikroskopie kann das aus dem Fokuspunkt kommende Fluoreszenzlicht mit einem von dort aus gesehen hinter dem Polarisationsstrahlteiler liegenden Detektor über beide Objektive registriert werden. Mit anderen Worten laufen dann Teilstrahlen von drei Eingangslichtstrahlen und des Fluoreszenzlichts durch den Polarisationsstrahlteiler und werden von diesem aufgeteilt bzw. zusammengeführt. Auch bei dem rücklaufenden Fluoreszenzlicht kann die Interferenzfähigkeit der Teilstrahlen – hier bei ihrer Zusammenführung mit dem Polarisationsstrahlteiler – genutzt werden. When using the new method in fluorescence light microscopy, the fluorescent light coming from the focal point can be registered with a detector located behind the polarization beam splitter, viewed from there, over both objectives. In other words, partial beams of three input light beams and of the fluorescent light then pass through the polarization beam splitter and are split or merged by the latter. Even with the returning fluorescent light, the interference capability of the partial beams - here in their merger with the polarization beam splitter - can be used.

Ein Detektor für das Fluoreszenzlicht kann beispielsweise aber auch hinter einem das Fluoreszenzlicht zwischen einem der Objektive und dem Polarisationsstrahlteiler auskoppelnden dichroitischen Spiegel angeordnet sein.However, a detector for the fluorescent light can also be arranged, for example, behind a dichroic mirror coupling out the fluorescent light between one of the objectives and the polarization beam splitter.

Es versteht sich, dass ein erfindungsgemäßes Verfahren auch multifokal durchgeführt werden kann, d. h. mit mehren Fokuspunkte gleichzeitig, um den Gesamtzeitaufwand für das vollständige Vermessen einer Probe entsprechend zu reduzieren. Dabei kann als Detektor ein zweidimensionales Bildsensorarray verwendet werden.It is understood that a method according to the invention can also be performed multifocal, d. H. with multiple focus points simultaneously to reduce the total time required to completely sample a sample. In this case, a two-dimensional image sensor array can be used as the detector.

Das neue Verfahren lässt sich mit weiteren in der Fluoreszenzmikroskopie bekannten Kontrastverfahren wie beispielsweise Fluorescence lifetime imaging oder FRET kombinieren. Des Weiteren ist das neue Verfahren vorteilhaft mit spektroskopischen Messmethoden wie beispielsweise Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie kombinierbar.The new method can be combined with other contrast methods known in fluorescence microscopy, such as fluorescence lifetime imaging or FRET. Furthermore, the new method can advantageously be combined with spectroscopic measurement methods such as, for example, fluorescence correlation spectroscopy.

Ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzlichtmikroskop zeichnet sich durch eine Beleuchtungseinheit mit folgenden Komponenten aus: eine erste Lichtquelle für einen ersten kohärenten Eingangslichtstrahl einer ersten Polarisation; eine zweite Lichtquelle für einen zweiten kohärenten Eingangslichtstrahl einer zweiten Polarisation, wobei die beiden Lichtquellen gemeinsame Komponenten aufweisen können; einen Polarisationsstrahlteiler, der den ersten Eingangslichtstrahl in zwei erste Teilstrahlen und den zweiten Eingangslichtstrahl in zwei zweite Strahlstrahlen aufteilt; zwei Objektive mit einer gemeinsamen Fokalebene, die jeweils einen der beiden ersten Teilstrahlen und einen der beiden zweiten Teilstrahlen in einen selben Fokuspunkt in der gemeinsamen Fokalebene fokussieren; und zwischen den Polarisationsstrahlteiler und die Objektive geschaltete optische Elemente, die die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden ersten Teilstrahlen zueinander und der beiden zweiten Teilstrahlen zueinander einstellen; wobei die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls so auf den Polarisationsstrahlteiler abgestimmt ist und die optischen Weglängen und die Polarisation der beiden ersten Teilstrahlen mit den zwischen den Polarisationsstrahlteiler und die Objektive geschalteten optischen Elementen so zueinander eingestellt sind, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase interferiert, und wobei die sich von der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls unterscheidende zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls so auf den Polarisationsstrahlteiler abgestimmt ist, dass die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer zu der ersten relativen Phase um π verschobenen zweiten relativen Phase interferieren. Es versteht sich, dass auch hier die ersten Teilstrahlen und die zweiten Teilstrahlen im Bereich der gemeinsamen Fokalebene nicht interferieren dürfen, was durch geeignete Maßnahmen zu verhindern ist.A fluorescent light microscope according to the invention is characterized by a lighting unit with the following components: a first light source for a first coherent input light beam of a first polarization; a second light source for a second coherent input light beam of a second polarization, wherein the two light sources may have common components; a polarization beam splitter dividing the first input light beam into two first partial beams and the second input light beam into two second beam beams; two objectives having a common focal plane, each of which focuses one of the two first partial beams and one of the two second partial beams into a same focal point in the common focal plane; and optical elements connected between the polarization beam splitter and the lenses, which adjust the optical path lengths and the polarizations of the two first sub-beams to each other and the two second sub-beams to each other; wherein the first polarization of the first input light beam is tuned to the polarization beam splitter and the optical path lengths and the polarization of the first two partial beams are adjusted to each other with the optical elements connected between the polarization beam splitter and the lenses, that the two first partial beams in the common focus point with interferes with a first relative phase, and wherein the second polarization of the second input light beam different from the first polarization of the first input light beam is tuned to the polarization beam splitter such that the two second partial beams in the common focal point have a second shifted by π relative to the first relative phase interfere with relative phase. It is understood that here too the first partial beams and the second partial beams in the region of the common focal plane must not interfere, which is to be prevented by suitable measures.

Zum Zusammenführen des ersten Eingangslichtstrahls und des zweiten Eingangslichtstrahls auf eine gemeinsame optische Achse vor dem sie jeweils aufteilenden Polarisationsstrahlteiler kann ein weiterer Polarisationsstrahlteiler vorgesehen sein, zu dessen inhärenten Eigenschaften es gehört, dass die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls senkrecht zu der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls ausgerichtet ist, wenn die beiden Eingangslichtstrahlen zusammengeführt sind. Dem Fachmann sind aber auch andere Weisen der Zusammenführung von Eingangslichtstrahlen bekannt.For merging the first input light beam and the second input light beam on a common optical axis in front of each dividing polarization beam splitter, a further polarization beam splitter can be provided, its inherent properties include that the second polarization of the second input light beam aligned perpendicular to the first polarization of the first input light beam is when the two input light beams are merged. However, other ways of combining input light beams are known to those skilled in the art.

Die Ausrichtung der Polarisationsrichtungen der aus dem sie zusammenführenden Polarisationsstrahlteiler austretende Teilstrahlen zu der Strahlteilerebene des sie jeweils in Teilstrahlen aufspaltenden Polarisationsstrahlteilers kann durch Drehen des zusammenführenden Strahlteilers gegenüber dem aufteilenden Strahlteiler oder durch eine geeignet ausgerichtete Lambda/2-Verzögerungsplatte erreicht werden.The alignment of the polarization directions of the beams emerging from the merging polarization beam splitter to the beam splitter plane of the polarization beam splitter splitting them into partial beams can be achieved by rotating the merging beam splitter relative to the splitting beam splitter or by a suitably aligned lambda / 2 retardation plate.

Für alle Eingangslichtstrahlen kann eine Strahlverlagerungseinrichtung vorgesehen sein, die sie relativ zur Strahlachse verkippt, um den Fokuspunkt, in den sie gemeinsam fokussiert werden, in der gemeinsamen Fokalebene der beiden Objektive zu verschieben. Auf diese Weise kann eine Probe im Bereich der Fokalebene mit dem Fokuspunkt abgescannt werden. Für ein zu diesem lateralen Abscannen zusätzliches axiales Abscannen in senkrechter Richtung zu der gemeinsamen Fokalebene der Objektive ist die Probe selbst gegenüber den Objektiven zu verschieben. Auch die laterale Relativverschiebung zwischen Probe und Fokuspunkt kann durch eine Verschiebung der Probe bewirkt werden.For all input light beams, a beam displacement device can be provided, which tilts them relative to the beam axis in order to shift the focal point, in which they are focused together, in the common focal plane of the two objectives. In this way, a sample can be scanned in the area of the focal plane with the focal point. For an additional axial scanning in the direction perpendicular to the common focal plane of the objectives for this lateral scanning, the sample itself is to be displaced with respect to the objectives. The lateral relative displacement between the sample and the focal point can also be effected by a displacement of the sample.

Bei dem neuen Fluoreszenzlichtmikroskop können die erste Lichtquelle und die zweite Lichtquelle einen gemeinsamen Laser aufweisen. Dabei ist aber eine die Interferenz des ersten Eingangslichtstrahls und des zweiten Eingangslichtstrahls verhindernde Einrichtung vorzusehen. Dazu kann die Interferenzfähigkeit der beiden Eingangslichtstrahlen trotz gleicher Wellenlänge zum Beispiel mit einem Delay in einem der Eingangslichtstrahlen, das über die Kohärenzlänge des gemeinsamen Lasers hinausgeht, beseitigt werden. Dem Fachmann sind hier auch andere Möglichkeiten der Kohärenzverhinderung bekannt.In the new fluorescent light microscope, the first light source and the second light source may have a common laser. However, one is the interference of the first input light beam and the second input light beam preventive device. For this purpose, the interference capability of the two input light beams despite the same wavelength, for example, with a delay in one of the input light beams, which goes beyond the coherence length of the common laser can be eliminated. The person skilled in the art is also aware of other possibilities for preventing coherence here.

Auch eine dritte Lichtquelle kann auf demselben gemeinsamen Laser aufbauen, wenn dieser z. B. mehrere Linien, d. h. Laserlicht unterschiedlicher Wellenlängen bereitstellt. Jedweder Laser der verschiedenen Lichtquellen kann bei dem neuen Fluoreszenzlichtmikroskop grundsätzlich ein Dauerstrichlaser sein, obwohl gepulste Laser, wie sie in der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie vielfach üblich sind, bevorzugt sein können.Also, a third light source can build on the same common laser, if this z. B. several lines, d. H. Laser light of different wavelengths provides. Any laser of the various light sources may basically be a continuous wave laser in the new fluorescent light microscope, although pulsed lasers, as are common in STED fluorescent light microscopy, may be preferred.

Weitere bevorzugte Ausführungsbeispiele des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops sind von dem bereits beschriebenen neuen Verfahren übertragbar. Hier nicht erläuterte Details des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops können bekannten Details von 4Pi-Fluoreszenzlichtmikroskopen entsprechen.Further preferred embodiments of the new fluorescent light microscope are transferable from the new method already described. Details of the new fluorescent light microscope not explained here can correspond to known details of 4Pi fluorescent light microscopes.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.Advantageous developments of the invention will become apparent from the claims, the description and the drawings. The advantages of features and of combinations of several features mentioned in the introduction to the description are merely exemplary and can come into effect alternatively or cumulatively, without the advantages having to be achieved by embodiments according to the invention. Further features are the drawings - in particular the illustrated geometries and the relative dimensions of several components to each other and their relative arrangement and operative connection - refer. The combination of features of different embodiments of the invention or of features of different claims is also possible deviating from the chosen relationships of the claims and is hereby stimulated. This also applies to those features which are shown in separate drawings or are mentioned in their description. These features can also be combined with features of different claims. Likewise, in the claims listed features for further embodiments of the invention can be omitted.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGURENBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben.The invention is explained in more detail below with reference to embodiments with reference to the accompanying drawings and described.

1 zeigt schematisch den Aufbau eines Fluoreszenzlichtmikroskops in einer ersten Ausführungsform. 1 schematically shows the structure of a fluorescent light microscope in a first embodiment.

2 illustriert die durch ein optisches Element bei einem Eingangslichtstrahl des Fluoreszenzmikroskops gemäß 1 verursachte Aberration der Wellenfronten. 2 FIG. 4 illustrates the optical element in an input light beam of the fluorescence microscope according to FIG 1 caused aberration of the wavefronts.

3 bis 7 geben die Polarisationen von Eingangslichtstrahlen und Teilstrahlen dieser Eingangslichtstrahlen an verschiedenen Positionen in dem Fluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1 wieder. Dabei sind diese Positionen in 1 markiert und die entsprechenden Markierungen in den 3 bis 7 wiederholt. 3 to 7 Indicate the polarizations of input light beams and partial beams of these input light beams at different positions in the fluorescent light microscope according to FIG 1 again. These positions are in 1 marked and the corresponding marks in the 3 to 7 repeated.

8 zeigt eine gegenüber der Ausführungsform gemäß 1 abgewandelte Ausführungsform eines Fluoreszenzlichtmikroskops. 8th shows a relation to the embodiment according to 1 modified embodiment of a fluorescent light microscope.

9 bis 14 skizzieren die sich dadurch ändernden Polarisationen an den markierten Positionen des Fluoreszenzlichtmikroskops; und 9 to 14 delineate the thereby changing polarizations at the marked positions of the fluorescent light microscope; and

15 gibt die Verteilung der Intensitäten des Lichts der verschiedenen Eingangslichtstrahlen in axialen Schnitten durch die Fokalebene wieder. 15 gives the distribution of the intensities of the light of the different input light beams in axial sections through the focal plane.

FIGURENBESCHREIBUNGDESCRIPTION OF THE FIGURES

1 skizziert den Aufbau eines Fluoreszenzlichtmikroskops 1. Dabei sind in 1 Positionen längs der Strahlengänge in dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 mit Nummern 1 bis 5 bzw. 3* bis 5* markiert. Diese Markierungen 2 sind keine Bezugszeichen, sondern auf sie wird in den 3 bis 7 Bezug genommen. Das Fluoreszenzlichtmikroskop 1 dient zum Abbilden einer mit einem Fluorophor in einer Probe 3 markierten Struktur. Dazu wird der Fluorophor mit Anregungslicht 4 bestrahlt, um ihn zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht 5 anzuregen. Das spontan emittierte Fluoreszenzlicht 5 von der Probe 3 wird mit einem Detektor 38 detektiert. Um das Volumen, aus dem das Fluoreszenzlicht 5, das mit dem Detektor 38 registriert wird, zu verkleinern, wird der Fluorophor in der Probe 3 außerhalb eines aktuell interessierenden Messpunkts mit Licht bestrahlt, das die spontane Emission von Fluoreszenzlicht verhindert. Insbesondere kann es sich dabei um Abregungslicht 6 handeln, das den Fluorophor durch stimulierte Emission wieder abregt, bevor er das Fluoreszenzlicht 5 spontan emittieren kann. Um dieses Grundprinzip umzusetzen, sind bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 drei Lichtquellen 7 bis 9 vorgesehen, die jeweils einen Laser 10 bis 12 umfassen. Dabei stellt der Laser 12 der Lichtquelle 9 das Anregungslicht 4 in Form eines Eingangslichtstrahls 15 bereit, der durch einen dichroitischen Spiegel 16 zu einer Strahlverlagerungseinrichtung 17 hin umgelenkt wird und dabei durch einen weiteren dichroitischen Spiegel 18 hindurchtritt. Der Laser 11 der Lichtquelle 8 stellt Abregungslicht 6 in Form eines Eingangslichtstrahls 14 in das Fluoreszenzlichtmikroskop 1 bereit, der über einen Spiegel 19, einen Polarisationsstrahlteiler 20 und den dichroitischen Spiegel 18 auf die Strahlverlagerungseinrichtung 17 gerichtet wird. Das Abregungslicht 6 von dem Laser 10 in Form eines weiteren Eingangslichtstrahls 13 tritt zunächst durch ein optisches Element 21 in Form einer linear helikalen Phasenrampe hindurch, die die zunächst ebenen Wellenfronten des Eingangslichtstrahls 13 um die Strahlachse herum aberriert, wie in 2 angedeutet ist. D. h., den Wellenfronten des Eingangslichtstrahls 13 wird eine um die Strahlachse herum von null auf 2π zunehmende Phasenverzögerung aufgeprägt. Dann tritt der Eingangslichtstrahl 13 durch den Polarisationsstrahlteiler 20 hindurch und wird von dem dichroitischen Spiegel 18 auf die Strahlverlagerungseinrichtung 17 gerichtet. Ab dem dichroitischen Spiegel 18 verlaufen alle Eingangsstrahlen 13 bis 15, obwohl sie hier der Übersichtlichkeit halber nebeneinander gezeichnet sind, koaxial. Von der Strahlverlagerungseinrichtung 17 werden sie gemeinsam verlagert, d. h. in der Regel gegenüber der optischen Achse des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 verkippt, um die Probe 3 lateral abzuscannen. Vor der Probe 3 treten die Eingangsstrahlen 13 bis 15 jedoch zunächst durch eine Lambda/2-Verzögerungsplatte 23 hindurch und werden dann von einem Polarisationsstrahlteiler 24 jeweils in zwei Teilstrahlen aufgeteilt, von denen einer im wesentlichen gerade durch den Polarisationsstrahlteilers 24 hindurchläuft und ein anderer von dem Polarisationsstrahlteiler 24 abgelenkt wird. Die aus dem Polarisationsstrahlteiler 24 so in zwei Richtungen austretenden Teilstrahlen der Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 werden von zwei Umlenkspiegeln 26 und 27 in zwei einander gegenüberliegende Objektive 28 und 29 gerichtet, die eine gemeinsame Fokalebene 30 aufweisen. In dieser gemeinsamen Fokalebene 30 werden die Teilstrahlen von beiden Objektiven 28 und 29 in einen selben Fokuspunkt 22 fokussiert. Dieser Fokuspunkt 22 ist mit Hilfe der Strahlverlagerungseinrichtung 17 zum Abscannen der Probe 3 in der gemeinsamen Fokalebene 30 verlagerbar. In dieser lateralen und in axialer Richtung ist die Probe mit dem Fokuspunkt 22 auch durch Verschieben der Probe gegenüber den Objektiven 28 und 29 abscannbar. Die optischen Weglängen der Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und der gemeinsamen Fokalebene 30 der Objektive 28 und 29 sowie ihre Polarisation werden dabei in einer im Folgenden noch näher erläutert werdenden Weise aufeinander abgestimmt. Zur Abstimmung der relativen Weglängen der Teilstrahlen von dem Polarisationsteilstrahler 24 bis zu der Fokalebene 30 kann einer oder können beide Umlenkspiegel 26, 27 verlagert werden, was in 1 bei dem Umlenkspiegel 27 durch einen Doppelpfeil 35 angedeutet ist. Auch der Polarisationsstrahlteiler 24 selbst kann zu diesem Zweck verschoben werden. Die Polarisationen der beiden Teilstrahlen werden hier jeweils durch eine Lambda/2-Verzögerungslatte 36 aufeinander abgestimmt, die zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und dem Umlenkspiegel 26 angeordnet ist. Alle Teilstrahlen aller Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 werden dabei in identischer Weise hinsichtlich ihrer Weglängen und Polarisationen manipuliert. Es gibt bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und den Objektiven 28 und 29 weder ein wellenlängen- noch ein polarisationsselektives optisches Element, mit dem beispielsweise gezielt unterschiedliche Weglängen für Teilstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen realisiert würden. Die Polarisations- bzw. Lichtfeldebenen werden von dem Polarisationsstrahlteiler 24 für alle reflektierten Teilstrahlen einerseits und alle transmittierten Teilstrahlen andererseits fest vorgegeben, so dass eine Selektion der Teilstrahlen der einzelnen Eingangslichtstrahlen nach unterschiedlichen Polarisationen sowieso ausscheidet. Die üblichen Dispersionen sind bei den optischen Elementen 26, 27 und 36 sowie den Objektiven 28 und 29 des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 hingegen durchaus vorhanden. Das Fluoreszenzlicht 5 von der Probe 3 gelangt hier, wenn auch in entgegen gesetzter Richtung, ebenfalls durch die Objektive 28 und 29, über die Umlenkspiegel 26 und 27 durch die Lambda/2-Platte 36, den Polarisationsstrahlteiler 24, die Lambda/2-Platte 23, die Strahlverlagerungseinrichtung 17 und dann durch die dichroitischen Spiegel 18 und 16 sowie über einen Umlenkspiegel 31 und durch eine konfokal zu dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 in der gemeinsamen Fokalebene 30 angeordnete Blende 32 in den Detektor 38. D. h. der Strahlengang zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und der Probe 3 ist für das Anregungslicht 4, das Fluoreszenzlicht 5 und beide Komponenten des Abregungslichts 6 identisch. 1 outlined the structure of a fluorescent light microscope 1 , Here are in 1 Positions along the beam paths in the fluorescent light microscope 1 marked with numbers 1 to 5 or 3 * to 5 *. These marks 2 are not reference signs, but they are in the 3 to 7 Referenced. The fluorescent light microscope 1 serves to image one with a fluorophore in a sample 3 marked structure. For this purpose, the fluorophore with excitation light 4 irradiated to him for the spontaneous emission of fluorescent light 5 to stimulate. The spontaneously emitted fluorescent light 5 from the sample 3 is with a detector 38 detected. To the volume from which the fluorescent light 5 that with the detector 38 is registered to zoom out, the fluorophore becomes in the sample 3 irradiated with light outside a currently interesting measuring point, which prevents the spontaneous emission of fluorescent light. In particular, this may be de-energizing light 6 act that de-excites the fluorophore by stimulated emission before it releases the fluorescent light 5 can emit spontaneously. In order to implement this basic principle, in the fluorescent light microscope 1 three light sources 7 to 9 each provided a laser 10 to 12 include. This is where the laser is 12 the light source 9 the excitation light 4 in the form of an input light beam 15 ready by a dichroic mirror 16 to a beam displacement device 17 down is deflected and thereby by another dichroic mirror 18 passes. The laser 11 the light source 8th provides de-energizing light 6 in the form of an input light beam 14 in the fluorescent light microscope 1 ready, over a mirror 19 , a polarization beam splitter 20 and the dichroic mirror 18 on the beam displacement device 17 is directed. The de-energizing light 6 from the laser 10 in the form of another input light beam 13 first passes through an optical element 21 in the form of a linear helical phase ramp through which the initially flat wavefronts of the input light beam 13 Aberriert around the beam axis, as in 2 is indicated. That is, the wavefronts of the input light beam 13 a phase delay increasing from zero to 2π around the beam axis is impressed. Then the input light beam occurs 13 through the polarization beam splitter 20 through and out of the dichroic mirror 18 on the beam displacement device 17 directed. From the dichroic mirror 18 all input beams pass 13 to 15 although they are drawn side by side here for the sake of clarity, coaxial. From the beam shifting device 17 they are displaced together, ie, as a rule, with respect to the optical axis of the fluorescent light microscope 1 tilted to the sample 3 to scan laterally. Before the rehearsal 3 enter the input beams 13 to 15 but first through a lambda / 2 retarder plate 23 through and then from a polarization beam splitter 24 each divided into two sub-beams, one of which is substantially straight through the polarization beam splitter 24 passes through and another from the polarization beam splitter 24 is distracted. The from the polarization beam splitter 24 so in two directions exiting partial beams of the input light beams 13 to 15 be of two deflecting mirrors 26 and 27 in two opposing lenses 28 and 29 directed, which is a common focal plane 30 exhibit. In this common focal plane 30 become the partial beams of both lenses 28 and 29 into a same focal point 22 focused. This focus point 22 is by means of the beam displacement device 17 to scan the sample 3 in the common focal plane 30 displaced. In this lateral and in the axial direction, the sample is at the focal point 22 also by moving the sample relative to the lenses 28 and 29 abscannbar. The optical path lengths of the partial beams between the polarization beam splitter 24 and the common focal plane 30 the lenses 28 and 29 as well as their polarization are tuned to one another in a manner to be explained in more detail below. For tuning the relative path lengths of the partial beams of the polarization partial radiator 24 up to the focal plane 30 can one or both deflecting mirrors 26 . 27 to be shifted in what 1 at the deflection mirror 27 by a double arrow 35 is indicated. Also the polarization beam splitter 24 itself can be moved for this purpose. The polarizations of the two partial beams are here each by a lambda / 2-delay bar 36 matched to each other, between the polarization beam splitter 24 and the deflecting mirror 26 is arranged. All sub-beams of all input beams 13 to 15 are manipulated in an identical way with respect to their path lengths and polarizations. There is the fluorescent light microscope 1 between the polarization beam splitter 24 and the lenses 28 and 29 neither a wavelength nor a polarization-selective optical element with which, for example, specifically different path lengths for partial beams of different wavelengths would be realized. The polarization or light field planes are from the polarization beam splitter 24 for all reflected partial beams on the one hand and all transmitted partial beams on the other hand firmly predetermined so that a selection of the partial beams of the individual input light beams according to different polarizations eliminated anyway. The usual dispersions are in the optical elements 26 . 27 and 36 as well as the lenses 28 and 29 of the fluorescent light microscope 1 on the other hand, definitely available. The fluorescent light 5 from the sample 3 Here, albeit in the opposite direction, also passes through the lenses 28 and 29 , about the deflection mirror 26 and 27 through the lambda / 2 plate 36 , the polarization beam splitter 24 , the lambda / 2 plate 23 , the beam displacement device 17 and then through the dichroic mirrors 18 and 16 as well as a deflection mirror 31 and by a confocal to the common focal point 22 in the common focal plane 30 arranged aperture 32 into the detector 38 , Ie. the beam path between the polarization beam splitter 24 and the sample 3 is for the excitation light 4 , the fluorescent light 5 and both components of the depletion light 6 identical.

Konkret sind bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 die optischen Weglängen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler 24 und dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 gleich. D. h., sie unterscheiden sich gar nicht oder um ein ganzzahliges Vielfaches aller beteiligten Wellenlängen. Damit sind die Voraussetzungen geschaffen, dass die Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 konstruktiv interferieren. Damit dies nicht durch unterschiedliche Polarisationen der jeweiligen Teilstrahlen verhindert wird, ist die Lambda/2-Platte 36 vorgesehen, die die Polarisationsrichtung des jeweils durchlaufenden Teilstrahls auf die Polarisationsrichtung des abgelenkten Teilstrahls dreht. Zumindest gilt dies für die Teilstrahlen, die aus dem Eingangslichtstrahl 14 ausgebildet werden, und deren Polarisationsrichtung in den folgenden 3 bis 7 jeweils mit einem gefüllten Pfeil angezeigt ist. Der Pfeil in den 3 bis 7, der nur als Umriss dargestellt ist, gibt demgegenüber die Polarisationsrichtungen der Eingangslichtstrahlen 13 und 15 bzw. deren Teilstrahlen an den mit den Markierungen 2 markierten Stellen des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 gemäß 1 wieder. Anzumerken ist in diesem Zusammenhang, dass die Eingangslichtstrahlen 13 und 14 zwar eine annähernd gleiche oder sogar identische Wellenlänge aufweisen, dass sie aber nicht zur Interferenz miteinander fähig sind. Aufgrund des Zusammenführens der Eingangslichtstrahlen 13 und 14 mit dem Polarisationsstrahlteiler 20 weisen sie zueinander senkrechte Polarisationsrichtungen auf. Die Polarisationsrichtung des Eingangslichtstrahls 15 wird durch den dichroitischen Spiegel 16, der auch linear polarisierende Eigenschaften aufweist, im vorliegenden Beispiel parallel zu der linearen Polarisierung des Eingangslichtstrahls 13 ausgerichtet. Diese Polarisationszustände gibt 3 wieder. In 3 ist wie in den 4 bis 7 und 9 bis 14 mit p die Polarisationsrichtung in der Zeichenebene gemäß 1 bzw. 8, d. h. in der Strahlteilerebene, in der der Polarisationsstrahlteiler die Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 in Teilstrahlen aufteilt, bezeichnet, während n die dazu senkrechte Polarisationsrichtung ist. In 3 ist die Ausrichtung der Lambda/2-Platte 23 angedeutet, die alle Polarisationen vor dem Polarisationsstrahlteiler 24 um 45° dreht. 4 zeigt diese gedrehten Polarisationen. Die 5 und 6 geben demgegenüber die Polarisationen der Teilstrahlen hinter dem Polarisationsstrahlteiler 24 wieder. Während die abgelenkten Teilstrahlen aller Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 jetzt in Richtung und Phase übereinstimmende Polarisationen aufweisen, sind die Polarisationen der durchlaufenden Teilstrahlen gemäß 6 zwar gleichgerichtet aber gegenphasig. In 6 ist weiterhin die Orientierung der Lambda/2-Platte 36 angedeutet, die diese Polarisationen um 90° dreht, woraus die Polarisationszustände gemäß 7 resultieren. Unter Berücksichtigung der Polarisationszustände der jeweiligen Teilstrahlen gemäß den 5 und 7 und unter Zugrundelegung gleicher Weglängen zu der gemeinsamen Fokalebene 30, interferieren die Teilstrahlen der Eingangslichtstrahlen 13 und 15 in dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 tatsächlich konstruktiv, während die Teilstrahlen der Eingangslichtstrahls 14 aufgrund entgegen gesetzter Phase in dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 destruktiv interferieren. In Kombination mit ebenen Wellenfronten des Eingangslichtstrahls 14 führt dies dazu, dass das Abregungslicht 6 des Eingangslichtstrahls 14 am jeweiligen Fokuspunkt 22 eine Nullstelle ausbildet, die auf beiden Seiten der Fokalebene 30 durch Intensitätsmaxima umgeben ist. Das Anregungslicht 4 des Eingangslichtstrahls 15 bildet hingegen sein Intensitätsmaximum erster Ordnung in dem Fokuspunkt 22 aus. Das Abregungslicht 6 des Eingangslichtstrahls 13 interferiert zwar grundsätzlich auch konstruktiv im Bereich der gemeinsamen Fokalebene 30. Die Aberration seiner Wellenfronten gemäß 2 durch das optische Element 21 führt aber dazu, dass sich dennoch im Fokuspunkt 22 selbst eine Nullstelle der Intensität ausbildet, die in der Fokalebene 30 von einem Ring maximaler Intensität umgeben ist. In der Summe grenzen die beiden Komponenten des Abregungslichts 6 in Form des Eingangslichtstrahls 13 und des Eingangslichtstrahls 14 das Volumen um den Fokuspunkt 22, in dem der Fluorophor in der Probe 3 mit dem Anregungslicht 4 effektiv zu der spontanen Emission des Fluoreszenzlichts 5 angeregt wird, sowohl axial (durch das Licht des Eingangslichtstrahls 14) als auch lateral (durch das Licht des Eingangslichtstrahls 13) ein. Hierdurch wird die Ortsauflösung des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 in allen Raumrichtungen erhöht. Das Besondere ist dabei, dass alle durchlaufenden und abgelenkten Teilstrahlen aller drei Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 dieselben optischen Wege zurücklegen und nur durch geschickte Einstellung ihrer Polarisationszustände vor dem Polarisationsstrahlteiler 24 unterschiedliche Formen der Interferenz in dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 erreicht werden. Dabei wird ausgenutzt, dass einander entgegen gesetzte Polarisationsrichtungen bei der Interferenz gleichwirkend mit um Lambda/2 unterschiedlich langen optischen Weglängen sind.Concretely, in the fluorescent light microscope 1 the optical path lengths between the polarization beam splitter 24 and the common focus point 22 equal. In other words, they do not differ at all or by an integer multiple of all wavelengths involved. This creates the conditions that the partial beams in the common focus point 22 constructively interfere. So that this is not prevented by different polarizations of the respective partial beams, the lambda / 2-plate 36 provided, which rotates the polarization direction of the respective passing partial beam to the polarization direction of the deflected partial beam. At least, this applies to the partial beams coming from the input beam 14 be formed, and their polarization direction in the following 3 to 7 each with a filled arrow is displayed. The arrow in the 3 to 7 , which is shown only as an outline, in contrast, gives the polarization directions of the input light beams 13 and 15 or their partial beams at the with the markings 2 marked areas of the fluorescent light microscope 1 according to 1 again. It should be noted in this context that the input light beams 13 and 14 Although they have an approximately identical or even identical wavelength, but they are not capable of interfering with each other. Due to the merging of the input light beams 13 and 14 with the polarization beam splitter 20 they have mutually perpendicular polarization directions. The polarization direction of the input light beam 15 is through the dichroic mirror 16 which also has linear polarizing properties, in the present example parallel to the linear polarization of the input light beam 13 aligned. These polarization states exist 3 again. In 3 is like in the 4 to 7 and 9 to 14 with p the polarization direction in the drawing plane according to 1 respectively. 8th , ie in the beam splitter plane in which the polarization beam splitter the input light beams 13 to 15 divided into sub-beams, referred to, while n is the perpendicular polarization direction. In 3 is the orientation of the lambda / 2 plate 23 indicated all the polarizations before the polarization beam splitter 24 turns 45 °. 4 shows these rotated polarizations. The 5 and 6 In contrast, the polarizations of the partial beams behind the polarization beam splitter 24 again. While the deflected partial beams of all input beams 13 to 15 now in the direction and phase have matching polarizations, the polarizations of the passing partial beams are according to 6 although rectified but in antiphase. In 6 is still the orientation of the lambda / 2 plate 36 indicated that rotates these polarizations by 90 °, from which the polarization states according to 7 result. Taking into account the polarization states of the respective partial beams in accordance with 5 and 7 and on the basis of equal path lengths to the common focal plane 30 , the partial beams of the input light beams interfere 13 and 15 in the common focus point 22 actually constructive, while the sub-beams of the input light beam 14 due to opposite phase in the common focus point 22 interfere destructively. In combination with even wavefronts of the input light beam 14 this causes the de-energizing light 6 of the input light beam 14 at the respective focal point 22 forming a null on both sides of the focal plane 30 surrounded by intensity maxima. The excitation light 4 of the input light beam 15 on the other hand, it forms its maximum intensity of the first order in the focal point 22 out. The de-energizing light 6 of the input light beam 13 Although in principle also constructively interferes in the area of the common focal plane 30 , The aberration of his wavefronts according to 2 through the optical element 21 But leads to the fact that still in the focus point 22 itself forms a zero point of intensity, that in the focal plane 30 surrounded by a ring of maximum intensity. In sum, the two components of the Abregungslicht 6 in the form of the input light beam 13 and the input light beam 14 the volume around the focal point 22 in which the fluorophore in the sample 3 with the excitation light 4 effectively to the spontaneous emission of fluorescent light 5 is excited, both axially (by the light of the input light beam 14 ) as well as laterally (by the light of the input light beam 13 ) one. As a result, the spatial resolution of the fluorescent light microscope 1 increased in all directions. The special feature is that all continuous and deflected partial beams of all three input light beams 13 to 15 cover the same optical paths and only by skillful adjustment of their polarization states in front of the polarization beam splitter 24 different forms of interference in the common focus point 22 be achieved. It is exploited that mutually opposite polarization directions in the interference are equally effective with lambda / 2 different lengths optical path lengths.

Bei der Ausführungsform des Fluoreszenzlichtmikroskops 1 gemäß 8 sind statt der Lambda/2-Verzögerungsplatte 36 zwei Lambda/4-Verzögerungsplatten 33 und 34 in den Strahlengängen sowohl der durchlaufenden als auch der abgelenkten Teilstrahlen vorgesehen. Diese führen zu einer zirkularen Polarisation der Teilstrahlen ausgehend von der zunächst identischen Polarisation wie bei dem Fluoreszenzmikroskop 1 gemäß 1 direkt nach dem Polarisationsstrahlteiler 24, wie in den 9 und 10 illustriert ist, die auch die Ausrichtungen der Lambda/4-Verzögerungsplatten 33 und 34 illustrieren. Die Drehrichtungen der resultierenden zirkularpolarisierten Teilstrahlen direkt nach den Lambda/4-Verzögerungsplatten sind in den 11 und 12 wiedergegeben. Während die Teilstrahlen 13 und 15 in gegensinnige, aber gleichphasige zirkulare Polarisationen polarisiert wurden, sind die Teilstrahlen des Eingangslichtstrahls 14 gegensinnig und gegenphasig zirkular polarisiert. Durch die Reflektion an den Umlenkspiegeln 26 und 27 dreht sich die Umlaufrichtung der zirkularen Polarisationen noch einmal in die Polarisationszustände gemäß den 13 und 14, wobei die Phasenbeziehung der zirkularen Polarisationen gleich bleibt. Dass die Teilstrahlen trotz gegenläufiger Drehrichtung ihrer zirkularen Polarisation überhaupt miteinander interferieren können, liegt an ihrer unterschiedlichen Ausbreitungsrichtung beim Auftreffen auf die gemeinsame Fokalebene 30. Weiterhin ist in 8 ein Polarisator 25 in dem Strahlengang der von dem Polarisationsstrahlteiler 24 reflektierten Teilstrahlen vorgesehen, um kleinere Anteile der Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 mit p-Polarisation, die in unerwünschter Weise von dem Polarisationsstrahlteiler 24 reflektiert werden, auszublenden. Ein solcher Polarisator 25 kann aus Symmetriegründen auch in dem Strahlengang der von dem Polarisationsstrahlteiler 24 transmittierten Teilstrahlen vorgesehen sein, obwohl sich hier keine relevanten Anteile der Eingangslichtstrahlen 13 bis 15 mit n-Polarisation finden. Mit beiden Polarisatoren 25 können zudem die relativen Intensitäten der reflektierten und transmittierten Teilstrahlen an dem gemeinsamen Fokuspunkt 22 aufeinander eingestellt werden. Derartige Polarisatoren 25 könnten aus denselben Gründen auch bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 gemäß 1 verwendet werden. Die grundsätzliche Verteilung der Intensitätsmaxima der einzelnen Lichtkomponenten um den jeweiligen Fokuspunkt 22 in der Fokalebene 30 unterscheidet sich zwischen den Fluoreszenzlichtmikroskopen der 1 und 8 nicht.In the embodiment of the fluorescent light microscope 1 according to 8th are instead of the lambda / 2 retardation plate 36 two lambda / 4 delay plates 33 and 34 provided in the beam paths of both the continuous and the deflected partial beams. These lead to a circular polarization of the partial beams starting from the initially identical polarization as in the fluorescence microscope 1 according to 1 directly after the polarization beam splitter 24 as in the 9 and 10 which also illustrates the alignments of the lambda / 4 retardation plates 33 and 34 illustrate. The directions of rotation of the resulting circularly polarized partial beams directly after the lambda / 4 retardation plates are in the 11 and 12 played. While the partial beams 13 and 15 in opposite, but in-phase circular polarizations were polarized, are the partial beams of the input light beam 14 in opposite directions and antiphase circularly polarized. By the reflection at the deflecting mirrors 26 and 27 The direction of rotation of the circular polarizations rotates once again in the polarization states according to the 13 and 14 , wherein the phase relationship of the circular polarizations remains the same. The fact that the sub-beams can interfere despite their opposite direction of rotation of their circular polarization at all, is due to their different propagation direction when hitting the common focal plane 30 , Furthermore, in 8th a polarizer 25 in the beam path of the polarization beam splitter 24 reflected partial beams provided to smaller portions of the input light beams 13 to 15 with p polarization being undesirably from the polarization beam splitter 24 be reflected, hide. Such a polarizer 25 can for reasons of symmetry also in the beam path of the polarization beam splitter 24 be provided transmitted sub-beams, although here no relevant portions of the input light beams 13 to 15 find with n-polarization. With both polarizers 25 In addition, the relative intensities of the reflected and transmitted partial beams at the common focal point 22 be adjusted to each other. Such polarizers 25 for the same reasons could also be used in the fluorescent light microscope 1 according to 1 be used. The fundamental distribution of the intensity maxima of the individual light components around the respective focal point 22 in the focal plane 30 differs between the fluorescent light microscopes of 1 and 8th Not.

Diese Verteilung der einzelnen Lichtkomponenten illustriert 15, wobei λ die Wellenlänge der jeweils interferierenden Teilstrahlen und ϕ die relative Phase der Teilstrahlen im Fokuspunkt 22 wiedergibt. Der horizontale Maßstabsbalken in 15a ist 250 nm lang. In den zweidimensionalen Schnitten der 15a bis d sind die unterschiedlichen Lichtintensitäten durch unterschiedliche Grautöne symbolisiert, wobei je dunkler desto mehr Intensität gilt. In 15e sind zwei Intensitätsprofile entlang einer vertikalen Linie durch den Fokuspunkt 22 in 15b und entlang einer horizontalen Linie durch den Fokuspunkt 22 in 15c aufgetragen. 15a zeigt die Intensitätsverteilung des Anregungslichts 4, d. h. des von den Teilstrahlen des Eingangslichtstrahls 15 gemäß 1 oder 8 ausgebildeten Interferenzmusters. Innerhalb eines Erfassungsbereichs 37 des konfokalen Detektors 38 gemäß 1 bzw. 8 finden sich dabei das Maximum erster Ordnung am Fokuspunkt 22 und die Maxima zweiter Ordnung auf beiden Seiten der Fokalebene 30. 15b zeigt die Intensitätsverteilung des Teils des Abregungslichts 6 aus dem Eingangslichtstrahl 13, dessen Wellenfronten mit dem optischen Element 21 aberriert sind. Das Interferenzmuster der Teilstrahlen des Eingangslichtstrahls 13 weist eine Nullstelle am Fokuspunkt 22 auf, die in der Fokalebene 30 von einem ringförmigen Maximum erster Ordnung umgeben ist. 15c zeigt die Intensitätsverteilung des Teils des Abregungslichts 6 aus dem Eingangslichtstrahl 14, dessen Wellenfronten hier nicht aberriert, d. h. eben sind. Das Interferenzmuster der Teilstrahlen des Eingangslichtstrahls 14 weist eine Nullstelle am Fokuspunkt 22 auf, die beiderseits der Fokalebene 30 von einem Maximum erster Ordnung begrenzt ist. 15d zeigt die Überlagerung der Intensitätsverteilungen gemäß 15b und c, bei der die deckungsgleiche Nullstelle am Fokuspunkt allseitig von Abregungslicht 6 umschlossen ist. Dabei würde die Intensitätsverteilung des Abregungslicht den Detektionsbereich 37 außerhalb des Fokuspunkts in axialer (z-)Richtung noch weiter ausfüllen, wenn die Wellenfronten des Eingangslichtstrahls 14 in an sich bekannter Weise aberriert wären, um die Maxima erster und zweiter Ordnung bei dem Interferenzmuster seiner Teilstrahlen miteinander zu verschmelzen. Die Profile gemäß 15e zeigen, dass bei geeigneter Wahl der Intensitäten der Eingangslichtstrahlen 13 und 14 der Fokuspunkt 22 sowohl lateral durch I_STED (x) als auch axial durch I_STED (z) von etwa gleich stark ansteigenden Intensitätsflanken begrenzt ist.This distribution of the individual light components is illustrated 15 , where λ is the wavelength of the respective interfering partial beams and φ the relative phase of the partial beams in the focal point 22 reproduces. The horizontal scale bar in 15a is 250 nm long. In the two-dimensional sections of the 15a to d, the different light intensities are symbolized by different shades of gray, the darker the more intensity applies. In 15e are two intensity profiles along a vertical line through the focal point 22 in 15b and along a horizontal line through the focal point 22 in 15c applied. 15a shows the intensity distribution of the excitation light 4 ie that of the sub-beams of the input light beam 15 according to 1 or 8th trained interference pattern. Within a coverage area 37 of the confocal detector 38 according to 1 respectively. 8th you will find the maximum of the first order at the focal point 22 and the second order maxima on both sides of the focal plane 30 , 15b shows the intensity distribution of the part of the depletion light 6 from the input beam 13 whose wavefronts with the optical element 21 aberrated. The interference pattern of the partial beams of the input light beam 13 has a zero at the focal point 22 on that in the focal plane 30 is surrounded by a ring-shaped maximum of the first order. 15c shows the intensity distribution of the part of the depletion light 6 from the input beam 14 whose wavefronts are not aberrated here, ie are even. The interference pattern of the partial beams of the input light beam 14 has a zero at the focal point 22 on, on both sides of the focal plane 30 is limited by a maximum of the first order. 15d shows the superimposition of the intensity distributions according to 15b and c, in which the congruent zero point at the focal point on all sides of de-excitation light 6 is enclosed. The intensity distribution of the de-excitation light would be the detection area 37 Filling out further outside of the focal point in the axial (z) direction when the wavefronts of the input light beam 14 would be aberrated in a conventional manner to merge the maxima of the first and second order in the interference pattern of its partial beams with each other. The profiles according to 15e show that with a suitable choice of the intensities of the input light beams 13 and 14 the focal point 22 is bounded laterally by I _STED (x) as well as axially by I _STED (z) of approximately equal intensity rising intensity edges.

Eine Erprobung eines Fluoreszenzlichtmikroskops mit dem in 1 skizzierten Aufbau ergab die erwartete hohe räumliche Auflösung sowohl lateral als auch axial. Konkret wurde mit vergleichsweise geringem apparativem Aufwand eine räumliche Auflösung in allen Richtungen von kleiner gleich 45 nm erreicht.A trial of a fluorescent light microscope with the in 1 Outlined construction yielded the expected high spatial resolution both lateral and axial. Concretely, a spatial resolution in all directions of less than or equal to 45 nm was achieved with comparatively low expenditure on equipment.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11

FluoreszenzlichtmikroskopFluorescent light microscope

22

Markierungmark

33

Probesample

44

Anregungslichtexcitation light

55

Fluoreszenzlichtfluorescent light

66

Abregungslichtde-excitation

77

Lichtquellelight source

88th

Lichtquellelight source

99

Lichtquellelight source

1010

Laserlaser

1111

Laserlaser

1212

Laserlaser

1313

EingangslichtstrahlInput light beam

1414

EingangslichtstrahlInput light beam

1515

EingangslichtstrahlInput light beam

1616

dichroitischer Spiegeldichroic mirror

1717

StrahlverlagerungseinrichtungBeam displacement device

1818

dichroitischer Spiegeldichroic mirror

1919

Umlenkspiegeldeflecting

2020

PolarisationsstrahlteilerPolarization beam splitter

2121

optisches Elementoptical element

2222

Fokuspunktfocus point

2323

Lambda/2-VerzögerungsplatteLambda / 2 retardation plate

2424

PolarisationsstrahlteilerPolarization beam splitter

2525

Polarisatorpolarizer

2626

Umlenkspiegeldeflecting

2727

Umlenkspiegeldeflecting

2828

Objektivlens

2929

Objektivlens

3030

gemeinsame Fokalebenecommon focal plane

3131

Umlenkspiegeldeflecting

3232

Blendecover

3333

Lambda/4-PlatteLambda / 4 plate

3434

Lambda/4-PlatteLambda / 4 plate

3535

Doppelpfeildouble arrow

3636

Lambda/2-PlatteLambda / 2 plate

3737

Detektionsbereichdetection range

3838

Detektordetector

Claims (22)

Verfahren zum Bestrahlen einer Probe mit Licht, – wobei ein erster Eingangslichtstrahl mit einem Strahlteiler in zwei erste Teilstrahlen aufgeteilt wird, – wobei die beiden ersten Teilstrahlen mit je einem Objektiv in einen selben Fokuspunkt in einer gemeinsamen Fokalebene der Objektive fokussiert werden, – wobei die optischen Weglängen der beiden ersten Teilstrahlen zwischen dem Strahlteiler und den Objektiven so zueinander eingestellt werden, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase interferieren, – wobei ein zweiter Eingangslichtstrahl mit demselben Strahlteiler in zwei zweite Teilstrahlen aufgeteilt wird, und – wobei im Bereich der gemeinsamen Fokalebene keine Interferenz der ersten Teilstrahlen mit den zweiten Teilstrahlen stattfindet, dadurch gekennzeichnet, dass als Strahlteiler ein Polarisationsstrahlteiler (24) verwendet wird, – wobei die Polarisationen der beiden ersten Teilstrahlen und die Polarisationen der beiden zweiten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler (24) und den Objektiven (28, 29) so zueinander eingestellt werden, dass im Bereich der gemeinsamen Fokalebene (30) die ersten Teilstrahlen interferieren und die zweiten Teilstrahlen interferieren, – wobei eine erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und eine sich von der ersten Polarisation unterscheidende Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so auf den Polarisationsstrahlteiler (24) abgestimmt werden, dass die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) mit einer zu der ersten relativen Phase um π verschobenen zweiten relativen Phase interferieren.A method for irradiating a sample with light, - wherein a first input light beam is split with a beam splitter into two first partial beams, - wherein the two first partial beams are focused with a lens in a same focal point in a common focal plane of the lenses, - Path lengths of the two first partial beams between the beam splitter and the lenses are set to each other such that the two first partial beams in the common focus point with a first relative phase interfere - a second input light beam is split with the same beam splitter into two second partial beams, and - in the region of the common focal plane no interference of the first partial beams with the second partial beams takes place, characterized in that a polarization beam splitter ( 24 ) - the polarizations of the two first partial beams and the polarizations of the two second partial beams between the polarization beam splitter ( 24 ) and the lenses ( 28 . 29 ) are adjusted to one another such that in the region of the common focal plane ( 30 ) the first partial beams interfere and the second partial beams interfere, - wherein a first polarization of the first input light beam ( 13 ) and a polarization of the second input light beam that differs from the first polarization ( 14 ) so on the polarization beam splitter ( 24 ) that the two second partial beams in the common focal point ( 22 ) interfere with a second relative phase shifted by π relative to the first relative phase. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers (24) ausgerichtet werden, dass der eine erste Teilstrahl und der eine zweite Teilstrahl gleichgerichtete und gleichphasige Lichtfelder aufweisen, während der andere erste Teilstrahl und der andere zweite Teilstrahl gleichgerichtete und gegenphasige Lichtfelder aufweisen.Method according to claim 1, characterized in that the first polarization of the first input light beam ( 13 ) and the second polarization of the second input light beam ( 14 ) so to the beam splitter plane of the polarization beam splitter ( 24 ), that the one first partial beam and the second partial beam have rectified and in-phase light fields, while the other first partial beam and the other second partial beam have rectified and antiphase light fields. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) orthogonal zu der ersten Polarisation des ersten Eingangsstrahls (13) ausgerichtet wird.Method according to Claim 2, characterized in that the second polarization of the second input light beam ( 14 ) orthogonal to the first polarization of the first input beam ( 13 ) is aligned. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers (24) ausgerichtet werden, dass die beiden ersten Teilstrahlen und die beiden zweiten Teilstrahlen jeweils gleiche Intensitäten aufweisen.Method according to claim 2 or 3, characterized in that the first polarization of the first input light beam ( 13 ) and the second polarization of the second input light beam ( 14 ) so to the beam splitter plane of the polarization beam splitter ( 24 ) are aligned so that the two first partial beams and the two second partial beams each have the same intensities. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenfronten des ersten Eingangslichtstrahls (13) so aberriert werden, dass sich bei gleichen Phasen der ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet, das in der gemeinsamen Fokalebene (30) von Intensitätsmaxima umgeben ist.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the wavefronts of the first input light beam ( 13 ) are aberrated so that at the same phases of the first partial beams in the common focal point ( 22 ) an intensity minimum at the focal point ( 22 ) formed in the common focal plane ( 30 ) is surrounded by intensity maxima. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich bei einander entgegen gesetzten Phasen der zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet, das auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene (30) von Intensitätsmaxima umgeben ist.A method according to claim 5, characterized in that in opposite phases of the second partial beams in the common focus point ( 22 ) an intensity minimum at the focal point ( 22 ) formed on both sides of the common focal plane ( 30 ) is surrounded by intensity maxima. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenfronten des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so aberriert werden, dass das Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene (30) von ineinander übergehenden Intensitätsmaxima 1. und 2. Ordnung umgeben ist.Method according to Claim 6, characterized in that the wavefronts of the second input light beam ( 14 ) are aberrated so that the intensity minimum at the focal point ( 22 ) on both sides of the common focal plane ( 30 ) surrounded by merging intensity maxima 1st and 2nd order. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Eingangslichtstrahl (13) und der zweite Eingangslichtstrahl (14) gleiche Wellenlängen aufweisen.Method according to claim 6 or 7, characterized in that the first input light beam ( 13 ) and the second input light beam ( 14 ) have the same wavelengths. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein dritter Eingangslichtstrahl (15), der eine andere Wellenlänge als der erste Eingangslichtstrahl und der zweite Eingangslichtstrahl aufweist, mit demselben Polarisationsstrahlteiler (24) in zwei dritte Teilstrahlen aufgeteilt wird, wobei die beiden dritten Teilstrahlen mit denselben Objektiven (28, 29) in denselben gemeinsamen Fokuspunkt (22) fokussiert werden und wobei die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden dritten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler (24) und den Objektiven (28, 29) so zueinander eingestellt werden, dass sich aus einer Interferenz der dritten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsmaximum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet.Method according to one of claims 5 to 8, characterized in that a third input light beam ( 15 ) having a different wavelength than the first input light beam and the second input light beam, with the same polarization beam splitter ( 24 ) is divided into two third sub-beams, wherein the two third sub-beams with the same lenses ( 28 . 29 ) into the same common focus point ( 22 ) and wherein the optical path lengths and the polarizations of the two third partial beams between the polarization beam splitter ( 24 ) and the lenses ( 28 . 29 ) are adjusted to one another such that an interference of the third partial beams in the common focal point ( 22 ) an intensity maximum at the focal point ( 22 ) trains. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des dritten Eingangslichtstrahls (15) auf eine Anregung eines Fluorophors zur Emission von Fluoreszenzlicht (5) abgestimmt wird, während die Wellenlängen des ersten Eingangslichtstrahls (13) und des zweiten Eingangslichtstrahls (14) auf die Verhinderung von spontaner Emission von Fluoreszenzlicht (5) durch den angeregten Fluorophor abgestimmt werden.Method according to Claim 9, characterized in that the wavelength of the third input light beam ( 15 ) upon excitation of a fluorophore to emit fluorescent light ( 5 ) while the wavelengths of the first input light beam ( 13 ) and the second input light beam ( 14 ) on the prevention of spontaneous emission of fluorescent light ( 5 ) are tuned by the excited fluorophore. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Fokuspunkt (22) kommendes Fluoreszenzlicht (5) mit einem von dort aus gesehen hinter dem Polarisationsstrahlteiler (24) liegenden Detektor (38) über beide Objektive (28, 29) registriert wird. Method according to claim 10, characterized in that from the focal point ( 22 ) coming fluorescent light ( 5 ) seen from there behind the polarization beam splitter ( 24 ) detector ( 38 ) over both lenses ( 28 . 29 ) is registered. Fluoreszenzlichtmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Bestrahlen einer Probe mit Licht aus zwei Richtungen, wobei die Beleuchtungseinheit aufweist: – eine erste Lichtquelle für einen ersten Eingangslichtstrahl; – eine zweite Lichtquelle für einen zweiten Eingangslichtstrahl; – einen Strahlteiler, der den ersten Eingangslichtstrahl in zwei erste Teilstrahlen und den zweiten Eingangslichtstrahl in zwei zweite Teilstrahlen aufteilt; – zwei Objektive mit einer gemeinsamen Fokalebene, die jeweils einen der beiden ersten Teilstrahlen in einen selben Fokuspunkt in der gemeinsamen Fokalebene fokussieren und von denen mindestens eines auch einen der beiden zweiten Teilstrahlen in denselben Fokuspunkt fokussiert; und – zwischen den Strahlteiler und die Objektive geschaltete optische Elemente, die die optischen Weglängen der beiden ersten Teilstrahlen so zueinander einstellen, dass die beiden ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt mit einer ersten relativen Phase interferieren, wobei im Bereich der gemeinsamen Fokalebene keine Interferenz der ersten Teilstrahlen mit den zweiten Teilstrahlen stattfindet, dadurch gekennzeichnet, dass als der Strahlteiler ein Polarisationsstrahlteiler (24) ist, – wobei die Polarisationen der beiden ersten Teilstrahlen und die Polarisationen der beiden zweiten Teilstrahlen zwischen dem Polarisationsstrahlteiler (24) und den Objektiven (28, 29) mit den zwischen den Polarisationsstrahlteiler (24) und die Objektive (28, 29) geschalteten optischen Elementen (26, 27 sowie 36 oder 33 sowie 34), so zueinander eingestellt sind, dass im Bereich der gemeinsamen Fokalebene (30) die ersten Teilstrahlen interferieren und die zweiten Teilstrahlen interferieren, – wobei eine erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und eine sich von der ersten Polarisation unterscheidende Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so auf den Polarisationsstrahlteiler (24) abgestimmt sind, dass die beiden zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) mit einer zu der ersten relativen Phase um π verschobenen zweiten relativen Phase interferieren.Fluorescence light microscope with a lighting unit for irradiating a sample with light from two directions, the lighting unit comprising: - a first light source for a first input light beam; A second light source for a second input light beam; A beam splitter which splits the first input light beam into two first partial beams and the second input light beam into two second partial beams; - Two lenses with a common focal plane, each focusing one of the two first partial beams in a same focal point in the common focal plane and at least one of which focuses one of the two second partial beams in the same focal point; and - optical elements connected between the beam splitters and the lenses, which adjust the optical path lengths of the two first partial beams to one another so that the two first partial beams in the common focal point interfere with a first relative phase, wherein in the region of the common focal plane no interference of the first Partial beams takes place with the second partial beams, characterized in that as the beam splitter, a polarization beam splitter ( 24 ), the polarizations of the two first partial beams and the polarizations of the two second partial beams between the polarization beam splitter ( 24 ) and the lenses ( 28 . 29 ) with the between the polarization beam splitter ( 24 ) and the lenses ( 28 . 29 ) switched optical elements ( 26 . 27 such as 36 or 33 such as 34 ) are set to one another in such a way that in the region of the common focal plane ( 30 ) the first partial beams interfere and the second partial beams interfere, - wherein a first polarization of the first input light beam ( 13 ) and a polarization of the second input light beam that differs from the first polarization ( 14 ) so on the polarization beam splitter ( 24 ) that the two second partial beams in the common focal point ( 22 ) interfere with a second relative phase shifted by π relative to the first relative phase. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers (24) ausgerichtet sind, dass der eine erste Teilstrahl und der eine zweite Teilstrahl gleichgerichtete und gleichphasige Lichtfelder aufweisen, während der andere erste Teilstrahl und der andere zweite Teilstrahl gleichgerichtete und gegenphasige Lichtfelder aufweisen.Fluorescence light microscope according to claim 12, characterized in that the first polarization of the first input light beam ( 13 ) and the second polarization of the second input light beam ( 14 ) so to the beam splitter plane of the polarization beam splitter ( 24 ), in that the first partial beam and the second partial beam have rectified and in-phase light fields, while the other first partial beam and the other second partial beam have rectified and antiphase light fields. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiterer Polarisationsstrahlteiler (20) vorgesehen ist, der den ersten Eingangslichtstrahl (13) und den zweiten Eingangslichtstrahl (14) vor dem diese aufteilenden Polarisationsstrahlteiler (24) zusammenführt, so dass die zweite Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) orthogonal zu der ersten Polarisation des ersten Eingangsstrahls (13) ausgerichtet ist.Fluorescence light microscope according to claim 13, characterized in that a further polarization beam splitter ( 20 ) is provided, the first input light beam ( 13 ) and the second input light beam ( 14 ) in front of the dividing polarization beam splitter ( 24 ), so that the second polarization of the second input light beam ( 14 ) orthogonal to the first polarization of the first input beam ( 13 ) is aligned. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausrichtung der ersten Polarisation des ersten Eingangslichtstrahls (13) und der zweiten Polarisation des zweiten Eingangslichtstrahls (14) so zu der Strahlteilerebene des Polarisationsstrahlteilers (24) einstellbar sind, dass die beiden ersten Teilstrahlen und die beiden zweiten Teilstrahlen jeweils gleiche Intensitäten aufweisen.Fluorescence light microscope according to claim 13 or 14, characterized in that the orientation of the first polarization of the first input light beam ( 13 ) and the second polarization of the second input light beam ( 14 ) so to the beam splitter plane of the polarization beam splitter ( 24 ) are adjustable, that the two first partial beams and the two second partial beams each have the same intensities. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die erste relative Phase der ersten Teilstrahlen auf null eingestellt ist und dass in dem ersten Eingangslichtstrahl (13) ein dessen Wellenfronten derart aberrierendes optisches Element (21) angeordnet ist, dass sich aus der Interferenz der ersten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet, das in der gemeinsamen Fokalebene (30) von Intensitätsmaxima umgeben ist.Fluorescence light microscope according to one of claims 12 to 15, characterized in that the first relative phase of the first partial beams is set to zero and that in the first input light beam ( 13 ) a wavefront thus aberrating optical element ( 21 ) is arranged, that from the interference of the first partial beams in the common focal point ( 22 ) an intensity minimum at the focal point ( 22 ) formed in the common focal plane ( 30 ) is surrounded by intensity maxima. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sich aus der Interferenz der zweiten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet, das auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene (30) von Intensitätsmaxima umgeben ist.Fluorescence light microscope according to claim 16, characterized in that from the interference of the second partial beams in the common focal point ( 22 ) an intensity minimum at the focal point ( 22 ) formed on both sides of the common focal plane ( 30 ) is surrounded by intensity maxima. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass in dem zweiten Eingangslichtstrahl (14) ein dessen Wellenfronten derart aberrierendes optisches Element angeordnet ist, dass das Intensitätsminimum an dem Fokuspunkt (22) auf beiden Seiten der gemeinsamen Fokalebene (30) von ineinander übergehenden Intensitätsmaxima erster und zweiter Ordnung umgeben ist.Fluorescence light microscope according to claim 17, characterized in that in the second input light beam ( 14 ) whose wavefront is so aberrant optical element is arranged, that the intensity minimum at the focal point ( 22 ) on both sides of the common focal plane ( 30 ) is surrounded by mutually merging intensity maxima of first and second order. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Lichtquelle (7) und die zweite Lichtquelle (8) einen gemeinsamen Laser aufweisen, wobei eine die wechselseitige Kohärenz des ersten Eingangslichtstrahls (13) und des zweiten Eingangslichtstrahls (14) verhindernde Einrichtung vorgesehen ist.Fluorescence light microscope according to claim 17 or 18, characterized in that the first light source ( 7 ) and the second light source ( 8th ) have a common laser, wherein one of the mutual coherence of the first input light beam ( 13 ) and the second input light beam ( 14 ) preventing device is provided. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine dritte Lichtquelle (9) für einen dritten kohärenten Eingangslichtstrahl (15) vorgesehen ist, der ebene Wellenfronten und eine andere Wellenlänge als der erste Eingangslichtstrahl (13) und der zweite Eingangslichtstrahl (14) aufweist und den derselbe Polarisationsstrahlteiler (24) in zwei dritte Teilstrahlen aufteilt, wobei die beiden dritten Teilstrahlen von denselben Objektiven (18, 29) in denselben gemeinsamen Fokuspunkt (22) fokussiert werden und wobei die optischen Weglängen und die Polarisationen der beiden dritten Teilstrahlen von den zwischen den Polarisationsstrahlteiler (24) und die Objektive (28, 29) geschalteten optischen Elementen (26, 27, 36) zueinander eingestellt werden, so dass sich aus der Interferenz der dritten Teilstrahlen in dem gemeinsamen Fokuspunkt (22) ein Intensitätsmaximum an dem Fokuspunkt (22) ausbildet.Fluorescence light microscope according to one of Claims 16 to 19, characterized in that a third light source ( 9 ) for a third coherent input light beam ( 15 ), the plane wavefronts and a different wavelength than the first input light beam ( 13 ) and the second input light beam ( 14 ) and the same polarization beam splitter ( 24 ) divided into two third partial beams, wherein the two third partial beams of the same lenses ( 18 . 29 ) into the same common focus point ( 22 ) and wherein the optical path lengths and the polarizations of the two third partial beams of the between the polarization beam splitter ( 24 ) and the lenses ( 28 . 29 ) switched optical elements ( 26 . 27 . 36 ) are adjusted to each other, so that from the interference of the third partial beams in the common focal point ( 22 ) an intensity maximum at the focal point ( 22 ) trains. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein von dem Fokuspunkt (22) aus gesehen hinter dem Polarisationsstrahlteiler (24) liegender Detektor (38) aus dem Fokuspunkt (22) über beide Objektive und die zwischen den Polarisationsstrahlteiler (24) und die Objektive (28) geschalteten optischen Elemente (26, 27, 36) kommendes Licht (5) einer bestimmten Wellenlänge registriert.Fluorescence light microscope according to claim 20, characterized in that one of the focal point ( 22 ) seen behind the polarization beam splitter ( 24 ) lying detector ( 38 ) from the focal point ( 22 ) over both lenses and between the polarization beamsplitter ( 24 ) and the lenses ( 28 ) switched optical elements ( 26 . 27 . 36 ) coming light ( 5 ) of a certain wavelength. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Strahlverlagerungseinrichtung (17) vorgesehen ist, die alle Eingangslichtstrahlen (13–15) gemeinsam verlagert, um den gemeinsamen Fokuspunkt (22) in der gemeinsamen Fokalebene (30) zu verschieben.Fluorescence light microscope according to one of claims 16 to 21, characterized in that a beam displacement device ( 17 ) is provided, all the input light beams ( 13 - 15 ) in order to define the common focal point ( 22 ) in the common focal plane ( 30 ) to move.

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