DE102007061929A1 - Modified polypeptide capable of lysing bacterial cell walls, useful as a medicament or diagnostic agent, has amino acid substitutions at protease cleavage sites that inhibit degradation by proteases - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Polypeptid mit der biologischen Aktivität Zellwände von Bakterien zu lysieren, wobei das Polypeptid keine Caspase-, Enterokinase-, Faktor Xa, Granzyme B, Staphylococcus Peptidase I (V8 Protease) und/oder Thrombinschnittstelle aufweist. Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuren mit einer Sequenz codierend für die erfindungsgemäßen Polypeptide.The The present invention relates to a modified polypeptide having biological activity cell walls of bacteria lysing the polypeptide without caspase, enterokinase, Factor Xa, Granzyme B, Staphylococcal Peptidase I (V8 Protease) and / or thrombin interface. The invention relates furthermore nucleic acids having a sequence coding for the polypeptides of the invention.
Pathogene Bakterien treten an vielen Stellen auf und verursachen enorme gesundheitliche Probleme durch Infektionen sowie hohe wirtschaftliche Kosten z. B. auch durch unerwünschten Bakterienbefall in der Nahrungsmittel-, Kosmetik- oder Umweltindustrie. Im Gesundheitswesen nehmen die Probleme aufgrund Antibiotika-resistenter Keime immer mehr zu, so dass händeringend nach Alternativen zu Antibiotika gesucht wird. In der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie wird zunehmend versucht, ohne die klassischen Konservierungsmittel auszukommen, die in der Bevölkerung immer weniger Akzeptanz finden. Als Lösung für diese Probleme bietet sich der Einsatz von Zellwand lysierenden Enzymen an, die auf natürliche Weise das Wachstum der unerwünschten Bakterien unterbinden und vorhandene Keime abtöten.pathogens Bacteria occur in many places and cause enormous health Problems caused by infections and high economic costs z. B. also by unwanted bacterial contamination in the food, Cosmetic or environmental industry. In healthcare, the problems take due to antibiotic-resistant germs becoming more and more, so much needed looking for alternatives to antibiotics. In the food and cosmetics industry is increasingly trying without the classic Preservatives get along in the population less and less accepted. As a solution for These problems are the use of cell wall lysierenden Enzymes that naturally increase the growth of the unwanted Prevent bacteria and kill existing germs.
Beispiele von Zellwand lysierenden Enzymen sind Endolysine, die aus Bakteriophagen, isoliert wurden. Bakteriophagen benutzen diese Enzyme am Ende ihres Vermehrungszyklus, um die innerhalb der Bakterienzelle gebildeten Bakteriophagen freizusetzen. Die Bakterienhülle wird dabei lysiert und das Wirtsbakterium auf diese Weise zerstört.Examples cell wall lysing enzymes are endolysins derived from bacteriophages, were isolated. Bacteriophages use these enzymes at the end of their life cycle Propagation cycle to those formed within the bacterial cell Release bacteriophages. The bacterial envelope is included lysed and destroyed the host bacterium in this way.
Ein weiteres Beispiel sind Enzyme, die der Bakteriophage am Anfang seines Vermehrungzyklus benötigt und in der Regel in Bakteriophagenschwanzproteinen lokalisiert sind. Diese Enzyme werden für den Aufbruch der Bakterienwand bei der Bakterieninfektion benötigt.One Another example are enzymes that the bacteriophage at the beginning of his Multiplication cycle is needed and usually in bacteriophage tail proteins are localized. These enzymes are for the departure the bacterial wall in the bacterial infection needed.
Ein drittes Beispiel sind Enzyme, die eine ähnliche Funktion und häufig auch eine sequenzielle Ähnlichkeit zu den Endolysinen aufweisen. Diese Enzyme sind die von Bakterien unter bestimmten Umständen gebildeten Autolysine, die zur Selbstlyse der Bakterien führen.One third example are enzymes that have a similar function and often a sequential similarity to the endolysins. These enzymes are those of bacteria autolysins formed in certain circumstances and used to Self-lysis of the bacteria lead.
Ein viertes Beispiel sind Enzyme, die ebenfalls von Bakterien gebildet werden und als Bakteriocine bekannt sind. Diese vier Gruppen von Zellwand lysierenden Enzyme werden bereits technisch eingesetzt und in Zukunft wohl noch an Bedeutung gewinnen. Ein Hauptanwendungsgebiet ist der medizinische Einsatz in der Prävention und Therapie, aber auch die Diagnostik von Bakterieninfektionen bei Mensch und Tier. Ein weiteres Feld ist die Anwendung in der Lebensmittel-, Umwelt- und Kosmetikindustrie zur Verhinderung eines unerwünschten Bakterienwachstums und zur Abtötung der Keime beispielsweise durch Desinfektion sowie der Bakteriennachweis.One Fourth example are enzymes that are also formed by bacteria and are known as bacteriocins. These four groups of Cell wall lysing enzymes are already used technically and in the future probably still gain in importance. A main application area is the medical use in prevention and therapy, but also the diagnosis of bacterial infections in humans and Animal. Another field is the application in the food, Environmental and cosmetics industry to prevent an undesirable Bacterial growth and to kill the germs, for example by disinfection and bacteria detection.
Praktisch
alle Anwendungen der Bakterien lysierenden Enzyme stellen hohe Anforderungen
an die Stabilität der eingesetzten Enzyme, damit sich ihr
Einsatz wirtschaftlich lohnt. In der
Generell wird die Wirksamkeit von Proteinen häufig durch vorhandene Proteasen verringert. Generelle Strategien zur Erhöhung der Proteaseresistenz sind z. B. der Zusatz von Metallchelatoren, um Proteasen zu hemmen, die für ihre Aktivität Metallionen benötigen oder der Zusatz von speziellen Proteaseinhibitoren, wie sie zum Beispiel für Serinproteasen kommerziell erhältlich sind. Proteaseinhibitoren können zur Stabilität von Zellwand lysierenden Enzymen jedoch nur bedingt eingesetzt werden, weil sie auch andere essentielle Komponenten am Wirkort stören. Darüber hinaus sind spezifische Inhibitoren auch sehr teuer. Auch die Auswahl anderer Umgebungsbedingungen, in denen Proteasen weniger aktiv sind, ist in der Regel nicht möglich, da die Zellwand lysierenden Enzyme ganz ähnliche Bedingungen für ihre Aktivität brauchen wie die Proteasen. So arbeiten Zellwand lysierende Enzyme in einer wässrigen Umgebung und unter moderaten pH-Werten am besten, unter denen auch die Proteaseaktivität am größten ist. Die bekannten Stabilisierungsansätze sind für den Einsatz bei Zellwand lysierenden Enzymen nicht geeignet.As a general rule The effectiveness of proteins is often due to existing Proteases reduced. General strategies to increase the protease resistance are z. The addition of metal chelators, to inhibit proteases responsible for their activity Metal ions or the addition of special protease inhibitors, as commercially available, for example, for serine proteases are. Protease inhibitors may contribute to stability However, cell enzymes can only be used conditionally by cell wall lysing enzymes. because they also disturb other essential components at the site of action. In addition, specific inhibitors are also very expensive. Also, the selection of other environmental conditions in which proteases less active, is usually not possible because the cell wall lysing enzymes quite similar conditions for their activity need like the proteases. This is how cell wall lysing enzymes work in an aqueous environment Environment and under moderate pH values best, among which the protease activity is greatest. The known stabilization approaches are for not suitable for use in cell wall lysing enzymes.
Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, stabile Zellwand lysierende Enzyme zur Verfügung zu stellen.Therefore The present invention is based on the object, stable To provide cell wall lysing enzymes.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.The Task is defined by the in the claims Object solved.
Die nachfolgenden Abbildungen dienen der Erläuterung der Erfindung.The The following figures serve to explain the invention.
Der Begriff „Polypeptid" oder „Protein" wie hier verwendet bezeichnet Peptide aus mindestens 8 Aminosäuren. Die Polypeptide können pharmakologisch oder immunologisch aktive Polypeptide oder für diagnostische Zwecke verwendete Polypeptide sein. bezeichnet ein Molekül mit einer Aneinanderreihung von mehr als 8 Aminosäuren.Of the The term "polypeptide" or "protein" as used herein denotes peptides of at least 8 amino acids. The polypeptides may be pharmacologically or immunologically active polypeptides or polypeptides used for diagnostic purposes. denotes a molecule with a juxtaposition of more than 8 amino acids.
Der Begriff „Zellwand lysierende Enzyme" wie hier verwendet bezeichnet Enzyme, die in der Lage sind, bakterielle Zellhüllen zumindest teilweise aufzubrechen oder so zu beschädigen, dass in der Folge eine Zelllyse oder zumindest ein bakteriostatischer Effekt auftritt. Insbesondere bezeichnet der Begriff Endolysine, Autolysine, Bakteriophagenschwanzproteine und Bakteriocine.Of the Term "cell wall lysing enzymes" as used herein refers to enzymes that are capable of bacterial cell envelopes at least partially break up or damage so that in the consequence a cell lysis or at least a bacteriostatic Effect occurs. In particular, the term endolysins, autolysins, Bacteriophage tail proteins and bacteriocins.
Der Begriff „Endolysin" wie hier verwendet bezeichnet Enzyme, die natürlicherweise von Bakteriophagen kodiert werden und die diese am Ende ihres Wirtszyklus herstellen, um die Wirtszelle zu lysieren und damit die Nachkommen freizusetzen. Endolysine sind aus mindestens einer enzymatisch aktiven Domäne (BAD) und einer nicht enzymatisch aktiven zellbindenden Domäne (CBD) aufgebaut. Die EADs können verschiedene Enzymaktivitäten aufweisen: N-Acetyl-Muramoyl-L-Alanin-Amidase (Amidase, z. B. Ami_2, Ami_5), (Endo)-Peptidase (z. B. CHAP), Transglykosylase, Glykosylhydrolase, (N-Acetyl)-Muramidase (Lysozyme), N-Acetyl-Glukosaminidase.Of the Term "endolysin" as used herein refers to enzymes, which are naturally encoded by bacteriophages and make these at the end of their host cycle to the host cell to lysieren and thus release the offspring. Endolysins are from at least one enzymatically active domain (BAD) and a Non-Enzymatically Active Cell-Binding Domain (CBD) built up. The EADs can have different enzyme activities N-acetyl-muramoyl-L-alanine amidase (amidase, eg Ami_2, Ami_5), (endo) -peptidase (eg CHAP), transglycosylase, glycosylhydrolase, (N-acetyl) -mutamidase (lysozyme), N-acetyl-glucosaminidase.
Der Begriff „Autolysin" wie hier verwendet bezeichnet bakterielle Peptidoglykanhydrolasen, die in bestimmten Situationen zu einer Selbstlyse der Bakterien führen. Funktionell und auch sequenziell sind Autolysine und Endolysine häufig verwandt. Verschiedene Domänen aus Endolysinen und Autolysinen können häufig modular kombiniert werden und bilden zum Teil funktionelle Chimären.Of the Term "autolysin" as used herein refers to bacterial Peptidoglycanhydrolases, which in certain situations to a Self-lysis of the bacteria lead. Functional and sequential Autolysins and endolysins are often related. Various Domains of endolysins and autolysins can often combined in a modular way and partly functional Chimeras.
Der Begriff „Bakteriophagenschwanzprotein" wie hier verwendet bezeichnet Phagenstrukturproteine, die am Anfang des Replikationszyklus des Bakteriophagen bei der Infektion die Funktion erfüllen, an Rezeptoren auf der Bakterienoberfläche zu binden und dabei über ihre enzymatische Funktion Komponenten der Zelloberfläche lysieren. Die entsprechenden Bakteriophagenproteine müssen nicht immer im Phagenschwanz lokalisiert sein, sondern können bei schwanzlosen Phagen auch direkt am Phagenkopf sitzen.Of the Term "bacteriophage tail protein" as used herein refers to phage structure proteins at the beginning of the replication cycle of the bacteriophage at the infection fulfill the function to bind to receptors on the bacterial surface and thereby via their enzymatic function components of the cell surface lyse. The corresponding bacteriophage proteins must not always localized in phage tail but can in brushless phages also sit directly on the phage head.
Der Begriff „Bakteriocin" wie hier verwendet bezeichnet proteinogene Toxine, die von Bakterien abgesondert werden, um das Größenwachstum ähnlicher Bakteriengattungen zu inhibieren. Sie bestehen aus einer Zellwand bindenden Domäne, einer Translokationsdomäne und aus dem „killing factor". Die in diesem Zusammenhang enthaltene Gruppe der Bakteriocine greift dabei bakterielle Membranen an. Beispiele sind Colicin, Microcin, Nisin, Epidermin und Lantibiotika (lanthioninhaltige Antibiotika).Of the Term "bacteriocin" as used herein refers to proteinogenic Toxins secreted by bacteria are more similar to the size growth To inhibit bacterial genera. They consist of a cell wall binding domain, a translocation domain and from the "killing factor." The included in this context Group of bacteriocins attack bacterial membranes. Examples are Colicin, Microcin, Nisin, Epidermin and Lantibiotika (lanthioninhaltige Antibiotics).
Der Begriff bakterielle „Zellwand" wie hier verwendet bezeichnet alle Komponenten, die die äußere Zellhülle der Bakterien aufbauen und so deren Unversehrtheit garantieren. Insbesondere ist darunter zu verstehen das Peptidoglykan, die äußere Membran der gram-negativen Bakterien mit dem Lipopolysaccharid, die Bakterienzellmembran, aber auch zusätzliche auf das Peptidoglykan aufgelagerte Schichten wie Kapseln, Schleime oder äußere Proteinschichten.Of the Term bacterial "cell wall" as used herein all the components that make up the outer cell shell build up the bacteria and thus guarantee their integrity. In particular, it is understood to mean the peptidoglycan, the outer one Membrane of Gram-negative bacteria with the lipopolysaccharide, the bacterial cell membrane, but also additional to that Peptidoglycan deposited layers such as capsules, mucus or outer Protein layers.
Der Begriff „Protease" wie hier verwendet bezeichnet ein Enzym, das in der Lage ist, Proteine und/oder Peptide hydrolytisch zu spalten.Of the Term "protease" as used herein refers to an enzyme which is capable of hydrolytically cleaving proteins and / or peptides.
Der
Begriff „Domäne" wie hier verwendet bezeichnet
einen Teilbereich einer Proteinsequenz, der entweder funktionell
und/oder strukturell definiert ist. Domänen können
aufgrund von Homologien häufig sehr gut über entsprechende
Suchprogramme vorhergesagt werden, die sich auf entsprechende Datenbanken
mit konservierten Domänen stützen (z. B. Conserved
Domgin Database (CDD) an der NCBI (
Der Begriff „Wildtyp" wie hier verwendet bezeichnet die Proteinsequenz, die noch bestimmte Proteaseschnittstellen beinhaltet. Es kann sich dabei um Proteinsequenzen handeln so wie sie natürlicherweise in einem Bakteriophagen, Prophagen oder Bakterium vorkommen. Zusätzlich bezeichnet der Begriff alle in den Datenbanken vorkommenden Sequenzen von Zellwand lysierenden Enzymen, die noch bestimmte Proteaseschnittstellen enthalten, auch wenn die Sequenzen bereits gegenüber natürlich vorkommenden Proteinen verändert wurden.Of the Term "wild type" as used herein refers to the protein sequence, which still contains certain protease interfaces. It may be protein sequences are as they are naturally occur in a bacteriophage, prophage or bacterium. additionally the term refers to all sequences occurring in the databases of cell wall lysing enzymes that still have specific protease cleavage sites even though the sequences are already opposite of course occurring proteins were changed.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Polypeptid mit der biologischen Aktivität Zellwände von Bakterien zu lysieren, wobei das Polypeptid keine Caspase-, Enterokinase-, Faktor Xa, Granzyme B, Staphylococcus Peptidase I (V8 Protease) oder Thrombinschnittstelle enthält. Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße modifizierte Polypeptide, die gram positive Bakterien lysieren, wobei die Bakterien aus der Gruppe bestehend aus Clostridien, Bazillen, Listerien, Staphylokokken, Lactobazillen, Enterokokken, Aerokokken, Pediokokken, Streptokokken, Mycoplasmen und/oder Leuconostoc stammen können. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polypeptid ein Endolysin, ein Bakteriophagenschwanzprotein, ein Autolysin oder ein Bakteriocin.The The present invention relates to a modified polypeptide having biological activity cell walls of bacteria lysing the polypeptide without caspase, enterokinase, Factor Xa, Granzyme B, Staphylococcal Peptidase I (V8 Protease) or thrombin interface. Preferably the present invention modified according to the invention Polypeptides that lyse gram positive bacteria, the bacteria from the group consisting of clostridia, bacilli, listeria, staphylococci, Lactobacilli, enterococci, aerococci, pediococci, streptococci, Mycoplasma and / or Leuconostoc. Preferably if the polypeptide according to the invention is an endolysin, a bacteriophage tail protein, an autolysin or a bacteriocin.
Überraschenderweise
stellte sich heraus, dass die Zellwand lysierenden Enzyme in ihrer
Aminosäuresequenz so verändert werden können,
dass eine erhöhte Proteasestabilität erreicht
werden kann, ohne dass man stabilisierende Substanzen zusetzen muss.
Es ist allgemein bekannt, dass verschiedene Proteasen an einer bestimmten
Aminosäure die Polypeptidkette schneiden oder Aminosäuresequenzmotive
für ihre enzymatische Aktivität benötigen.
Proteaseschnittstellen in Proteinen können bei vorhandener
Aminosäuresequenz mit geeigneten Sequenzanalyseprogrammen
vorausgesagt werden (z. B. ExPASy PeptideCutter,
Überraschenderweise zeigte sich jedoch, dass die Schnittstellen und Aminosäuresequenzmotive für die Proteasen in geringer Anzahl, häufig sogar in singulärer Form in den Zellwand lysierenden Enzymen vorhanden sind. Dadurch ist eine Modifikation einiger weniger oder sogar nur einer Proteaseschnittstelle ausreichend, um die Stabilität der Zellwand lysierenden Enzyme zu erhöhen.Surprisingly However, it turned out that the interfaces and amino acid sequence motifs for the proteases in small numbers, often even in singular form in the cell wall lysing enzymes available. This is a modification of a few or even only one protease interface sufficient to maintain stability increase the cell wall lysing enzymes.
In der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise nur solche Proteaseschnittstellen verändert, die von bestimmten, potentiell am Wirkort der Zellwand lysierenden Enzyme vorhandenen Proteasen erkannt werden. Dabei werden die Aminosäuresequenzen der Zellwand lysierenden Enzyme so modifiziert, dass sie von den spezifischen Proteasen nicht mehr erkannt und folglich nicht mehr geschnitten werden. Das führt zu einer erhöhten Stabilität der Zellwand lysierenden Enzyme gegen am Wirkort vorhandene Proteasen. Somit wird ein proteasebedingter Verlust der Aktivität der Zellwand lysierenden Enzyme verhindert und eine längere Wirksamkeit erzielt.In Preferably, only such protease cleavage sites will be used in the present invention changed by certain, potentially at the site of action of Cell wall lysing enzymes are recognized by existing proteases. The amino acid sequences of the cell wall become lysing Enzymes so modified that they are not specific to the specific proteases be recognized more and therefore no longer be cut. Leading lysing to increased stability of the cell wall Enzymes against proteases present at the site of action. Thus becomes a proteasebedingter Loss of activity of the cell wall lysing enzymes prevented and achieved a longer effectiveness.
Es
gibt eine Reihe von Proteasen, die für ihre enzymatische
Aktivität eine spezifische Erkennungssequenz in ihren Substratproteinen
benötigen. Einige Beispiele dafür sind in der
folgenden Tabelle aufgeführt. P1 bezeichnet die Position
der Aminosäure, nach der geschnitten wird, P4, P3 und P2
sind die Positionen N-terminal vor der Schnittstelle P1. Die Bezeichnung
P1' und P2' sind die Positionen C-terminal im Anschluss an P1. Das
bedeutet, dass die Proteasen die Polypeptidkette zwischen P1 und
P1' spalten. Die anstelle der Aminosäurereste aufgeführten
Großbuchstaben stellen die international verwendeten Bezeichnungen
der Aminosäurereste dar und sind allgemein bekannt. Werden
in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung die Großbuchstaben
verwendet, sind die entsprechenden Aminosäurerest gemeint. Tabelle 1
Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung ein modifiziertes Polypeptid mit der biologischen Aktivität Zellwände von Bakterien zu lysieren, wobei das erfindungsgemäße Polypeptid gegenüber der natürlicherweise vorkommenden eine oder mehrere Modifikationen in seiner Aminosäuresequenz an einer oder mehreren der in Tabelle 1 aufgezeigten Positionen aufweist, wobei die eine Modifikation oder die mehreren Modifikationen an den in Tabelle 1 aufgeführten Aminosäuren vorkommen. Dadurch erhöht sich die Stabilität des Polypeptids gegenüber der oder den Proteasen, deren Erkennungssequenz entsprechend geändert wurde.Preferably For example, the present invention relates to a modified polypeptide with the biological activity cell walls of bacteria to lyse, wherein the polypeptide of the invention towards the naturally occurring one or several modifications in its amino acid sequence at one or more of the positions shown in Table 1 wherein the one or more modifications occur on the amino acids listed in Table 1. This increases the stability of the polypeptide towards the protease (s), their recognition sequence was changed accordingly.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Aminosäure an der Position, nach der geschnitten wird (P1) durch eine andere geeignete Aminosäure ersetzt, so dass das erfindungsgemäße Polypeptid nicht mehr von der Protease geschnitten wird, dessen Erkennungsstelle entsprechend modifiziert wurde. Statt eines Aminosäureaustausches an Position P1 oder auch zusätzlich zu einem Austausch an Position P1 können weitere Aminosäurepositionen in der Erkennungsstelle vorzugsweise die in Tabelle 1 aufgeführten Positonen an P4, P3, P2, P1' und/oder P2', durch andere Aminosäuren ausgetauscht werden. Vorzugsweise werden pro Erkennungsstelle 6, 5, 4, 3, 2, 1 Sustitutionen vorgenommen, besonders bevorzugt insbesondere 1 bis 3 Substitutionen.In a preferred embodiment of the present invention, the amino acid at the position to be cut (P1) is replaced by another suitable amino acid so that the polypeptide according to the invention is no longer cut by the protease whose recognition site has been correspondingly modified. Instead of an amino acid exchange at position P1 or in addition to an exchange At position P1, further amino acid positions in the recognition site, preferably the positions listed in Table 1 at P4, P3, P2, P1 'and / or P2', can be exchanged for other amino acids. Preferably, 6, 5, 4, 3, 2, 1 institutions are made per recognition site, more preferably in particular 1 to 3 substitutions.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können in einem Polypeptid eine oder mehrere Proteaseschnittstellen wie zuvor beschrieben modifiziert werden.In another embodiment of the present invention may have one or more protease cleavage sites in a polypeptide modified as described above.
Wichtig ist, dass die erfindungsgemäße Proteinvariante nach der Mutation nicht nur eine höhere Proteaseresistenz aufweist, sondern auch weiterhin ihre Zellwand lysierende Aktivität behält. Die Aminosäuresubstitution wird daher wie nachfolgend beschrieben durchgeführt.Important is that the protein variant of the invention after the mutation not only a higher protease resistance but also continues its cell wall lysing activity reserves. The amino acid substitution therefore becomes as described below.
Im
Stand der Technik sind eine Reihe von essentiellen Aminosäureresten
bekannt, die für die Aktivität der Zellwand lysierenden
Enzyme bekannt sind z. B. konservierte Cysteine und Histidine bei
verschiedenen Amidasen oder CHAP Domänen. Die entsprechenden
essentiellen Reste können auch mit Sequenzanalyseprogrammen
gefunden werden, die speziell nach konservierten Domänen
suchen (z. B. Conserved Domain Database (CDD) über NCBI
(
Um
die Stabilität, Struktur und Funktion der erfindungsgemäßen
Polypeptide möglichst wenig zu destabilisieren, werden
die auszutauschenden Aminosäuren aus der Proteaseerkennungssequenz
durch Aminosäuren ersetzt, die von ihrer Struktur und Biochemie
her möglichst nah verwandt sind und dennoch von der Protease
nicht erkannt werden. Es ist mittlerweile allgemeines Fachwissen
die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren in bestimmte
Gruppen einzuteilen, die von ihrer Biochemie her unterschiedlich
sind (z. B. saure, basische, hydrophobe, polare, aromatische Aminosäuren),
innerhalb derer die Aminosäuren jedoch zueinander verwandt
sind. Bevorzugte Austausche für die Aminosäuren
in den erfindungsgemäßen Enzymen sind in Tabelle
2 zusammengefasst. Die in Spalte 2 genannten Austauschmöglichkeiten
stellen konservative Aminosäurealternativen dar, die entweder
von ihrer Struktur her und/oder von ihrer Funktion her besonders ähnlich zur
Aminosäure im Wildtyp sind. Dies sind besonders bevorzugte
Austauschvarianten. Möglich sind jedoch für die
erfindungsgemäßen proteasestabileren Zellwand
lysierenden Enzyme auch weitere Austauschvarianten, die in Spalte
3 genannt sind. Tabelle 2
Eine
weitere Möglichkeit zu bestimmen, welche Aminosäure
anstelle der zu substituierenden eingebaut wird, stellt die Dayhoff-Matrix
dar; siehe z. B. in Creighton (
Eine
weitere Möglichkeit zu bestimmen, welche Aminosäure
anstelle der zu substituierenden eingebaut wird, bedient sich der
Hilfe von Sequenzanalyseprogrammen z. B. des Programms BLAST, siehe
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid in einer oder mehreren Thrombinerkennungssequenzen modifiziert. Dabei wird das der mit R bezeichnete Aminosäurerest an Position P1 vorzugsweise gegen den mit K bezeichneten Aminosäurerest ausgetauscht. Ein Austausch gegen S, Q oder A ist ebenfalls bevorzugt. In der ersten Variante der Thrombinerkennungssequenz (G; R; G) können zusätzlich oder alternativ zum Austausch des R die beiden G oder nur eines davon gegen vorzugsweise A ausgetauscht werden. In der zweiten Variante der Thrombinerkennungssequenz (P; R; nicht D, E; nicht D, E) wird ebenfalls vorzugsweise das R gegen ein K oder gegen ein S, Q oder A ausgetauscht. Zusätzlich oder als Alternative kann das P an Position P2 gegen ein A, ein S oder Q ausgetauscht werden. Ferner können zusätzlich oder als Alternative eine oder beide Positionen P1' und P2' mit einem D oder E substituiert werden.In a preferred embodiment, the polypeptide of the invention is modified in one or more thrombin recognition sequences. In this case, the amino acid residue designated R at position P1 is preferably exchanged for the amino acid residue designated K. An exchange for S, Q or A is also preferred. In the first variant of the thrombin recognition sequence (G; R; G), in addition or as an alternative to the replacement of the R, the two Gs or only one of them can be exchanged for preferably A. In the second variant of the thrombin recognition sequence (P; R; not D, E, not D, E), it is also preferable to exchange the R for a K or for an S, Q or A. Additionally or alternatively, the P at position P2 may be replaced with an A, an S or a Q. Furthermore, in addition or alternatively one or both positions P1 'and P2' are substituted with a D or E.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind aufgeführt in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 und 5.Especially preferred embodiments are listed in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5.
Die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeführten Aminosäuresubstitutionen
können mit Hilfe von molekularbiologischen Standardtechniken
erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind und z. B. in
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können mit verschiedenen Tests auf Proteaseempfindlichkeit und/oder Enzymaktivität untersucht werden. Beispiele für solche Test sind Proteaseverdau und anschließende Auftrennung der Fragmente über SDS-Gelelektrophorese, Massenspektrometrie, Zelllysetest auf Agarplatten, Flüssiglysetest durch Messung der Lichtstreuung im Photometer, Zymogrammassay zum Aktivitätstest auf Gelen.The polypeptides of the invention can with various tests for protease sensitivity and / or enzyme activity to be examined. Examples of such tests are protease digestion and subsequent separation of the fragments via SDS gel electrophoresis, mass spectrometry, cell lysis test on agar plates, liquid lysis test by measuring the light scattering in the photometer, zymogram assay for Activity test on gels.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im medizinischen, therapeutischen, umwelttechnischen, kosmetischen oder Lebensmittelbereich eingesetzt werden.The polypeptides of the invention can in the medical, therapeutic, environmental, cosmetic or food sector.
Bei der Modifikation der Erkennungsstellen wird dabei vorzugsweise die Erkennungsstelle solcher Proteasen modifiziert, die in dem gewünschten Anwendungsgebiet erfahrungsgemäß vorkommen. So ist bekannt, dass im Menschen oder im Tier z. B. die Caspasen, Thrombin, Granzyme B, Enterokinase, Faktor Xa vorkommen. Ferner können darüber hinaus Proteasen aus pathogenen Bakterien vorliegen, die eine Infektion im Mensch oder Tier auslösen oder als Begleitflora mit vorhanden sind. Dazu zählen z. B. die V8 Protease aus Staphylococcus oder Clostridiopeptidase B aus Clostridien. Sollen die erfindungsgemäßen Polypeptide in der Therapie solcher Infektionen verwendet werden, werden vorzugsweise die Erkennungsstellen für die Proteasen modifiziert, die in den Bakterien vorliegen, die für eine zu therapierende Infektion verantwortlich sind. Ein Anwendungsgebiet für Zellwand lysierende Enzyme ist die topische Anwendung in Wunden in Form von Salben, Cremes, Tinkturen oder Wundabdeckungen wie Verbänden oder Bandagen, z. B. bei einer Infektion durch Staphylokokken oder Clostridien. Zusätzliche Stabilitätsprobleme für die Zellwand lysierenden Enzyme können dadurch auftreten, dass in der Wundversorgung teilweise Medikamente oder medizinische Produkte verwendet werden, die ebenfalls Proteasen enthalten. Beispielsweise wird bei Wunden der Haut versucht, eine sanfte Wundreinigung durch Fibrinolyse zu erreichen. Beispiele für Proteasen, die in der Wundversorgung eingesetzt werden sind Fibrinolysin, Plasmin, Streptokinase, Clostridiopeptidase A und Bacillus subtilis Protease. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Polypeptide ebenfalls Modifikationen der Erkennungsstellen für diese Proteasen auf.at the modification of the recognition sites is preferably the Receptor of such proteases modified in the desired Application occur according to experience. So is known that in humans or animals z. The caspases, thrombin, Granzyme B, enterokinase, factor Xa occur. Furthermore, can moreover, proteases from pathogenic bacteria are present, which trigger an infection in humans or animals or as Accompanying flora are present with. These include z. B. the V8 Protease from Staphylococcus or Clostridiopeptidase B from Clostridia. Should the polypeptides of the invention in therapy such infections are preferably the recognition sites modified for the proteases present in the bacteria, responsible for an infection to be treated are. A field of application for cell wall lysing enzymes is the topical application in wounds in the form of ointments, creams, Tinctures or wound dressings such as dressings or bandages, z. B. in an infection by staphylococci or clostridia. Additional stability issues for the Cell wall lysing enzymes can occur by that in the wound care partial medication or medical products used, which also contain proteases. For example is tried on wounds of the skin, a gentle wound cleansing through To achieve fibrinolysis. Examples of proteases that used in wound care are fibrinolysin, plasmin, Streptokinase, clostridiopeptidase A and Bacillus subtilis protease. Preferably, the polypeptides of the invention also modifications of the recognition sites for these Proteases on.
In der Lebensmittel-, Umwelt- und Kosmetikindustrie können ebenfalls eine Vielzahl von Proteasen vorliegen, die entweder von Bakterien produziert werden, die z. B. in der Lebensmittelherstellung verwendet werden wie Laktobazillen, Lactococcen oder verschiedene Bazillenstämme, oder die von unerwünschten Keimen, die lysiert werden sollen, ausgeschieden werden (z. B. B. cereus, B. subtilis, Cl. perfringens, Cl. botulinum). Zusätzlich sind auch in den Lebensmitteln selbst Proteasen vorhanden. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Polypeptide solche Modifikationen der Erkennungsstellen von Proteasen auf, die in der Lebensmittel-, Umwelt- und Kosmetikindustrie vorkommen.In food, environmental and cosmetics industries also a variety of proteases are present either from Bacteria are produced, the z. B. in food production can be used as lactobacilli, lactococci or various Bacteria strains, or those of unwanted germs, which are to be lysed (eg B. cereus, B. subtilis, Cl. perfringens, Cl. botulinum). additionally Proteases are also present in the foods themselves. Preferably the polypeptides of the invention have such Modifications of the recognition sites of proteases found in the Food, environmental and cosmetics industries.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das erfindungsgemäße Polypeptid als Arzneimittel sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids als Arzneimittel zur Prävention oder Therapie von Erkrankungen, die durch gram positive Bakterien insbesondere Clostridien, Bazillen, Listerien, Staphylokokken, Lactobazillen, Enterokokken, Aerokokken, Pediokokken, Streptokokken, Mycoplasmen und/oder Leuconostoc hervorgerufen werden.The The present invention further relates to the invention Polypeptide as a medicament and the use of the inventive Polypeptides as a medicament for prevention or therapy of diseases caused by gram positive bacteria in particular Clostridia, bacilli, listeria, staphylococci, lactobacilli, Enterococci, aerococci, pediococci, streptococci, mycoplasma and / or Leuconostoc.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids zur Unterdrückung des Wachstums von gram positiven Bakterien in der Umwelt-, Lebensmittel- oder Kosmetikindustrie.About that In addition, the present invention relates to the use of the invention Polypeptides to suppress the growth of gram positive Bacteria in the environmental, food or cosmetics industry.
Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, sind jedoch nicht als einschränkend aufzufassen.The The following embodiments serve to explain of the invention, however, are not to be construed as limiting.
Beispiel 1: Proteaseverdau von PlyPitti26Example 1: Protease digestion of PlyPitti26
Es wurde ein Verdau von PlyPitti26 mit den Proteasen Thrombin und V8 durchgeführt. Jeweils 90 μl Proteinlösung (Proteinkonzentration 1,35 mg/ml) wurden mit 10 μl Thrombin und in Kontrollansätzen Plasmin versetzt. Für den V8 Protease Verdau wurden 99 μl Proteinlösung und 1 μl Proteaselösung verwendet. Die Proteasestammlösungen waren jeweils 500 μg/ml. Die Probenansätze wurden über Nacht bei 25°C in einem 20 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO4 Puffer inkubiert. Ein Teil der Proben wurde mit SDS-Gel-Auftragspuffer versetzt und nach Aufkochen auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert.Digestion of PlyPitti26 with the proteases thrombin and V8 was performed. In each case 90 .mu.l protein solution (protein concentration 1.35 mg / ml) were mixed with 10 .mu.l of thrombin and in control plasmin. For the V8 protease digestion, 99 μl of protein solution and 1 μl of protease solution were used. The protease stock solutions were each 500 μg / ml. The samples were incubated overnight at 25 ° C. in a 20 mM Tris / HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO 4 buffer. A portion of the samples were spiked with SDS gel loading buffer and analyzed after boiling on SDS-polyacrylamide gels.
Es
wurde festgestellt, dass PlyPitti26 durch Thrombin vollständig
abgebaut wird, wobei zwei relativ große Proteinfragmente
entstanden, von denen das eine die CHAP-Domäne enthielt
und das andere die Amidase-Domäne und die CBD. Bei einem
Verdau mit V8 Protease entstanden mehrere kleinere, aber ebenfalls definierte
Proteinfragmente. Bei einem Kontrollverdau mit Plasmin erfolgte
unter den gegebenen Bedingungen keine Fragmentierung des Proteins.
Die Ergebnisse sind in
Beispiel 2: Aktivitätstest von unbehandeltem und mit Proteasen behandeltem PlyPitti26Example 2: Activity Test of untreated and protease-treated PlyPitti26
In weiteren Versuchen wurden die Proben im Flüssiglysetest auf die Lyseaktivität gegenüber Staphylococcus Zellen getestet. Der Flüssiglysetest ist ein Aktivitätstest für Zellwand lysierende Enzyme, bei dem die bakterielle Zelllyse in Echtzeit über Lichtstreuung im Photometer gemessen wird. Die Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm ist dabei ein Maß für die Anzahl an vorhandenen Bakterienzellen. Lysieren die Bakterienzellen wird die Probenlösung nach und nach klar und die gemessene Absorption nimmt im Idealfall bis auf einen Wert von Null ab. Staphylococcus Bakterien werden in BHI-Medium bis zu einer OD600 von ungefähr 0,8 kultiviert. Die nicht hitzeinaktivierten Zellen werden geerntet und in TEST Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7.5, 60 mM NaCl, 0.1% Tween, 2 mM CaCl2) resuspendiert mit einer OD600 von ungefähr 1. 990 μl Zellsuspension wird jeweils mit 10 μl Enzymlösung versetzt (Enzymkonzentration im Test 10 μg/ml) und bei 30°C die Abnahme der Absorption bei 600 nm verfolgt.In further experiments, the samples were tested in the liquid lysis test for the lysis activity against Staphylococcus cells. The liquid lysis test is an activity test for cell wall lysing enzymes in which bacterial cell lysis is measured in real time via light scattering in the photometer. The absorption at a wavelength of 600 nm is a measure of the number of existing bacterial cells. When the bacterial cells lyse, the sample solution gradually becomes clear and the measured absorbance ideally decreases to a value of zero. Staphylococcus bacteria are cultured in BHI medium to an OD 600 of approximately 0.8. The nonheat inactivated cells are harvested and resuspended in TEST buffer (20mM Tris / HCl pH 7.5, 60mM NaCl, 0.1% Tween, 2mM CaCl 2 ) with an OD 600 of approximately 1. 990μl of cell suspension is each loaded with 10μl of enzyme solution shifted (enzyme concentration in the test 10 ug / ml) and monitored at 30 ° C, the decrease in absorbance at 600 nm.
Es
wurde festgestellt, dass bei nicht verdautem PlyPitti26 und bei
der Plasminkontrolle nach etwa 1000 s eine vollständige
Lyse der Staphylokokken eingetreten ist, während bei den
mit Thrombin und V8 Protease verdauten Proben praktisch keine Zelllyse
mehr stattfindet, das Zellwand lysierende Enzym also vollständig inaktiviert
wurde. Die Ergebnisse sind in
Beispiel 3. Stabilisierung von CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USAExample 3. Stabilization of CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA
Eine
gegen Staphylokokken wirksame synthetisch hergestellte Endolysinvariante,
die aus den enzymatisch aktiven Domänen CHAP und Ami des
Endolysins von PlyPitti26 besteht und aus der Zellwand bindenden
Domäne (CBD) des Endolysins des Prophagen Φ SA2USA,
der aus dem Genom des MRSA Stamms USA300 stammt (
Um
dises Protein gegen Thrombinverdau und Verdau durch V8 Protease
zu stabilisieren wurden mittels zielgerichteter Mutagenese sowohl
die Thrombin-Schnittstelle als auch die im Linker zwischen CHAP-
und Amidase-Domäne liegenden V8-Schnittstellen durch Aminosäuresubstitutionen
modifiziert. Die zu diesem Zweck durchgeführten erfindungsgemäßen
Einzel- und Doppel- und Vierfachmutationen sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3
Ein
Thrombinverdau von Mutante 4 aus Tabelle 3 und dem nicht modifizeirten CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA
ist in
Die Endolysine wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in den Verdau eingesetzt. Für den Thrombinverdau wurden 90 μl Protein und 10 μl humanes Thrombin (Stammlösung mit 50 μg/ml) eingesetzt. Die Probenansätze wurden über Nacht bei 25°C in folgendem Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO4) inkubiert. Ein Teil der Proben wurde mit SDS-Gel-Auftragspuffer versetzt und nach Aufkochen auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Die Mutation von R an Position 167 gegen A führt zu einer vollständigen Insensibilisierung gegen Thrombin.The endolysins were used in the digest at a concentration of 1 mg / ml. For thrombin digestion, 90 μl of protein and 10 μl of human thrombin (stock solution with 50 μg / ml) were used. The samples were incubated overnight at 25 ° C. in the following buffer (20 mM Tris / HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO 4 ). A portion of the samples were spiked with SDS gel loading buffer and analyzed after boiling on SDS-polyacrylamide gels. Mutation of R at position 167 to A leads to complete insensitization to thrombin.
Nicht
modifizeirtes CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA und Mutante 4 wurden ebenfalls
mit V8 Protease verdaut. Die Endolysine wurden in einer Konzentration
von 1 mg/ml in den Verdau eingesetzt. Für den V8 Protease
Verdau wurden 99 μl Protein und 1 μl V8 Protease
(Stammlösung mit 500 μg/ml) eingesetzt. Die Probenansätze
wurden für 15 min bzw. 60 min in 20 mM Tris/HCl pH 7.5,
10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO4 Puffer inkubiert. Ein
Teil der Proben wurde mit SDS-Gel-Auftragspuffer versetzt und nach
Aufkochen auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Die Mutation von
E an Position 163 gegen A führt zwar nicht zu einer vollständigen
Insensibilisierung gegenüber V8 Protease, jedoch ist die
erfindungsgemäße Mutante gegenüber dem
Wildtyp, bei dem ein vollständiger Verdau eintritt, deutlich
stabilisiert. Bei der modifizierten Polypeptid sind sowohl nach
15 min als auch nach 60 min noch zwei Fragmente von etwa 40 kDa
vorhanden, die bei dem nicht modifizeirten Polypeptid nach 15 min
nur noch schwach und nach 60 mm gar nicht mehr vorhanden sind. Das
ergebnis des V8 Proteaseverdau ist in
Beispiel 4. Lysetest mit Proteasesensitiven und Proteaseresistenten EndolysinenExample 4. Lysis test with protease sensitive and protease resistant endolysins
Um zu untersuchen, ob die erfindungsgemäßen Polypeptide nach den Aminosäureaustauschen noch die gewünschte Aktivität besitzen, wurden sie in einem Plattenlysetest mit verschiedenen Staphylococcus Stämmen getestet. Die Bakterienstämme wurden über Nacht in 5 ml Kulturen in BHI-Medium angezogen und die Bakterienzellen 5 mm bei 4000 UpM in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Das Zellpellet wurde anschließend in 200 μl PBS-Puffer (10 mM NaPhosphat, 144 mM NaCl, 50 mM KCl, pH 7,4) resuspendiert und die Zellen 30 min bei 80°C hitzeinaktiviert. Die hitzeinaktivierten Zellen wurden mit 15 ml Topagar in Petrischalen gegossen und getrocknet. Anschließend wurden jeweils 5 μg Protein aufgetüpfelt und die Agarplatten für 1 h bei 30°C inkubiert. Enstehende Zelllysehöfe an den Stellen der aufgetüpfelten Proteine wurden visuell ausgewertet und je nach Größe mit +++, ++ und + bewertet oder mit -, falls keine Lyse auftrat.Around to investigate whether the polypeptides of the invention after the amino acid exchange nor the desired Have activity, they were in a plate lysis test tested with different Staphylococcus strains. The Bacterial strains were overnight in 5 ml cultures grown in BHI medium and the bacterial cells 5 mm at 4000 rpm centrifuged in the table centrifuge. The cell pellet was subsequently in 200 μl of PBS buffer (10 mM Na phosphate, 144 mM NaCl, 50 mM KCl, pH 7.4) and the cells are re-suspended for 30 min at 80 ° C heat inactivated. The heat-inactivated cells were washed with 15 ml Topagar poured into Petri dishes and dried. Subsequently 5 μg of protein were spotted and the Agar plates incubated for 1 h at 30 ° C. most Hende Zelllysehöfe in the places of the spotted Proteins were visually evaluated and depending on size rated +++, ++ and + or - if no lysis occurred.
Das
Testergebnis für einige erfindungsgemäße
Polyxpeptide ist in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4
Sowohl die nicht modifizierten PlyPitti26 als auch CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA weisen ein breites Lysespektrum gegenüber verschiedenen Staphylococcus Stämmen auf, wobei das CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA eine etwas bessere Lyseaktivität zeigt. Die beiden in der Tabelle gezeigten erfindungsgemäßen modifizierten Polypeptide Modul 4 und Modul 10 mit den Aminosäureaustauschen an der Thrombin- bzw. verschiedenen V8 Proteaseschnittstellen weisen eine praktisch identische Aktivität wie das nicht modifizierte Protein CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA auf. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Mutationen die Aktivität der Zellwand lysierenden Enzyme nicht negativ beeinflussen.Either the unmodified PlyPitti26 as well as CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA have a broad lysis spectrum over different ones Staphylococcus strains, the CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA shows a slightly better lysis activity. The two in the Table shown modified according to the invention Polypeptides Module 4 and Module 10 with the amino acid substitutions at the thrombin or different V8 protease cleavage sites a virtually identical activity as the unmodified one Protein CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA. This shows that the invention Mutations the activity of cell wall lysing enzymes do not negatively influence.
Beispiel 5: Modifizierte Zellwand bindende Enzyme gegen Clostridium difficileExample 5: Modified cell wall binding Enzymes against Clostridium difficile
Zwei Endolysine aus verschiedenen Cl. difficile Phagen (Zugangsnummern YP_529586 für das Endolysin aus dem Phagen Φ CD119 und YP_001087453 für das Endolysin aus dem Stamm Cl. difficile 630) weisen eine singuläre Caspase 1 Schnittstelle nach Aminosäure D214 auf, wohingegen eine singuläre Thrombinschnittstelle nur bei dem Endolysin aus dem Phagen Φ CD119 an Position 87 auftritt. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit der beiden Endolysine, wurde neben den Modifikationen der Caspase 1 Schnittstellen von D214 zu E214 beim Φ CD119 Endolysin R an Position 87 durch K ausgetauscht, das in dem homologen Endolysin aus dem Stamm Cl. difficile 630 an dieser Position vorhanden ist und von Thrombin nicht als Schnittstelle erkannt wird. Weitere erfindungsgemäße Modifikationen sind in Tabelle 2 dargestellt.Two endolysins from different Cl. difficile phages (accession numbers YP_529586 for the endolysin from the phage Φ CD119 and YP_001087453 for the endolysin from the strain Cl. difficile 630) have a singular caspase 1 site after amino acid D214, whereas a unique thrombin site only occurs at the endolysin from the phage Φ CD119 at position 87 occurs. Due to the high sequence similarity of the two endolysins, in addition to the modifications of the caspase 1, one of D214 to E214 in the Φ CD119 endolysin R at position 87 replaced by K, which in the homologous endolysin from strain Cl. difficile 630 is present at this position and is not recognized by thrombin as an interface. Further modifications according to the invention are shown in Table 2.
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows Sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can of the official publication platform of the DPMA become.
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