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Die
Erfindung betrifft eine histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung,
die in Diagnosen unter Anwendung der Endoskopie verwendet wird.
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Diagnostische
Verfahren unter Anwendung der Endoskopie finden weitläufig Anwendung
in der Diagnose von Krankheiten, z.B. Krebserkrankungen, Gastrointestinalgeschwüren und
der Colitis ulcerosa, auf Grundlage endoskopischer Gastrointestinaluntersuchungen
am oberen und unteren Gastrointestinaltrakt. Die Erfassung von Anomalien
oder Schädigungen
in Geweben anhand einer solchen endoskopischen Untersuchung beinhaltet üblicherweise
die Betrachtung mittels eines mit sichtbarem Licht arbeitenden Endoskops
mit etwa 10- bis 500-facher Vergrößerung ohne Verwendung eines
Färbemittels.
Mittlerweile kommt jedoch ein als Chromoendoskopie bezeichnetes
Verfahren zur Anwendung, bei dem die endoskopische Beobachtung in
einem Zustand durchgeführt
wird, in dem eine Lösung,
die einen Farbstoff enthält,
zuvor über
die Gewebeoberflächen gesprüht worden
ist. Da es in der Chromoendoskopie möglich ist, die Morphologie
der Oberfläche
des Gastrointestinallumens klar und deutlich zu beobachten, können sogar
mikroskopische Schädigungen
anhand der Änderungen
des Farbtons einfach entdeckt werden. Beispiele für Endoskope,
die für
die Chromoendoskopie verwendet werden können, sind ein mit sichtbarem
Licht arbeitendes Endoskop und ein Fluoreszenzendoskop.
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Beispiele
für in
der Chromoendoskopie hauptsächlich
eingesetzte Farbstoffe sind Indigocarmin (Masahiro Tada,
Akitada Iso, et al., (Clinical Gastroenterology, Bd. 7, Nr. 2, 1992)),
das in der Beobachtung unter Anwendung des Kontrastverfahrens zum
Färben
des Gastrointestinallumens unter sichtbarem Licht verwendet wird;
Acriflavin und Fluorescein (Gastroenterology 2004, Bd. 127,
Nr. 3, Seiten 706-713) für Fluoreszenzfärbung; und
dergleichen.
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In
der Diagnose von Krebs oder dergleichen ist es wichtig, sowohl die
Oberfläche
der biologischen Gewebe als auch die innenliegenden Gewebeteile
zu betrachten. Um die innenliegenden Teile der biologischen Gewebe
zu betrachten, wird im Allgemeinen ein Verfahren angewandt, bei
dem ein mikroskopisch kleiner Teil eines durch Biopsie oder dergleichen
entnommenen Gewebes im Labor in Scheiben geschnitten wird. Um den
innenliegenden Teil des biologischen Gewebes in situ zu betrachten,
kommen beispielsweise Verfahren wie MRI, PET, CT, ein mit weicher
Röntgenstrahlung
arbeitendes Verfahren und dergleichen zur Anwendung, bei denen der
ganze Körper
betrachtet wird. In der Gastrointestinalendoskopie sind Endoskope
auf den Markt gebracht worden, die die Autofluoreszenzreaktion biologischer Gewebe
nutzen. Wird Licht einer bestimmten Wellenlänge auf biologisches Gewebe
gestrahlt, so geben endogene fluoreszierende Substanzen in dem Gewebe
Autofluoreszenzstrahlung ab. Anhand von Intensitätsunterschieden und anhand
der Spektren können
so normale Gewebebereiche und geschädigte Gewebebereiche visuell
betrachtet werden.
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Um
mit einem herkömmlichen
Endoskop beispielsweise Gastrointestinalkrebs zu diagnostizieren, ist
es erforderlich, den geschädigten
Bereich durch Betrachtung auf empirischem Wege zu ermitteln, daraus
eine Gewebsprobe herauszuschneiden und in einem separaten Labor
eine Diagnose durch Färben des
Gewebes durchzuführen.
Nunmehr ist jedoch auch möglich,
mittels eines kürzlich
entwickelten konfokalen Endoskops die innenliegenden Teile eines
Gewebes zu betrachten, ohne das Gewebe entfernen zu müssen.
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Im
Allgemeinen beruht ein konfokales Abbildungssystem auf einer Technik,
bei der deutlich erkennbare Bilder innenliegender Gewebeteile ohne mechanische
Schnitte erhalten werden können,
indem eine Lochblende, auch als Pinhole bezeichnet, vor dem Detektor
angeordnet und nur dasjenige Licht erfasst wird, das in der Schärfen- oder
Bildebene innerhalb des Gewebes reflektiert wird. Bei einem solchen
konfokalen Abbildungssystem wird typischerweise das mit einer fluoreszierenden
Substanz gefärbte
Gewebe mit Laserlicht abgetastet und ein Fluoreszenzbild des Gewebes
betrachtet. Das konfokale Abbildungssystem benötigt demnach üblicherweise
fluoreszierende Färbemittel.
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Das
konfokale Endoskop, das mit dem oben beschriebenen konfokalen Abbildungssystem
arbeitet, hat sowohl eine der normalen Betrachtung dienende Optik
als auch eine der konfokalen Betrachtung dienende Optik. Es ermöglicht so
ein sogenanntes Screening, d.h. ein systematisches Durchtesten des
geschädigten
Gewebebereichs sowie eine Betrachtung von Zellen anhand von optischen
Gewebeschnitten, ohne dass die Zellen herausgeschnitten werden müssen, was
weniger invasiv und zudem in situ möglich ist.
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Derzeit
vermarktete konfokale Endoskope arbeiten mit blauem Laserlicht einer
Wellenlänge
von 488 nm als Lichtquelle zur Farbstoffanregung. Eine wichtige
Eigenschaft, die ein in konfokalen Endoskopen zu medizinischen Zwecken
eingesetzter fluoreszierender Farbstoff aufweisen muss, besteht
darin, dass der fluoreszierende Farbstoff nicht toxisch ist und
keine mutationsauslösende
Wirkung gegenüber dem
Körper
aufweist. Derzeit sind deshalb fluoreszierende Farbstoffe, die zusammen
mit konfokalen Endoskopen zu medizinischen Zwecken eingesetzt werden
können,
auf Fluorescein, das zur Augenfundusgefäßdarstellung intravenös injiziert
wird, sowie auf Acriflavin beschränkt, das als antibiotische
Substanz verwendet wird (Gastrointestinal Endoscopy Clin
of N Am, 2005, Bd. 12, Seiten 715-731).
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Was
die für
konfokale Endoskope verwendeten Lichtquellen betrifft, ist in Zukunft
mit einer Wellenlängendiversifizierung
zu rechnen. Da Licht in einem Wellenlängenbereich, der von rot bis
infrarot reicht, ein größeres Durchdringungsvermögen gegenüber biologischen
Geweben aufweist als blaues Licht, wird vermutet, dass mit solchem
Licht konfokale Bilder an Stellen aufgenommen werden können, die
tiefer als die Oberfläche
des biologischen Gewebes liegen. Indocyaningrün (Icg) ist als infrarotfluoreszierende
Verbindung zu Diagnosezwecken verfügbar und für die Verabreichung an den
menschlichen Körper
zugelassen worden. Es wird hauptsächlich für die Untersuchung der Leberfunktion
und zur Augenfundusgefäßdarstellung
verwendet. Wird Indocyaningrün
als Färbemittel
in der konfokalen Endoskopie eingesetzt, so ist es nicht möglich, damit
einen Kontrast zu erzielen, wie er beispielsweise bei Verwendung
von Fluorescein möglich
ist, das in Gastroenterology 2004, vol. 127, Bd. 3, Seiten
706-713 beschrieben ist. Wird Indocyaningrün als fluoreszierender
Farbstoff für
die Endoskopie eingesetzt, so besteht weiterhin das Problem, dass
es toxischer als Fluorescein ist.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, eine histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung
für die
Endoskopie bereitzustellen, die
- (1) geringe
Biotoxizität
aufweist,
- (2) einen Kontrast liefert, um auch unter einer Weißlichtquelle
Unregelmäßigkeiten
auf einem Gewebe zu betonen,
- (3) Fluoreszenzstrahlung aussendet, und
- (4) ein gutes Fluoreszenzfärbevermögen gegenüber innenliegenden
Gewebeteilen aufweist und zur Diagnose von Schädigungen in innenliegenden
Gewebeteilen verwendbar ist.
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Die
Erfinder haben unter verschiedenartigen Aspekten Untersuchungen
angestellt und sind dabei insbesondere auf die Sicherheit des Farbstoffs
fokussiert gewesen. Im Ergebnis haben sie herausgefunden, dass eine
Verbindung gemäß der nachfolgend angegebenen
Formel (1), die durch Brillantgrün
dargestellt ist, die oben genannten Anforderungen erfüllt. Sie
haben auch herausgefunden, dass eine solche Verbindung als Fluoreszenzfarbstoff
(fluoreszierendes Färbemittel)
verwendbar ist, um innenliegende Gewebeteile selektiv zu färben, da
diese Verbindung nur Fluoreszenzstrahlung aussendet, wenn sie auf
ein Gewebe, insbesondere Albumin, aufgebracht wird, jedoch in wässriger
Lösung
keine Fluoreszenzstrahlung abgibt. Dadurch können deutlich erkennbare Fluoreszenzbilder
der innenliegenden Gewebeteile erzeugt werden. Auf Grundlage dieser
Erkenntnisse ist nun die Erfindung fertiggestellt worden.
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Die
Erfindung stellt eine histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung
für die
Endoskopie bereit, die eine Verbindung enthält, die durch die folgende
Formel (1) dargestellt ist:
worin R
1 und
R
2, die identisch oder verschieden sein können, jeweils
eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen und X
– einen
Anionrest darstellt.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, die Verwendung der durch
die Formel (1) dargestellten Verbindung zur Herstellung eines histofluoreszierenden
Farbstoffs für
die Endoskopie anzugeben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben,
bei dem mittels eines Endoskops durch Verabreichung einer Zusammensetzung,
die die durch die Formel (1) dargestellte Verbindung enthält, eine
Diagnose durchgeführt
und das mit der Zusammensetzung gefärbte Gewebe mit einem Endoskop
betrachtet wird.
- (1) Bei der Betrachtung des
Gastrointestinaltrakts unter einem herkömmlichen Endoskop, das mit
einer Weißlichtquelle
arbeitet, erzeugt der histofluoreszierende Farbstoff nach der Erfindung,
der ein blauer Farbstoff ist, im Vergleich zu roten Farbstoffen
wie Fluorescein einen besonders starken Kontrast.
- (2) Bei der Betrachtung mit einem Endoskop, bei dem ein Weißlichtendoskop
und ein konfokales Endoskop miteinander kombiniert sind, sorgt der erfindungsgemäße Farbstoff
gegenüber
weißem Licht
für einen
blauen Kontrast, während
er gegenüber
rotem Licht eine gewebespezifische Fluoreszenz aufweist. Bei Verwendung
des oben angegebenen Endoskops können
so mittels eines einzigen Farbstoffs sowohl geschädigte Bereiche entdeckt
als auch konfokale Bilder dieser Bereiche aufgenommen werden.
- (3) Die Verbindung nach Formel (1) weist in einer wässrigen
Lösung
keine Fluoreszenz auf. Sie weist nur dann Fluoreszenz auf, wenn
sie auf ein Gewebe, insbesondere Albumin, aufgebracht wird. Demzufolge
färbt die
Verbindung nicht den Interstitialraum zwischen den Zellen. Vielmehr
ist sie in der Lage, gezielt den innenliegenden Teil des Gewebes
zu färben.
- (4) Bei Verwendung des erfindungsgemäßen histofluoreszierenden Farbstoffs
ist ohne Entnahme des Gewebes die Visualisierung des innenliegenden
Teils eines geschädigten
Bereichs gleichzeitig unter endoskopischer Betrachtung unter sichtbarem
Licht, Fluoreszenzstrahlung und konfokaler Betrachtung möglich. Dabei
sind die Färbebilder
scharf und deutlich erkennbar. Der Farbstoff ist deshalb in der
Diagnose von Gastrointestinalkrankheiten und dergleichen verwendbar.
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Die
Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
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1 ein
Diagramm, welches das Anregungsspektrum (Abs.) und das Fluoreszenzspektrum (Emission)
von Brillantgrün
zeigt;
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2 ein
Diagramm, welches das Anregungsspektrum (Abs.) und das Fluoreszenzspektrum (Emission)
von Rhodamin B zeigt;
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3 ein
Diagramm, welches das Fluoreszenzspektrum einer flüssigen Mischung
aus Brillantgrün
und Albumin zeigt;
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4 ein
Diagramm, welches das Fluoreszenzspektrum von Albumin zeigt;
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5 einen
Satz fotografischer Aufnahmen, die das Ergebnis einer Fluoreszenzfärbung eines
Bereichs mit Brillantgrün
bis zu einer Tiefe von 35 μm unter
der luminalen Oberflächenschicht
des Dickdarms zeigen;
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6 eine
fotografische Aufnahme, die die Ergebnisse einer Fluoreszenzfärbung eines
Bereichs mit Brillantgrün
in einer Tiefe von 10 μm
unter der luminalen Oberflächenschicht
des Dickdarms liegt; und
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7 eine
fotografische Aufnahme, die die Ergebnisse einer Fluoreszenzfärbung mit
Brillantgrün
eines Bereichs in einer Tiefe von 15 μm zeigt.
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Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele
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Beispiele
für die
Endoskopie, die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommt,
sind medizinische Endoskopieverfahren wie die Gastrointestinalendoskopie,
die respiratorische Endoskopie, die vaskuläre Endoskopie und die Peritoneoskopie. Unter
diesen Verfahren wird die Gastrointestinalendoskopie besonders bevorzugt.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung beinhalten mit sichtbarem Licht arbeitende Endoskope sämtliche
Endoskope, die eine Betrachtung unter sichtbarem Licht ermöglichen,
sowie konventionelle Endoskope, vergrößernde Endoskope und Chromoendoskope,
bei denen eine Betrachtung unter sichtbarem Licht vorgenommen wird. Fluoreszenzendoskope
beinhalten Endoskope, die die durch Bestrahlen mit Anregungslicht
erzeugte Fluoreszenzstrahlung messen, und auch vergrößernde Fluoreszenzendoskope.
Mit einem konfokalen Endoskop ist ein Endoskop gemeint, das mit
einem konfokalen Abbildungssystem ausgestattet ist. Zudem hat ein
solches konfokales Endoskop üblicherweise sowohl
eine der normalen Betrachtung dienende Optik sowie eine der konfokalen
Betrachtung dienende Optik.
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Die
histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung nach der Erfindung
enthält
eine Verbindung, die durch die oben angegebene Formel (1) dargestellt
ist. In der Formel (1) bezeichnen R1 und
R2, die identisch oder verschieden sein
können,
jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. Beispiele
für eine
solche Alkylgruppe sind eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine
n-Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine n-Butylgruppe und dergleichen.
Unter diesen Substanzen sind eine Methylgruppe und eine Ethylgruppe
bevorzugt. Außerdem stellen
in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung sowohl R1 als
auch R2 eine Ethylgruppe dar.
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X– stellt
einen Anionrest dar. Als Beispiel hierfür sind HOSO3 – (Sulfat-Ion), ein Halogenion
und dergleichen zu nennen. Unter diesen Verbindungen ist HOSO3 – besonders bevorzugt.
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Ein
besonders bevorzugtes Beispiel der durch die Formel (1) dargestellten
Verbindung ist Brillantgrün
(R1 = R2 = C2H5, X– =
HOSO3 –).
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Brillantgrün wird weitläufig als
farbgebender Stoff für
kosmetische Produkte eingesetzt. Es ist also ein legales Färbemittel,
das in kosmetischen Produkten verwendet werden darf. Die Sicherheit
dieses Bestandteils ist anerkannt. Es ist jedoch nicht vollständig bekannt,
dass diese Verbindung nur dann Fluoreszenzstrahlung aussendet, wenn
sie an ein Protein wie Albumin gebunden ist. Außerdem ist es bisher überhaupt
nicht bekannt, dass diese Verbindung die Erzeugung deutlich erkennbarer
Fluoreszenzbilder innenliegender Gewebeteile nur dann ermöglicht, wenn
es auf Gewebe aufgebracht wird.
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Handelsübliche Produkte
für Brillantgrün sind beispielsweise
Brillantgrün
(B4014-25G) von Sigma-Aldrich-Company. Brillantgrün ist auch
unter anderen Namen erhältlich,
z.B. unter Pigment Green 1 und Basic Green und mit einer Farbindexnummer C.I.
42040 angegeben.
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Der
Gehalt der Verbindung nach Formel (1) in dem erfindungsgemäßen Gewebefarbstoff
beträgt im
Hinblick auf das Färbevermögen und
die Klarheit der Färbebilder
vorzugsweise 0,01 bis 70 Gew.-%, noch besser 0,01 bis 50 Gew.-%
und am besten 0,01 bis 20 Gew.-%.
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Der
Gewebefarbstoff nach der Erfindung kann in beliebiger Form eingesetzt
werden, z.B. als Flüssigkeit,
als Granulat oder als Tablette. Wird der Farbstoff im Gastrointestinaltrakt
verteilt oder submukös
verabreicht, so liegt er vorzugsweise als Flüssigkeit vor. Wird er oral
verabreicht, so liegt er vorzugsweise als Flüssigkeit, Granulat, Tabletten
oder dergleichen vor.
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Der
Gewebefarbstoff nach der Erfindung kann verschiedene Bestandteile
aufweisen, die entsprechend der Formulierung miteinander vermischt sind.
So können
beispielsweise ein Konsistenzmittel, ein Eindickmittel, eine grenzflächenaktive
Substanz, ein Süßungsmittel,
ein Konservierungsmittel, ein Aromastoff, ein pH-Einstellmittel,
Wasser und dergleichen eingemischt werden.
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Das
pH-Einstellmittel ist ein Wirkstoff, der den pH-Wert auf 5 bis 9
einstellt. Beispiele hierfür sind
Salzsäure,
Phosphorsäure,
Zitronensäure,
Malinsäure,
Essigsäure
und deren Salze, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydrogencarbonat,
Tetranatriumpyrrolat und dergleichen. Außerdem können Ethanol, Wasser und dergleichen
als Lösungsmittel
hinzugegeben werden. Im Falle von Tabletten können Bestandteile, die üblicherweise
bei Tabletten eingesetzt werden, verwendet werden, z.B. ein Bindemittel
und ein Zersetzungsmittel.
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Da
der erfindungsgemäße Gewebefarbstoff Gewebe
blau färben
kann, ist er in der herkömmlichen
endoskopischen Weißlichtbetrachtung
verwendbar. Das vorliegend verwendete Endoskop ist ein herkömmliches
Endoskop oder ein vergrößerndes
Endoskop und dient der endoskopischen Betrachtung mit 10- bis 500-facher
Vergrößerung.
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Das
Färbevermögen gegenüber Gewebe
variiert ausgehend vom normalen Gewebezustand bis zu einem präkanzerösen Zustand
oder einem Zustand, in dem ein Tumor vorhanden ist. Beim Färben normalen
Gewebes werden die Zellmembran und das Cytoplasma der Epithelzellen
im Dünndarm
oder Dickdarm gefärbt.
Dagegen weisen bei der Beobachtung von Tumoren individuelle Zellen
Merkmale auf, wie z.B. einen Anstieg des Kernvolumens, einen Anstieg
der Menge des Kernchromatins und des Hy perchromatismus, ein Anstieg
der Zahl an Kernkörperchen,
eine Anomalie in Zahl oder Form der Chromosome, eine basophile Zellfärbung und
deren Zusammenhang mit den Proliferationseigenschaften der Zellen
und dergleichen. Außerdem
fügen sich
in Tumorzellen eine große
Zahl an Kernchromatinen nahe der Kernmembran aneinander, wodurch
das endoplasmische Retikulum vereinfacht wird. Außerdem werden
die Mitochondrien unregelmäßig und
in ihrer Größe uneinheitlich,
und es gibt eine erhöhte
Menge an filamentösen
Strukturen, die in den Zellen erzeugt werden.
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Die
Gewebefarbstoffzusammensetzung nach der Erfindung wurde durch Beobachtung
gefunden, vornehmlich zu dem Zweck, eine gute Färbung der Epithelzellen und
des Cytoplasmas zu gewährleisten
und dabei den Interstitialraum praktisch nicht zu färben. Auf
diese Weise können
die Morphologie der Zellen in dem Gewebe oder die Eigenschaften der
zellularen Anordnung erfasst werden. Die Farbstoffzusammensetzung
ist sehr gut zusammen mit einem Endoskop verwendbar, das den auf
die Farbstoffzusammensetzung ausgelegten Wellenlängenbereich nutzt, da Anomalien
in Geweben und Zellen für
die Betrachtung durch ein konfokales Abbildungssystem geeignet sind.
Da der Zellkern nicht gefärbt wird,
ist ein Nachweis, wie oben beschrieben, im Falle eines präkanzerösen Zustands
oder dergleichen leichter möglich.
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Die
Farbstoffzusammensetzung nach der Erfindung hat außerdem die
Eigenschaft, Fluoreszenzstrahlung nur für gebundene Gewebe auszusenden. Die
benötigte
Information kann so auch erhalten werden, ohne eine Spülung mit
einer Lösung
vornehmen zu müssen.
Unter diesem Gesichtspunkt kann man auch sagen, dass die Signifikanz
der mit dem erfindungsgemäßen Farbstoff
erhaltenen Information hoch ist.
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Wie
die folgenden Beispiele zeigen, zeichnet sich die Verbindung nach
Formel (1) gegenüber
anderen Färbemitteln
dadurch aus, dass sie in einem Lösungszustand
keine Fluoreszenzstrahlung aussendet, jedoch bei Verteilung in dem
Körperlumen Fluoreszenzstrahlung
aussendet, und dass sie deutlich erkennbare, fluoreszenzgefärbte Bilder
innenliegender Gewebeteile liefert. Deshalb ist der erfindungsgemäße Farbstoff
sehr gut für
die Endoskopie als histofluoreszierender Farbstoff verwendbar.
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Hat
das mit einer konfokalen Optik arbeitende Endoskop sowohl eine für die normale
Betrachtung bestimmte Optik als auch eine für die konfokale Betrachtung
bestimmte Optik, so kann sowohl die Oberfläche als auch der innenliegende
Teil des Gewebes ohne Entfernen des Gewebes in dem geschädigten Bereich
einer Diagnose unterzogen werden, indem dieser geschädigte Bereich
zunächst
unter normalem Licht visuell betrachtet wird und dann mit Erreichen
der fraglichen Läsion
mit einem konfokalen Endoskop fluoreszenzgefärbte Querschnittsbilder des
innenliegenden Gewebeteils (beispielsweise bis zu 250 μm) betrachtet
werden. Die Morphologie von Zellen oder Kernen eines biologischen
Gewebes kann so in lebendem Zustand betrachtet werden. Im Ergebnis
ist so eine Diagnose von Gastrointestinalerkrankungen wie einem
präkanzerösen Stadium, Krebs,
Geschwüren
und der Colitis ulcerosa sicher, schnell und minimalinvasiv möglich. Auch
kann die Genauigkeit, mit der die Diagnose durchgeführt wird, deutlich
verbessert werden.
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Bei
einer solchen endoskopischen Beobachtung kann der erfindungsgemäße Gewebefarbstoff direkt
in dem Gastrointestinallumen verteilt oder submukös verabreicht
werden. Außerdem
kann er auch oral oder intravenös
verabreicht werden.
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Beispiele
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Die
Erfindung wird im Folgenden genauer anhand von Beispielen beschrieben.
Jedoch ist die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1
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Brillantgrün (hergestellt
von Sigma-Aldrich Company, B4014-25G) wurde mit destilliertem Wasser
auf eine Konzentration von 0,001 mg/ml eingestellt. Die Lichtabsorbanz
wurde mittels eines Spektrofotometers (hergestellt von Shimadzu
Corporation, BioSpec-1600) über
einen Wellenlängenbereich
von 200 bis 750 nm kontinuierlich gemessen, um die Wellenlänge zu bestimmen,
bei der die Absorption maximal war. Dann wurde eine Bestrahlung
mit der so erhaltenen Wellenlänge
maximaler Absorption von 625 nm als Anregungslicht durchgeführt und
die Wellenlänge
des gestreuten Lichtes, das in der Richtung senkrecht zur Lichtachse
des Anregungslichtes erfasst wurde, mittels eines Fluoreszenzspektrofotometers
(hergestellt von Shimadzu Corporation, RF-1500) gemessen, um so
eine Wellenlänge
maximaler Fluoreszenz von 625 nm zu erhalten. Die maximale Anregungswellenlänge, die
mit diesem Fluoreszenzspektrofotometer gemessen wurde, betrug 627
nm. 1 zeigt die Wellenlänge maximaler Anregung und
die Wellenlänge
maximaler Fluoreszenz, die mit dem Fluoreszenzfotometer gemessen
wurden.
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Im
Ergebnis wurde von dem als Lösung
zubereiteten Farbstoff keine Fluoreszenz erfasst. Der gleiche Test
wurde an Brillantblau FCF durchgeführt, das als blauer Lebensmittelfarbstoff
weitläufig
Verwendung findet.
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Im
Ergebnis stellte sich heraus, dass Brillantblau FCF eine Wellenlänge maximaler
Absorption von 629 nm, eine Wellenlänge maximaler Anregung von
619 nm und eine Wellenlänge
maximaler Fluoreszenz von 650 nm aufwies. Im gleichen Wellenlängenbereich
ergab sich ein deutlicher Unterschied in der Fluoreszenzintensität. Für Brillantgrün stellte
sich heraus, dass es unter einer Lichtquelle, die im roten Wellenlängenbereich
abstrahlt, keine Fluoreszenzstrahlung aussendet.
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Bei
Messung mit einem Fluoreszenzfotometer zeigte Brillantgrün keinen
Unterschied zwischen der Wellenlänge
maximaler Absorption und der Wellenlänge maximaler Fluoreszenz.
Dies impliziert, dass die Verbindung nicht dem Prozess der Anregung
durch eingestrahltes Licht und der Emission von Fluoreszenzstrahlung
unterzogen wurde.
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Wird
jedoch biologisches Gewebe aus dem Dickdarm oder dergleichen mit
Brillantgrün
gefärbt und
unter bestimmtem Laserlicht angeregt, so ist eine Betrachtung anhand
intensiver Fluoreszenzstrahlung möglich.
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Zum
Vergleich mit Brillantgrün
wurde das Wellenlängenmuster
von Rhodamin B gemessen, das die innenliegenden Teile von Zellen
im Lumen des Dickdarms oder dergleichen in gleicher Weise färbt wie
Brillantgrün.
Es konnte bestätigt
werden, dass Rhodamin B auch im gelösten Zustand intensive Fluoreszenz
zeigte, wie aus 2 hervorgeht.
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Beispiel 2
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Brillantgrün (hergestellt
von Sigma-Aldrich Company, B4014-25G) wurde unter Verwendung von destilliertem
Wasser als Lösung
mit 0,1 mg/ml zubereitet. Albumin (aus Rinderserum, globulinfrei;
Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 013-15104) wurde unter Verwendung
physiologischer Kochsalzlösung als
Lösung
mit 2,0 mg/ml zubereitet. Unter Verwendung einer 0,1 M-Pufferlösung (pH
5) und der oben angegebenen 2,0 mg/ml Albumin-Lösung wurde eine flüssige Mischung
aus 0,01 mg/ml Brillantgrün
und Albumin zubereitet. Dann wurde eine Bestrahlung mit der Wellenlänge maximaler
Absorption durch Brillantgrün
von 625 nm als Anregungswellenlänge
vorgenommen und die Wellenlänge
des gestreuten Lichtes, das in der Richtung senkrecht zur Lichtachse
des Anregungslichtes erfasst wurde, unter Verwendung eines Spektrofotometers
(hergestellt von Shimadzu Corporation, RF-1500) gemessen. Die Wellenlänge maximaler
Fluoreszenz betrug 651 nm. 3 zeigt die
mit einem Fluoreszenzfotometer gemessene Wellenlänge maximaler Fluoreszenz.
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Zum
Vergleich mit der flüssigen
Mischung aus Brillantgrün
und Albumin wurde die Wellenlänge maximaler
Fluoreszenz einer Albuminlösung
bezüglich
einer Anregungswellenlänge
von 625 nm gemessen, wie in 4 gezeigt
ist. Da das Spektrum keinen Unterschied zwischen der Anregungswellenlänge und
der Fluoreszenzwellenlänge
zeigte, stellte sich heraus, dass Albumin selbst keine Fluoreszenzstrahlung
bei einer Anregungswellenlänge
von 625 nm aussendete.
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Aus
diesen Tatsachen konnte abgeleitet werden, dass Brillantgrün unter
einer Lichtquelle, die im roten Wellenlängenbereich abstrahlt, im Zustand wässriger
Lösung
keine Fluoreszenz aussendet, jedoch bei Bindung an Albumin Fluoreszenz
aussendet.
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Beispiel 3
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Brillantgrün (hergestellt
von Sigma-Aldrich Company, B4014-25G) wurde unter Verwendung von destilliertem
Wasser als Lösung
zubereitet, wobei die Konzentration auf 1,0 mg/ml eingestellt wurde.
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Eine
Maus (ddY, 13 Wochen alt, männlich) wurde
unter Anästhesie
einer Laparotomie unterzogen. Ihr Dickdarm wurde entnommen. Unmittelbar nach
der Entnahme wurde die zubereitete Lösung aus Brillantgrün auf den
Dickdarm aufgebracht und eine Fluoreszenzbetrachtung der Probe mit
einem konfokalen Abbildungssystem durchgeführt, das mit einem konfokalen
Mikroskop arbeitet (hergestellt von Leica Corp., TCPSP2). Dabei
wurden das Färbevermögen, das
Durchdringungsvermögen
sowie die Fluoreszenzeigenschaften von Brillantgrün untersucht.
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Die
Betrachtung wurde an Querschnitten in Abständen von 5 μm von der luminalen Oberflächenschicht
der Fleischprobe in Tiefenrichtung vorgenommen (vergl. 5).
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Wie 5 zeigt,
war eine Betrachtung in ausreichender Qualität bis zu einer Tiefe von 35 μm möglich. Somit
ist eine Betrachtung in Tiefenrichtung auch durch Einstellen von
Verstärkungswerten
und dergleichen möglich.
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6 zeigt
ein Querschnittsbild an einer Stelle, die 10 μm tief unter der Oberflächenschicht liegt. 7 zeigt
ein Querschnittsbild an einer Stelle, die 15 μm tief unter der Oberflächenschicht
liegt. Das Cytoplasma ist gut gefärbt, während der Interstitialraum
kontrastdunkel ist. Somit ist eine sehr gute Beobachtung der Morphologie
oder des Zustands der Zellen möglich.