DE102007006736B4 - In-vitro test kit for the animal-free determination of the sensitizing potential of a substance - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, mit den Schritten: a) Humane Monozyten und Keratinozyten werden bereitgestellt und in Kokultur genommen. b) es wird die Einwirkung von Cytokinen auf diese Zellen gewährleistet, z. B. indem die Cytokine zugesetzt werden, wobei die folgenden Vorgänge c) bis e) gezielt ausgelöst werden. c) unter Aktivierung der Keratinozyten durch die Cytokine kommt es zur Differenzierung der Monozyten zu Dendritischen Zellen, hierdurch erfolgt die Generierung spezifisch für das Testverfahren geeigneter Dendritischer Zellen, d) zusätzlich wirken die Cytokine direkt auf die Differenzierung der Monozyten, e) Entstehung einer lockeren Kokultur aus aktivierten humanen Keratinozyten, die nicht ausdifferenziert sind, und aus beweglichen humanen Dendritischen Zellen, f) wobei keine weiteren Träger wie Kollagen/Fibroblastenschichten verwendet werden, g) Zugabe der auf ihr Sensibilisierungspotential zu testenden Substanz(en) zur fertigen Kokultur, h) Bestimmung der Expression von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen, wie z. B....Method for the animal-free determination of the sensitizing potential of a substance, with the following steps: a) Human monocytes and keratinocytes are provided and taken into coculture. b) the action of cytokines on these cells is ensured, e.g. B. by adding the cytokines, the following processes c) to e) being triggered in a targeted manner. c) Activation of the keratinocytes by the cytokines leads to the differentiation of the monocytes into dendritic cells, which results in the generation of dendritic cells specifically suitable for the test procedure, d) in addition, the cytokines act directly on the differentiation of the monocytes, e) formation of a loose coculture from activated human keratinocytes, which are not differentiated, and from motile human dendritic cells, f) no further carriers such as collagen / fibroblast layers are used, g) addition of the substance (s) to be tested for their sensitization potential to the finished coculture, h) determination the expression of maturation markers of dendritic cells, such as. B ....

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro Testkit zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz. Das Testkit besteht aus einer lockeren Kokultur aus aktivierten humanen basalen Keratinozyten und aus beweglichen humanen Dendritischen Zellen. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren das Herstellungsverfahren dieses Testkits.The present invention relates to an in vitro test kit for animal-free determination of the sensitizing potential of a substance. The kit consists of a loose co-culture of activated human basal keratinocytes and of mobile human dendritic cells. The present invention further includes the manufacturing method of this test kit.

Stand der TechnikState of the art

Die Kontaktdermatitis ist ein weit verbreitetes berufsbezogenes oder umweltbedingtes Gesundheitsproblem.Contact dermatitis is a common occupational or environmental health problem.

Die Begriffe Kontaktdermatitis und Kontaktekzem (contact hypersensitivity) beschreiben Hautreaktionen nach Kontakt mit niedermolekularen Substanzen (typisch < 500 kDa). Ist diese Hautreaktion durch Aktivitäten des Immunsystems vermittelt, handelt es sich um ein allergisches Kontaktekzem/eine allergische Kontaktdermatitis. Die auslösenden Chemikalien werden als Allergene, Haptene oder als sensibilisierende Stoffe bezeichnet. Ist das Immunsystem nicht an der Ausbildung der Hautreaktionen beteiligt, werden die auslösenden Stoffe als Irritantien oder Toxine bezeichnet (Nomenklatur: Johansson et al., 2001).The terms contact dermatitis and contact dermatitis (contact hypersensitivity) describe skin reactions after contact with low-molecular substances (typically <500 kDa). If this skin reaction is mediated by activities of the immune system, it is an allergic contact eczema / allergic contact dermatitis. The triggering chemicals are referred to as allergens, haptens or as sensitizing substances. If the immune system is not involved in the formation of skin reactions, the triggering substances are referred to as irritants or toxins (nomenclature: Johansson et al., 2001).

Das Potential einer Chemikalie, eine allergische Kontaktdermatitis auslösen zu können, wird als sensibilisierendes Potential (sensitization potential) bezeichnet. Der derzeit gängige und von der OECD anerkannte Test, mit dem ein solches Potential ermittelt wird, ist der lokale Lymphknotentest an der Maus (mouse local lymph node assay, LLNA) (Kimber and Weisenberger 1989; OECD, Guideline 429, 2002). Durch die Einführung dieses Tests konnte gegenüber seinen Vorgängern die Anzahl der benötigten Tiere reduziert und auch deren Belastung vermindert werden. Ethisch vertretbarer wäre jedoch ein tierversuchsfreies Testverfahren (in-vitro assay). Außerdem liefert LLNA teilweise falsche Ergebnisse, wie beispielsweise bezüglich der Substanz Benzocaine (Basketter et al., 1995), so dass auch die Sicherheit der Testaussage betreffend weitere Fortschritte notwendig sind.The potential of a chemical to induce allergic contact dermatitis is called a sensitization potential. The current and accepted by the OECD test, with which such a potential is determined, is the mouse local lymph node assay (LLNA) (Kimber and Weisenberger 1989, OECD, Guideline 429, 2002). The introduction of this test compared to its predecessors, the number of animals required reduced and their burden can be reduced. Ethically more acceptable, however, would be an animal-free test method (in vitro assay). In addition, LLNA provides partially incorrect results, such as with regard to the substance benzocaine (Basketter et al., 1995), so that the safety of the test statement regarding further progress is necessary.

Langerhanszellen sind unreife Dendritische Zellen in der Haut (Banchereau and Steinman, 1998). Dendritische Zellen besitzen die Fähigkeit, eine primäre Immunreaktion zu initiieren und sind damit auch an der Initiation der allergischen Kontaktdermatitis zentral beteiligt. Sie können erkennen, ob sich in ihrer Umgebung Gefahr-signalisierende Moleküle befinden. Kontakt mit Gefahr-signalisierenden Molekülen induziert die Reifung der Dendritischen Zelle zur Antigen-präsentierenden Zelle, die Allergene in passender Form dem spezifischen Immunsystem zuführen kann. In der Folge werden damit auch T- und B-Lymphozyten sowie weitere Zellen in die Reaktion auf Allergenkontakt einbezogen (Übersicht in: Reis e Sousa, 2006). Es läge daher nahe, in einem alternativen in-vitro Testverfahren Langerhanszellen zu kultivieren und geeignete Reaktionen der Zellen auf Allergenkontakt zu messen (Übersicht in: Ryan et al., 2005). Dies ist derzeit nicht möglich, da kein Zellkulturverfahren beschrieben ist, mit dem aus der menschlichen Haut isolierte Langerhanszellen ausreichend lang reaktiv gehalten werden können (Peiser et al., 2003).Langerhans cells are immature dendritic cells in the skin (Banchereau and Steinman, 1998). Dendritic cells have the ability to initiate a primary immune response and are thus centrally involved in the initiation of allergic contact dermatitis. They can see if there are danger-signaling molecules in their environment. Contact with danger-signaling molecules induces the maturation of the dendritic cell to the antigen-presenting cell, which can deliver allergens in appropriate form to the specific immune system. As a result, T and B lymphocytes and other cells are also involved in the reaction to allergen contact (reviewed in: Reis e Sousa, 2006). It would therefore be natural to cultivate Langerhans cells in an alternative in vitro test method and to measure suitable responses of the cells to allergen contact (reviewed in: Ryan et al., 2005). This is currently not possible, since no cell culture method is described with which Langerhans cells isolated from the human skin can be kept sufficiently reactive (Peiser et al., 2003).

Es liegen keine menschlichen Zelllinien vor, die authentische Dendritische Zellen ersetzen könnten. Versuche mit den Zelllinien THP-1, KG-1 oder MUTZ-3 zeigten, dass diese Zellen nur auf extrem starke Allergene reagieren und das in einem Konzentrationsbereich, der an der Grenze zu toxischer Aktivität liegt (borderline concentrations) (Yoshida et al., 2003; Azam et al., 2006). Außerdem neigen Zelllinien zu genetischer Instabilität.There are no human cell lines that could replace authentic dendritic cells. Experiments with the cell lines THP-1, KG-1 or MUTZ-3 showed that these cells react only to extremely strong allergens and that in a concentration range which is borderline to toxic activity (borderline concentrations) (Yoshida et al., Azam et al., 2006). In addition, cell lines are prone to genetic instability.

Es wurden Verfahren entwickelt, mit denen sich aus Vorläufern Dendritische Zellen generieren lassen, die in ihren Leistungen authentischen Dendritischen Zelle nahe kommen. Vorläuferzellen sind dabei Monozyten, die aus adultem peripheren Blut oder aus Leukozytenkonzentrat (buffy coat) gewonnen werden, oder CD34+-Blutstammzellen aus Nabelschnurblut oder Knochenmark. Die Vorläuferzellen differenzieren, durch Cytokine stimuliert, zu unreifen Dendritischen Zellen. Eingesetzt wurden die Cytokine IL-4 zusammen mit GM-CSF, teilweise auch zusätzlich mit TNF-α (Sallusto and Lanzavecchia, 1994; Schuler et al., 1995; Steckel et al., 1995; Chapius et al., 1997; Caux et al., 1996). Der Begriff unreife Dendritische Zelle bedeutet hier, dass es sich bei diesen Zellen um differenzierte Zellen handelt, die auf einen Reifestimulus durch pathogenassoziierte Moleküle oder Allergene warten und die nach Kontakt damit zur Antigen-präsentierenden Zelle reifen können. Dieser Typ Dendritischer Zellen wurde ausgiebig auf seine Fähigkeit untersucht, sensibilisierende Substanzen in Testverfahren detektieren zu können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Dendritischen Zellen, wenn sie solitär kultiviert werden, als Testsystem für Allergene ungeeignet sind. Detektierbare Konzentrationen von Kontaktallergenen liegen im subtoxischen bis bereits toxischen Bereich, und eine Unterscheidung zwischen Allergenen und Irritantien ist kaum möglich (Hulette et al., 2002; Sträube et al., 2005; Übersicht in: Ryan et al., 2005). Außerdem zeigte sich, insbesondere für die aus CD14+ Monozyten gewonnenen Dendritischen Zellen, eine erhebliche Spendervarianz bezüglich der Testergebnisse, so dass Testzellen verschiedener Spender gepoolt werden mussten (Pichowski et al., 2000; Aeby et al., 2004).Methods have been developed to generate precursor dendritic cells that are close in their performance to authentic dendritic cells. Precursor cells are monocytes derived from adult peripheral blood or buffy coat or CD34 + blood stem cells from umbilical cord or bone marrow. The precursor cells differentiate, stimulated by cytokines, to immature dendritic cells. Cytokines IL-4 were used in conjunction with GM-CSF, in part also with TNF-α (Sallusto and Lanzavecchia, 1994, Schuler et al., 1995, Steckel et al., 1995, Chapius et al., 1997, Caux et al al., 1996). The term immature dendritic cell means here that these cells are differentiated cells that are waiting for a mature stimulus by pathogen-associated molecules or allergens and that can mature after contact therewith to the antigen-presenting cell. This type of dendritic cell has been extensively studied for its ability to detect sensitizing substances in test procedures. In summary, these dendritic cells, when solitary cultured, are unsuitable as a test system for allergens. Detectable concentrations of contact allergens are in the subtoxic to already toxic range, and a distinction between allergens and irritants is hardly possible (Hulette et al., 2002, Sträube et al., 2005, reviewed in: Ryan et al., 2005). In addition, there was a significant donor variance in test results, in particular for the dendritic cells obtained from CD14 + monocytes, so that test cells from different donors had to be pooled (Pichowski et al., 2000, Aeby et al., 2004).

Ein weiteres Problem bezüglich einer Anwendung generierter Dendritischer Zeilen in einem Testsystem auf sensibilisierende Substanzen ist, dass diese Zellen in Kultur zu einer spontanen, von Stimulation von außen unabhängigen Reifung neigen. Detektiert werden soll aber gerade eine potentielle allergeninduzierte Reifung. Ein Zellkulturverfahren, aus dem Dendritische Zellen mit typischen Merkmalen authentischer Langerhanszellen resultieren, benutzt für die Generierung aus CD14+ Zellen eine Kombination der Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β. So generierte Zellen neigen nicht zu spontaner Reifung, aber solitär kultiviert bleiben auch bei diesem System überzeugende Reaktionen der Zellen auf Allergene aus (Geissmann et al., 1998; Geissmann et al., 1999; Aiba et al., 2000; Peiser et al., 2004). Another problem related to the application of generated dendritic cells in a test system to sensitizing substances is that these cells in culture are prone to spontaneous, external stimulation-independent maturation. But to be detected is currently a potential allergen-induced maturation. A cell culture procedure that yields dendritic cells with typical characteristics of authentic Langerhans cells uses a combination of cytokines IL-4, GM-CSF and TGF-β for the generation of CD14 + cells. Cells thus generated are not prone to spontaneous maturation, but solitary cultured in this system remain convincing responses of the cells to allergens (Geissmann et al., 1998, Geissmann et al., 1999, Aiba et al., 2000, Peiser et al. , 2004).

Niedermolekulare Allergene sind Haptene, die an Proteine gebunden werden müssen, bevor sie Immunreaktionen auslösen können. An dieser Proteinbindung sind Keratinozyten beteiligt. Keratinozyten könnten außerdem zur Reifung Dendritischer Zellen nach Allergenkontakt beitragen, indem sie Gefahrsignale an die Dendritischen Zellen senden (Vandebriel et al., 2005). In einem zellbasierten Testsystem für sensibilisierende Substanzen sollten daher Dendritische Zellen und Keratinozyten kombiniert benutzt werden.Low molecular weight allergens are haptens that need to be bound to proteins before they can trigger immune responses. Keratinocytes are involved in this protein binding. Keratinocytes could also contribute to the maturation of dendritic cells after allergen exposure by sending danger signals to the dendritic cells (Vandebriel et al., 2005). Dendritic cells and keratinocytes should therefore be used in combination in a cell-based sensitizer test system.

Primäre humane Keratinozyten können in-vitro zu einer dreidimensionalen Zellkultur herangezüchtet werden, die Zellschichten verschiedener Differenzierungsstufen aufweist. Einige Modelle beinhalten alle epidermalen Schichten, von der basalen Schicht bis zur Hornschicht. Die basalen Keratinozyten liegen meist auf einer Schicht von Fibroblasten, die ihrerseits auf eine Kollagenmatrix aufgebracht wurden. Solche Kulturen werden als Hautäquivalent, Epidermis-Äquivalent, organtypisches Hautmodell oder rekonstruierte Epidermis bezeichnet (Bell et al., 1981; Limat and Hunziker, 2002). Epidermis-Äquivalente unter anderem zur Testung auf Irritantien und Toxine werden beispielsweise angeboten von den Firmen SkinEthic (Nizza, Frankreich), CellSystems (St. Katharinen, Deutschland), Euroderm (Leipzig, Deutschland) oder MatTek Inc. (Massachussets, USA).Primary human keratinocytes can be cultured in vitro to form a three-dimensional cell culture which has cell layers of different differentiation levels. Some models include all epidermal layers, from the basal layer to the horny layer. The basal keratinocytes are usually located on a layer of fibroblasts, which in turn were applied to a collagen matrix. Such cultures are referred to as dermal equivalent, epidermis equivalent, organtypic skin model or reconstructed epidermis (Bell et al., 1981; Limat and Hunziker, 2002). Epidermis equivalents for testing for irritants and toxins, for example, are offered by the companies SkinEthic (Nice, France), CellSystems (St. Katharinen, Germany), Euroderm (Leipzig, Germany) or MatTek Inc. (Massachussets, USA).

Ein in-vitro Testsystem zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, das auf derart rekonstruierter Epidermis basiert, sollte zusätzlich Dendritische Zellen enthalten. Wird allerdings Epidermis in organische Kultur genommen, wandern die Langerhanszellen spontan aus der Epidermis in das Kulturmedium aus (Larsen et al., 1990). Es ist nicht bekannt, ob in der Epidermis zwischen suprabasalen Keratinozyten und Langerhanszellen tatsächlich feste Zellkontakte bestehen oder ob schon unreife Langerhanszellen beweglich sind. Vereinzelt wurde von mehrschichtigen Hautäquivalenten berichtet, in die sich Vorläufer Dendritischer Zellen kohärent integrieren und dann differenzieren ließen (Facy et al., 2004; Schaerli et al., 2005). Im Patent EP 0 789 074 B1 ist beschrieben, wie CD34+ Vorläuferzellen in ein Epidermisäquivalent eingebracht werden, differenzieren und sich dann suprabasal in das Epidermisäquivalent integrieren. Die Offenlegungsschrift DE 10 2004 061 289 A1 beschreibt die Integration von Immunzellen in ein Testkit, das aus einem geschichteten Epidermisäquivalent besteht. Unklar ist, wieso, anders als in-vivo, die Dendritischen Zellen im Hautäquivalent gebunden werden und es bleiben sollen, bis ihre Reifung induziert wird. Es gibt kein anerkanntes Testkit zur in-vitro Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, das auf geschichteten Hautäquivalenten mit integrierten Dendritischen Zellen basiert. Probleme bereiten eine hohe Spendervarianz bezüglich der Testergebnisse, schlechte Kohärenz der sich im Modell befindlichen Zellen sowie der Einfluss der Fibroblasten auf die Testergebnisse.An in vitro test system for determining the sensitizing potential of a substance based on such reconstructed epidermis should additionally contain dendritic cells. However, if epidermis is taken into organic culture, the Langerhans cells migrate spontaneously from the epidermis into the culture medium (Larsen et al., 1990). It is not known whether there are any solid cell contacts in the epidermis between suprabasal keratinocytes and Langerhans cells, or whether immature Langerhans cells are mobile. There have been isolated reports of multi-layered skin equivalents, in which precursors of dendritic cells can be coherently integrated and then differentiated (Facy et al., 2004, Schaerli et al., 2005). In the patent EP 0 789 074 B1 describes how CD34 + progenitor cells are introduced into an epidermis equivalent, differentiate and then integrate suprabasally into the epidermis equivalent. The publication DE 10 2004 061 289 A1 describes the integration of immune cells into a test kit consisting of a layered epidermis equivalent. It is unclear why, unlike in vivo, the dendritic cells are bound in the skin equivalent and should remain until their maturation is induced. There is no recognized test kit for in vitro determination of the sensitizing potential of a substance based on stratified skin equivalents with integrated dendritic cells. There are problems with high donor variance in terms of test results, poor coherence of the cells in the model and the influence of the fibroblasts on the test results.

Vor diesem Hintergrund präsentiert die vorliegende Erfindung ein Testkit zur Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, bestehend aus einer lockeren Kokultur einer einschichtigen Lage von humanen nicht-differenzierenden Keratinozyten und aus beweglichen Dendritischen Zellen, die mittels IL-4, GM-CSF und TGF-β aus humanen allogenen CD14+ Monozyten in Anwesenheit der Keratinozyten generiert werden.Against this background, the present invention presents a test kit for determining the sensitizing potential of a substance consisting of a loose co-culture of a monolayer of human non-differentiating keratinocytes and of mobile dendritic cells produced by IL-4, GM-CSF and TGF-β are generated from human allogeneic CD14 + monocytes in the presence of keratinocytes.

Die im Testkit eingesetzten Keratinozyten sind humane normale Keratinozyten, die während ihrer ersten Kultur durch „Antrypsinieren” hinsichtlich starker Adhärenz an Zellkultur-Plastikmaterial selektiert wurden sein können.The keratinocytes used in the kit are human normal keratinocytes, which may have been selected by "trypsinizing" for their adherence to cell culture plastic material during their first culture.

Die kokultivierten Keratinozyten erreichen ein aktiviertes Stadium, das vergleichbar ist mit dem Stadium von an der Wundheilung beteiligten Keratinozyten. Dies ist z. B. an der hohen Sekretionsrate der Metalloproteinase MMP-9 erkennbar.The co-cultured keratinocytes reach an activated stage that is comparable to the stage of keratinocytes involved in wound healing. This is z. B. recognizable by the high secretion rate of the metalloproteinase MMP-9.

Das Zellkulturmedium muss eine Differenzierung der Keratinozyten nicht unterstützen, z. B. durch eine niedrige Calciumkonzentration.The cell culture medium need not support differentiation of keratinocytes, e.g. B. by a low calcium concentration.

Das vorgeschlagene Testkit kann sensibilisierende Substanzen anhand der Erhöhung von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen detektieren. Bevorzugt wird die CD86-Expression auf den Dendritischen Zellen per FACS-Analyse gemessen (verwendeter Antikörper z. B. R-Phycoerythrin mouse anti-human CD86 (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland)). Weiterhin bevorzugt erfolgt für die FACS-Analyse eine Doppelfärbung zur Identifizierung der Zellen, z. B. CD86/CD11c (verwendeter Antikörper z. B. mouse anti-human CD11c:FITC (z. B. von Serotec, Düsseldorf, Deutschland)) oder CD86/HLA-DR (verwendeter Antiköper z. B. FITC-conjugated mouse anti-human HLA-DR (z. B. von BD)) oder CD86/CDIc (z. B. human CD1c-FITC von Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland), Dabei sind Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Detektion sensibilisierender Substanzen deutlich besser als bei bisherigen Assays.The proposed test kit can detect sensitizing substances by increasing the maturity markers of dendritic cells. Preferably, CD86 expression on the dendritic cells is measured by FACS analysis (used antibody eg R-phycoerythrin mouse anti-human CD86 (eg from BD, Heidelberg, Germany)). Further preferred for the FACS analysis is a double staining to identify the cells, eg. CD86 / CD11c (used antibody eg mouse anti-human CD11c: FITC (eg from Serotec, Dusseldorf, Germany)) or CD86 / HLA-DR (used antibodies eg FITC-conjugated mouse anti-human HLA-DR (eg from BD)) or CD86 / CDIc (eg human CD1c-FITC from Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany) Sensitivity and reproducibility of the detection of sensitizing substances significantly better than previous assays.

Dosis-Wirkungs-Beziehungen bislang ungeprüfter Substanzen können bestimmt und mit bekannten Allergenen verglichen werden, deren Potential z. B. aus LLNA-Assays verifiziert ist. Damit lässt sich die Stärke des sensibilisierenden Potentials einer Testsubstanz in Kategorien bezüglich ihrer Wirkstärke einteilen. Es können effektive Konzentrationen angegeben werden.Dose-response relationships of previously unchecked substances can be determined and compared with known allergens whose potential z. B. is verified from LLNA assays. This allows the strength of the sensitizing potential of a test substance to be categorized according to its potency. Effective concentrations can be specified.

Eine messbare Reifung der Dendritischen Zellen durch Kontakt mit sensibilisierenden Substanzen erfolgt bereits weit unterhalb irritierender oder toxischer Konzentrationen. Die Viabilität der Dendritischen Zellen kann durch die Färbrate mit 7-AAD (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland) oder Propidiumiodid (z. B. von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) bestimmt werden. Damit kann das Testkit sensibilisierend und irritierend wirkende Konzentrationen einer Substanz differenzieren.A measurable maturation of the dendritic cells by contact with sensitizing substances is already well below irritating or toxic concentrations. The viability of the dendritic cells can be determined by staining with 7-AAD (eg from BD, Heidelberg, Germany) or propidium iodide (eg from Sigma, Deisenhofen, Germany). Thus, the test kit can differentiate sensitizing and irritating concentrations of a substance.

Die Zugabe des Cytokins TGF-β bedingt, dass die Dendritischen Zellen im Testkit nicht zu spontaner Reifung neigen.The addition of the cytokine TGF-β implies that the dendritic cells in the test kit are not prone to spontaneous maturation.

Es besteht kein nennenswerter Einfluss der Zell-Spender auf die Testergebnisse. Es ist nicht notwendig, Spender zu poolen.There is no appreciable influence of the cell donors on the test results. It is not necessary to pool donors.

Da keine Zellen des spezifischen Immunsystems ins Testkit integriert sind, müssen Keratinozyten und Dendritische Zellen, bzw. ihre Vorläufer, nicht vom selben Spender stammen.Since no cells of the specific immune system are integrated into the test kit, keratinocytes and dendritic cells, or their precursors, do not have to come from the same donor.

Das Testkit lässt sich aus cryokonservierten Zellen herstellen.The test kit can be made from cryopreserved cells.

Die Kokultur erfolgt serumfrei (z. B. in KGM (PromoCell, Heidelberg, Deutschland)).Coculture is serum-free (eg in KGM (PromoCell, Heidelberg, Germany)).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne dass sie einschränkend zu verstehen sind.The following examples illustrate the invention without being limiting.

Beispiel für die Herstellung eines Testkits, bestehend aus einer lockeren Kokultur von humanen Keratinozyten und beweglichen humanen Dendritischen Zellen, die aus Vorläuferzellen durch die Cytokine IL-4, GM-CSF und TGF-β in Anwesenheit der Keratinozyten generiert werden.Example of a test kit consisting of a loose coculture of human keratinocytes and mobile human dendritic cells generated from progenitor cells by cytokines IL-4, GM-CSF and TGF-β in the presence of keratinocytes.

1. Vorbereitende Arbeiten1. Preparatory work

1.1 Selektion und Cryokonservierung primärer humaner Keratinozyten1.1 Selection and cryopreservation of primary human keratinocytes

Normale menschliche Hautproben sind mit der Erlaubnis lokaler Ethikkomitees als übrigbleibendes Material nach chirurgischen Eingriffen, wie einer Mammareduktion, erhältlich. Alle Arbeiten erfolgen unter sterilen Bedingungen. Die Haut wird in Streifen geschnitten und 18 Stunden lang bei 4°C in einem Medium inkubiert, das 3 RMB units Dispase I (z. B. von Roche, Mannheim, Deutschland) in PBS (z. B. von Gibco, Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland) enthält. Danach bisst sich die Dermis abziehen. Die epidermalen Streifen werden 15 Minuten lang bei 37°C in einer Lösung inkubiert, die 0.25% Trypsin (z. B. von Biochrom, Berlin, Deutschland) und 0.01% DNase (z. B. von Roche, Mannheim, Deutschland) in PBS enthält. Dabei zerfällt die Epidermis in eine Einzelzellsuspension, die durch ein 40 μm Zellsieb (z. B. von BD, Heidelberg, Deutschland) passagiert und anschlieβend dreimal mit PBS gewaschen wird. Die Keratinozyten werden dann in einem serumfreien Zellkulturmedium wie KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) resuspendiert und auf Zellkulturflaschen ausgesät, die für adhärierende Säugetierzellen geeignet sind (z. B. Costar Cell Culture Flask, von Corning Incorporated, Schiphol-Rijk, Niederlande). Die Dichte wird auf 2–5 × 105 Zellen/cm2 (Durchmesser > 8 um) eingestellt, und die Zellkulturflaschen werden in einem Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am Tag nach der Aussaat und danach an jedem zweiten Tag werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit frischem Medium versorgt. Etwa 8 Tage nach der Aussaat erfolgt bei erfolgreicher Bildung von Keratinozyteninseln eine Selektion durch „Antrypsinieren”. Die Zellen werden 3 Minuten lang bei Raumtemperatur 1 × Trypsin (Biochrom, Berlin, Deutschland) ausgesetzt, wodurch mir kräftig haftende, viable Zellen nicht abschwimmen. Nach Stoppen der Trypsinaktivität und Waschen mit PBS werden die selektierten Zellen bis zur Konfluenz weiterkultiviert. Die Ernte der Zellen erfolgt durch Ablösen von den Zellkulturflaschen durch Inkubation mit 1 × Trypsin für 15 Minuten bei 37°C. Dann wird 5% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (z. B. von Gibco, Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Deutschland) in PBS zugegeben. Nach zweimaligen Waschen in PBS werden die Zellen in hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum mit 10% DMSO (z. B. Hybrimax von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in einer Dichte von etwa 6 × 106 Zellen > 8 μm/ml resuspendiert, 1 ml-weise portioniert, langsam in einer Cryobox (z. B. in einem Cryo 1°C Freezing Container von Nalgene (Batavia, IL, USA)) auf –80°C heruntergekühlt und dann in flüssigem Stickstoff cryokonserviert. Jede Charge wird eifern Endotoxintest unterzogen, bevorzugt dem Limulus amoebocyte lysate Test (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA).Normal human skin specimens are available with the approval of local ethics committees as residual material after surgical procedures such as mammary reduction. All work is done under sterile conditions. The skin is cut into strips and incubated for 18 hours at 4 ° C in a medium containing 3 RMB units Dispase I (eg from Roche, Mannheim, Germany) in PBS (eg from Gibco, Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Germany). Then the dermis will peel off. The epidermal strips are incubated for 15 minutes at 37 ° C in a solution containing 0.25% trypsin (eg from Biochrom, Berlin, Germany) and 0.01% DNase (eg from Roche, Mannheim, Germany) in PBS contains. The epidermis breaks down into a single cell suspension, which is passaged through a 40 μm cell strainer (eg from BD, Heidelberg, Germany) and subsequently washed three times with PBS. The keratinocytes are then resuspended in a serum-free cell culture medium such as KGM-2 supplemented (PromoCell, Heidelberg, Germany) and seeded on cell culture flasks suitable for adherent mammalian cells (e.g., Costar Cell Culture Flask, Corning Incorporated, Schiphol). Rijk, The Netherlands). The density is adjusted to 2-5 x 10 5 cells / cm 2 (diameter> 8 μm) and the cell culture bottles are incubated in an incubator at 37 ° C, 5% CO2 and 95% humidity. On the day after sowing and every other day thereafter, the cells are washed with PBS and supplied with fresh medium. Approximately 8 days after sowing, successful selection of keratinocyte islands results in selection by "trypsinization". The cells are exposed to 1 × trypsin (Biochrom, Berlin, Germany) for 3 minutes at room temperature, which prevents me from vigorously adhering vigorous, viable cells. After stopping the trypsin activity and washing with PBS, the selected cells are further cultured to confluency. Cells are harvested by peeling off the cell culture flasks by incubation with 1X trypsin for 15 minutes at 37 ° C. Then 5% heat-inactivated fetal calf serum (eg, from Gibco, Invitrogen Corporation, Karlsruhe, Germany) in PBS is added. After washing twice in PBS, the cells are resuspended in heat-inactivated fetal calf serum with 10% DMSO (eg Hybrimax from Sigma, Deisenhofen, Germany) at a density of about 6 x 10 6 cells> 8 μm / ml, 1 ml-wise portioned, slowly cooled to -80 ° C in a cryobox (eg, in a Cryo 1 ° C freezing container from Nalgene (Batavia, IL)) and then cryopreserved in liquid nitrogen. Each batch is subjected to endotoxin testing, preferably the Limulus amoebocyte lysate assay (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA).

1.2 Cryokonservierung humaner Monozyten1.2 Cryoconservation of human monocytes

Humane Monozyten werden bevorzugt aus Leukozytenkonzentrat (buffy coat, z. B. von DRK-Blutspendediensten, Deutschland) isoliert, können aber auch aus Vollblut gereinigt werden. Das Konzentrat wird 1:2 mit PBS verdünnt, und es wird eine Ficoll-(z. B. von Biochrom, Berlin, Deutschland)Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Die Leukozytenfraktion wird entnommen und solange mit PBS gewaschen, bis die Überstände klar sind. Anschließend werden aus den Leukozyten die Monozyten bevorzugt durch magnetisches Sortieren (MACS) weiter aufgereinigt. Bevorzugt werden hier das Oberflächenantigen CD14 nach Herstellerprotokoll (CD 14 MicroBeads, human (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland)) oder das human Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi) benutzt. Die isolierten CD 14+-Monozyten werden in fötalem Kälberserum (z. B. von Gibco) mit 10% DMSO (z. B. Hybrimax von Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in einer Dichte von 2–3 × 10 Zellen > 8 μm/ml resuspendiert und cryokonserviert wie oben für die Keratinozyten beschrieben. Jede Charge wird einem Endotoxintest unterzogen, bevorzugt dem Limulus amoebocyte lysate test (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA).Human monocytes are preferably isolated from leukocyte concentrate (buffy coat, eg from DRK blood donation services, Germany), but can also be purified from whole blood. The concentrate is diluted 1: 2 with PBS and a Ficoll (eg from Biochrom, Berlin, Germany) density gradient centrifugation is performed. The leukocyte fraction is removed and washed with PBS until the supernatants are clear. Subsequently, the monocytes are further purified from the leukocytes, preferably by magnetic sorting (MACS). The surface antigen CD14 according to the manufacturer's protocol (CD 14 MicroBeads, human (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)) or the human monocyte isolation kit II (Miltenyi) are preferably used here. The isolated CD 14 + monocytes are transfected into fetal calf serum (eg from Gibco) with 10% DMSO (eg Hybrimax from Sigma, Deisenhofen, Germany) at a density of 2-3 x 10 cells> 8 μm / ml are resuspended and cryopreserved as described above for the keratinocytes. Each lot undergoes an endotoxin test, preferably the Limulus amoebocyte lysate test (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA).

1.3. Cryokonservierung humaner Leukozyten1.3. Cryoconservation of human leukocytes

Alternativ werden Monozyten über ihre im Vergleich zu anderen Leukozyten stärkere Adhärenz an Zellkulturschalen und an Keratinozyten angereichert. Für diese spätere Anwendung werden nach der Dichtegradientenzentrifugation die gewaschenen Leukozyten (PBMC) ohne weitere Aufreinigung cryokonserviert wie oben beschrieben.Alternatively, monocytes are enriched by their greater adherence to cell culture dishes and keratinocytes compared to other leukocytes. For this later application, after density gradient centrifugation, the washed leukocytes (PBMC) are cryopreserved without further purification as described above.

2. Aussaat des Testkits2. Sow the test kit

2.1. Aussaat der cryokonservierten Keratinozyten2.1. Sow the cryopreserved keratinocytes

Cryokonservierte Keratinozyten, beschrieben in 1.1, werden in einem 37°C-Wasserbad aufgetaut und mehrfach in PBS gewaschen. Danach werden die Keratinozyten in ein serumfreies Zellkulturmedium überführt. Vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) benutzt. Die Zelldichte wird so gewählt, dass sich nach der Aussaat 2–6 × 104 Zellen > 8 μm/cm2 in der Testschale (z. B. Costar Cell Culture Cluster, von Corning Incorporated, Schiphol-Rijk, Niederlande) befinden. Die Zellkulturen werden am nächsten Tag mit PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium versorgt. Die Kultivierung erfolgt solange, bis die heranwachsenden Keratinozyteninseln die Fläche der Testschale halb bedecken (halbkonfluent). Dies wird innerhalb von 2–4 Tagen erreicht.Cryopreserved keratinocytes, described in 1.1, are thawed in a 37 ° C water bath and washed several times in PBS. Thereafter, the keratinocytes are transferred to a serum-free cell culture medium. Preferably, KGM-2 is used with Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Germany). The cell density is chosen so that after sowing 2-6 × 10 4 cells> 8 μm / cm 2 are in the test dish (eg Costar Cell Culture Cluster, from Corning Incorporated, Schiphol-Rijk, Netherlands). The cell cultures are washed the next day with PBS and supplied with fresh cell culture medium. The cultivation takes place until the growing keratinocyte islands half cover the surface of the test dish (semi-confluent). This is achieved within 2-4 days.

2.2 Aussaat der cryokonservierten Monozyten2.2 Sowing the cryopreserved monocytes

Cryokonservierte Monozyten, beschrieben in 1.2, werden in einem 37°C-Wasserbad aufgetaut und mehrfach in PBS gewaschen. Danach werden die Monozyten in ein serumfreies Zellkulturmedium überführt, das für sie und für Keratinozyten gleichzeitig geeignet ist. Vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) benutzt. Die Testschale, die bereits halbkonfluent adhärierende Keratinozyten, wie in 2.1 beschrieben, enthält, wird mit PBS gewaschen, und dann wird die Flüssigkeit abgesaugt. Auf die Keratinozyten werden die Monozyten ausgesät. Die Zelldichte der Monozyten wird so gewählt, dass sich nach der Aussaat 2–5 × 10 Zellen der Monozytenpräparation > 8 μm/cm2 zusätzlich zu den Keratinozyten in der Testschale befinden. Die Monozyten adhärieren zunächst an das Plastikmaterial und an die Keratinozyten, lösen sich aber nach einigen Stunden größtenteils wieder ab. Es entsteht eine Kokultur aus adhärenten Keratinozyten, auf denen locker Monozyten aufliegen. Die Viabilität der Monozyten wird durch die Keratinozyten aufrecht erhalten.Cryopreserved monocytes, described in 1.2, are thawed in a 37 ° C water bath and washed several times in PBS. Thereafter, the monocytes are transferred to a serum-free cell culture medium which is suitable for them and for keratinocytes simultaneously. Preferably, KGM-2 is used with Supplement Mix (PromoCell, Heidelberg, Germany). The test dish, which already contains semi-confluent adherent keratinocytes as described in 2.1, is washed with PBS and then the liquid is aspirated. The monocytes are seeded on the keratinocytes. The cell density of the monocytes is selected such that after sowing 2-5 × 10 cells of the monocyte preparation are> 8 μm / cm 2 in addition to the keratinocytes in the test shell. The monocytes initially adhere to the plastic material and the keratinocytes, but dissolve mostly after a few hours again. The result is a coculture of adherent keratinocytes on which loose monocytes rest. The viability of the monocytes is maintained by the keratinocytes.

2.3 Aussaat cryokonservierter Leukozyten2.3 Sowing of cryopreserved leukocytes

Alternativ zu 2.2 können, nachdem in der Testschale die Keratinozyten gewaschen sind und die Flüssigkeit abgesaugt ist, cryokonservierte Leukozyten, wie in 1.3 beschrieben, nach Auftauen, Waschen und Aufnahme ins Zellkulturmedium (vorzugsweise wird KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell) benutzt) auf die Keratinozyten ausgesät werden. Hierbei werden Zelldichten der Leukozyten so gewählt, dass in der Zellkulturschale Leukozytendichten von 1–2 × 106 Zellen > 8 μm/cm2 vorliegen. Nach 2–3 Stunden werden Zellen, die nicht an das Plastikmaterial oder an die Keratinozyten haften, mit 37°C warmen Zellkulturmedium abgespült and abgesaugt. Anschließend wird frisches Zellkulturmedium zugegeben.As an alternative to 2.2, after the keratinocytes are washed in the test dish and the liquid is aspirated, cryopreserved leukocytes, as described in 1.3, after thawing, washing and uptake into the cell culture medium (preferably KGM-2 is used with Supplement Mix (PromoCell)) the keratinocytes are sown. In this case, cell densities of the leukocytes are selected such that leukocyte densities of 1-2 × 10 6 cells> 8 μm / cm 2 are present in the cell culture dish. After 2-3 hours, cells which do not adhere to the plastic material or to the keratinocytes are rinsed off with 37 ° C. warm cell culture medium and aspirated. Subsequently, fresh cell culture medium is added.

3. Generierung Dendritischer Zellen3. Generation of dendritic cells

2–3 Stunden nach der Aussaat der Monozyten auf die Keratinozytenkulturen, wie in 2.2 beschrieben, bzw. nach dem Abspülen nicht-adhärenter Leukozyten, wie in 2.3 beschrieben. werden die rekombinanten humanen Cytokine IL-4 ad 100 ng/ml (z. B. von Immuntools, Friesoythe, Deutschland), GM-CSF ad 100 ng/ml (z. B. von Immuntools) und TGF-β1 ad 10 ng/ml (z. B. von R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) zugegeben. An Tag 2 und an Tag 4 der Kokultur werden GM-CSF ad 100 ng/ml und TGF-β1 ad 10 ng/ml zugegeben. An Tag 5–6 ist die Kokultur als Testkit benutzbar.2-3 hours after seeding of the monocytes on the keratinocyte cultures, as described in 2.2, or after rinsing non-adherent leukocytes, as described in 2.3. the recombinant human cytokines IL-4 ad 100 ng / ml (eg from Immuntools, Friesoythe, Germany), GM-CSF ad 100 ng / ml (eg from Immuntools) and TGF-β1 ad 10 ng / ml (eg from R & D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany). GM-CSF ad 100 ng / ml and TGF-β1 ad 10 ng / ml are added on day 2 and day 4 of coculture. On days 5-6 the coculture can be used as a test kit.

Anwendungsbeispiel example

Bestimmung der Konzentration, bei der eine Testsubstanz im Testkit eine halbmaximale Reifung der Dendritischen Zellen induziertDetermination of the concentration at which a test substance in the test kit induces a half-maximal maturation of the dendritic cells

Ein Testkit wird in einer 12-Loch Testschale (Costar Cell Culture Cluster von Corning Inc.) mit Zellen wie im Herstellungsverfahren in 1.1 und 1.2 beschrieben nach Herstellungsverfahren 2.1 und 2.2 hergestellt. Die zu testende Substanz wird in einem geeigneten Lösungsmittel (wie Wasser, DMSO, Ethanol, Ölgemische) in maximal möglicher Konzentration gelöst. Den Vertiefungen der Testschale mit den Kokulturen wird zu jeweils 2 ml Zellkulturmedium KGM-2 mit Supplement Mix (PromoCell) die Testsubstanz in einer Verdünnungsreihe zugegeben. Dabei wird die Testsubstanz vor Zugabe zum Testkit so verdünnt, dass in den Kokulturen gleiche Endkonzentrationen des Lösungsmittels vorliegen. Es werden jeweils Doppelwerte angelegt. Das Testkit wird nach Zugabe der Testsubstanz 24 Stunden lang in einem Brutschrank inkubiert. Danach werden die nicht-adhärenten Zellen mit dem Zellkulturmedium abgezogen und in FACS-Röhrchen überführt (5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube, BD Falcon, Heidelberg, Deutschland). Nach einer Zentrifugation (334 rpm, 4 min., 20°C) werden für mögliche spätere ELISA-Assays die Medien abgenommen, ihr exaktes Volumen bestimmt und bei –80°C gelagert. Die Zellen werden 2 × in PBS gewaschen, und jede Probe wird in zwei Aliquote aufgeteilt. Je eins der Aliquote wird mit je 5 μl der Antikörperlösungen CD11c:FITC (von Serotec) und CD86-PE (von BD) für die FACS-Analyse gefärbt. Das jeweils zweite Aliquot wird mit 20 μl 7-AAD (Cell Viability Solution von BD) gefärbt. Es werden nur Proben mit mehr als 85% vitalen Zellen hinsichtlich ihrer CD86-Expression ausgewertet. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) für CD86 werden für CD11c-positive Zellen bestimmt. Die MFI-Werte der Testsubstanz-Proben werden durch den MFI-Mittelwert der Lösungsmittel-Proben dividiert. Die resultierenden Faktoren werden gegen die Konzentration der Testsubstanz aufgetragen, und aus der Kurve wird die Konzentration der Testsubstanz bestimmt, die zu halbmaximaler Erhöhung der MFI-Werte für CD86 führt. Nach Durchführung unabhängiger Tests unter Verwendung von Zellen, die von jeweils 3 verschiedenen Spendern für die Keratinozyten und für die Monozyten stammen. ergibt sich die Konzentration, die eine mittlere halbmaximale CD86-MPI-Erhöhung bewirkt.A test kit is prepared in a 12-well test dish (Costar Cell Culture Cluster from Corning Inc.) with cells as described in Preparation Method 1.1 and 1.2 according to Preparation Methods 2.1 and 2.2. The substance to be tested is dissolved in a suitable solvent (such as water, DMSO, ethanol, oil mixtures) in the maximum possible concentration. The test substance in a dilution series is added to the wells of the test dish with the cocultures in each case to 2 ml cell culture medium KGM-2 with Supplement Mix (PromoCell). The test substance is diluted in such a way before addition to the test kit that the final concentrations of the solvent are the same in the cocultures. In each case double values are created. The test kit is incubated for 24 hours in an incubator after addition of the test substance. Thereafter, the non-adherent cells are withdrawn with the cell culture medium and transferred to FACS tubes (5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube, BD Falcon, Heidelberg, Germany). After centrifugation (334 rpm, 4 min., 20 ° C), the media are removed for possible later ELISA assays, their exact volume determined and stored at -80 ° C. The cells are washed 2X in PBS and each sample is split into two aliquots. Each one of the aliquots is stained with 5 μl each of the antibody solutions CD11c: FITC (from Serotec) and CD86-PE (from BD) for the FACS analysis. The second aliquot is stained with 20 μl of 7-AAD (Cell Viability Solution from BD). Only samples with more than 85% vital cells are evaluated for their CD86 expression. The mean fluorescence intensities (MFI) for CD86 are determined for CD11c-positive cells. The MFI values of the test substance samples are divided by the MFI mean of the solvent samples. The resulting factors are plotted against the concentration of the test substance and from the curve the concentration of the test substance is determined which leads to half maximal increase of the MFI values for CD86. After conducting independent tests using cells derived from each of 3 different donors for the keratinocytes and for the monocytes. gives the concentration that causes a mean half-maximal CD86-MPI increase.

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Claims (15)

Verfahren zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, mit den Schritten: a) Humane Monozyten und Keratinozyten werden bereitgestellt und in Kokultur genommen. b) es wird die Einwirkung von Cytokinen auf diese Zellen gewährleistet, z. B. indem die Cytokine zugesetzt werden, wobei die folgenden Vorgänge c) bis e) gezielt ausgelöst werden. c) unter Aktivierung der Keratinozyten durch die Cytokine kommt es zur Differenzierung der Monozyten zu Dendritischen Zellen, hierdurch erfolgt die Generierung spezifisch für das Testverfahren geeigneter Dendritischer Zellen, d) zusätzlich wirken die Cytokine direkt auf die Differenzierung der Monozyten, e) Entstehung einer lockeren Kokultur aus aktivierten humanen Keratinozyten, die nicht ausdifferenziert sind, und aus beweglichen humanen Dendritischen Zellen, f) wobei keine weiteren Träger wie Kollagen/Fibroblastenschichten verwendet werden, g) Zugabe der auf ihr Sensibilisierungspotential zu testenden Substanz(en) zur fertigen Kokultur, h) Bestimmung der Expression von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen, wie z. B. CD86.Method for the non-animal-free determination of the sensitizing potential of a substance, comprising the steps: a) Human monocytes and keratinocytes are provided and cocultured. b) it ensures the action of cytokines on these cells, z. As by the cytokines are added, the following operations c) to e) are triggered specifically. c) activation of the keratinocytes by the cytokines leads to differentiation of the monocytes into dendritic cells, as a result of which the generation of dendritic cells which are specific for the test procedure takes place, d) additionally the cytokines act directly on the differentiation of the monocytes, e) formation of a loose co-culture from activated human keratinocytes, which are not differentiated, and from mobile human dendritic cells, f) where no further carriers such as collagen / fibroblast layers are used, g) addition of the substance (s) to be tested for sensitization potential to the finished co-culture, h) Determination of the expression of maturation markers of dendritic cells, such. Eg CD86. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Cytokine zumindest IL-4. GM-CSF und/oder TGF-β sind.The method of claim 1, wherein the cytokines are at least IL-4. GM-CSF and / or TGF-β. In-vitro-Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche, zumindest umfassend a) humanes Leukozytenkonzentrat, humane Keratinozyten und Cytokine oder b) humane Monozyten, humane Keratinozyten und Cytokine.In vitro test kit for carrying out the method according to one of the preceding claims, comprising at least a) human leukocyte concentrate, human keratinocytes and cytokines or b) human monocytes, human keratinocytes and cytokines. Testkit nach Anspruch 3, zusätzlich umfassend Mittel zum Nachweis der Expression von Reifungsmarkern Dendritischer Zellen, z. B. Antikörper zum Nachweis von CD86.Test kit according to claim 3, additionally comprising means for detecting the expression of Maturation markers of dendritic cells, e.g. For example, antibodies to detect CD86. Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Testkits nach Anspruch 3 zur tierversuchsfreien Bestimmung des sensibilisierenden Potentials einer Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass in einem für die Kultur von Säugerzellen geeigneten Plastikmaterial humane Keratinozyten und humane Monozyten kokultiviert werden.A method for producing an in vitro test kit according to claim 3 for the non-animal determination of the sensitizing potential of a substance, characterized in that in a suitable for the culture of mammalian cells plastic material, human keratinocytes and human monocytes are cocultivated. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinozyten cryokonserviert gewesen sein können.A method according to claim 5, characterized in that the keratinocytes may have been cryopreserved. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass bevorzugt Keratinozyten eingesetzt werden, die während ihrer ersten Kultivierung durch Antrypsinieren hinsichtlich starker Adhärenz an Plastikmaterial selektiert wurden.Method according to one of claims 5 or 6, characterized in that preferably keratinocytes are used, which were selected during their first cultivation by Antrypsinieren for strong adherence to plastic material. Verfahren nach einem der Anspruchs 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten nach erfolgter Adhäsion den Keratinozyten zugefügt werden.Method according to one of claims 5 to 7, characterized in that the monocytes are added after adhesion to the keratinocytes. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten bereits vor dem Einfügen in die Kokultur durch magnetisches Sortieren aus Vollblut oder Leukozytenkonzentrat angereichert wurden oder alternativ, dass die Monozyten erst in der Kokultur angereichert wurden, indem ans einer ausgesäten Leukozytenfraktion Zellen selektiert wurden, die stärker an die Plastikoberfläche des Zellkulturmaterials oder an die bereits enthaltenen Keratinozyten haften.Method according to one of claims 5 to 8, characterized in that the monocytes were enriched prior to insertion into the coculture by magnetic sorting of whole blood or leukocyte concentrate or alternatively, that the monocytes were enriched only in coculture by cells sown on a leukocyte fraction were selected that adhere more strongly to the plastic surface of the cell culture material or to the already contained keratinocytes. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetisch angereicherten Monozyten und die Leukozytenfraktion cryokonserviert gewesen sein können.Method according to one of claims 5 to 9, characterized in that the magnetically enriched monocytes and the leukocyte fraction may have been cryopreserved. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Zugabe der Monozyten die Cytokine IL-4, GM-CSF und/oder TGF-β zugegeben werden, so dass die Monozyten zu Dendritischen Zellen differenzieren und die Keratinozyten aktiviert werden.Method according to one of claims 5 to 10, characterized in that after the addition of the monocytes, the cytokines IL-4, GM-CSF and / or TGF-β are added, so that the monocytes differentiate into dendritic cells and the keratinocytes are activated. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Kokultur nach erfolgter Differenzierung der Monozyten zu Dendritischen Zellen als Testkit benutzt werden kann.Method according to one of claims 5 to 11, characterized in that the co-culture can be used after the differentiation of the monocytes to dendritic cells as a test kit. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass serumfreie Zellkulturmedien benutzt werden können,Method according to one of claims 5 to 12, characterized in that serum-free cell culture media can be used, Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Keratinozyten und Monozyten nicht vom selben Spender stammen müssen.Method according to one of claims 5 to 13, characterized in that keratinocytes and monocytes need not originate from the same donor. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen nicht von verschiedenen Spendern gepoolt werden müssen.Method according to one of claims 5 to 14, characterized in that the cells do not have to be pooled by different donors.
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