DE102007006585B3 - Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran modifiziert - Google Patents

Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran modifiziert Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes (W), welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes (12) im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran (11') modifiziert, und eine Biosensoranordnung, eine Vorrichtung für die amperometrische und/oder potentiometrische, pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung, einen Testkit, ein Screeningverfahren und deren Verwendungen bei welchen Synaptosomen (10') oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträger (10) elektrophysiologisch untersucht werden und bei welchen Primärträger (10) verwendet werden, die eine synaptosomale/synaptische Membran (11') als Membran (11) aufweisen, welche den Wirkortkomplex (12) im Bereich der Membran (11) des jeweiligen Primärträgers (10) enthalten.

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran modifiziert.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Durch gängige Methoden ist es bisher nicht möglich, die Aktivität, die Funktion und das Zusammenspiel von Membranproteinen im Bereich von Synapsen oder synaptischen Übergängen auf einfache und eindeutige Art und Weise zu untersuchen. Aber gerade die Wechselwirkung von Membranproteinen untereinander ist oft komplex und die heterologe Expression einzelner intrazellulärer Proteine in der Plasmamembran kann zu unspezifischen Effekten und Missinterpretation der Daten führen.
  • Aus der Druckschrift WO 02/074983 A1 sind eine Sensoranordnung, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur amperometrischen und/oder potentiometrischen pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung bekannt, wobei proteinhaltige Primärträger, z. B. in Form von Vesikeln oder Membranfragmenten an einen eine Elektrode bildenden Sekundärträger angelagert und einer elektrophysiologischen Untersuchung in einem wässrigen Messmedium zugeführt werden können. Die Primärträger sind jeweils mit einem zu einer elektrischen Aktion anregbaren biologischen Einheit, insbesondere einem Membranprotein versehen.
  • Die Veröffentlichung "Characterization of a Mg2+-ATPase and a proton pump in cholinergic synaptic vesicles from the electric Organ of Torpedo marmorata", Eur. J. Biochem. 1984, 144 (3), Seiten 441 bis 446 beschreibt die Untersuchung synaptischer Vesikel im Zusammenhang mit der Magnesium-ATPase unter verschiedenen Bedin gungen, wobei insbesondere die Beeinflussung verschiedener vermeintlicher Inhibitoren, z. B. Ouabain und Oligomicin, untersucht werden.
  • Aus der Publikation "Functional identification of a vesicular acetyl cholin transporter and its expression from a cholinergic gene locus", The Journal of biological chemistry, 269 (35), Seiten 21929 bis 21932 beschreibt Untersuchungen an vesikulären Acetylcholintransportern aus Säugetieren sowie deren genetische Expression.
  • Aus der Veröffentlichung "AP-3-dependent mechanisms control the targeting of a chloride channel ClC-3 in neuronal and non-neuronal cells", The Journal of biological chemistry, 249 (24), Seiten 25430 bis 25439 befasst sich mit Chloridkanälen aus neuronalen und nicht-neuronalen Spezies und damit im Zusammenhang stehenden synaptischen Vesikeln.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran modifiziert zu schaffen, mit welchen auf einfache und doch zuverlässige Art und Weise eine elektrophysiologische Untersuchung von Membranproteinen im Bereich von Synapsen oder synaptischen Übergängen möglich ist.
  • Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird bei Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran modifiziert mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche 1, 2 und 3 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Verfahren sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, durch entsprechende Maßnahmen Synaptosomen oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträger einer elektrophysiologischen Untersuchung zu unterziehen, wobei Primärträger maßgeblich sind, die eine synaptosomale/synaptische Membran als Membran aufweisen, welche einen Wirkortkomplex im Bereich der Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten.
  • Entsprechend schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes im Bereich – also an oder in – einer synaptosomalen/synaptischen Membran modifiziert, bei welchem Synaptosomen oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträger elektrophysiologisch untersucht werden und bei welchem Primärträger verwendet werden, die eine synaptosomale/synaptische Membran als Membran aufweisen, welche den Wirkortkomplex im Bereich der Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten.
  • Geschaffen wird also ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran modifiziert, bei welchem Synaptosomen oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträger elektrophysiologisch untersucht werden, bei welchem Primärträger verwendet werden, die eine synaptosomale/synaptische Membran als Membran aufweisen, welche den Wirkortkomplex im Bereich der Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird als Wirkortkomplex oder als Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer einer synaptosomalen/synaptischen vesikulären ATPase oder einer vATPase verwendet, wobei als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl und 50 mmol/l Hepes pH 7,2 verwendet wird, wobei als aktivierendes Medium ein Medium mit 150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl, 50 mmol/l Hepes pH 7,2 und 0,1 bis etwa 1,0 mmol/l Na-ATP verwendet wird und wobei als Ruhemedium ein Medium mit 150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl und 50 mmol/l Hepes pH 7,2 verwendet wird.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird als Wirkortkomplex oder als Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines synaptosomalen/synaptischen vesikulären Acetylcholintransporters oder eines vAChTs verwendet, wobei als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 320 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2, 50 mmol/l Hepes-NaOH pH 7,4, und 1 mmol/l Na-ATP verwendet wird, wobei als aktivierendes Medium ein Medium mit 300 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2, 50 mmol/l Hepes-NaOH pH 7,4, 1 mmol/l Na-ATP und 20 mmol/l Acetylcholin verwendet wird und wobei als Ruhemedium ein Medium mit 320 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2 und 50 mmol/l Hepes-NaOH pH 7,4 verwendet wird.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird als Wirkortkomplex oder als Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines synaptosomalen/synaptischen vesikulären Chloridkanals oder eines CLC-3s verwendet, wobei als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 330 mmol/l K-Glutamat, 50 mmol/l Hepes pH 7,2 und 0,3 mmol/l Mg-ATP verwendet wird, wobei als aktivierendes Medium ein Medium mit 330 mmol/l K-Glutamat, 50 mmol/l Hepes pH 7,2, 0,3 mmol/l Mg-ATP und 30 mmol/l KCL verwendet wird und wobei als Ruhemedium ein Medium mit 330 mmol/l K-Glutamat und 50 mmol/l Hepes pH 7,2 verwendet wird.
  • Eine Biosensoranordnung für die amperometrische und/oder potentiometrische Testung synaptosomaler/synaptischer pharmakologischer Wirkortkomplexe und/oder Wirkstoffkomplexe ist in diesem Zusammenhang mit einem Sekundärträger und mit einer Mehrzahl Primärträger ausgebildet, welche in unmittelbarer räumlicher Nachbarschaft des Sekundärträgers angeordnet sind, wobei als Primärträger Synaptosomen oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate vorgesehen sind.
  • Eine Vorrichtung für die amperometrische und/oder potentiometrische, pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung ist mit mindestens einem Messbereich, in welchem als Messsonde eine Biosensoranordnung gemäß obiger Beschreibung vorgesehen ist, mit einer Datenerfassungs-/Steuereinrichtung, welche zumindest zur Erfassung von Messdaten der Sensoranordnung ausgebildet ist, und mit einer Austausch- und Mischeinrichtung versehen, welche zum Verfügungstellen, Austausch, Mischen und Einstellen des Messmediums ausgebildet ist.
  • Ein Testkit, welcher zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist, weist mindestens einen Primärträger, einen Messbereich und ein erstes oder Ruhemedium, ein zweites, nicht-aktivierendes Medium, und ein drittes, aktivierendes Medium zur Aufnahme eines potenziellen Wirkstoffkomplexes, auf.
  • Ein entsprechendes Screeningverfahren ist zum Identifizieren eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, der Konzentration eines bekannten Wirkstoffes, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon oder einer beliebigen Kombination der zuvor genannten Größen oder Eigenschaften geeignte, und zwar durch Verwenden eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der Wirkstoff, der Wirkstoffkomplex, der Teil oder das Derivat davon eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines synaptosomalen/synaptischen Proteins enthält, oder eines Teils davon modifiziert.
  • Denkbar sind des Weiteren entsprechende Verwendungen der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktivatoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines synaptosomalen/synaptischen Proteins enthält.
  • Durch Erfindung wird also die Möglichkeit einer elektrophysiologischen Untersuchung von Synaptosomen oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträgern und damit von synaptosomalen/synaptischen Membranen als Membranen der Primärträger und folglich von entsprechenden Wirkortkomplexen, die in Form synaptosomaler/synaptischer Proteine als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten vorliegen oder jeweils von einem oder mehreren synaptosomalen/synaptischen Proteinen als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten gebildet werden, geschaffen. Dadurch ist es möglich, derartige synaptosomaler/synaptischer Proteine als Wirkortkomplexe zum Beispiele in vergleichsweise nativer Umgebung elektrophysiologisch zu untersuchen.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
  • Diese und weitere Aspekte werden anhand der Figuren weiter erläutert:
  • 1A–4 zeigen in schematischer Form Ergebnisse einer Anwendung einer Ausführungsform der Erfindung, nämlich für den Fall der Untersuchung eine vATPase.
  • 5 zeigt in schematischer Form Ergebnisse einer anderen Anwendung einer Ausführungsform der Erfindung, nämlich für den Fall der Untersuchung eines vACh/Protonen-Antiporters.
  • 6, 7 zeigen in schematischer Form Ergebnisse einer weiteren Anwendung einer Ausführungsform der Erfindung, nämlich für den Fall der Untersuchung eines CLC-3-Kanals.
  • 8 zeigt in schematischer und geschnittener Seitenansicht eine Ausführungsform der einer Biosensensoranordnung.
  • 9 zeigt Details einer zu weiteren Ausführungsform einer Biosensoranordnung mit einem Vesikel als Primärträger.
  • 10 zeigt eine schematische und teilweise geschnittene Seitenansicht eines anderen Ausführungsbeispiels einer Biosensoranordnung mit einem Vesikel als Primärträger und deren Verwendung in einer Messvorrichtung.
  • 11A–D zeigen in einer schematischen Seitenansicht eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • 12A–C zeigen in einer schematischen Seitenansicht eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Beschreibung von Ausführungsbeispielen der Erfindung
  • Im Folgenden wird auf die Figuren zunächst ganz allgemein Bezug genommen:
    Es werden strukturell und/oder funktionell gleiche, ähnliche oder gleich wirkende Aspekte und Elemente mit denselben Bezugszeichen bezeichnet, nicht in jedem Fall ihres Auftretens wird eine detaillierte Beschreibung wiederholt.
  • Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes W, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes 12 im Bereich – also z. B. an oder in – einer synaptosomalen/synaptischen Membran 11' modifiziert.
  • Es wird insbesondere ein Verfahren geschaffen, bei welchem Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträger 10 elektrophysiologisch untersucht werden und bei welchem Primärträger 10 verwendet werden, die eine synaptosomale/synaptische Membran 11' als Membran 11 aufweisen, welche den Wirkortkomplex 12 im Bereich der Membran 11 des jeweiligen Primärträgers 10 enthalten.
  • Unter den Begriffen Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel und deren Derivate werden im Sinne der Erfindung auch insbesondere intrazelluläre Kompartimente im allgemeinen, Synaptosomen im engeren Sinne und synaptische/synaptosomale Vesikel oder Liposomen im engeren Sinne verstanden. Die jeweiligen Derivate können insbesondere auch Cluster oder Aggregate dieser Spezies oder auch bestandteile davon sein, z. B. Membranfragmente.
  • Es kann ein Wirkortkomplex 12 verwendet werden, welcher ein synaptosomales/synaptisches Protein als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheit aufweist oder welcher von einem synaptosomalen/synaptischen Protein als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheit gebildet wird.
  • Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt also in der Schaffung der Möglichkeit einer elektrophysiologischen Untersuchung von Synaptosomen 10' oder synaptosomalen/synaptischen Liposomen oder Vesikeln oder deren Derivaten als Primärträgen 10 und damit von synaptosomalen/synaptischen Membranen 11' als Membranen 11 der Primärträger 10 und folglich von entsprechenden Wirkortkomplexen 12, die in Form synaptosomaler/synaptischer Proteine als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten vorliegen oder jeweils von einem oder mehreren synaptosomalen/synaptischen Proteinen als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten gebildet werden. Dadurch ist es möglich, derartige synaptosomale/synaptische Proteine als Wirkortkomplexe 12 zum Beispiele in vergleichsweise nativer Umgebung elektrophysiologisch zu untersuchen.
  • Im Sinne der Erfindung wird unter einem – ggf. auch potentiellen – Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex W jegliche stoffliche und/oder elektrisch geladene Entität verstanden, die eine Wirkung auf den Wirkortkomplex 12, 12' ausübt oder – ggf. möglicherweise – ausüben kann. Es kann sich also auch um ein Substrat handeln, um ein Kosubstrat, um einen Inhibitor, um eine zu transportierende Spezies, einfach um einen Elektrolytbestandteil, um einen Ladungsträger, z. B. auch um ein Elektron oder Proton, ggf. hydratisiert oder um einen Liganden, wobei dies Aufzählung nicht abschließend ist.
  • Das Verfahren kann insbesondere die Schritte und Eigenschaften aufweisen:
    • (a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger 10, welche den Wirkortkomplex 12 im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran 11' als Membran 11 des jeweiligen Primärträgers 10 enthalten,
    • (b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger 10 am oder im Oberflächenbereich 24a eines Isolationsbereichs 24 einer als Sekundärträger 20 dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium 30, 30-1, 30-2, 30-3, wobei der Sekundärträger 20 gegenüber dem Messmedium 30, 30-1, 30-2, 30-3 und gegenüber den Primärträgern 10 mittels des Isolationsbereichs 24 mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
    • (c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes W,
    • (d) In-Wechselwirkung-Bringen insbesondere In-Kontakt-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes W mit dem Wirkortkomplex 12 der Primärträger 10, und
    • (e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes W auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes 12 durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes 12 oder einer Änderung der elektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundärträger 20,
    • (f) bei welchem ein durch den Wirkortkomplex 12 erzeugter elektrischer Strom und/oder ein durch den Wirkortkomplex 12 erzeugtes elektrisches Potenzial als elektrische Aktion verwendet werden, welches jeweils erzeugt wird durch einen Vorgang oder mehrere Vorgänge aus der Gruppe, die aufweist den Transport, die Verschiebung, die Anlagerung, die Freigabe, die Bindung von Ladungsträgern, Stoffen und/oder Liganden und die Konformationsänderungen,
    • (g) bei welchem als Messmedium 30, 30-1, 30-2, 30-3 eine wässrige Elektrolytlösung verwendet wird,
    • (h) bei welchem als Primärträger 10 Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Vesikel oder Liposomen oder deren Derivate verwendet werden und
    • (i) bei welchem Primärträger 10 verwendet werden, die als Membran 11 eine synaptosomale/synaptische Membran 11' mit dem Wirkortkomplex 12 aufweisen.
  • Die Synaptosomen 10' oder synaptosomalen/synaptischen Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate mit synaptosomalen/synaptischen Membranen 11' können in nativer Form als Primärträger 10 verwendet werden.
  • Es können auch Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate mit synaptosomalen/synaptischen Membranen 11' in gereinigter, biochemisch und/oder molekularbiologischer geänderter Form als Primärträger 10 verwendet werden.
  • Als Messmedium 30 können ein Ruhemedium 30-1, mindestens ein nicht-aktivierendes Medium 30-2 und/oder mindestens ein aktivierendes Medium 30-3 verwendet werden, durch welche neben dem Wirkortkomplex 12 in den synaptosomalen/synaptischen Membranen 11' vorhandene weitere und zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten 12' nicht aktiviert, in ihrer Aktivität reduziert oder inhibiert werden.
  • Es kann eine Mehrzahl synaptosomaler/synaptischer Wirkortkomplexe 12 untersucht wird. Dies kann sequentiell oder parallel erfolgen.
  • Es kann eine Biosensorelektrode als Sekundärträger 20 verwendet werden, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperartiger Elektrodenbereich 21 mit mindestens einer Elektrode 26 vorgesehen ist oder wird, welcher gegenüber dem Messmedium 30 und gegenüber den Primärträgern 10 elektrisch und mechanisch isoliert ist oder wird, und zwar durch Vorsehen eines Isolationsbereichs 24 in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut ist oder wird, und zwar aus zumindest einer Oberschicht 24a einer amphiphilen organischen Verbindung.
  • Es kann eine Elektrode 26 aus einem Metall aus der Gruppe, die gebildet wird von Gold. Silber und Platin, im Elektrodenbereich 21 vorgesehen sein oder werden, und zwar mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht 24b und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht 24a darauf.
  • Es kann eine Elektrode 26 verwendet werden, die kann mit oder aus einem Kunststoffmaterial oder einem Polymermaterial ausgebildet ist, welches elektrisch leitfähig ist, mit einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht 24a darauf.
  • Die Oberschicht 24a kann auch ganz oder teilweise von oder mit einem Gemisch aus einem Lipid oder aus mehreren Lipiden in einem oder in mehreren organischen Lösungsmitteln, insbesondere in langkettigen aliphatischen Kohlenswasserstoffen, z. B. in Dekan, Dodekan und/oder Heaxdekan, oder deren Derivaten gebildet sein oder werden.
  • Es kann eine Biosensorelektrode als Sekundärträger 20 verwendet werden, bei welcher der eine Elektrode 26 der Biosensorelektrode als Sekundärträger 20 abdeckende Bereich des Isolationsbereichs 24 als Membranstruktur SSM ausgebildet ist oder wird, insbesondere mit einer Fläche A im Bereich von etwa 0,1 mm2 bis etwa 50 mm2 und mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit Gm im Bereich von etwa 1 nS/cm2 bis etwa 100 nS/cm2 und/oder mit einer spezifischen Kapazität Cm im Bereich von etwa 10 nF/cm2 bis etwa 1000 nF/cm2.
  • Als Primärträger 10 kann jeweils ein Vesikel, ein Liposom, eine mizelläre Struktur oder ein Membranfragment verwendet werden.
  • Der Wirkortkomplex 12 kann aus dem Organismus eines Säugers, insbesondere Ratte, Schwein, Schaf oder Mensch stammen oder aus diesem genetisch abgeleitet sein oder werden.
  • Es kann ein Wirkortkomplex 12 verwendet werden, der zumindest zum Teil im Primärträger 10 die Membran 11 durchspannend ausgebildet ist.
  • Als enzymatische Eigenschaft können verwendet werden:
    • – die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes W oder eines Teils davon oder des Messmediums 30 oder eines Teils davon,
    • – der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes W oder eines Teils davon oder des Messmediums 30 oder eines Teils davon,
    • – die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes W oder eines Teils davon oder des Messmediums 30 oder eines Teils davon,
    • – eine Konformationsänderung oder Bewegung des Wirkortkomplexes 12 oder eines Teils davon oder
    • – eine beliebige Kombination dieser Prozesse.
  • Die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) können durchgeführt werden durch:
    • – Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes W, eines Teils oder einer Vorform davon,
    • – Austauschen des Messmediums 30 oder eines Teils davon und/oder
    • – chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums 30 oder eines Teils davon oder des Wirkstoffkomplexes W, eines Teils oder einer Vorform davon.
  • Es kann eine Sensoranordnung 1 aus Biosensorelektrode als Sekundärträger 20 und daran angelagerten Primärträgern 10 in einem Messraum 50, Messbereich 50 oder Messgefäß 50 vom Messmedium 30 umströmt oder angeströmt werden.
  • Es kann eine Strömungsgeschwindigkeit oder Fließgeschwindigkeit v des Messmediums 30 im Bereich von etwa 0,1 m/s bis etwa 2 m/s verwendet werden.
  • Es kann aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt werden durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmediums 30, gegebenenfalls mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums 50.
  • In den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) können ein oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
    • (j) Einbringen des Sekundärträgers 20 mit den Primärträgern 10 in ein erstes, nicht-aktivierendes Messmedium 30-1 und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt e,
    • (k) Einbringen des Sekundärträgers 20 mit den Primärträgern 10 in ein zweites, aktivierendes Messmedium 30-2 und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt e,
    • (l) Einbringen des Sekundärträgers 20 mit den Primärträgern 10 in ein drittes oder Test-Messmedium 30-3 und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt e, wobei das dritte oder Test-Messmedium 30-3 dem zweiten aktivierenden Messmedium 30-2 entsprechend gewählt wird und der Wirkstoffkomplex W, ein Teil oder eine Vorstufe davon enthalten sind oder hinzugefügt und/oder freigesetzt werden.
  • Zwischen den Schritten (j) und (k) kann ein Waschschritt durchgeführt werden durch Einbringen des Sekundärträgers 20 mit den Primärträgern 10 in ein viertes oder Waschmedium 30-4.
  • Direkt vor dem Schritt (l) kann der Schritt (j) wiederholt durchgeführt werden.
  • Des Weiteren wird eine Biosensoranordnung für die amperometrische und/oder potentiometrische Testung synaptosomaler/synaptischer pharmakologischer Wirkortkomplexe 12 und/oder Wirkstoffkomplexe W beschrieben mit einem Sekundärträger 20 und mit einer Mehrzahl Primärträger 10, welche in unmittelbarer räumlicher Nachbarschaft des Sekundärträgers 20 angeordnet sind, wobei als Primärträger 10 Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate vorgesehen sind.
  • Der Wirkortkomplex 12 kann als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheit ein synaptosomales/synaptisches Protein aufweisen oder von einem synaptosomalen/synaptischen Protein gebildet sein.
  • Es können Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel mit synaptosomalen/synaptischen Membranen 11' in nativer Form als Primärträger 10 vorgesehen sind.
  • Es können andererseits auch Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel mit synaptosomalen/synaptischen Membranen 11' in gereinigter, biochemisch und/oder molekularbiologischer geänderter Form als Primärträger 10 vorgesehen sein.
  • Als Messmedium 30 kann ein Ruhemedium, ein nicht-aktivierendes Medium und/oder ein aktivierendes Medium vorgesehen sein, durch welche neben dem Wirkortkomplex 12 in den synaptosomalen/synaptischen Membranen 11' vorhandene weitere und zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten 12' nicht aktiviert, in ihrer Aktivität reduziert oder inhibiert werden.
  • Eine Biosensoranordnung weist einen Sekundärträger 20 auf, welcher einen elektrisch leitfähigen und festkörperartigen Elektrodenbereich 21 aufweist, wobei die Primärträger 10 zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten als Wirkortkomplexe 12 aufweisen, und mit einem wässrigen Messmedium 30, in welchem die Primärträger 10 und der Sekundärträger 20 angeordnet sind, wobei der Elektrodenbereich 21 gegenüber dem Messmedium 30 elektrisch isoliert ausgebildet ist, wobei der Elektrodenbereich 21 gegenüber den Primärträgern 10 und gegenüber den biologischen Einheiten als Wirkortkomplexen 12 elektrisch isoliert ausgebildet ist und wobei als Primärträger 10 Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Vesikel oder deren Derivate zur elektrophysiologischen Untersuchung vorgesehen sind, die eine synaptosomale/synaptische Membran 11' als Membran 11 aufweisen, welche den Wirkortkomplex 12 als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten im Bereich der Membran 11 des jeweiligen Primärträgers 10 enthalten.
  • Es kann eine Biosensorelektrode als Sekundärträger 20 vorgesehen sein, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperartiger Elektrodenbereich 21 mit mindestens einer Elektrode 26 vorgesehen ist, welcher gegenüber dem Messmedium 30 und gegenüber den Primärträgern 10 elektrisch und mechanisch isoliert ist, und zwar durch Vorsehen eines Isolationsbereichs 24 in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut ist, und zwar aus zumindest einer Oberschicht 24a einer amphiphilen organischen Verbindung.
  • Die Elektrode 26 kann aus einem Metall aus der Gruppe, die gebildet wird von Gold, Silber und Platin, im Elektrodenbereich 21 vorgesehen sein, und zwar mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht 24b und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht 24a darauf.
  • Die Oberschicht 24a kann auch ganz oder teilweise von oder mit einem Gemisch aus einem Lipid oder aus mehreren Lipiden in einem oder in mehreren organischen Lösungsmitteln, insbesondere in langkettigen aliphatischen Kohlenswasserstoffen, z. B. in Dekan, Dodekan und/oder Heaxdekan, oder deren Derivaten gebildet sein oder werden.
  • Die Elektrode 26 kann auch mit oder aus einem Kunststoffmaterial oder einem Polymermaterial ausgebildet sein, welches elektrisch leitfähig ist. mit einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht 24a darauf. Somit werden u. a. eine Polymerelektrode oder ein Polymersensor vorgesehen.
  • Es kann eine Biosensorelektrode als Sekundärträger 20 verwendet werden, bei welcher der eine Elektrode 26 der Biosensorelektrode als Sekundärträger 20 abdeckende Bereich des Isolationsbereichs 24 als Membranstruktur SSM ausgebildet ist oder wird, insbesondere mit einer Fläche A im Bereich von etwa 0,1 mm2 bis etwa 50 mm2 und mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit Gm im Bereich von etwa 1 nS/cm2 bis etwa 100 nS/cm2 und/oder mit einer spezifischen Kapazität Cm im Bereich von etwa 10 nF/cm2 bis etwa 1000 nF/cm2.
  • Als Primärträger 10 kann jeweils ein Vesikel, ein Liposom, eine mizelläre Struktur oder eine Membranfragment vorgesehen sein.
  • Der Wirkortkomplex 12 oder ein Teil davon kann als ein Monomer oder ein Oligomer einer synaptosomalen/synaptischen vesikulären ATPase oder einer vATPase vergesehen sein.
  • Ferner kann als Wirkortkomplex 12 oder als Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines synaptosomalen/synaptischen vesikulären Acetylcholintransporters oder eines vAChTs vorgesehen sein.
  • Als Wirkortkomplex 12 oder als Teil davon kann ein Monomer oder ein Oligomer eines synaptosomalen/synaptischen vesikulären Chloridkanals oder eines CLC-3s vorgesehen sein.
  • Als Wirkortkomplex 12 kann jeweils ein Membranprotein, insbesondere eine Ionenpumpe, ein Ionenkanal, ein Transporter, ein Rezeptor oder ein Bestandteil oder ein Verband davon vorgesehen sein.
  • Der Wirkortkomplex 12 kann in nativer Form oder in abgewandelter Form, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form, vorgesehen sein.
  • Ferner wird eine Vorrichtung für die amperometrische und/oder potentiometrische, pharmakologische Wirkort- und/oder Wirkstofftestung beschrieben mit mindestens einem Messbereich 50, in welchem als Messsonde eine Biosensoranordnung 1 nach einem der Ansprüche 38 bis 53 vorgesehen ist, mit einer Datenerfassungs-/Steuereinrichtung 40, welche zumindest zur Erfassung von Messdaten der Sensoranordnung 1 ausgebildet ist und mit einer Austausch- und Mischeinrichtung 60, welche zum Verfügungstellen, Austausch, Mischen und Einstellen des Messmediums 30 ausgebildet ist.
  • Mittels der Austauscheinrichtung 60 können über das Messmedium 30 Messbedingungen, insbesondere pharmakologische Bedingungen, definiert in kontinuierlicher Art und Weise einstellbar sein, vorzugsweise nach Art eines kontinuierlichen Fließsystems.
  • Dabei können mittels der Austauscheinrichtung 60 in der Nachbarschaft der Sensoranordnung 1 Fließ- und Strömungsgeschwindigkeiten von etwa v ≈ 0,1 – 2 m/s erzeugbar sein.
  • Es kann eine Mehrzahl integrierter Sensoranordnungen 1, vorzugsweise in separaten, strömungsmäßig und elektrisch voneinander entkoppelten und unabhängigen Vertiefungsbereichen einer Mikroplatte oder Mikrotiterplatte vorgesehen sein, vorzugsweise um 8, 12, 96 Messkanäle auf einem Raster auszubilden.
  • Ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist mindestens einen Primärträger 10, einen Messbereich 50 und ein erstes oder Ruhemedium 30-1, ein zweites, nicht-aktivierenden Medium 30-2 und ein drittes, aktivierendes Medium 30-3 zur Aufnahme eines potenziellen Wirkstoffkomplexes W auf.
  • Der Testkit kann mindestens einen potenziellen Wirkstoffkomplex W aufweisen.
  • Beschrieben wird auch ein Screeningverfahren zum Identifizieren eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes W, Teils oder Derivats davon, des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes W, Teils oder Derivats davon, des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes W, Teils oder Derivats davon, der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes W, Teils oder Derivats davon, der Konzentration eines bekannten Wirkstoffes, Wirkstoffkomplexes W, Teils oder Derivats davon oder einer beliebigen Kombination der zuvor genannten Größen oder Eigenschaften durch Verwenden eines erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder einer erfindungsgemäßen Biosensoranordnung und/oder einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und/oder eines erfindungsgemäßen Testkits, wobei der Wirkstoff, der Wirkstoffkomplex W, der Teil oder das Derivat davon eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes 12, welcher einen Typ eines synaptosomalen/synaptischen Proteins enthält, oder eines Teils davon modifiziert.
  • Verwendet werden können die erfindungsgemäßen Verfahren zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktivatoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes 12, welcher einen Typ eines synaptosomalen/synaptischen Proteins enthält.
  • Die Biosensoranordnung kann auch verwendet werden zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktivatoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes 12, welcher einen Typ eines synaptosomalen/synaptischen Proteins enthält, und insbesondere des humanen synaptosomalen/synaptischen Proteins.
  • Die Vorrichtung kann verwendet werden zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktivatoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes 12, welcher einen Typ eines synaptosomalen/synaptischen Proteins enthält, und insbesondere des humanen synaptosomalen/synaptischen Proteins.
  • Auch der Testkit kann verwendet werden zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes 12, welcher einen Typ eines synaptosomalen/synaptischen Proteins enthält, und insbesondere des humanen synaptosomalen/synaptischen Proteins.
  • Diese und weitere Aspekte werden anhand der folgenden Bemerkungen weiter erläutert:
    Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Untersuchung von Membranproteinen in synaptischen Vesikeln als intrazellulären Kompartimenten und der Wirkung von Substanzen auf eines oder mehrere dieser Proteine.
  • Durch gängige Methoden ist es bisher nicht oder nur eingeschränkt möglich, Aktivität, Funktion und Zusammenspiel von Transportern und Kanälen in intrazellulären Kompartimenten (z. B. synaptischen Vesikeln) zu untersuchen. Gerade die Wechselwirkung der Membranproteine untereinander ist oft komplex und die heterologe Expression einzelner intrazellulärer Proteine in der Plasmamembran kann zu unspezifischen Effekten und Missinterpretation der Daten führen.
  • Als herkömmliche Methoden traten bisher in Erscheinung Bindungs-, bzw. Aufnahmestudien von radioaktiv markierten Substraten an Präparationen synaptischer Vesikel und an nativen Hirnschnitten, die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zur Detektion beispielsweise von pH-Wert- oder Membranpotenzialänderungen sowie die Quantifizierung der Proteindichte und -expression mittels verschiedener molekularbiologischer Methoden.
  • Die Untersuchung der Wirkung von Substanzen bei radioaktiven Bindungs- und Aufnahmeassays lässt in der Regel keine Unterscheidung zu, ob ein Wirkstoff nur bindet oder auch transportiert wird (dafür müssten alle Wirkstoffe radioaktiv markiert sein).
  • Radioaktive Messungen bedürfen speziell ausgebildeten Personals sowie notwendiger Sicherheitseinrichtungen.
  • Fluoreszenzmethoden zur Messung von pH-Wert-Änderungen oder Membranpotenzialänderungen geben nur indirekte Hinweise auf die Transportaktivität.
  • Beide Methoden untersuchen nicht direkt die Transportfunktion des Proteins, sondern erfordern Vermittler in Form von Färbereagenzien oder radioaktiv markierten Substraten. Bestimmt wird nicht die unmittelbare Enzymaktivität, sondern die Änderung einer Substratkonzentration nach dem Abschluss des Transportes. Sie erfassen die Transportaktivität im Laufe von Minuten.
  • Molekularbiologische Untersuchungen der Proteindichte und -expression ermöglichen keine Aussagen zur Funktionalität und Aktivität.
  • Die hier vorgestellte Entwicklung und die vorliegende Erfindungen können diesen Mangel beheben und bei der Untersuchung und beim Screening relevanter Substan zen hilfreich sein. Dabei können Substanzen ohne großen Aufwand auf mehrere in der Membran vorkommende Proteine getestet werden.
  • Elektrogene Membranproteine (wie z. B. vATPase, vGAT, vGluT, vAChT, ZnT3, vMAT, ClC-3 in synaptischen Vesikeln) verschieben Ionen oder geladene Substrate über die Membran. Der Erfindung liegt gemäß einem Aspekt die Idee zu Grunde, diese Ladungsverschiebungen direkt durch Anbindung von Enzympräparationen auf einer geeigneten Oberfläche, die z. B. in ein Durchflusssystem integriert ist oder bei der ein Substratsprung durchgeführt werden kann, z. B. als Stromfluss zu messen und den Einfluss verschiedener (Wirk-)Substanzen auf die Messgröße Stromfluss zu untersuchen.
  • Die Messung der Enzymaktivität gemäß einem Verfahren einer Ausführungsform dieser Erfindung bedarf keiner Vermittler oder markierter Substrate. Eine Einzelmessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist sensitiv gegenüber allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden.
  • Substrate müssen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort des Proteins durch einen schnellen Lösungswechsel induziert wird.
  • Im Folgenden wird im Detail auf die Figuren Bezug genommen. Und zwar zunächst auf die 1 bis 7, die Anwendungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen. Die 8 bis 12C betreffen auch die strukturellen Aspekte der Erfindung und werden anschließend erläutert.
  • Beispiel 1: Herstellung eines Sensorchips
  • Sensorchips mit Goldstruktur wurden in einem Aufdampfprozess mittels Schattenmaske erzeugt. Hierzu wurde nach dem Aufdampfen einer Titanschicht von 5–10 nm Dicke eine 200 nm dicke Goldschicht mit 3 mm Durchmesser und eine entsprechende Kontaktierungsmöglichkeit auf kreisrunde Glasscheiben aufgebracht. Durch Aufkleben eines Glasrohrabschnittes oder Spritzgussteiles wurde ein Probengefäß über der Goldoberfläche erzeugt.
  • Die Goldoberfläche wurde durch eine 1 mmol/l Octadecylmercaptanlösung mercaptanisiert, mit 2-Propanol (absolut) gespült und getrocknet. Sie wurde dann mit Dyphytanoyl-Phophatidylcholin (in Dekan) bedeckt und mit einem Anlagerungspuffer (z. B. 300 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgCl2, 4 mmol/l KCl, 50 mmol/l Hepes pH 7,2, 2 mmol/l DTT) überschichtet.
  • Beispiel 2: Präparation von synaptischen Vesikeln
  • Die synaptischen Vesikel wurden nach folgendem Protokoll präpariert: 3 adulte Ratten wurden betäubt und dekapitiert. Das Hirn wurde entnommen und vom myelinreichen Stammhirn befreit. Alles Weitere fand (wenn nicht anders angegeben) in einer Kühlkammer statt. Pro Hirn wurden 10 ml Präparationspuffer (PP) (5 mmol/l IRIS, 0,32 mol/l Saccharose, PIB, PIC, PID (1:1.000) (enthalten je 2 μg/ml Leupeptin + Chymostatin, 1 μg/ml Pepstatin, 1 mmol/l Benzamidin)) verwendet und mit 12 Durchgängen in einem Elvehjem-Homogenisator homogenisiert und auf 3 graduierte 15 ml-Röhrchen verteilt. Zentrifugieren: 10 min, 1000 rpm, 4°C. Überstände in drei 15 ml-Röhrchen, Pellets auf 10 ml mit PP auffüllen, mit 5 Durchgängen homogenisieren, erneut zentrifugieren. Überstände vereinigen und auf 15 ml mit PP auffüllen. Jeweils 7,5 ml auf Percollgradienten (je 7,5 ml 3, 10 und 23% Percoll) auftragen. Zentrifugieren; 7 min, 18.500 rpm. Fraktionen zwischen 3% und 10% und zwischen 10% und 23% absammeln, mit mindestens vierfachem Volumen PP verdünnen und zentrifugieren: 35 min, 15.000 rpm. Pellet in je 30 ml 5 mmol/l IRIS/HCl, pH 7,4 + PIB, PIC, PID (1:1000) resuspendieren. jeweils 60 ml in 250 ml Kolben, 20-mal bei RT auf- und abpipettieren (osmotischer Schock), auffüllen auf 36 ml und zentrifugieren: 60 min, 50.000 rpm.
  • Jedes Pellet mit 4 ml Saccharosepuffer (0,2 M Saccharose, 0,1 mmol/l MgCl2, 0,5 mmol/l EGTA, 10 mmol/l HEPES/NaOH, pH 7,4) resuspendieren und 5 Durchgänge pottern. Auftragen auf einen kontinuierlichen Saccharosegradienten (32 ml; 0,3–1,2 mol/l Saccharose in 10 mmol/l HEPES/NaOH, pH 7,4 0,5 mmol/l EGTA) und zentrifugieren: 120 min, 25000 rpm. Absammeln des Gradienten in 1 ml Fraktionen (= 36 Fraktionen je Gradient).
  • Beispiel 3: Herstellung des Sensorchips mit synaptischen Vesikeln
  • 10–20 μl der beschallten Membransuspension (Proteinkonzentration ca. 0,05–0.1 mg ml–1) wurden auf dem Sensorchip aufgetragen und über Nacht im Kühlschrank (bei < 8°C) inkubiert.
  • Die Kapazität der proteinbeladenen Membranen lag bei ca. 300 nF/cm2 bis 1000 nF/cm2, die Leitfähigkeit G1s bei ca. 10 nS/cm2 bis 100 nS/cm2.
  • Beispiel 4: Aktivitätsmessung und ATP-Abhängigkeit der Aktivität der vATPase
  • Die vesikuläre vATPase pumpt unter Verbrauch von ATP Protonen in das Lumen der Vesikel. Der so entstandene Protonengradient über die vesikuläre Membran ist die Hauptantriebskraft für die meisten vesikulären Transporter. Die vATPAse ist abhängig von Magnesium und wird durch Bafilomycin A1 spezifisch inhibiert.
  • Die Aktivierung durch ATP ist in den Messkurven (a) bis (c) der 1A und (a) und (b) der 1B dargestellt.
  • Die Durchflusszelle mit integriertem Protein beladenem Sensorchip wurde zunächst mit einer nicht-aktivierenden Lösung [150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl, 50 mmol/l Hepes pH 7,2] durchspült. Danach wurde mittels elektromechanischem 3/2-Wegeventil auf aktivierende Lösung (150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl, 50 mmol/l Hepes pH 7,2, 0,1–1,0 mmol/l Na-ATP) umgestellt. Der Transport von Protonen in die Vesikel führt zu einem positiven Signal, da positive Ladungsträger (Protonen) zur Sensoroberfläche verschoben werden.
  • Die 1A und 1B zeigen also die Stromantwort eines mit synaptischen Vesikeln beladenen Sensors auf ATP-Konzentrationssprünge hin. 1A zeigt die Stromantwort des Sensors in einem ATP-haltigen Medium (Messkurven (a) und (c)) bzw. in einem Medium ohne ATP (Messkurve (b)). Die Messungen wurden auf dem gleichen Sensor in der Reihenfolge von (a) nach (c) durchgeführt. 1B zeigt die Stromantwort in Abhängigkeit von der eingesetzten ATP-Konzentration.
  • Beispiel 5: Magnesiumabhängigkeit der Aktivität der vATPase
  • Die Abhängigkeit von Magnesium ist in den Messkurven (a) bis (c) der 2 dargestellt.
  • Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurde in der nicht-aktivierenden als auch der aktivierenden Lösung das Magnesium durch 0.5 mmol/l EDTA ausgetauscht. EDTA titriert Überreste von freien Magnesium Ionen weg. Unter diesen Bedingungen kann die vATPase nicht das ATP hydrolysieren und somit kein Transport von Protonen stattfinden.
  • 2 zeigt also die Stromantwort eines mit synaptischen Vesikeln beladenen Sensors auf ATP-Konzentrationssprünge hin, und zwar in Abhängigkeit von der Konzentration an Magnesium. Die Messungen wurden auf dem gleichen Sensor in der Reihenfolge von (a) nach (c) durchgeführt
  • Beispiel 6: Bafilomycinabhängigkeit der Aktivität der vATPase
  • Die Messkurven (a) und (b) der 3 demonstrieren die Inhibition mit Bafilomycin A1.
  • Die Messungen wurden wie bei Aktivierung durch ATP beschrieben durchgeführt, allerdings wurde in die nicht-aktivierenden als auch in die aktivierende Lösung 25 nmol/l Bafilomycin A1 zugegeben. Bafilomycin A1 ist ein spezifischer Inhibitor der vATPase.
  • 3 zeigt also die Stromantwort eines mit synaptischen Vesikeln beladenen Sensors auf ATP-Konzentrationssprung hin. Diese wird durch den vATPase-spezifischen Inhibitor Bafilomycin A1 inhibiert.
  • Beispiel 7: DIDS-Abhängigkeit der Aktivität der vATPase
  • Die Messkurven (a) bis (c) der 4 demonstrieren die Inhibition mit DIDS.
  • Die Messungen wurden wie bei Aktivierung durch ATP beschrieben durchgeführt, allerdings wurde in die nicht-aktivierende als auch in die aktivierende Lösung 0,1–10 μmol/l DIDS zugegeben. DIDS inhibiert die vATPase mit Inhibitionskonstante Ki = 4.9 μmol/l (Hartinger & Jahn, 1993).
  • 4 zeigt also die Inhibierung der Stromantwort der vATPase Signale auf einen 300-μmol/l-ATP-Konzentrationssprung durch den Inhibitor DIDS.
  • Beispiel 8: Aktivitätsmessung vAChT
  • Der vesikuläre Acetylcholin Transporter vAChT ist ein Acetylcholin/Protonenantiporter (Exchanger). Die Funktion von vAChT in cholinergen Synapsen ist die Beladung der synaptischen Vesikel mit dem Neurotransmitter Acetylcholin.
  • 5 zeigt in Messkurve (a) die Aktivierung durch einen Konzentrationssprung in der Acetylcholinkonzentration.
  • Die Durchflusszelle mit integriertem Protein beladenem Sensorchip wurde zunächst mit „Ruhepuffer" [320 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2, 50 mmol/l Hepes pH 7,4] durchspült. Danach folgte die nicht-aktivierende Lösung (320 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2, 50 mmol/l Hepes pH 7,4, 1,0 mmol/l Na-ATP) und mittels elektromechanischem 3/2-Wegeventil wurde anschließend auf aktivierende Lösung (300 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2, 50 mmol/l Hepes pH 7,4, 1,0 mmol/l Na-ATP, 20 mmol/l Acetylcholin) umgestellt. Der vesikuläre Acetylcholin Transporter ist ein ACh/Protonenaustauscher. Der Import von Acetylcholin bei gleichzeitigem Export von Protonen führt zu einem negativen Signal, da positive Ladungsträger (Protonen) weg von der Sensoroberfläche verschoben werden.
  • 5 zeigt in Messkurve (b) die Inhibition mit Vesamicol.
  • Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurde in alle Lösungen 5 μmol/l Vesamicol zugegeben. Vesamicol ist ein spezifischer Inhibitor des vesikulärem Acetylcholin Transporters vAChT.
  • 5 zeigt also Stromantwort eines mit synaptischen Vesikeln beladenen Sensors auf Konzentrationssprünge mit Acetylcholin. Die Signale wurden mit dem vAChT-spezifischen Inhibitor Vesamicol inhibiert.
  • Beispiel 9: Aktivitätsmessungen CLC-3
  • Die vATPase Aktivität ist eng gekoppelt an Transport von Chloridionen über die vesikuläre Membran. Höhere Chloridkonzentrationen erlauben höhere Azidifizierung des Vesikelinneren und damit den Aufbau eines steileren Protonengradienten über die Membran (Reimer et al., 2001). Umgekehrt führt die Aktivierung der vATPase zum verstärkten Einstrom von Chloridionen in das Innere des Vesikels. Der Chloridkanal CLC-3 kommt in synaptischen Vesikeln vor und wurde als ein wichtiger Faktor für die Chloridleitfähigkeit der vesikulären Membranen und die Azidifizierung von synaptischen Vesikel beschrieben (Stobrawa et al., 2001). Ebenfalls wurde auch der verwandte CLC-5 als vesikuläre Cl-Transporter beschrieben, allerdings kommt dieses Protein vor allem in Endosomen vor (Jentsch et al., 2002). Zusätzlich wurde postuliert, dass der Glutamattransporter vGLUT Chloridionen leiten kann und das die Chloridleitfähigkeit von vGLUT durch Zugabe von Glutamat inhibiert wird (Bellocchio et al., 2000). Aus diesem Grund wurden die Messungen der Chloridströme in Gegenwart von Glutamat durchgeführt (siehe unten).
  • 6 zeigt die Aktivierung durch einen Chloridkonzentrationssprung als Stromantwort eines mit synaptischen Vesikeln beladenen Sensors auf Konzentrationssprünge mit Chlorid.
  • Die Durchflusszelle mit integriertem Protein beladenem Sensorchip wurde zunächst mit „Ruhepuffer" [330 mmol/l K-Glutamat, 50 mmol/l Hepes pH 7,2] durchspült. Danach folgte die nicht-aktivierende Lösung (330 mmol/l K-Glutamat, 50 mmol/l Hepes pH 7,2, 0,3 mmol/l Mg-ATP) und mittels elektromechanischem 3/2-Wegeventil wurde anschließend auf aktivierende Lösung (300 mmol/l K-Glutamat, 50 mmol/l Hepes pH 7,2, 0,3 mmol/l Mg-ATP, 30 mmol/l KCl) umgestellt. Der vesikuläre Chloridkanal CLC-3 leitet Chloridionen in das Innere der Vesikel. Dies führt zu einem negativem Signal, da negative Ladungsträger zur Sensoroberfläche verschoben werden.
  • Die Messkurven (a) bis (d) in 7 demonstrieren die Inhibition mit DIDS.
  • Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurde in alle Lösungen steigende Konzentrationen (0,1 μmol/l bis 100 μmol/l) von DIDS zugegeben. Wie schon in 4 zu sehen ist, inhibieren DIDS Konzentrationen gleich oder höher 10 μmol/l die vATPase vollständig. Der Chloridsignal war jedoch auch bei 100 μmol/l DIDS immer noch stabil. Die Inhibition der vATPase führt zu einer teilweise Inhibition von Chloridströmen (10–20% Inhibition). Die Unempfindlichkeit des Chloridsignals gegenüber höheren DIDS-Konzentrationen spricht dafür, dass die gemessenen Chloridströme CLC-3-spezifisch sind.
  • Darüber hinaus zeigen die Experimente, dass verschiedene Proteine (hier z. B. CLC3 und vATPase) in einem Vesikel parallel und in ihrer Wechselwirkung miteinander untersucht und gemessen werden können.
  • Es werden nun einige strukturelle Aspekte der Erfindung erläutert:
    8 zeigt in schematischer und geschnittener Seitenansicht eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1.
  • Diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1 weist ein Trägersubstrat 22 mit einem Oberflächenbereich 22a auf, auf welchem ein vermittelnder Zwischensubstratbereich 26 in Form einer geschichteten Metallstruktur vorgesehen ist, und zwar mit einem Primärmetall 26-1, hier z. B. aus Kupfer, einer Hilfsschicht 26-2, hier z. B. aus Nickel, die als Diffusionsbarriere und als Legierungsbildungsbarriere dient, sowie einer eigentlichen Elektrodenschicht 26-3, hier aus Gold.
  • Durch eine spezifische chemische Wechselwirkung mit der eigentlichen Elektrodenschicht 26-3 sind Biomaterialschichten 24a, 24b auf der Oberseite 26a des Vermittlungssubstrats 26 vorgesehen und immobilisiert. Diese Biomaterialschichten 24a, 24b dient als und bilden den Isolationsbereich 24 für die erfindungsgemäße Biosensoranordnung 1 und bestehen aus einer geschichteten Abfolge selbstorganisierender Monoschichten 24a und 24b, und zwar aus einer zuunterst angeordneten Unterschicht in Form einer Alkanthiolmonoschicht 24b, welche über die spezifische Thiol-Gold- oder SH-Au-Wechselwirkung an der Oberfläche 26a angekoppelt und dort immobilisert ist, und einer zuoberst vorgesehenen Lipidmonoschicht 24a. Durch diese Anordnung wird eine Membranbiosensorelektrodeneinrichtung M oder 20 mit einer festkörperunterstützten Membran SSM gebildet.
  • 9 zeigt in schematischer und teilweise geschnittener Seitenansicht einen Ausschnitt einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1, bei welcher als Primärträger 10 in Form eines Vesikels oder Liposoms erfindungsgemäß ein ein Synaptosom 10' oder ein synaptosomales/synaptisches Liposom oder Vesikel oder ein Derivate davon vorgesehen ist, in dessen Membran 11 in Form einer synaptosomalen/synaptischen Membran 11' in orientierter Art und Weise als Wirkortkomplex 12 ein synaptosomales/synaptisches Protein 12' als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheit in Form eines Membranproteins eingelagert ist. In Bezug auf die Ausführungsform der 9 ist festzuhalten, dass die Darstellung nicht maßstabsgetreu ist, und zum anderen in der Regel eine große Mehrzahl Vesikel 10, 10 gleichzeitig auf der SSM oder der Oberfläche 24a der als Sekundärträger 20 dienenden Biosensoranordnung 20 angelagert oder adsorbiert sind.
  • Es ist gezeigt, dass durch Umsetzung des im Messmedium 30 vorgesehenen Substrats S zu einem umgesetzten Substrat S' ein Stofftransport der Spezies Q von einer Seite 10a der Membran 10, 10' zur gegenüberliegenden Seite 10b in das Vesikelinnere erfolgt, welcher über den entsprechenden Nettoladungstransport und den damit verbundenen Verschiebungsstrom in zeitlich abhängiger Form nachgewiesen werden kann.
  • 10 zeigt in einer schematischen und teilweise geschnittenen Seitenansicht eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung 1 und in einer entsprechenden Ausführungsform eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur amperometrischen und/oder potentiometrischen pharmakologischen Wirkstofftestung.
  • Ein Messraum 50 in Form eines im Wesentlichen geschlossenen Gefäßes bildet zusammen mit einer Austausch-/Mischeinrichtung 60, zum Beispiel in Form eines Perfusorsystems oder einer Pumpenanlage, einen geschlossenen Flüssigkeitskreislauf. Die Kommunikation der als Messmedium 30 dienenden Flüssigkeit erfolgt über entsprechende Zuführ- und Abführeinrichtungen 51 bzw. 52. Das Messmedium 30 kann dabei eine wässrigere Elektrolytlösung sein, die bestimmte Ionenanteile, eine gegebene Temperatur, einen bestimmten pH-Wert usw. aufweist. Des Weiteren sind im Messmedium 30 gegebenenfalls bestimmte Substratstoffe S und/oder bestimmte Wirkstoffe W enthalten, oder sie werden in späteren Verfahrensschritten durch die Austausch-/Mischeinrichtung 60 hinzugefügt.
  • Im Messbereich 50 ist eine erfindungsgemäße Biosensoranordnung 1 vorgesehen. Die Biosensoranordnung 1 besteht aus Primärträgern 10, welche am Oberflächenbereich 24a der als Sekundärträger 20 dienenden Sensorelektrodeneinrichtung angelagert sind.
  • In dem in 10 in schematischer und nicht maßstabsgetreuer Form gezeigten Ausführungsbeispiel ist nur ein einziger Primärträger 10 gezeigt. Dieser besteht aus einem Lipidvesikel oder Liposom in Form einer im Wesentlichen hohlkugelförmig und geschlossen ausgebildeten Lipiddoppelschicht oder Lipidmembran 11. In diese Lipiddoppelschicht 11 des als Primärträger 10 dienenden Vesikels ist als im Wesentlichen biologische Einheit 12 ein Membranprotein membrandurchgreifend eingelagert.
  • Durch Umsetzung eines im Messmedium 30 vorhandenen Substrats S zu einem umgesetzten Substrat S' werden im Membranprotein 12 bestimmte Prozesse initiiert, die in dem in 10 gezeigten Fall zu einem Stofftransport einer Spezies Q von der extravesikulären Seite oder Außenseite 10a des Vesikels 10 zur intravesikulären Seite oder Innenseite 10b des Vesikels 10 führt. Ist die Spezies Q mit einer elektrischen Ladung behaftet, so führt der Transport dieser Spezies Q von der Seite 10a zur Seite 10b zu einem Nettoladungstransport, welcher mit einem elektrischen Strom von der Außenseite 10a des Vesikels 10 zur Innenseite 10b des Vesikels 10 korrespondiert.
  • Zum einen sind in jedem Vesikel 10 in der Regel eine Vielzahl im Wesentlichen identischer Membranproteinmoleküle 12 in im Wesentlichen gleicher Orientierung in der Membran 11 des Vesikels 10 eingebaut. Werden diese im Wesentlichen simultan aktiviert – z. B. durch einen durch Mischen initiierten Konzentrationssprung in der Konzentration des Substrats S von einem nicht aktivierenden Messmedium N, 30 ohne Substrat S zu einem aktivierenden Messmedium A, 30 mit Substrat S – so führt das zu einem messbaren elektrischen Strom.
  • Dieser Ladungsträgertransport ist deshalb messbar, weil eine Vielzahl von Primärträgern 10 oder Vesikeln an der Oberfläche 24a der Sensorelektrodeneinrichtung 20 angelagert sind, so dass sich bei Aktivierung einer Vielzahl von Proteinmolekülen 12 in einer Vielzahl von Vesikeln vor der Oberfläche 24a der Sensorelektrodeneinrichtung 20 eine Raumladung bestimmter Polarität ausbildet. Diese Raumladung wirkt dann auf die Elektrode 26, die in dem in 10 gezeigten Fall auf einem Träger 22 aus Glas in Form einer Goldschicht aufgedampft ist und durch eine als Isolationsbereich 24 dienende Doppelschicht aus einer unteren Schicht 24b und einer als Oberfläche dienenden Oberschicht 24a abgedeckt und gegenüber dem Messmedium 30 elektrisch isoliert wird.
  • Die Oberfläche oder obere Schicht 24a des Isolationsbereichs 24 ist zum Beispiel ein zur Lipiddoppelschicht 11 des Vesikels 10 kompatible Lipidmonoschicht, die mittels eines Self-Assembling-Vorgangs auf einer die untere Schicht 24b bildenden Alkanthiolmonoschicht ausgebildet ist, so dass die Abfolge der Schichten 24b und 24a, nämlich die Abfolge aus einer Alkanthiolmonoschicht und einer Lipidmonoschicht auf einem festkörperartig ausgebildeten Goldsubstrat als Elektrode 26 eine Membranstruktur SSM bildet, die auch als festkörperunterstützte Membran bezeichnet wird (SSM: Solid Supported Membrane).
  • Über eine Anschlussleitung 48i ist die Sensoranordnung 1 und insbesondere die Sensorelektrodeneinrichtung 20 mit einer Datenerfassungs-/Steuereinrichtung 40 verbunden. Diese weist einen Messeinrichtung 44 auf, in welchem in zeitlicher Abhängigkeit ein elektrischer Strom I(t) oder eine elektrische Spannung U(t) gemessen werden kann. Des Weiteren ist eine Verstärkereinrichtung 42 vorgesehen, in welcher die Messsignale gefiltert und/oder verstärkt werden. Über eine Steuerleitung 48s wird die Wirkstofftestung durch Steuerung der Austausch-/Mischeinrichtung 60 geregelt. Über eine weitere Leitung 48o wird der elektrische Stromkreis mittels einer Gegenelektrode 46, zum Beispiel in Form einer Pt/Pt-Elektrode oder mittels einer Ag/AgCl-Elektrode geschlossen. Isolationen 28, 27 und 47 verhindern Kurzschlüsse der SSM bzw. der Gegenelektrode 46 gegenüber dem Messmedium 30.
  • Die 11A bis 11D zeigen eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes W, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes 12 im Bereich – also an oder in – einer synaptosomalen/synaptischen Membran 11' modifiziert im Sinne eines Verfahrens zur amperometrischen und/oder potenziometrischen, pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung.
  • In einem als Küvette ausgebildeten Messraum 50 ist an einer als Sensorelektrodeneinrichtung oder Sekundärträger 20 dienenden Biosensormembran ein Ensemble von Vesikeln als Primärträger 10 erfindungsgemäß in Form von Synaptosomen 10' oder synaptosomalen/synaptischen Liposomen oder Vesikeln oder deren Derivaten mit einem dort eingelagerten Membranprotein als Wirkortkomplexe 12 in Form von synaptosomaler/synaptischer Protein 12 als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten adsorbiert. Die so ausgebildete Biosensoranordnung 1 ist dabei im Messraum 50 in einem vorgesehenen Messmedium 30 inkubiert.
  • Der Messraum 50 ist über eine Zuführleitung 51 über eine vorgesehene erste Ventileinrichtung V1 steuerbar wahlweise mit einer Mehrzahl von Vorratsgefäßen 53, 54 und 55 verbunden, in welchen bestimmte Volumina des Messmediums 30 mit bestimmten weiteren Inhaltsstoffen versehen, vorgesehen sind.
  • So enthält das erste Vorratsgefäß 53 der 11A bis 11D ein nicht aktivierendes Messmedium N, welches so gewählt ist, dass die in den Vesikeln 10 eingelagerten Wirkortkomplexe 12 durch die Zusammensetzung des Messmediums des Typs N nicht zu einer elektrischen Aktion aktiviert werden. Im zweiten Vorratsgefäß 54 der 11A bis 11D ist ein Messmedium A enthalten, durch welches die Wirkortkomplexe 12 in den Vesikeln 10 zu einer elektrischen Aktion, also zu einem Ladungstransport oder dergleichen, aktivierbar sind. Im dritten Vorratsgefäß 55 der
  • 11A bis 11D schließlich ist dem aktivierenden Messmedium A des Gefäßes 54 ein Wirkstoff W hinzugefügt worden, dessen Wirkung auf die Aktivität der Wirkortkomplexe 12 in den Vesikeln 10 ermittelt werden soll.
  • Über eine Abführeinrichtung 52 oder Abführleitung ist der Messraum 50 oder die Küvette über eine zweite Ventileinrichtung V2 zumindest mit einem Teil der Austausch-/Mischeinrichtung 60 verbunden. Des Weiteren kann über das Ventil V2 ein Entsorgungsgefäß E hinzugeschaltet werden, zum Beispiel um die Austausch-/Mischeinrichtung 60 zu entleeren.
  • In einer ersten Phase der pharmakologischen Wirkstofftestung, welche in 11A gezeigt ist, ist der Messraum 50 über die erste Ventileinrichtung V1 und die Zuführeinrichtung 51 mit dem ersten Vorratsgefäß 53 verbunden. Andererseits ist der Messraum 50 über die Abführeinrichtung 52 und über die zweite Ventileinrichtung V2 mit der Austausch-/Mischeinrichtung 60 verbunden. Durch Betrieb der Austausch-/Mischeinrichtung 60 wird eine Saugkraft über die miteinander verbundenen Bereiche ausgeübt, so dass aus dem Vorratsgefäß 53 das nicht aktivierende Messmedium N durch die Küvette des Messraums 50 strömt und die Biosensormembran sowie die proteinhaltigen Vesikel 10 umspült oder umströmt. In diesem Zustand kann keinerlei elektrische Aktivität der Wirkortkomplexe 12 gemessen werden, und diese Phase dient der Equilibration der Biosensormembran sowie der Aufnahme von Störsignalen und dem Abgleich des Rauschens.
  • In der in 11B gezeigten zweiten Testphase wird über die Datenerfassungs-/Steuereinrichtung 40 die erste Ventileinrichtung V1 so geschaltet, dass die Zuführeinrichtung 51 des Messraums 50 mit dem zweiten Vorratsgefäß 54 kommunizierend verbunden ist, so dass auf Betrieb der Austausch-/Mischeinrichtung 60 hin das aktivierende Messmedium A durch die Küvette des Messbereichs 50 strömt, die Biosensormembran sowie die proteinhaltigen Vesikeln strömt und umspült und somit die in den Vesikeln 10 enthaltenen Membranproteine als Wirkortkomplexe 12 zu einem elektrogenen Ladungstransport anregt, welcher dann über die in den 11A–11D nicht gezeigte Datenerfassung nachgewiesen werden kann.
  • In einer in 11C gezeigten dritten Phase des Verfahrens der pharmakologischen Wirkstofftestung wird die erste Ventileinrichtung V1 derart geschaltet, dass der Messraum 50 mit dem dritten Vorratsgefäß 55 strömungsmäßig verbunden ist, so dass auf Betrieb der Austausch-/Mischeinrichtung 60 hin nunmehr das aktivierende Messmedium A unter Zusatz des Wirkstoffes W durch die Küvette des Messraums 50 strömt und somit die Biosensormembran sowie die proteinhaltigen Vesikel 10 umspült.
  • Durch Aufnahme etwaiger elektrischer Signale unter dem Einfluss des hinzugefügten Wirkstoffes W kann im Vergleich zu den während der Phase der 11B aufgenommenen Signale der Einfluss des Wirkstoffes auf die Aktivität der Wirkortkomplexe 12 in den Vesikeln 10 im Wesentlichen ermittelt werden.
  • In der Phase, welche in 11D gezeigt ist, wird die in der Austausch-/Mischeinrichtung 60 aufgenommene Flüssigkeitsmenge in das Entsorgungsgefäß E hin entsorgt, wobei durch die zweite Ventileinrichtung V2 die Austausch-/Mischeinrichtung 60 ausschließlich mit dem Entsorgungsgefäß E verbunden ist.
  • Selbstverständlich kann die in den 11A bis 11D gezeigte Anordnung bzw. das damit in Zusammenhang stehende Testverfahren auch komplexer ausfallen und weitere Messzwischenschritte, Spül- und Waschvorgänge enthalten.
  • Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechanische Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die einfache Handhabbarkeit und geringer Störanfälligkeit. In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zuverlässigkeit, eine geringe Störanfälligkeit sowie insbesondere ein gegenüber herkömmlichen Verfahren maßgeblich gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren kostengünstig ausgearbeitet und durchgeführt werden können.
  • Die 12A bis 12C beschreiben eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Vorgesehen sind dabei aber nur zwei Vorratsgefäße 53 und 54. Das Vorratsgefäß 53 enthält wieder eine nicht aktivierende Lösung N. Das Vorratsgefäß 54 enthält als X entweder in einem ersten Verfahrensschritt die aktivierende Lösung A und in einem zweiten Verfahrensschritt eine aktivierende Lösung A + W mit zu testendem Wirkstoff W. Im ersten Fall X = A wird die Aktivierung der biologischen Einheit als Referenzsignal gemessen. Im zweiten Fall X = A + W wird dann der Effekt des Wirkstoffes auf die Aktivierung messbar.
  • Im einfachsten Fall kann der Wirkstoff W identisch sein mit dem Substrat S und/oder mit der Transportspezies Q.
  • Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung der Möglichkeit einer elektrophysiologischen Untersuchung von Synaptosomen 10' oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträgern 10 und damit von synaptosomalen/synaptischen Membranen 11' als Membranen 11 der Primärträger 10 und folglich von entsprechenden Wirkortkomplexen 12, die in Form synaptosomaler/synaptischer Proteine als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten vorliegen oder jeweils von einem oder mehreren synaptosomalen/synaptischen Proteinen als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten gebildet werden. Dadurch ist es möglich, derartige synaptosomaler/synaptischer Proteine als Wirkortkomplexe 12 zum Beispile in vergleichsweise nativer Umgebung elektrophysiologisch zu untersuchen.
  • Im Folgenden werden noch einige weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung erläutert:
    Die hier vorgestellten Messungen wurden an synaptischen Vesikeln durchgeführt.
  • Diese synaptischen Vesikel sind – im Sinne der Erfindung – die nativen synaptischen Vesikel, die in Synapsen vorkommen und der Freigabe oder Freisetzung von Neurotransmittern dienen. Synaptische Vesikel beinhalten – hauptsächlich – vesikuläre Transporter.
  • Synaptosomen sind dagegen im Sinne der Erfindung Vesikel oder Liposomen, die aus synaptischen oder synaptosomalen Plasmamebranen gewonnen werden und vor allem plasmamembranständige Trannsporter enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht jedoch auch ganz allgemein auf den Bereich der Messung von oder an synaptischen oder synaptosomalen Membranen oder auch von oder an Membranen intrazellulärer Kompartimente oder Komponenten.
  • Erfindungsgemäß ist auch die Untersuchung des Zusammenwirkens der verschiedener synaptischer oder synaptosomaler Proteine möglich. Dabei kann das Zusammenwirken der verschiedenen Proteinen auf verscheidene Arten aufgefasst werden:
    • (i) Sequentielle Tests: Bei so genannten sequentiellen Tests im Sinne der Erfindung werden verschiedene Proteine, z. B. Transporter, sequentiell auf demselben Sensor selektiv gemessen und/oder getestet. Dazu wird der zunächst die erste Spezies, der erste Transporter, mit einem spezifischen Messverfahren zuerst vermessen/aktiviert. Danach wird das Messverfahren derart abgeändert, dass eine weietere und andere Spezies, z. B. ein weiterer Transporter, wird aktiviert und vermessen werden kann, und so weiter. Die Selektive Aktivierung und Messung einer bestimmten Spezies erfolgt dabei durch das Setzen und Anwenden spezieller und damit spezifischer Messbedigungen, z. B. durch die Wahl von spezifischen Messlösungen und Messprotokollen. Die Wahl der Messlösungen ist also entscheidend, um selektive Messbedingungen für die jeweilige Spezies zu schaffen. Diese Messbedingungen erlauben eine selektive Aktivierung der jeweiligen Spezies mit unterschiedlichen Substraten/Ladungsträgern als auch von Spezies, die zwar z. B. dasselbe Substrat oder diesselben Ladungsträger transportieren, aber verschiedene Co-Substrate verwenden.
    • (ii) Parallele Tests: Zwei oder mehr Spezies können innerhalb einer Messsequenz – also quasi parallel – hintereinander aktiviert und vermessen werden, so dass die Aktivität der Spezies simultan beobachtet werden kann. Ein solches Messprotokoll verlangt z. B. zwei aufeinanderfolgende Konzentrationssprünge mit zwei verschiedenen Substraten/Ladungsträgern, die für die jeweiligen Spezies spezifisch sind. Die Aktivität der jeweiligen Transporter kann zeitlich getrennt selektiv gemessen werden. Als Beispiel können die Messungen der vATPase und der Chloridleitfähigkeit angesehen werden, wie sie in 7 dargestellt sind. Prinzipiell können auf dieser Weise erfindungsgemäß mehrere Spezies, z. B. Transporter, hintereinander aktiviert werden.
    • (iii) Besondere Vorteile der sequentiellen und parallelen Aktivierung gemäß der vorliegenden Erfindung ergeben sich wie folgt: Es ist die Untersuchung des Zusammenwirkens von intrazellulären als auch plasmamembranständigen Transportern in situ – also z. B. direkt in den synaptischen Vesikeln bzw. an den synaptischen Membranen – möglich. Durch die hohe Robustheit der Sensoren können mehrere Transporter auf einem Sensor über längere Zeit hintereinander untersucht werden. Außerdem erlaubt der Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung einen höheren Durchsatz, z. B. für Screeningverfahren. Es sind zwar an sich sequentielle und parallele Messungen von mehreren Transportern mit anderen Messverfahren – wie Fluoreszenzmessungen mit FLEX-Station, Oocytenmessungen mit TEVC – grundsätzlich denkbar. Allerdings hat die hier vorgestellte erfindungsgemäße Technologie mehrere Vorteile gegenüber von diesen Technologien: Die Messung der Enzymaktivität mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bedarf keiner Vermittler oder markierter Substrate. Eine Einzelmessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist sensitiv gegenüber allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden. Substrate müssen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort des Proteins durch einen schnellen Lösungswechsel induziert wird. Darüber hinaus ist im Gegensatz zu der Patch-/Voltageclamp-Technik ein höherer Durchsatz möglich.
  • In Bezug auf diese Aspekte können noch folgende Eigenschaften und Bezeichnungen für die spezielle Wahl der Messbedingungen und insbesondere der Messlösungen genannt werden, die jedoch vom allgemeinen Rahmen und den allgemeinen Bezeichnungen abgedeckt werden:
    So können für in (i) beschriebenen sequentielle Messverfahren die spezifischen Lösungen für einzelne Transporter im allgemeinen als Ruhelösung, nicht-aktivierende Lösung und aktivierende Lösung aufgefasst und bezeichnet werden.
  • Für die in (ii) aufgeführten parallelen Messverfahren können im Allgemeinen die Lösungen als nicht-aktivierende Lösung, aktivierende Lösung 1 und aktivierende Lösung 2 bezeichnet und aufgefasst werden.
  • Die hier beschriebene Erfindung erlaubt sowohl intrazelluläre als auch in der Plasmamembran lokalisierte Spezies, z. B. Transporter in einem Membranvesikel, einem Liposom oder in einem Membranfragment zu messen und deren Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Spezies oder Transporter können im durch optimierte Messprotokolle aktiviert oder inhibiert einzelnen selektiv werden. Es gibt mehrere Möglichkeiten verschiedenen Transporter selektiv zu messen:
    Spezies mit unterschiedlichen Substratspezifitäten können durch unterschiedliche Substratkonzentrationssprünge aktiviert werden. So werden z. B. die vATPase durch einen ATP-Konzentrationssprung, der Chloridkanal CLC3 durch einen Chloridkonzentrationssprung und der Acetylcholintransporter durch einen Acetylcholinsprung aktiviert.
  • Bei verschiedene Spezies, z. B. Transportern, mit gleichen oder auch unterschiedlichen Substraten können durch unterschiedliche Inhibitoren selektiv Inhibitionen erreicht werden. So führt z. B. 10 μmol/l DIDS zur vollständigen Inhibition der vATPase wogegen der Chloridkanal CLC3 bei diesen Konzentrationen nicht inhibiert werden kann. Diese Untersuchung ist vor allem bei einer parallelen Messung der Spezies nützlich, bei der die Aktivität der beiden Spezies simultan analysiert werden kann. Es ist aber eine solche Analyse mit Inhibitoren auch bei einem sequentiellen Test möglich. Es kann z. B. der Transporter vAChT spezifisch mit Vesamicol inhibiert werden, wogegen der Cholin-/Acetylcholintransporter CHT1, der ebenfalls in synaptischen Vesikeln vorkommt, nicht mit Vesamicol inhibiert wird.
  • Spezies mit gleichen Substraten aber unterschiedlichen Co-Substraten können z. B. durch Anlegen von verschiedenen Ionengradienten über der Membran selektiv aktiviert werden. So können z. B. der Glutamattransporter EAAT – z. B. EAAC1 – durch Aufbau eines Na-Gradienten und durch anschließende Glutamatkonzentrationssprünge aktiviert werden. EAAT-Transporter sind nicht in natriumfreien Bedingungen aktiv. Der vGLUT-Transporter kann dagegen unter natriumfreien Bedingungen gemessen werden.
  • Elektrische Messungen von und an synaptischen Vesikeln sind mittels herkömmlicher Verfahren, z. B. mttels Patchclamp wegen der geringen Vesikelgröße von etwa 30 nm 50 nm (Takamori et al., 2006 Cell 127: 831–846) nicht möglich. Patchclampmessungen an Synaptosomen sind ebenfalls wegen ihrer geringen Größe sehr schwierig im Bereich von 1 μm bis 3 μm Durchmesser (Dekel et al., 2003).
  • Die hier explizit angegeben Konzentrationen der Stoffe in den Messlösungen stellen nur bevorzugte Bedingungen dar. Die Zusammensetzung der entsprechenden Lösungen sind in allgemeinerer Form bei der Erfindung verwendbar.
  • Es kann das nicht aktivierende Medium in dem oben diskutierten Fall K+, Mg++, Cl-, und HEPES bei pH 5–8 enthalten. Besonders bevorzugt ist aber dabei dann ein Medium mit 150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl, und 50 mmol/l HEPES pH 7,2.
  • Die Messlösungen können für parallele Messungen im Allgemeinen als nicht-aktivierende Lösung, aktivierende Lösung 1 (z. B. ATP Sprung) und aktivierende Lösung 2 (z. B. Chloridsprung) aufgefasst und bezeichnet werden.
  • Statt eines Wirkstoffes können auch mehrere Wirkstoffe oder Wirkstoffkomplexe vorgesehen sein. Unter einem Wirkstoff lassen sich dann somit auch verschiedene stoffliche und/oder elektrisch geladene Entitäten subsummieren, die ggf. über verschiedene Wirkmechanismen ins Geschehen eingreifen. Es können somit – wie oben angedeutet – auch zwei verscheidene Substrate (Substrat 1 und Substrat 2) für verscheidene Messphasen bei sequentiellen oder parallelen Test vorgesehen sein oder werden.
  • Falls mit einen Inhibitor gemessen wird, kann der verwendete Wirkstoff in allen Lösungen (Ruhe-, nicht-aktivierende, aktivierende) vorliegen. Auch der Inhibitor selbst kann als ein weiterer Wirkstoff aufgefasst werden.
    • 1
    erfindungsgemäße Biosensoranordnung oder Sensoranordnung
    10
    Primärträger
    10a
    Oberfläche, Außenseite, extravesikuläre Seite
    10b
    Innenseite, intravesikuläre Seite
    10'
    Synaptosom, synaptosomales/synaptisches Liposom/Vesikel
    11
    Membran des Primärträgers 10
    11'
    synaptosomale/synaptische Membran
    12
    Wirkortkomplex, biologische Einheit, Membranprotein
    12'
    synaptosomales/synaptisches Protein
    13
    Ionenmedium
    20
    Sekundärträger, Sensorelektrodeneinrichtung, Membranbiosensorelektrodenbereich
    20a
    erste oder obere Oberfläche
    20c
    zweite oder untere Oberfläche
    21
    Elektrodenbereich
    22
    Träger, Trägersubstratbereich
    22a
    Oberflächenbereich, Oberseitenoberflächenbereich
    24
    Isolationsbereich, Biomaterialbereich
    24a
    Oberschicht, Oberflächenbereich, Lipidmonoschicht
    24b
    Unterschicht, Thiol-/Mercaptanmonoschicht
    26
    Elektrode
    26a
    Oberseitenoberflächenbereich
    26-1
    Primärmetallbereich, insbesondere aus/mit Kupfer
    26-2
    Hilfsschicht, z. B. Diffusions-/Legierungsbildungsbarriere, insbesondere mit/aus Nickel
    26-3
    eigentliche Elektrodenschicht, insbesondere mit/aus Gold
    27
    Isolation
    28
    Isolation
    29
    Anschluss
    30
    Messmedium
    40
    Datenerfassungs-/Steuereinrichtung
    42
    Verstärkereinrichtung
    44
    Messeinrichtung
    46
    Gegenelektrode
    48i, o
    Anschlussleitungen
    48s
    Steuerleitung
    50
    Messbereich, Gefäß, Küvette
    50a
    erste oder obere Oberfläche
    50c
    zweite oder untere Oberfläche
    51
    Zuführeinrichtung
    51a
    Auslassöffnung, Austrittsöffnung
    52
    Abführeinrichtung
    52e
    Einlassöffnung, Eintrittsöffnung
    53
    Vorratsgefäß
    54
    Vorratsgefäß
    55
    Vorratsgefäß
    60
    Austausch-/Mischeinrichtung
    100
    Messvorrichtung
    A
    aktivierendes Messmedium
    A + W
    aktivierendes Messmedium mit Wirkstoff W
    Cm
    spezifische Kapazität
    E
    Entsorgung
    Gm
    spezifische Leitfähigkeit
    M
    Membranbiosensorelektrodenbereich
    N
    nicht aktivierendes Messmedium
    I(t)
    Stromsignal
    Q
    Ladungsträger
    S
    Substrat
    S'
    umgesetztes Substrat
    SSM
    Membranstruktur, festkörperunterstützte Membran
    U(t)
    Spannungssignal
    v
    Fließgeschwindigkeit, Strömungsgeschwindigkeit
    W
    Wirkstoffkomplex, Wirkstoff
    X
    Wirkstoffkomplex, Wirkstoff
  • Literatur
    • Bellocchio EE, Reimer RJ, Fremeau RT, Edwards RT (2000) Uptake of glutamate into synaptic vesicles by an inorganic phosphate transporter. Science 289: 957–960.
    • Hartinger J, Jahn R (1993). An anion binding site that regulates the glutamate transporter of synaptic vesicles. J Biol Chem 268: 23122–23127.
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    • Stobrawa SM, Breiderhoff T, Takamori S, Engel D, Schweizer M, Zdebik AA ; Bosl, MR, Ruether K, Jahn H, Draguhn A, Jahn R, Jentsch TJ (2001). Disruption of CLC-3, a chloride channel expressed on synaptic vesicles, leads to a loss of the hippocampus. Neuron 29: 185–196.

Claims (27)

  1. Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes (W), welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes (12) im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran (11') modifiziert, – bei welchem Synaptosomen (10') oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträger (10) elektrophysiologisch untersucht werden, – bei welchem Primärträger (10) verwendet werden, die eine synaptosomale/synaptische Membran (11') als Membran (11) aufweisen, welche den Wirkortkomplex (12) im Bereich der Membran (11) des jeweiligen Primärträgers (10) enthalten, – bei welchem als Wirkortkomplex (12) oder als Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer einer synaptosomalen/synaptischen vesikulären ATPase oder einer vAT-Pase verwendet wird, – bei welchem als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl und 50 mmol/l Hepes pH 7,2 verwendet wird, – bei welchem als aktivierendes Medium ein Medium mit 150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl, 50 mmol/l Hepes pH 7,2 und 0,1 bis etwa 1,0 mmol/l Na-ATP verwendet wird und – bei welchem als Ruhemedium ein Medium mit 150 mmol/l K-Aspartat, 2 mmol/l MgSO4, 4 mmol/l KCl und 50 mmol/l Hepes pH 7,2 verwendet wird.
  2. Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes (W), welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes (12) im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran (11') modifiziert, – bei welchem Synaptosomen (10') oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträger (10) elektrophysiologisch untersucht werden, – bei welchem Primärträger (10) verwendet werden, die eine synaptosomale/synaptische Membran (11') als Membran (11) aufweisen, welche den Wirkortkomplex (12) im Bereich der Membran (11) des jeweiligen Primärträgers (10) enthalten, – bei welchem als Wirkortkomplex (12) oder als Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines synaptosomalen/synaptischen vesikulären Acetylcholintransporters oder eines vAChTs verwendet wird, – bei welchem als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 320 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2, 50 mmol/l Hepes-NaOH pH 7,4, und 1 mmol/l Na-ATP verwendet wird, – bei welchem als aktivierendes Medium ein Medium mit 300 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2, 50 mmol/l Hepes-NaOH pH 7,4, 1 mmol/l Na-ATP und 20 mmol/l Acetylcholin verwendet wird und – bei welchem als Ruhemedium ein Medium mit 320 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl2 und 50 mmol/l Hepes-NaOH pH 7,4 verwendet wird.
  3. Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes (W), welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes (12) im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran (11') modifiziert, – bei welchem Synaptosomen (10') oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate als Primärträger (10) elektrophysiologisch untersucht werden, – bei welchem Primärträger (10) verwendet werden, die eine synaptosomale/synaptische Membran (11') als Membran (11) aufweisen, welche den Wirkortkomplex (12) im Bereich der Membran (11) des jeweiligen Primärträgers (10) enthalten, – bei welchem als Wirkortkomplex (12) oder als Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines synaptosomalen/synaptischen vesikulären Chloridkanals oder eines CLC-3s verwendet wird, – bei welchem als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 330 mmol/l K-Glutamat, 50 mmol/l Hepes pH 7,2 und 0,3 mmol/l Mg-ATP verwendet wird, – bei welchem als aktivierendes Medium ein Medium mit 330 mmol/l K-Glutamat, 50 mmol/l Hepes pH 7,2, 0,3 mmol/l Mg-ATP und 30 mmol/l KCL verwendet wird und – bei welchem als Ruhemedium ein Medium mit 330 mmol/l K-Glutamat und 50 mmol/l Hepes pH 7,2 verwendet wird.
  4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem ein Wirkortkomplex (12) verwendet wird, welcher ein synaptosomales/synaptisches Protein als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheit aufweist oder welcher von einem synaptosomalen/synaptischen Protein als zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheit gebildet wird.
  5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüchen, mit den Schritten: (a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger (10), welche den Wirkortkomplex (12) im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran (11') als Membran (11) des jeweiligen Primärträgers (10) enthalten, (b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger (10) am oder im Oberflächenbereich (24c) eines Isolationsbereichs (24) einer als Sekundärträger (20) dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium (30, 30-1, 30-2, 30-3), wobei der Sekundärträger (20) gegenüber dem Messmedium (30, 30-1, 30-2, 30-3) und gegenüber den Primärträgern (10) mittels des Isolationsbereichs (24) mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird, (c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes (W), (d) In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes (W) mit dem Wirkortkomplex (12) der Primärträger (10), und (e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes (W) auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes (12) durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes (12) oder einer Änderung der elektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundärträger (20), (f) bei welchem ein durch den Wirkortkomplex (12) erzeugter elektrischer Strom oder ein durch den Wirkortkomplex (12) erzeugtes elektrisches Potenzial als elektrische Aktion verwendet werden, welches jeweils erzeugt wird durch einen Vorgang oder mehrere Vorgänge aus der Gruppe, die aufweist den Transport, die Verschiebung, die Anlagerung, die Freigabe, die Bindung von Ladungsträgern, Stoffen und/oder Liganden und die Konformationsänderungen, (g) bei welchem als Messmedium (30, 30-1, 30-2, 30-3) eine wässrige Elektrolytlösung verwendet wird, (h) bei welchem als Primärträger (10) Synaptosomen (10') oder synaptosomale/synaptische Vesikel oder Liposomen oder deren Derivate verwendet werden und (i) bei welchem Primärträger (10) verwendet werden, die als Membran (11) eine synaptosomale/synaptische Membran (11') mit dem Wirkortkomplex (12) aufweisen.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem Synaptosomen (10') oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate mit synaptosomalen/synaptischen Membranen (11') in nativer Form als Primärträger (10) verwendet werden.
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem Synaptosomen (10') oder synaptosomale/synaptische Liposomen oder Vesikel oder deren Derivate mit synaptosomalen/synaptischen Membranen (11') in gereinigter, biochemisch und/oder molekularbiologischer geänderter Form als Primärträger (10) verwendet werden.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messmedium (30) ein Ruhemedium, mindestens ein nicht-aktivierendes Medium und/oder mindestens ein aktivierendes Medium verwendet werden, durch welche neben dem Wirkortkomplex (12) in den synaptosomalen/synaptischen Membranen (11') vorhandene weitere und zu einer elektrischen Aktion aktivierbare biologische Einheiten (12') nicht aktiviert, in ihrer Aktivität reduziert oder inhibiert werden.
  9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Mehrzahl synaptosomaler/synaptischer Wirkortkomplexe (12) untersucht wird.
  10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Mehrzahl synaptosomaler/synaptischer Wirkortkomplexe (12) sequentiell untersucht wird.
  11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Mehrzahl synaptosomaler/synaptischer Wirkortkomplexe (12) parallel untersucht wird.
  12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger (20) verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperartiger Elektrodenbereich (21) mit mindestens einer Elektrode (26) vorgesehen ist oder wird, welcher gegenüber dem Messmedium (30) und gegenüber den Primärträgern (10) elektrisch und mechanisch isoliert ist oder wird, und zwar durch Vorsehen eines Isolationsbereichs (24) in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut ist oder wird, und zwar aus zumindest einer Oberschicht (24a) einer amphiphilen organischen Verbindung.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, bei welchem eine Elektrode (26) aus einem Metall aus der Gruppe, die gebildet wird von Gold, Silber und Platin, im Elektrodenbereich (21) vorgesehen ist oder wird, und zwar mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht (24b) und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht (24a) darauf.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, bei welchem die Elektrode (26) mit oder aus einem Kunststoffmaterial oder einem Polymermaterial verwendet wird, welches elektrisch leitfähig ist, mit einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht (24a) darauf.
  15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 14, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger (20) verwendet wird, bei welcher der eine Elektrode (26) der Biosensorelektrode als Sekundärträger (20) abdeckende Bereich des Isolationsbereichs (24) als Membranstruktur (SSM) ausgebildet ist oder wird, insbesondere mit einer Fläche (A) im Bereich von etwa 0,1 mm2 bis etwa 50 mm2 und mit einer spezifischen elektrischen Leitfähigkeit (Gm) im Bereich von etwa 1 nS/cm2 bis etwa 100 nS/cm2 und/oder mit einer spezifischen Kapazität (Cm) im Bereich von etwa 10 nF/cm2 bis etwa 1000 nF/cm2.
  16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger (10) jeweils ein Vesikel, ein Liposom, eine mizelläre Struktur oder ein Membranfragment verwendet wird.
  17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Wirkortkomplex (12) oder als Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines synaptosomalen/synaptischen vesikulären Acetylcholintransporters oder eines vAChTs verwendet wird.
  18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem der Wirkortkomplex (12) aus dem Organismus eines Säugers, insbesondere Ratte, Schwein, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesem genetisch abgeleitet ist oder wird.
  19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem ein Wirkortkomplex (12) verwendet wird, der zumindest zum Teil im Primärträger (10) die Membran (11) durchspannend ausgebildet ist.
  20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als enzymatische Eigenschaft verwendet wird: – die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes (W) oder eines Teils davon oder des Messmediums (30) oder eines Teils davon, – der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes (W) oder eines Teils davon oder des Messmediums (30) oder eines Teils davon, – die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes (W) oder eines Teils davon oder des Messmediums (30) oder eines Teils davon, – eine Konformationsänderung oder Bewegung des Wirkortkomplexes (12) oder eines Teils davon oder – eine beliebige Kombination dieser Prozesse.
  21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) durchgeführt werden durch: – Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes (W), eines Teils oder einer Vorform davon, – Austauschen des Messmediums (30) oder eines Teils davon und/oder – chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums (30) oder eines Teils davon oder des Wirkstoffkomplexes (W), eines Teils oder einer Vorform davon.
  22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Sensoranordnung (1) aus Biosensorelektrode als Sekundärträger (20) und daran angelagerten Primärträgern (10) in einem Messraum (50), Messbereich (50) oder Messgefäß (50) vom Messmedium (30) umströmt oder angeströmt wird.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, bei welchem eine Strömungsgeschwindigkeit oder Fließgeschwindigkeit (v) des Messmediums (30) im Bereich von etwa 0,1 m/s bis etwa 2 m/s verwendet wird.
  24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem aufeinander folgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird durch aufeinander folgendes Austauschen des Messmediums (30), gegebenenfalls mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums (50).
  25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) ein oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden: (j) Einbringen des Sekundärträgers (20) mit den Primärträgern (10) in ein erstes, nicht-aktivierendes Messmedium (30-1) und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), (k) Einbringen des Sekundärträgers (20) mit den Primärträgern (10) in ein zweites, aktivierendes Messmedium (30-2) und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), (l) Einbringen des Sekundärträgers (20) mit den Primärträgern (10) in ein drittes oder Test-Messmedium (30-3) und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder Test-Messmedium (30-3) dem zweiten aktivierenden Messmedium (30-2) entsprechend gewählt wird und der Wirkstoffkomplex (W), ein Teil oder eine Vorstufe davon enthalten sind oder hinzugefügt und/oder freigesetzt werden.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, bei welchem zwischen den Schritten (j) und (k) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers (20) mit den Primärträgern (10) in ein viertes oder Waschmedium (30-4).
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 oder 26, bei welchem direkt vor dem Schritt (l) der Schritt (j) wiederholt durchgeführt wird.
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