DE102007005190A1 - Peptide useful for specifically killing cells comprises a sequence capable of coupling to a specific-binding molecule, an oligomerization sequence and a sequence for binding a cytotoxic component - Google Patents

Abstract

New peptide (I) comprises a sequence A capable of coupling to a molecule that specifically binds to biological structures, an oligomerization sequence B and a sequence C for binding a component that is cytotoxic on contact with a target. An independent claim is also included for a macromolecular structure comprising (I) covalently bound through an amino acid X (glutamine, asparagine or cysteine) to a component (II) that specifically binds to biological structures. ACTIVITY : Cytostatic; Antiparasitic. No biological data given. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

Die Erfindung betrifft makromolekulare Strukturen zum Transport von cytotoxisch wirksamen Ionen, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Strukturen sowie die Verwendung dieser Strukturen in verschiedenen ausgewählten Indikationen, gekennzeichnet dadurch, dass die makromolekulare Struktur ein Peptid umfasst, das mindestens einen zur spezifischen Interaktion mit dem Ziel, einen zur Oligomerisierung und einen zur Bindung einer beim Kontakt mit dem Ziel cytotoxischen Komponente befähigten Abschnitt umfasst.The The invention relates to macromolecular structures for the transport of Cytotoxically effective ions, process for their preparation, medicaments containing these structures as well as the use of these structures in different selected indications, characterized in that the macromolecular structure comprises a peptide which is at least one for the specific interaction with the goal, one for the oligomerization and one for binding a cytotoxic component upon contact with the target includes qualified section.

Ein Hauptziel der pharmazeutischen Forschung ist es gegenwärtig, die gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe zu verstärken und die systemischen Nebenwirkungen zu minimieren, was insbesondere bei Substanzen mit hoher intrinsischer und damit unvermeidlicher Toxizität (z. B. Cytostatika) von großer Bedeutung ist. Dies kann sowohl über die Verringerung der für die therapeutische Wirkung benötigten Gesamtdosis als auch über die Ansammlung der Wirkstoffe am gewünschten Wirkort erreicht werden, was beides durch die kontrollierte, räumlich spezifische Freisetzung von Wirkstoffmolekülen im weitesten Sinn (Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren oder niedermolekularen Substanzen) am gewünschten Zielort – d. h. in einem Zielgewebe oder in einzelnen Zielzellen – bewerkstelligt werden kann. Darunter ist insbesondere der spezifische Transfer von therapeutisch oder diagnostisch nutzbaren Substanzen in definierte, insbesondere strukturell definierte biologische Ziele («drug delivery» oder «drug targeting») zu verstehen, der ein wichtiges Ziel der gegenwärtigen pharmazeutischen Forschung ist.One The main objective of pharmaceutical research is currently to enhance the desired effects of known drugs and to minimize the systemic side effects, in particular for substances with high intrinsic and therefore inevitable Toxicity (eg cytostatics) of great importance is. This can be both about reducing the for the therapeutic effect needed total dose as well the accumulation of the active ingredients at the desired site of action can be achieved both through the controlled, spatially specific Release of drug molecules in the broadest sense (proteins, Peptides, nucleic acids or low-molecular substances) at the desired destination - d. H. in a target tissue or in individual target cells - can be accomplished. Among them is in particular the specific transfer of therapeutic or diagnostically usable substances in defined, in particular structurally defined biological targets ("drug delivery" or "drug targeting »), which is an important goal of the present day pharmaceutical research is.

Die heute verfügbare Antikörpertechnologie erlaubt die Erzeugung von hochaffinen Bindungspartnern für nahezu jede beliebig biologische Struktur; überdies sind zahlreiche natürliche Liganden für zelluläre Rezeptoren charakterisiert und kloniert worden, so dass es kein Problem mehr darstellt, Moleküle mit hoher und spezifischer Affinität zu den gewünschten Zielen zu erzeugen. In vielen Fällen sind auch niedermolekulare Liganden wie z. B. Glykoside bekannt, die auf chemischem Weg imitiert und somit zur Zielsteuerung verwendet werden können. Dem Fachmann stehen somit verschiedene einschlägig bekannte Methoden zur Verfügung, einen Bindungspartner mit hoher und selektiver Affinität zu einem definierten biologischen Ziel zu erzeugen. Ein solches Molekül wird im Folgenden als «Suchermolekül» bezeichnet.The Antibody technology available today the generation of high-affinity binding partners for nearly any biological structure; moreover, there are many natural ligands for cellular receptors characterized and cloned, so that it no longer a problem represents molecules with high and specific affinity to generate the desired goals. In many cases, too low molecular weight ligands such. B. glycosides known on chemical Way imitated and thus can be used for targeting. The person skilled in the art is therefore familiar with various relevant ones Methods available, a binding partner with high and selective affinity for a defined biological To create a goal. Such a molecule is below referred to as the "Seeker molecule".

Jedoch üben diese Suchermoleküle, ob mikro- oder makromolekular, selber im allgemeinen keine pharmazeutisch nutzbare Funktion aus, während die Wirkstoffmoleküle selbst nicht zielspezifisch sind. Ein Hauptaugenmerk muss daher darauf liegen, diese Trennung zu überbrücken und das therapeutische Potential der verfügbaren Wirkstoffmoleküle mit der Zielspezifität der Suchermoleküle zu verbinden.However, practice these Seeker molecules, whether micro- or macromolecular, themselves generally no pharmaceutically useful function while the Drug molecules themselves are not target specific. One The main focus must therefore be on bridging this separation and the therapeutic potential of the available drug molecules to connect with the target specificity of the searcher molecules.

Der effizienteste bislang bekannte und am vielseitigsten verwendbare Ansatz zum Erreichen dieses Ziels besteht in der Verwendung von Trägerstrukturen im kolloidalen (d. h. Sub-μm-) Größenbereich, an deren Oberflächen entsprechende Zielsuchermoleküle gebunden werden können. Geeignete Trägerstrukturen sind kolloidale Partikel, welche mit Antikörpern gegen oder mit natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels verknüpft und zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen die Erfassung und Elimination durch das Immunsystem geschützt werden.Of the most efficient hitherto known and most versatile Approach to achieving this goal is the use of Support structures in the colloidal (i.e., sub-μm) Size range, corresponding to the surfaces Targeting molecules can be bound. Suitable support structures are colloidal particles containing antibodies against or with natural ligands for characteristic Molecular structures of the goal linked and at the same time inert coating of their surface against the detection and elimination by the immune system.

Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche auf Liposomen basierende Ansätze bekannt, die sich jedoch durch folgende Nachteile kennzeichnen:

• – Die Stabilität der Partikel ist zeitlich begrenzt.
• – Die Liposomenmembran ist selbst innerhalb der Stabilitätszeit nicht vollständig dicht, so dass mit Substanzverlust gerechnet werden muss.
• – Die Möglichkeiten der Oberflächengestaltung sind eingeschränkt.
• – Die wässrige Innenphase ist auf hydrophile Substanzen limitiert.
• – Die Beladungseffizienz ist gering: typischerweise < 0,5%.
• – Ungefähr 50% der zur Verknüpfung mit den Zielsuchermolekülen erforderlichen reaktiven Gruppen sind auf der Innenseite der Vesikelmembran gelegen (nicht mehr praktisch verfügbar, kann jedoch unvorhersehbare Reaktionen bewirken).
• – Die Kopplung von Proteinen an Membranen kann zur Bildung von hochimmunogenen Strukturen führen und damit eine Immunreaktion gegen die Liposomen auslösen, die jede weitere Anwendung von Liposomen verhindert.

Numerous liposome-based approaches are known in the prior art, but they are characterized by the following disadvantages:

• - The stability of the particles is limited in time.
• - The liposome membrane is not completely dense even within the stability time, so that must be expected with loss of substance.
• - The possibilities of surface design are limited.
• - The aqueous inner phase is limited to hydrophilic substances.
• - The loading efficiency is low: typically <0.5%.
• Approximately 50% of the reactive groups needed to link to the targeting molecules are located on the inside of the vesicle membrane (no longer practically available, but can cause unpredictable reactions).
• - The coupling of proteins to membranes can lead to the formation of highly immunogenic structures and thus trigger an immune reaction against the liposomes, which prevents any further use of liposomes.

WO96/20698 beschreibt als Alternative zu Liposomen polymolekulare solide Nanopartikel aus natürlichen oder synthetischen Polykondensaten mit einem überwiegend allgemein beschriebenen eigenschaftsmodifizierenden Oberflächenüberzug aus natürlichen oder synthetischen Makromolekülen. Stabilität und Anwendbarkeit dieser Partikel sind jedoch sehr begrenzt. Des Weiteren eignen sie sich aufgrund ihrer hydrophoben Natur nicht für stark hydrophile Substanzen wie Ionen. WO96 / 20698 describes as an alternative to liposomes polymolecular solid nanoparticles of natural or synthetic polycondensates having a predominantly generally described property-modifying surface coating of natural or synthetic macromolecules. However, stability and applicability of these particles are very limited. Furthermore, due to their hydrophobic nature, they are not suitable for strongly hydrophilic substances such as ions.

Ein weiteres grundsätzliches Problem im «drug targeting» besteht weiterhin darin, dass zwar zahlreiche spezifisch auf der Oberfläche bestimmter Zielzellen exprimierte Moleküle bekannt sind, jedoch eine Bindung der zielsuchenden Struktur an diese spezifischen Oberflächenmoleküle nicht unbedingt eine Internalisierung der zielsuchenden Struktur auslöst. Wenn – was in der Mehrzahl der Fälle gilt – an die Oberflächenmoleküle gebundene zielsuchende Strukturen nicht von der die Oberflächenmoleküle tragenden Zelle aufgenommen werden, ist die Wirkstofffreisetzung auf den allmählichen Zerfall der Trägerstrukturen angewiesen, durch welche der Wirkstoff freigesetzt wird. Dies geht natürlich wiederum zu Lasten der Spezifität. Das konventionelle «drug targeting» ist somit auf die relativ kleine Gruppe von Oberflächenmolekülen angewiesen, die sowohl spezifisch für bestimmte Zielzellen sind als auch als Rezeptoren für die Aufnahme von Stoffen in die Zelle wirksam sind. Gerade in höheren Organismen, in denen alle Zellen aus einem gemeinsamen Pool von Ressourcen schöpfen, ist die Gewebespezifität von Rezeptoren für die Aufnahme von Stoffen jedoch eher gering. Dennoch ist Spezifität gerade im Zusammenhang mit cytotoxisch wirkenden Substanzen, wie sie zur Behandlung von Tumoren und zum Teil auch von Infektionen mit eukaryontischen Parasiten wie z. B. Trypanosomen, Plasmodien oder Amöben erforderlich sind, notwendig.Another fundamental problem in "drug targeting" is that while numerous molecules specifically expressed on the surface of certain target cells are known, binding of the targeting structure to these specific surface molecules does not necessarily induce internalization of the targeting structure. If - which applies in the majority of cases - to The surface-molecules bound homing structures are not taken up by the cell carrying the surface molecules, drug release is dependent on the gradual decay of the carrier structures through which the drug is released. Of course, this is at the expense of specificity. Conventional "drug targeting" thus relies on the relatively small group of surface molecules that are both specific to particular target cells and act as receptors for the uptake of substances into the cell. However, especially in higher organisms, where all cells derive from a common pool of resources, the tissue specificity of receptors for uptake of substances is rather low. Nevertheless, specificity is precisely in connection with cytotoxic substances, such as those for the treatment of tumors and in part also infections with eukaryotic parasites such. As trypanosomes, plasmodia or amoebae are necessary.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine molekulare Struktur bereitzustellen, die imstande ist, selektiv und effizient an eine bestimmte Zelloberflächenstruktur zu binden und eine cytotoxische Wirkung auf die Zielzelle auszuüben.task Therefore, it was a molecular structure of the present invention capable of selectively and efficiently delivering to a to bind certain cell surface structure and a cytotoxic Effect on the target cell.

Überraschenderweise wurde diese Aufgabe durch ein Peptid gelöst, das drei Abschnitte aufweist, wovon einer zur Kopplung mit beliebigen Suchermolekülen geeignet ist, einer eine Oligomerisierung des Peptids bewirkt und der dritte ein radioaktives Ion mit hoher Affinität binden kann. Im Folgenden wird dieses Peptid als «Trilobit» bezeichnet.Surprisingly this task was solved by a peptide containing three sections one of which is for coupling to any of the searcher molecules is suitable, one causes an oligomerization of the peptide and the third binds a radioactive ion with high affinity can. In the following, this peptide is called "trilobite".

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Peptid, umfassend mindestens

• (A) eine zur Verknüpfung mit einem spezifisch an biologische Strukturen bindenden Molekül geeignete Aminosäurensequenz,
• (B) eine zur Oligomerisierung befähigte Aminosäurensequenz,
• (C) eine zur Bindung einer beim Kontakt mit dem Ziel cytotoxischen Komponente befähigte Aminosäurensequenz.

The present invention thus relates to a peptide comprising at least

• (A) an amino acid sequence suitable for linking to a molecule specifically binding to biological structures,
• (B) an amino acid sequence capable of oligomerization,
• (C) an amino acid sequence capable of binding a cytotoxic component in contact with the target.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst (C) ein Hexahistidinylpeptid. Es ist hierbei besonders bevorzugt, wenn das radioaktive Ion ein ⁶⁴Cu- oder ⁵⁶Ni-Ion ist. Diese Isotope und Bezugsquellen (z. B. Amersham (Little Chalfont, Buckinghamshire, Großbritannien)) für sie sind dem Fachmann vertraut.In a preferred embodiment, (C) comprises a hexahistidinyl peptide. It is particularly preferred here if the radioactive ion is a ⁶⁴ Cu or ⁵⁶ Ni ion. These isotopes and sources of supply (eg, Amersham (Little Chalfont, Buckinghamshire, Great Britain)) for them are familiar to those skilled in the art.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst (B) eine Isoleucinzippersequenz, z. B. die Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 1 (Weissenhorn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95[11], 6032-6036 (1998)). Von dieser Sequenz wurde gezeigt, dass sie eine Trimerisierung von sie umfassenden Peptiden bewirken kann.In a further preferred embodiment comprises (B) an isoleucine zipper sequence, e.g. B. the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 (Weissenhorn et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA Vol. 95 [11], 6032-6036 (1998)). From this sequence it was shown that it can cause trimerization of peptides comprising it.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst (A) mindestens eine Aminosäure X ausgewählt unter Glutamin, Asparagin und Cystein. Es ist hierbei besonders bevorzugt, wenn A mehrere Aminosäuren X enthält, insbesondere 3 oder mehr, z. B. 3 bis 10, z. B. 3.In Another preferred embodiment comprises (A) at least one amino acid X selected under Glutamine, asparagine and cysteine. It is particularly preferred here if A contains several amino acids X, in particular 3 or more, z. B. 3 to 10, z. B. 3.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Aminosäuren X durch flexible Zwischenstücke voneinander getrennt, insbesondere durch Zwischenstücke der Form GPGS, GGS oder GGGS.In Another preferred embodiment is the amino acids X separated by flexible spacers from each other, in particular by Intermediate pieces of the form GPGS, GGS or GGGS.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Peptid, das die Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 2 umfasst.In a preferred embodiment, the invention relates a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

Die Bereitstellung eines Peptids mit definierter Sequenz kann hierbei grundsätzlich durch jedes dem Fachmann geläufige Verfahren erfolgen, vorzugsweise durch die Festphasensynthese nach dem Verfahren von Merrifield ( Merrifield R.B.: «The automatic synthesis of proteins», Sci. Am. 218(3):56-62 passim (1968) ), wie z. B. beschrieben in: Atherton E., Sheppard R.C.: «Solid Phase peptide synthesis: a practical approach», IRL Press, Oxford, England (1989) ; sowie in: Stewart J.M., Young J.D.: «Solid Phase peptide synthesis, 2nd edition», Pierce Chemical Company, Rockford (1984) .The provision of a peptide having a defined sequence can in principle be carried out by any method known to the person skilled in the art, preferably by the solid-phase synthesis according to the method of Merrifield (US Pat. Merrifield RB: "The automatic synthesis of proteins", Sci. At the. 218 (3): 56-62 passim (1968) ), such. As described in: Atherton E., Sheppard RC: "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", IRL Press, Oxford, England (1989) ; as in: Stewart JM, Young JD: "Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition", Pierce Chemical Company, Rockford (1984) ,

Alternativ kann die Bereitstellung durch Expression anhand des genetischen Codes von einer natürlichen oder synthetischen Nukleinsäure (RNA oder DNA) mit definierter Sequenz erfolgen, was entweder in vivo, durch Einbringen der Nukleinsäure in einer zur Expression derselben befähigte prokaryontische oder eukaryontisch Zelle («Transformation» bzw. «Transfektion»), oder in vitro, durch Inkontaktbringen der Nukleinsäure mit einem entsprechenden System aus Enzymen, Substraten und Cofaktoren, geschehen kann. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann geläufig und z. B. in «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» von Joseph Sambrook und David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Labmn edition (2001) ; «Short Protocols in Molecular Biology» von Frederick M. Ausubel, Current Protocols, 5th edition (2002) dargestellt.Alternatively, the expression can be carried out by expression based on the genetic code of a natural or synthetic nucleic acid (RNA or DNA) with a defined sequence, either in vivo, by introducing the nucleic acid into a procaryotic or eukaryotic cell ("transformation" or "eukaryotic cell") capable of expression "Transfection"), or in vitro, by contacting the nucleic acid with a corresponding system of enzymes, substrates and cofactors, can happen. Corresponding methods are familiar to the expert and z. In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" by Joseph Sambrook and David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Labmn edition (2001) ; Short Protocols in Molecular Biology by Frederick M. Ausubel, Current Protocols, 5th edition (2002) shown.

Die Synthese sowohl von Peptiden als auch von Nukleinsäuren wird ebenfalls von zahlreichen Firmen als Dienstleistung angeboten (z. B. MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland).The Synthesis of both peptides and nucleic acids is also offered by numerous companies as a service (eg MWG Biotech, Ebersberg, Germany).

Der Fachmann erkennt, dass die beschriebenen Methoden zahlreichen Abwandlungen und Kombinationen zugänglich sind. Diese alle sind zur erfindungsgemäßen Bereitstellung des Peptids grundsätzlich geeignet.The person skilled in the art recognizes that the methods described are accessible to numerous modifications and combinations. These are all for the provision of the peptide according to the invention basically suitable.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein wie oben beschriebenes Peptid, das über die Aminosäure X kovalent mit einer spezifisch an biologische Strukturen bindenden Komponente verbunden ist, wobei es bevorzugt ist, wenn die Verbindung zwischen der Aminosäure X und der spezifisch an biologische Strukturen bindenden Komponente über einen polymeren Platzhalter erfolgt, vorzugsweise über Polyethylenglykol, z. B. Polyethylenglykol mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht zwischen 3000 und 8000 Dalton. Zweckmäßigerweise kann zur Herstellung der Verbindung zwischen Peptid und spezifisch bindender Komponente ein terminal bifunktionalisiertes Polyethylenglykol als Zwischenstück verwendet werden, vorzugsweise ein Polyethylenglykol, das am einen Ende mit einer aminoreaktiven Gruppe wie z. B. NHS-Ester und am anderen Ende mit einer thiolreaktiven Gruppe wie z. B. Vinylsulfon versehen ist. Solche Gruppen, damit derivatisierte Polyethylenglykole und ihre Verwendung sind dem Fachmann geläufig; siehe z. B. WO 02/00162 und Flaig et al. 2005 ( J Drug Del. Sci. Tech. 15(1):59–63 ).The present invention further relates to a peptide as described above, which is covalently linked via the amino acid X with a specific binding to biological structures component, wherein it is preferred if the connection between the amino acid X and the specific binding to biological structures component a polymeric spacer is used, preferably via polyethylene glycol, for. As polyethylene glycol having a number average molecular weight between 3000 and 8000 daltons. Conveniently, a terminal bifunctionalized polyethylene glycol can be used as an intermediate piece, preferably a polyethylene glycol, which at one end with an amino-reactive group such as. B. NHS ester and at the other end with a thiol-reactive group such. B. vinyl sulfone is provided. Such groups, polyethyleneglycols derivatized therewith and their use are familiar to the person skilled in the art; see, for. B. WO 02/00162 and Flaig et al. 2005 ( J Drug Del. Sci. Tech. 15 (1): 59-63 ).

In einer besonderen Ausführungsform ist die spezifisch an biologische Strukturen bindende Komponente ausgewählt unter Antikörpern und ihren Fragmenten und Derivaten, Lektinen, CD-Molekülen und ihren Liganden und mit Peptiden beladenen MHC-Molekülen. Die Auswahl geeigneter Strukturen und der sie bindenden Komponente liegt im Bereich des durchschnittlichen fachmännischen Könnens.In a particular embodiment is specific to biological structures binding component selected from Antibodies and their fragments and derivatives, lectins, CD molecules and their ligands and peptide-loaded MHC molecules. The selection of suitable structures and their binding component is in the range of the average expert Can s.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen molekularen Struktur zur spezifischen Abtötung lebender Zellen in vitro sowie zur Herstellung eines Medikaments zur spezifischen Abtötung lebender Zellen in vivo, wobei es bevorzugt ist, wenn die lebenden Zellen Tumorzellen oder Zellen eukaryontischer Parasiten sind, z. B. eukaryontische Parasiten der Gattung Trypanosoma.object The present invention furthermore relates to the use of a molecular according to the invention Structure for the specific killing of living cells in vitro and for the manufacture of a drug for specific killing living cells in vivo, it being preferred that the living Cells are tumor cells or cells of eukaryotic parasites, e.g. B. eukaryotic parasites of the genus Trypanosoma.

Die Erfindung wird jetzt anhand der folgenden, nicht abschließend oder beschränkend zu verstehenden Beispiele näher erläutert. Der Fachmann erkennt, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung zahlreiche Modifikationen und Abwandlungen des beschriebenen Verfahrens möglich sind. Sie alle sind als zu der Erfindung gehörig zu betrachten.The Invention will now be apparent from the following, not exhaustive or limiting to examples to understand explained. The skilled artisan recognizes that in the context of the present Invention numerous modifications and variations of the described Procedure are possible. They are all considered to be the invention proper to look at.

BeispieleExamples

Beispiel 1: Charakterisierung des Trilobit-PeptidsExample 1: Characterization of the trilobite peptide

Die Eigenschaften des Trilobit-Peptids (SEQ ID NO:2) wurden mit den Programmen antigenic, pepnet und pepstats aus dem Programmpaket EMBOSS implementiert, das von http://www.emboss.org/ bzw. http://emboss.sourceforge.org/ kostenlos heruntergeladen werden kann, untersucht.The properties of the trilobite peptide (SEQ ID NO: 2) were implemented with the antigenic, pepnet and pepstats programs from the EMBOSS program package developed by http://www.emboss.org/ respectively. http://emboss.sourceforge.org/ can be downloaded for free, examined.

PEPSTATS of from 1 to 70PEPSTATS of from 1 to 70

• Molecular weight = 7033.57 Residues = 70Molecular weight = 7033.57 Residues = 70
• Average Residue Weight = 100.480 Charge = –1.5Average Residue Weight = 100,480 Batch = -1.5
• Isoelectric Point = 6.1312Isoelectric Point = 6.1312
• A280 Molar Extinction Coefficient = 1280A280 Molar Extinction Coefficient = 1280
• A280 Extinction Coefficient 1 mg/ml = 0.18A280 Extinction Coefficient 1 mg / ml = 0.18
• Improbability of expression in inclusion bodies = 0.903Improbability of expression in inclusion bodies = 0.903

Residueresidue NumberNumber Mole% Mole% DayhoffStat DayhoffStat A = AlaA = Ala 2 2 2.8572857 0.3320332 B = AsxB = Asx 0 0 0.0000000 0.0000000 C = CysC = Cys 0 0 0.0000000 0.0000000 D = AspD = Asp 1 1 1.4291429 0.2600260 E = GluE = Glu 10 10 14.28614286 2.3812381 F = PheF = Phe 0 0 0.0000000 0.0000000 G = GlyG = Gly 20 20 28.57128571 3.4013401 H = HisH = His 7 7 10.00010,000 5.0005000 I = IleI = Ile 8 8th 11.42911429 2.5402540 J = -J = - 00 0.0000000 0.0000000 K = LysK = Lys 5 5 7.1437143 1.0821082 L = LeuL = Leu 2 2 2.8572857 0.3860386 M = MetM = mead 1 1 1.4291429 0.8400840 N = AsnN = Asn 1 1 1.4291429 0.3320332 O = -O = - 00 0.0000000 0.0000000 P = ProP = Per 3 3 4.2864286 0.8240824 Q = GlnQ = Gln 1 1 1.4291429 0.3660366 R = ArgR = bad 1 1 1.4291429 0.2920292 S = SerS = Ser 7 7 10.00010,000 1.4291429 T = ThrT = Thr 0 0 0.0000000 0.0000000 U = -U = - 00 0.0000000 0.0000000 V = ValV = Val 0 0 0.0000000 0.0000000 W = TrpW = Trp 0 0 0.0000000 0.0000000 X = XaaX = Xaa 0 0 0.0000000 0.0000000 Y = TyrY = Tyr 1 1 1.4291429 0.4200420 Z = GlxZ = Glx 0 0 0.0000000 0.0000000 PropertyProperty Residuesresidues NumberNumber Mole%Mole% TinyTiny (A+C+G+S+T)(A + C + G + T + S) 2929 41.42941429 Smallsmall (A+B+C+D+G+N+P+S+T+V)(A + B + C + D + G + N + P + S + T + V) 3434 48.57148571 AliphaticAliphatic (I+L+V)(I + L + V) 1010 14.28614286 AromaticAromatic (F+H+W+Y)(F + H + W + Y) 88th 11.42911429 Non-polarNon-polar (A+C+F+G+I+L+M+P+V+W+Y)(A + C + F + G + I + L + M + P + V + W + Y) 3737 52.85752857 PolarPolar (D+E+H+K+N+Q+R+S+T+Z)(D + E + H + K + N + Q + R + S + T + Z) 3333 47.14347143 Chargedcharged (B+D+E+H+K+R+Z)(B + D + E + H + K + R + Z) 24 24 34.28634286 Basic basic (H+K+R)(H + K + R) 1313 18.57118571 Acidicacidic (B+D+E+Z)(B + D + E + Z) 1111 15.71415714

Der Hydropathieverlauf ist in 3 dargestellt, die Raumstruktur unter Annahme einer -Helix in 4.The hydropathy course is in 3 represented the spatial structure assuming a helix in 4 ,

Beispiel 2: Konjugation von Trilobit mit Antikörper-FragmentenExample 2: Conjugation of trilobite with Antibody fragments

Das Trilobit-Peptid, durch Merrifield-Synthese hergestellt, wird zunächst durch HPLC aufgereinigt und durch Polyacrylamidgelelektrophorese (5–20% Polyacrylamid) nach Laemmli, gefolgt von Färbung mit Coomassie Brillant Blau, auf Reinheit und Einheitlichkeit überprüft und durch Vergleich mit Standards bekannter Menge quantifiziert.The Trilobite peptide, produced by Merrifield synthesis, is added first purified by HPLC and purified by polyacrylamide gel electrophoresis (5-20%). Polyacrylamide) according to Laemmli, followed by staining with Coomassie Brilliant blue, checked for purity and uniformity and quantified by comparison to standards of known quantity.

Es werden 100 mg Trilobit in 10 ml an 25 mM Tris-HCl pH 6.0 aufgenommen, wodurch der für die Konjugation der Aminogruppen idealen Wert eingestellt wird. Anschließend wird die Peptidlösung mit einem dreifachen molaren Überschuss an NHS-Ester-/Vinylsulfon-Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 8000 Da versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.It 100 mg of trilobite are taken up in 10 ml of 25 mM Tris-HCl pH 6.0, whereby the ideal for the conjugation of the amino groups Value is set. Subsequently, the peptide solution with a three-fold molar excess of NHS ester / vinylsulfone polyethylene glycol with an average molecular weight of 8000 Da and overnight incubated at room temperature.

Anschließend wird der Reaktionsansatz zur Entfernung nicht umgesetzten Polyethylenglykols und zur Einstellung des für die Konjugation der Zielsucher idealen pH-Werts durch eine Membran mit einer Ausschlussgröße von ca. 13 kDa gegen 10 mM Tris-HCl pH 8.0 dialysiert. Im Anschluss daran werden die Zielsuchermoleküle (Antikörper-Fab-Fragmente) in mindestens 100fachem molaren Überschuss, bezogen auf die Trilobitmoleküle, zugesetzt und wiederum über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.Subsequently is the reaction mixture to remove unreacted polyethylene glycol and for setting the conjugate of the target viewfinder ideal pH through a membrane with an exclusion size of about 13 kDa dialysed against 10 mM Tris-HCl pH 8.0. In connection the targeting molecules (antibody Fab fragments) become in at least 100-fold molar excess, based on the trilobite molecules, added and again over Incubated at room temperature overnight.

Zur Inaktivierung der letzten noch nicht umgesetzten Gruppen werden schließlich dem Ansatz 5 mg Cystein zugesetzt, er wird 1 h unter vorsichtigem Rühren inkubiert und dann durch zur Reinigung der fertigen Konjugate durch eine Membran mit einer Ausschlußgröße von ca. 100 kDa gegen 10 mM Tris-HCl pH 7.0 dialysiert.to Inactivation of the last unreacted groups Finally, the approach added 5 mg of cysteine, he will Incubated for 1 h with gentle stirring and then through for purifying the finished conjugates through a membrane with an exclusion size of about 100 kDa dialysed against 10 mM Tris-HCl pH 7.0.

Zur Quantitäts- und Qualitätskontrolle werden 20 μl der Lösung entnommen und durch HPLC unter nativen Bedingungen untersucht. Das konjugierte Peptid erscheint in Form eines Hauptpeaks von ca. 480 kDa, begleitet von zwei kleineren Peaks von ca. 320 und ca. 160 kDa.to Quantity and quality control will be 20 μl taken from the solution and by HPLC under native conditions examined. The conjugated peptide appears as a major peak of about 480 kDa, accompanied by two smaller peaks of about 320 and about 160 kDa.

Beispiel 3: Beladung von konjugiertem Trilobit mit Kupfer-64Example 3: Loading of conjugated Trilobite with copper-64

500 mg des in Beispiel 1 erhaltenen Konjugats (entsprechend ca. 30 mg Trilobit) werden mit 200 μg ⁶⁴Cu, bezogen auf das Kupferion, versetzt und 3 Stunden lang auf Eis inkubiert. Anschließend wird das beladende Konjugat durch eine Membran mit einer Ausschlußgröße von ca. 10 kDa gegen einen großen Überschuss von 10 mM Tris-HCl pH 7.0 dialysiert, und Proteingehalt und Radioaktivität des Produkts werden gemessen.500 mg of the conjugate obtained in Example 1 (corresponding to about 30 mg of trilobite) are mixed with 200 μg of ⁶⁴ Cu, based on the copper ion, and incubated on ice for 3 hours. Subsequently, the loading conjugate is dialyzed through a membrane of approximately 10 kDa size against a large excess of 10 mM Tris-HCl pH 7.0, and the protein content and radioactivity of the product are measured.

Beschreibung der ZeichnungenDescription of the drawings

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• zeigt den schematischen Aufbau eines erfindungsgemäßen Peptids. A = zur Verknüpfung mit einem spezifisch an biologische Strukturen bindenden Molekül geeignete Aminosäurensequenz; a = Aminosäuren mit aminogruppenhaltigen Resten; B = Isoleucinzipper-Trimerisierungsdomäne; C = Hexahistidinylrest.shows the schematic structure of an inventive Peptide. A = for linking to a specific to biological Structures binding molecule suitable amino acid sequence; a = amino acids with residues containing amino groups; B = isoleucinzipper trimerization domain; C = hexahistidinyl radical.

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• zeigt schematisch den räumlichen Aufbau einer der erfindungsgemäßen Strukturen. A, B, C wie in 2; D = Polyethylenglykol 8000; E = spezifische Liganden für die Zielzellen; F = ⁶⁴Cu oder ⁵⁶Ni.shows schematically the spatial structure of one of the structures according to the invention. A, B, C as in 2 ; D = polyethylene glycol 8000; E = specific ligands for the target cells; F = ⁶⁴ Cu or ⁵⁶ Ni.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows Sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can of the official publication platform of the DPMA.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

• - WO 96/20698 [0007] WO 96/20698 [0007]
• - WO 02/00162 [0021] WO 02/00162 [0021]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

• - Merrifield R.B.: «The automatic synthesis of proteins», Sci. Am. 218(3):56-62 passim (1968) [0017] - Merrifield RB: "The automatic synthesis of proteins", Sci. At the. 218 (3): 56-62 passim (1968) [0017]
• - Atherton E., Sheppard R.C.: «Solid Phase peptide synthesis: a practical approach», IRL Press, Oxford, England (1989) [0017] Atherton E., Sheppard RC: "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", IRL Press, Oxford, England (1989) [0017]
• - Stewart J.M., Young J.D.: «Solid Phase peptide synthesis, 2nd edition», Pierce Chemical Company, Rockford (1984) [0017] Stewart JM, Young JD: "Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition", Pierce Chemical Company, Rockford (1984) [0017]
• - «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» von Joseph Sambrook und David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Labmn edition (2001) [0018] - "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" by Joseph Sambrook and David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Labmn edition (2001). [0018]
• - «Short Protocols in Molecular Biology» von Frederick M. Ausubel, Current Protocols, 5th edition (2002) [0018] - "Short Protocols in Molecular Biology" by Frederick M. Ausubel, Current Protocols, 5th edition (2002) [0018]
• - J Drug Del. Sci. Tech. 15(1):59–63 [0021] - J Drug Del. Sci. Tech. 15 (1): 59-63 [0021]
• - http://www.emboss.org/ [0025] - http://www.emboss.org/ [0025]
• - http://emboss.sourceforge.org/ [0025] - http://emboss.sourceforge.org/ [0025]

Claims (17)

Peptid, umfassend mindestens (A) eine zur Verknüpfung mit einem spezifisch an biologische Strukturen bindenden Molekül geeignete Aminosäurensequenz, (B) eine zur Oligomerisierung befähigte Aminosäurensequenz, (C) eine zur Bindung einer beim Kontakt mit dem Ziel cytotoxischen Komponente befähigte Aminosäurensequenz.Peptide comprising at least (A) one for Linkage with a specific to biological structures binding molecule suitable amino acid sequence, (B) an amino acid sequence capable of oligomerization, (C) one for binding a cytotoxic component upon contact with the target competent amino acid sequence. Peptid nach Anspruch 1, wobei (C) ein Hexahistidinylpeptid umfasst.The peptide of claim 1, wherein (C) is a hexahistidinyl peptide includes. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei (B) eine Isoleucinzippersequenz umfasst.The peptide of claim 1 or 2, wherein (B) is an isoleucine zipper sequence includes. Peptid nach Anspruch 3, wobei die Isoleucinzippersequenz die Aminosäurensequenz SEQ ID NO:1 umfasst.The peptide of claim 3, wherein the isoleucine zipper sequence the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 comprises. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei (A) eine Aminosäure X ausgewählt unter Glutamin, Asparagin und Cystein umfasst.A peptide according to any one of claims 1 to 4, where (A) an amino acid X selected from glutamine, Includes asparagine and cysteine. Peptid nach Anspruch 5, wobei A mehrere Aminosäuren X enthält.A peptide according to claim 5, wherein A is a plurality of amino acids X contains. Peptid nach Anspruch 6, wobei die Aminosäuren X durch flexible Zwischenstücke voneinander getrennt sind.A peptide according to claim 6, wherein the amino acids X are separated by flexible spacers. Peptid nach Anspruch 7, wobei die Zwischenstücke die Form GPGS, GGS oder GGGS haben.A peptide according to claim 7, wherein the intermediates have the form GPGS, GGS or GGGS. Peptid nach einem der vorherigen Ansprüche, das die Sequenz SEQ ID NO:2 umfasst.A peptide according to any one of the preceding claims, which comprises the sequence SEQ ID NO: 2. Makromolekulare Struktur, enthaltend mindestens ein Peptid nach Anspruch 5 oder 6, über die Aminosäure X kovalent verbunden mit einer spezifisch an biologische Strukturen bindenden Komponente.Macromolecular structure containing at least a peptide according to claim 5 or 6, via the amino acid X covalently linked to a specific to biological structures binding component. Makromolekulare Struktur nach Anspruch 10, wobei die Verbindung zwischen der Aminosäure X und der spezifisch an biologische Strukturen bindenden Komponente über einen polymeren Platzhalter erfolgt.A macromolecular structure according to claim 10, wherein the connection between the amino acid X and the specific component binding to biological structures via a polymeric placeholder takes place. Makromolekulare Struktur nach Anspruch 11, wobei der polymere Platzhalter Polyethylenglykol ist.A macromolecular structure according to claim 11, wherein the polymeric placeholder is polyethylene glycol. Makromolekulare Struktur nach Anspruch 12, wobei der polymere Platzhalter Polyethylenglykol mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht zwischen 3000 und 8000 Dalton ist.A macromolecular structure according to claim 12, wherein the polymeric placeholder polyethylene glycol with a number average Molecular weight is between 3000 and 8000 daltons. Makromolekulare Struktur nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die spezifisch an biologische Strukturen bindende Komponente ausgewählt ist unter Antikörpern und ihren Fragmenten und Derivaten, Lektinen, CD-Molekülen und ihren Liganden und mit Peptiden beladenen MHC-Molekülen.Macromolecular structure according to one of the claims 10 to 14, the specific binding to biological structures Component is selected from antibodies and their fragments and derivatives, lectins, CD molecules and their ligands and peptide-loaded MHC molecules. Verwendung einer Struktur nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zur spezifischen Abtötung lebender Zellen in vitro.Use of a structure according to any one of the claims 10 to 14 for the specific killing of living cells in vitro. Verwendung einer Struktur nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zur Herstellung eines Medikaments zur spezifischen Abtötung lebender Zellen in vivo.Use of a structure according to any one of the claims 10 to 14 for the preparation of a medicament for specific killing live cells in vivo. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die lebenden Zellen Tumorzellen oder Zellen eukaryontischer Parasiten sind.Use according to claim 15 or 16, wherein the living Cells are tumor cells or cells of eukaryotic parasites.