DE102007004283A1

DE102007004283A1 - Magnetresonanz-Kontrastmittel mit eisenbindendem Protein

Info

Publication number: DE102007004283A1
Application number: DE102007004283A
Authority: DE
Inventors: Arne Dr. Hengerer
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens Healthcare GmbH
Priority date: 2007-01-23
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2008-07-31
Anticipated expiration: 2027-01-24
Also published as: US20090252688A1; DE102007004283B4; JP2008179637A; CN101318023A

Abstract

Das Erfindungsprinzip basiert darauf, eine eisenbindende Funktionalität in Form eines bakteriellen eisenbindenden Proteins mit einem Bindungselement zu verknüpfen, welches spezifisch eine biologische Struktur erkennt, um eine lokale detektierbare Konzentrationserhöhung des Kontrastmittels zu erhöhen. Die Erfindung stellt ein Magnetresonanz-Kontrastmittel bereit, welches mittels eines Bindungselements an eine biologische Struktur im Körper eines Säugetiers binden kann, wobei das Bindungselement ein isoliertes Polypeptid aufweist, wobei das Polypeptid eine erste Aminosäuresequenz eines bakteriellen eisenbindenden Proteins oder ein Derivat davon umfasst, wobei das bakterielle eisenbindende Protein oder das Derivat davon eine eisenbindende Aktivität aufweist. Bevorzugt kann das Bindungselement ein Protein binden. Insbesondere bevorzugt kann das Bindungselement einen Liganden für ein zelluläres Membranprotein, einen Liganden für ein zelluläres Glykoprotein, einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment eines Antikörpers aufweisen und/oder ein Tumorantigen binden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Magnetresonanz-Kontrastmittel, welches ein eisenbindendes Protein oder ein Derivat davon mit eisenbindender Aktivität aufweist. Die Erfindung betrifft ferner ein zugehöriges isoliertes Polypeptid, eine zugehörige isolierte Nukleinsäure und eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche das erfindungsgemäße Magnetresonanz-Kontrastmittel aufweist.
Bei bildgebenden Verfahren, welche Magnetresonanz-(MR) oder Kernspin-Verfahren verwenden, ist es bekannt, Kontrastmittel mit paramagnetischen Metallen, z. B. Eisen, zu verwenden. Um die Wirksamkeit von Kontrastmittel zu verbessern, ist es bekannt, spezifische Kontrastmittel zu verwenden, welche, z. B. durch Binden an eine biologische Struktur, spezifische Strukturen im Körper erkennbar machen. Dies geschieht durch eine lokale Veränderung des Magnetfelds, z. B. indem das Kontrastmittel einen paramagnetischen oder superparamagnetischen Signalgeber aufweist. Es ist bekannt, spezifische Kontrastmittel zu verwenden, welche einerseits an eine biologische Struktur binden können (z. B. durch Antigen-Antikörper-Bindung) und andererseits ein paramagnetisches Metall aufweisen. Aus Kuriu et al. ist z. B. ein Kontrastmittel bekannt, welches einen monoklonalen Antikörper aufweist, welcher an ein paramagnetisches Metall konjugiert ist (Kuriu Y, Otsuji E, Kin S, Nakase Y, Fukuda KI, Okamoto K, Hagiwara A, Yamagishi H; Monoclonal antibody conjugated to gadolinium as a contrast agent for magnetic resonance imaging of human rectal carcinoma. J Surg Oncol. 2006 Jul 17; 94(2): 144–148).
Als besonders geeignete MR-Kontrastmittel haben sich auch paramagnetische oder superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel erwiesen, welche sich funktionalisieren lassen (H, Lee E, Kim do K, Jang NK, Jeong YY, Jon S., Antibiofouling polymer-coated superparamagnetic iron Oxide nanoparticles as potential magnetic resonance contrast agents for in vivo cancer imaging. J Am Chem Soc. 2006 Jun 7; 128(22): 7383–9).
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Magnetresonanz-Kontrastmittel bereitzustellen, welches geeignet ist, biologische Strukturen spezifisch zu binden, und welches besonders effizient Eisen bindet.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Magnetresonanz-Kontrastmittel bereit, welches mittels eines Bindungselements an eine biologische Struktur im Körper eines Säugetiers binden kann, wobei das Bindungselement ein isoliertes Polypeptid aufweist, wobei das Polypeptid eine erste Aminosäuresequenz eines bakteriellen eisenbindenden Proteins oder ein Derivat davon umfasst, wobei das bakterielle eisenbindende Protein oder das Derivat davon eine eisenbindende Aktivität aufweist.
Es wird angemerkt, dass sich der Begriff „eisenbindend" nicht auf das Binden von elementaren Eisen beschränkt sondern das Binden des Elements Eisen in jeder Form umfasst, als Element, als Ion, als Oxid, in Form von Partikeln oder Nanopartikeln usw.
Ein Polypeptid weist eine Abfolge von Aminosäuren mit einer definierten Sequenz auf. Unter einem isolierten Polypeptid wird ein Polypeptid verstanden, das in einer Form vorliegt, welche im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden ist.
Ein Bindungselement, welches an eine biologische Struktur im Körper eines Säugetieres bindet, ist jegliches Element, welches mit ausreichender Spezifität und Affinität an eine biologische Struktur bindet, so dass eine detektierbare Anreicherung des Kontrastmittels am Ort, an welcher sich die biologische Struktur befindet, ermöglicht wird. Unter einer bio logischen Struktur wird jegliche körpereigene Struktur verstanden, die einer Bindung durch das Bindungselement zugänglich ist. Eine nicht abschließende Liste von Beispielen für das Bindungselement umfasst Antikörper, Liganden für Rezeptoren, Liganden für zelluläre Membranproteine, Liganden für Glykoproteine, wobei die Liganden sowohl natürlichen Ursprungs (z. B. der natürliche Ligand oder eine modifizierte Form des natürlichen Liganden eines Rezeptors) wie auch künstlichen Ursprungs sein können, Antikörper-Fragmente, single-chain-Antikörper, etc. Beispiele für die biologische Struktur umfassen (nicht abschließend) Proteine, insbesondere Membranproteine, Glykoproteine, Kohlehydrate, Nukleinsäuren, Lipoproteine, Tumorantigene, etc.
Unter einem bakteriellen eisenbindenden Protein wird ein Protein verstanden, welches mit hoher Spezifität (z. B. Bindungskonstante von > 10¹⁵ mol^–1, vorzugsweise > 10¹⁸ mol^–1) Eisen bindet und einen bakteriellen Ursprung hat. Unter einem Derivat eines bakteriellen eisenbindenden Proteins wird ein von dem natürlichen Protein abgeleitetes Polypeptid verstanden, welches eine Sequenzhomologie zu dem natürlichen Protein aufweist und welches selbst eine eisenbindende Aktivität mit einer hohen Bindungskonstante (z. B. Bindungskonstante von > 10¹⁵ mol^-1, vorzugsweise > 10¹⁸ mol^-1) aufweist.
Eisen ist ein wichtiges Spurenelement für lebende Organismen, was einerseits eine Folge des häufigen Vorkommens dieses Elements in der Umwelt ist und andererseits aus seinem chemischen Eigenschaften resultiert, da Eisen zwei stabile Oxidationszustände (+II/+III) besitzt, die ineinander umgewandelt werden können und für die Teilnahme an Redoxprozessen, wie z. B. innerhalb der Atemkette, gut geeignet sind. Eisen kann in Proteinen in unterschiedlichen Strukturen vorkommen, z. B. als Häm-Gruppe, als Eisen-Schwefel-Cluster, als Eisen-Nickel, als Di-Eisen oder als mononukleäres Eisen. Es ist als Co-Faktor von vielen Enzymen an wichtigen Stoffwechselprozessen beteiligt. Allerdings ist es aufgrund der geringen Löslichkeitsprodukte von Fe(II) und Fe(III) für Zellen schwer zu gänglich. Außerdem hydrolisiert Fe(III) in wässriger Umgebung und bildet polymere Hydroxide, die unter physiologischen Bedingungen ausfallen können. Da Eisen außerdem die Bildung von freien Radikalen katalysiert, hat es zudem stark toxische Wirkungen. Aus diesem Grund ist die Verfügbarkeit von Eisen im Körper streng reguliert, durch körpereigene eisenbindende Proteine, z. B. Transferrine, Ferritine, wird Eisen gebunden und kann in das Zellinnere transportiert werden.
Für Bakterien, welche den Körper eines Säugetieres besiedeln, stellt Eisen eine wertvolle Ressource dar. Aus diesem Grunde haben Bakterien eine Vielzahl von eisenbindenden Proteinen evolviert, welche ihrerseits dazu dienen, Eisen zu binden und für Bakterien verfügbar zu machen. Diese bakteriellen Eisenbindenden Proteine zeichnen sich durch extrem hohe Eisenkonstanten aus, z. B. > 10¹⁵ mol^-1 oder > 10¹⁸ mol^-1 (Briat J.-F. (1992). Iron assimilation and storage in prokaryotes. J. Gen. Microbiol. 138: 2475–2483, Guerinot, M. L. (1994) Micobial iron transport. Annu Rev Microbiol (48): 743–772). Dementsprechend sind bakterielle eisenbindende Proteine extrem effiziente Eisenchelatoren.
Das Erfindungsprinzip basiert darauf, eine eisenbindende Funktionalität in Form eines bakteriellen eisenbindenden Proteins mit einem Bindungselement zu verknüpfen, welches spezifisch eine biologische Struktur erkennt, um eine lokale detektierbare Konzentrationserhöhung des Kontrastmittels zu erhöhen. Bevorzugt kann das Bindungselement ein Protein binden. Insbesondere bevorzugt kann das Bindungselement einen Liganden für ein zelluläres Membranprotein, einen Liganden für ein zelluläres Glykoprotein, einen Antikörper oder ein Antigenbindendes Fragment eines Antikörpers aufweisen und/oder ein Tumorantigen binden.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung umfasst das Bindungselement eine zweite Aminosäuresequenz.
Das Bindungselement ist mit der eisenbindenden Funktionalität verknüpft, z. B. durch eine kovalente Bindung oder in Form eines stabilen Komplexes.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung bildet die vom Bindungselement umfasste zweite Aminosäuresequenz bevorzugt einen Teil des Polypeptids, welches ebenfalls die erste Aminosäuresequenz umfasst, die ein bakterielles eisenbindendes Protein oder ein Derivat davon aufweist. Das Polypeptid umfasst also gemäß dieses bevorzugten Aspekts sowohl das Bindungselement als auch die eisenbindende Funktionalität.
Bevorzugt weist das Polypeptid einen Spacer- oder eine Linker-Aminosäuresequenz auf, die zwischen der ersten und zweiten Aminosäuresequenz vorgesehen ist. Diese Spacer-Aminosäuresequenz kann z. B. 10 bis 20 Aminosäuren lang sein, wobei dem Fachmann übliche Aminosäuresequenzen, die zur Verwendung als Spacer-Aminosäuresequenz geeignet sind, bekannt sind, z. B. Polyglyzinsequenzen und ähnliche.
Bevorzugt handelt es sich bei dem bakteriellen eisenbindenden Protein um ein Siderophor. Siderophore sind hochaffine extrazelluläre Eisen(III)-Chelatoren.
Bevorzugt ist das bakterielle eisenbindende Protein ein Fe(III) binding Protein (Fbp) oder ein Major Ferric Einding Protein (MIRP) der Familien Hämophilus, Pasteurellales, Pasteurellaceae oder Neisseria. Stärker bevorzugt ist das bakterielle eisenbindende Protein ein Fe(III) binding Protein (Fbp) der Spezies H. influenzae, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. cinerea, N. lactamica, N. subflava, N. kochii oder N. polysaccharea.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist die erste Aminosäuresequenz gewählt aus der Gruppe, die besteht aus:

a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2;
b) eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 15, bevorzugt 30 aufeinander folgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 aufweist;
c) eine Aminosäuresequenz eines Derivats eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, wobei das Derivat von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, welches ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 kodiert;
d) eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 60% homolog zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 ist; und
e) eine Aminosäuresequenz eines Derivats von einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, wobei das Derivat von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches mindestens 60% homolog zu einem Nukleinsäuremolekül ist, welches das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 kodiert.

Im Kontext dieser Erfindung werden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen Bedingungen verstanden, welche Hybridisierung von allelischen Varianten ermöglichen, aber keine Hybridisierung mit anderen nicht-verwandten Genen ermöglichen. Dabei werden die dem Fachmann bekannten üblichen Bedingungen verwendet, wie in Sambrook et al. beschrieben (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbour Labotory Press, 2. Aufl., 1989). Stringente Hybridisierungsbedingungen sind z. B. 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem Waschschritt mit 2 × SSC bei 50°C.
Der Ausdruck „homolog" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung eine definierte Homologie von mindestens 60%, vorzugsweise 75%, stärker bevorzugt 90%, auf DNA- oder Aminosäureebene, welche gemäß bekannter Verfahren bestimmt werden kann, z. B. durch computergestützte Sequenzvergleiche. Dabei werden zwei hinsichtlich ihrer Homologie zu untersuchende Sequenzen rechnergestützt so miteinander verglichen (z. B. S. F. Altschul et al. (1999), basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215 oder durch das „Global Alignment Program (GAP) der Genetics Computer Group (GCG)), dass sich eine größtmögliche Übereinstimmung ergibt (das sog. „Alignment") und dann wird die Anzahl der übereinstimmenden Nukleotide bzw. Aminosäuren ausgedrückt als prozentueller Anteil der Gesamtzahl der Nukleotide bzw. Aminosäuren in der Sequenz.
Bevorzugt weist die zweite Aminosäuresequenz, welche vom Bindungselement umfasst ist, die Aminosäuresequenz ARG-GLY-ASP (RGD) auf.
Proteine, welche die ARG-GLY-ASP (RGD) Bindungsstelle enthalten, können Integrine binden, welche z. B. auf Endothelzellen von Blutgefäßen exprimiert sind. Die RGD-Sequenz ist die Bindungsstelle für eine große Anzahl von Adhäsionsproteinen von extrazellulärer Matrix, Blut und Zelloberfläche und die Integrin-bindende Aktivität von Adhäsionsproteinen kann reproduziert werden durch kurze synthetische Peptide, welche die RGD-Sequenz enthalten. Solche Peptide unterstützen die Adhäsion an Zellen, und es können auch RGD-Sequenzen gewählt werde, welche spezifisch an bestimmte Integrine binden. Siehe auch Ruoslahti, E., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 1996; 12; 697–715.
Bindungselemente, welche die RGD-Sequenz enthalten, können das Kontrastmittel spezifisch an zelluläre Integrine binden. Zwei Beispiele für Peptide, welche Integrine binden können und die RGD-Sequenz enthalten sind mit SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 gegeben. Es ist bevorzugt, dass gemäß einer Ausführungs form der vorliegenden Erfindung die zweite Aminosäuresequenz die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 umfasst.
Weitere Peptide mit dem RGD-Bindungsmotiv, welche als Bindungselement geeignet sind, sind beispielsweise auch in der veröffentlichten Patentanmeldung US 20050070466A1 beschrieben In SEQ ID NO: 3 ist exemplarisch ein integrinbindendes Protein mit RGD Motiv beschrieben (s. a. Matsuzaka Y, Okamoto K, Mabuchi T, Iizuka M, Ozawa A, Oka A, Tamiya G, Kulski JK, Inoko H., Identification, expression analysis and polymorphism of a novel RLTPR gene encoding a RGD motif, tropomodulin domain and proline/leucine-rich regions. Gene. 2004 Dec 22; 343(2): 291–304)
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die zweite Aminosäuresequenz gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:

a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3;
b) einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 15, bevorzugt 30, aufeinander folgende Aminosäuren der Aminosäurensequenz gemäß SEQ ID NO: 3 aufweist;
c) einer Aminosäuresequenz eines Derivats eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, wobei das Derivat von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, welches das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 kodiert;
d) einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 60% homolog zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 ist, und
e) einer Aminosäuresequenz eines Derivats eines Polypeptids eines mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, wobei das Derivat von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches mindestens 60% homolog zu einem Nukleinsäuremolekül ist, welches das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 kodiert.

Unter einem Derivat des Polypeptids wird ein von dem natürlichen Protein abgeleitetes Polypeptid verstanden, welches eine Sequenzhomologie zu dem natürlichen Protein aufweist und welches selbst als Bindungselement fungiert, d. h. an die jeweilige biologische Struktur bindet.
Ferner betrifft die Erfindung ein isoliertes Polypeptid, welches eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz gemäß der oben beschriebenen Varianten aufweist. Unter einem isolierten Polypeptid wird ein Polypeptid verstanden, das in einer Form vorliegt, welche im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden ist.
Das Polypeptid kann darüberhinaus weitere Elemente oder Sequenzbereiche aufweisen, z. B. eine Linker-Sequenz oder Marker zum Aufreinigen des Polypeptids.
Das erfindungsgemäße Polypeptid weist eine erste Domäne mit einer ersten Aminosäuresequenz eines bakteriellen eisenbindenden Proteins oder ein Derivat der ersten Aminosäuresequenz auf, welches eine eisenbindende Aktivität aufweist, wobei das Polypeptid eine zweite Domäne mit einer zweiten Aminosäuresequenz aufweist, welche als Bindungselement zur Bindung an einer biologische Struktur im Körper eines Säugetiers wirkt.
Außerdem betrifft die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert. Diese Nukleinsäurese quenz kann in einem geeigneten Vektor vorliegen, z. B. einem für ein jeweiliges Expressionssystem geeigneten Expressionsplasmid. Unter einem isolierten Nukleinsäuremolekül wird ein Nukleinsäuremolekül verstanden, das in einer Form vorliegt, welche im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren ist.
Ferner betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche das erfindungsgemäße Magnetresonanz-Kontrastmittel in pharmazeutisch verwendbarer Form und ein pharmazeutisch verwendbares Trägermittel aufweist.
Beispiel einer Ausführungsform der Erfindung
Konstruktion des Polypeptids
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids wird ein Fusionsprotein hergestellt, welches einerseits das Integrin-bindende Peptid gemäß SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 und andererseits die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist. Die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 sind Integrin-bindende Peptide, welche die gleiche Aminosäuresequenz mit unterschiedliche verknüpften Disulfidbrücken aufweisen. Die Domäne, welche das Integrin-bindende Peptid aufweist, kann von der Domäne, welche das eisenbindende Protein aufweist, mit einem Linker oder Spacer mit einer Länge von z. B. 10–20 Aminosäuren beabstandet sein. Eine Nukleinsäure, welche das Fusionspeptid, aufweisend die Integrin-bindende Domäne, den Spacer und die eisenbindende Domäne, kodiert, kann entsprechend herkömmlicher, dem Fachmann bekannter Klonierungstechniken in einem geeigneten Expressionsvektor kloniert werden (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbour Labotory Press, 2. Aufl., 1989). Das Polypeptid kann in einem geeigneten Expressionssystem (E. coli, Baculovirus, CHO-Zellen oder ähnliches) exprimiert werden. Anschließend wird das Polypeptid mittels eines geeigneten Verfahrens aufgereinigt. Es ist denkbar, das Polypeptid zur vereinfachten Aufreinigung mit weiteren Funktionalitäten auszustatten, z. B. einen Marker, über welchen das Protein durch Affinitätschromatographie gereinigt werden kann, wie z. B. einem Polyhistidinrest, dem so genannten „His-Tag", oder andere, dem Fachmann bekannte Marker.
Herstellung des Kontrastmittels
Zur Herstellung des Kontrastmittels wird zunächst eine Dispersion aus monokristallinen oder monodispersen Eisenoxidpartikeln (Nanopartikel mit Durchmesser von 1 bis 100 nm) hergestellt. Dies wird in einer Ein-Schritt-Synthese aus Eisen(II) und Eisen(III)-Salzen hergestellt. Zu einer wässrigen Eisenchloridlösung (FeCl₂ und FeCl₃) wird unter Rühren eine NH₃-Lösung oder NaOH-Lösung hinzugefügt. Aus der Lösung fällt Magnetit, Fe₃O₄, aus. Zu der Suspension wird unter Rühren und Erwärmen Ölsäure hinzugefügt, wodurch eine feine Dispersion von Magnetitpartikeln entsteht (vgl. auchPark et al. (2005), One-nanometer-scale-size-controlled synthesis of monodisperse magnetic iron oxide nanoparticles, Angewandte Chemie International Edition, 44, 19, 2872–2877).
Nach Aufreinigen werden die Partikel in einem zweiten Schritt mit den Fusionsproteinen beschichtet, welches unter Rühren in wässriger Lösung zu der Eisensuspension hinzutritiert wird. Schließlich müssen noch unbesetzte Oberflächen der Eisennanopartikel abgesättigt werden, z. B. mit Dextran, PEG, Stärke oder ähnlichem. Nach Aufreinigung werden die beschichteten Partikel in wässriger, pH-gepufferter Lösung aufgenommen. Die Eisenkonzentration des Kontrastmittels soll z. B. 0,1 mmol bis 1,0 mmol Fe/ml betragen.
Verwendung des Kontrastmittels
Das Kontrastmittel wird als 1–2 ml Bolus-Injektion verabreicht. Während der Akkumulationsphase von einigen Minuten bis zu 8 Stunden nach der Injektion kann eine MR Untersuchung durchgeführt werden, zum Einsatz empfiehlt sich ein dynamisches MRT-Bildgebungsverfahren, z. B. mittels T2*-gewichteten oder T1-gewichteten Gradientenechosequenzen (GRE).
Es wird betont, dass das dargestellte Ausführungsbeispiel lediglich veranschaulichend und beispielhaft ist. Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind viele Variationen und Modifikationen denkbar, insbesondere bezüglich der Wahl der ersten und optional der zweiten Aminosäuresequenz, der Verknüpfung von der eisenbindenen Funktionalität und dem Bindungselement sowie bezüglich der jeweiligen Darreichungsform des Kontrastmittels.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- US 20050070466 A1 [0025]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Kuriu Y, Otsuji E, Kin S, Nakase Y, Fukuda KI, Okamoto K, Hagiwara A, Yamagishi H; Monoclonal antibody conjugated to gadolinium as a contrast agent for magnetic resonance imaging of human rectal carcinoma. J Surg Oncol. 2006 Jul 17; 94(2): 144–148 [0002]
- H, Lee E, Kim do K, Jang NK, Jeong YY, Jon S., Antibiofouling polymer-coated superparamagnetic iron Oxide nanoparticles as potential magnetic resonance contrast agents for in vivo cancer imaging. J Am Chem Soc. 2006 Jun 7; 128(22): 7383–9 [0003]
- Briat J.-F. (1992). Iron assimilation and storage in prokaryotes. J. Gen. Microbiol. 138: 2475–2483, Guerinot, M. L. (1994) Micobial iron transport. Annu Rev Microbiol (48): 743–772 [0011]
- Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbour Labotory Press, 2. Aufl., 1989 [0020]
- S. F. Altschul et al. (1999), basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215 [0021]
- Ruoslahti, E., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 1996; 12; 697–715 [0023]
- Matsuzaka Y, Okamoto K, Mabuchi T, Iizuka M, Ozawa A, Oka A, Tamiya G, Kulski JK, Inoko H., Identification, expression analysis and polymorphism of a novel RLTPR gene encoding a RGD motif, tropomodulin domain and proline/leucine-rich regions. Gene. 2004 Dec 22; 343(2): 291–304 [0025]
- Sambrook et al., Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbour Labotory Press, 2. Aufl., 1989 [0033]
- Park et al. (2005), One-nanometer-scale-size-controlled synthesis of monodisperse magnetic iron oxide nanoparticles, Angewandte Chemie International Edition, 44, 19, 2872–2877 [0034]

Claims

Magnetresonanz-Kontrastmittel, welches mittels eines Bindungselements an eine biologische Struktur im Körper eines Säugetiers binden kann, wobei das Bindungselement ein isoliertes Polypeptid aufweist, wobei das Polypeptid eine erste Aminosäuresequenz eines bakteriellen eisenbindenden Proteins oder ein Derivat davon umfasst, wobei das bakterielle eisenbindende Protein oder das Derivat davon eine eisenbindende Aktivität aufweist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach Anspruch 1, wobei das Bindungselement an ein Protein bindet.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach Anspruch 2, wobei das Bindungselement einen Liganden für ein zelluläres Membranprotein aufweist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Bindungselement einen Liganden für ein zelluläres Glykoprotein aufweist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Bindungselement einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment eines Antikörpers aufweist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Bindungselement an ein Tumorantigen bindet.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Bindungselement, welches an die biologische Struktur bindet, eine zweite Aminosäuresequenz aufweist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach Anspruch 7, wobei die vom Bindungselement umfasste zweite Aminosäuresequenz einen Teil des Polypetids bildet.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach Anspruch 8, wobei das Polypeptid eine Linker-Aminosäuresequenz aufweist, die zwischen der ersten und der zweiten Aminosäuresequenz vorgesehen ist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das bakterielle eisenbindende Protein ein Siderophor ist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche wobei das bakterielle eisenbindende Protein ein Fe(III) binding Protein (Fbp) oder ein Major ferric binding Protein (MIRP) der Familie Haemophilus, Pasteurellales, Pasteurellaceae oder Neisseria ist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche wobei das bakterielle eisenbindende Protein ein Fe(III) binding Protein (Fbp) der Spezies H. influenzae, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. cinerea, N. lactamica, N. subflava, N. kochii oder N. polysaccharea ist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erste Aminosäuresequenz gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2; b) einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 15 aufeinander folgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 aufweist; c) einer Aminosäuresequenz eines Derivats eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, wobei das Derivat von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches unter strin genten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, welches das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 kodiert; d) einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 60% homolog zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 ist; und e) einer Aminosäuresequenz eines Derivats eines Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, wobei das Derivat von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches mindestens 60% homolog zu einem Nukleinsäuremolekül ist, welches das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 kodiert.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei die zweite Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp (RGD) aufweist.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach Anspruch 14, wobei die zweite Aminosäuresequenz die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 umfasst.
Magnetresonanz-Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die zweite Aminosäuresequenz gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3; b) einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 15 aufeinander folgende Aminosäuren der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 aufweist; c) einer Aminosäuresequenz eines Derivats eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, wobei das Derivat von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, welches das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 kodiert; d) einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 60% homolog zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 ist; und e) einer Aminosäuresequenz eines Derivats eines Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, wobei das Derivat von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, welches mindestens 60% homolog zu einem Nukleinsäuremolekül ist, welches das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 kodiert.
Isoliertes Polypeptid, wobei das Polypeptid eine erste Domäne mit einer ersten Aminosäuresequenz eines bakteriellen eisenbindenden Proteins oder ein Derivat davon aufweist, welches eine eisenbindende Aktivität aufweist, und wobei das Polypeptid eine zweite Domäne mit einer zweiten Aminosäuresequenz aufweist, welche als Bindungselement zur Bindung an einer biologische Struktur im Körper eines Säugetiers wirkt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid gemäß Anspruch 17 kodiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend ein Magnetresonanz-Kontrastmittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 und ein pharmazeutisch verwendbares Trägermittel.