DE102006046959A1

DE102006046959A1 - Verfahren zur Herstellung eines Thrombozytenkonzentrats

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Publication number: DE102006046959A1
Application number: DE102006046959A
Authority: DE
Inventors: Andreas Prof. Dr. Greinacher
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: Universitaet Greifswald
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2006-10-04
Publication date: 2008-04-10

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft standardisierte Thrombozytenkonzentrate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung solcher Thrombozytenkonzentrate als pharmazeutische Zusammensetzung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft standardisierte Thrombozytenkonzentrate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung solcher Thrombozytenkonzentrate als pharmazeutische Zusammensetzung.
Hintergrund der Erfindung
Seit Anfang der 1990er Jahre hat sich in der Transfusionsmedizin die sogenannte Blutkomponententherapie durchgesetzt. Dabei erhält der Patient genau die Bestandteile des Vollblutes, die er benötigt. Im Sinne dieses Konzepts werden bei verschiedenen therapeutischen Anwendungen (wie z.B. Gerinnungsstörungen) heutzutage Thrombozytenkonzentrate eingesetzt.
Die Haltbarkeit dieser Thrombozytenpräparate liegt bei wenigen Tagen, so dass diese Blutkonserven, die besonders in der Transplantationsmedizin und der Tumortherapie von großer Bedeutung sind, nicht in großem Umfang bevorratet werden können, sondern möglichst frisch hergestellt werden müssen. Die bekannten Verfahren zur Isolierung von Thrombozytenkonzentraten aus Vollblut umfassen verschiedene Zentrifugations- und Filtrationsschritte.
Bei einem der gebräuchlichen Verfahren wird zunächst das Plasma von den zellulären Bestandteilen des Bluts durch Zentrifugation abgetrennt. Diese Zellfraktion enthält neben den Thrombozyten (Blutplättchen) auch Leukozyten und Erythrozyten. Dabei bilden die Erythrozyten den untersten Teil des Sediments und können mit Hilfe eines Abpressgeräts halbquantitativ von Thrombozyten und Leukozyten getrennt werden. Das verbliebene Material, das die Thrombozyten- und Leukozytenfraktion enthält, nennt man Buffy coat. Aus dem Buffy coat müssen anschließend Leukozyten und die verbliebenen Erythrozyten entfernt werden, um das Thrombozytenkonzentrat zu erhalten. Dazu werden zunächst 4–6 Buffy coats aus je einer Vollblutspende gepoolt und entweder Plasma oder eine Elektrolytlösung zugegeben. Dann werden die Erythrozyten und ein großer Teil der Leukozyten durch Zentrifugation entfernt. Anschließend wird, üblicherweise durch Filtration, eine Leukozytendepletion erreicht, und das Thrombozytenkonzentrat bleibt zurück. Ein solches aus 4–6 Buffy coats erhaltenes Thrombozytenkonzentrat stellt eine therapeutische Einheit dar und sollte mindestens ca. 2,0·10¹¹, 2,4·10¹¹ oder 3·10¹¹ Thrombozyten enthalten (Richtlinien der EU, der deutschen Ärztekammer und der USA).
Der Stand der Technik umfasst außerdem Aphereseverfahren, bei denen die verschiedenen Sedimentfraktionen von Vollblut während der Zentrifugation abgenommen werden können (vgl. US 6, 022, 306 , US 6, 514, 189 , US 6, 354, 986 , US 6,334,842 ). Auf diese Weise wird die Herstellung von Thrombozytenkonzentrat aus Vollblut ermöglicht. Ein Vorteil, der sich aus diesen Verfahren ergibt, besteht darin, dass die nicht abgetrennten Bestandteile des Bluts dem Spender zurück transfundiert werden können. Das macht es möglich, einem Spender eine größere Menge Thrombozyten abzunehmen als bei der Entnahme von Vollblut. Es sind Aphereseverfahren bekannt, bei denen von einem Spender bis zu ca. 9·10¹¹ Thrombozyten gewonnen werden können (z.B. Picker et al., 2006, Transfusion 46:1601-1608).
Die mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellten Thrombozytenkonzentrate sind hinsichtlich ihres Volumens, ihrer Qualität und der enthaltenen Thrombozytenzahl nur innerhalb relativ weiter Grenzen standardisiert, da die individuellen Besonderheiten des Spenders auch die Qualität des Thrombozytenkonzentrates beeinflussen.
Es wäre wünschenswert, alle erhaltenen Thrombozytenkonzentrate vor der Verabreichung an den Patienten hinsichtlich verschiedener Qualitätsmerkmale zu untersuchen und sie gegebenenfalls derart zu modifizieren, dass sie bezüglich dieser Qualitätsmerkmale festgelegten Standards entsprechen. Diese Merkmale umfassen unter anderem die Thrombozytendichte des Konzentrats, die Verunreinigung des Konzentrats mit Erythrozyten und Leukozyten, die Funktion der Thrombozyten, die Menge an Antikörpern gegen Blutgruppenbestandteile, insbesondere Anti-A und Anti-B-Antikörper, und die Abwesenheit von Pathogenen. Das betrifft vor allem die Abwesenheit von Viren, Bakterien, Protozoen.
Die Untersuchung eines Thrombozytenkonzentrats auf mehrere Qualitätsmerkmale führt jedoch dazu, dass dieses nicht mehr verwendet werden kann, da die Anzahl an Thrombozyten zur Transfusion dann zu gering ist. Zur Zeit ist damit eine Produktkontrolle Produkt-zerstörend.
Aufgrund der mit der Qualitätskontrolle verbundenen hohen Kosten und des Verlusts von Spendermaterial werden in Deutschland gegenwärtig nur ca. 1% der Thrombozytenkonzentrate hinsichtlich ihrer Qualitätsmerkmale untersucht (Bundesgesundheitsblatt, 2000, 43:571).
Gegenüber dem Stand der Technik stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, das die kostengünstige Gewinnung von Thrombozytenkonzentraten erlaubt und bei dem jedes Produkt hinsichtlich seiner Qualität geprüft und möglichst standardisiert ist.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft, unter anderem, ein Verfahren zur Herstellung von standardisiertem Thrombozytenkonzentrat aus Spendermaterial, Schritte umfassend, bei denen man:

a) Thrombozyten enthaltendes Spendermaterial von einer Mehrzahl von Spendern mit Hilfe eines Zellseparationsverfahrens auftrennt,
b) die thrombozytenreiche Fraktion sammelt,
c) die thrombozytenreiche Fraktion untersucht und/oder standardisiert,
d) die thrombozytenreiche Fraktion in mehrere standardisierte Einheiten Thrombozytenkonzentrat aufteilt.

Die Qualität der Thrombozyten in jeder nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen standardisierten Einheit einer Charge ist gleich. Vorzugsweise sind die standardisierten Einheiten untereinander auch in ihrer Menge gleich, es können jedoch auch, z.B. zur Qualitätskontrolle oder, je nach Bedarf, unterschiedlich große Mengen abgenommen werden.
Vorzugsweise sind die in Schritt d erhaltenen standardisierten Einheiten Thrombozytenkonzentrat therapeutische Einheiten, die zur Transfusion bei Menschen geeignet sind und bevorzugt nach den Richtlinien der EU bzw. der deutschen Ärztekammer und der USA mindestens 2,0·10¹¹ Thrombozyten, oder mindestens 2,4·10¹¹ Thrombozyten, mehr bevorzugt mindestens 3·10¹¹ Thrombozyten umfassen.
Um mehrere standardisierte therapeutische Einheiten an Thrombozytenkonzentrat zu erhalten, ist Voraussetzung, dass die thrombozytenreiche Fraktion in Schritt c eine ausreichende Zahl an Thrombozyten umfasst, so dass eine Aufteilung in mehrere therapeutische Einheiten (also vorzugsweise jeweils mindestes 2,0·10¹¹ Thrombozyten) Thrombozytenkonzentrat möglich ist und/oder Untersuchungen durchgeführt werden können und noch mindestens eine therapeutische Einheit zur Transfusion verwendet werden kann. Die Fraktion in Schritt c sollte daher mindestens 4·10¹¹ oder mindestens 4,8·10¹¹ Thrombozyten umfassen, bevorzugt mindestens 7,2·10¹¹, mindestens 1·10¹², mindestens 5·10¹² oder mindestens 1·10¹³ Thrombozyten. Bevorzugt erhält man mit dem Verfahren 3 oder mehr Einheiten, insbesondere 3 oder mehr therapeutische Einheiten Thrombozytenkonzentrat.
Um dies zu erreichen, werden in einer Ausführungsform der Erfindung vor der Untersuchung und Standardisierung in Schritt c eine Mehrzahl von in Schritt b erhaltenen thrombozytenreichen Fraktionen vereinigt.
Dazu können Thrombozyten aus Spendermaterial von jeweils einem Spender einzeln aufgereinigt und vereinigt werden. Bevorzugt wird aber Material von mehreren Spendern gemeinsam aufgereinigt, z.B. nach den im Stand der Technik bekannten Verfahren, durch die aus Material von 4–6 Spendern eine therapeutische Einheit an Thrombozyten erhalten wird. Mehrere dieser therapeutischen Einheiten werden vereinigt. An dem erhaltenen Thrombozytenpool werden nun Untersuchung und Standardisierung durchgeführt (siehe 1).
Als Spendermaterial im Sinne der Erfindung können allgemein Vollblut oder Buffy coats verwendet werden. Wird Vollblut als Ausgangsmaterial verwendet, kann dieses in Blutbeuteln zusammengeführt und durchmischt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung geht man jedoch nicht von Vollblut aus, sondern von sogenannten Buffy coats, der beim Zentrifugieren von Vollblut entstehenden Schicht aus Leukozyten und Thrombozyten, die sich zwischen dem Plasmaüberstand und den sedimentierten Erythrozyten befindet. Nach der Zentrifugation von Vollblut können, z.B. in einer Blutbeutelpresse, Plasma und Erythrozyten durch Abpressen entfernt werden, so dass der Buffy coat erhalten wird, in dem Thrombozyten, Leukozyten und ein Restanteil von Erythrozyten enthalten sind.
Zur Weiterverarbeitung können mehrere Blutbeutelinhalte Buffy coat z.B. durch Ausspülen mit Plasma oder mit Elektrolytlösung in einem Blutbeutel zusammengeführt werden. Dies erfolgt durch eine Schlauchverbindung zwischen dem Sammelgefäß und den Buffy coat-Blutbeuteln, z.B. über ein steriles Schlauch-Verschweißungsverfahren. Das Zusammenführen der Buffy coats kann entweder erfolgen, bevor eine weitere Auftrennung und Aufreinigung der Thrombozyten erfolgt, oder es können kontinuierlich Buffy coats angeschlossen und nachgefüllt werden, während der Separationsvorgang bereits erfolgt.
Üblicherweise erfolgt das Abtrennen und Einsammeln der Thrombozytenfraktion mittels Zellseparation nach der Zusammenführung der Spendermaterialien. Die Zellseparation kann direkt mit Hilfe eines Apheresegeräts erreicht werden. Ein Apheresegerät im Sinne der Erfindung ist dabei eine Vorrichtung, die dazu in der Lage ist, aus Spendermaterial, das durch die Vorrichtung hindurchgepumpt wird, automatisch eine in Bezug auf Thrombozyten angereicherte Fraktion abzutrennen. Geeignete Geräte sind z.B. Amicus (Baxter Transfusion Theraeies, Deerfield, IL), MCS Plus (Haemonetics Corp., Braintree, MA) oder Trima Accel (Gambro BCT, Lakewood, CO). Das Trennungsprinzip ist z.B. in Picker et al. (2006, Transfusion 46:1601-2608, mit weiteren Zitaten) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Spendenmaterial, insbesondere Buffy coats, von einer Mehrzahl an Spendern kontinuierlich durch ein Apheresegerät aufgereinigt und die thrombozytenreiche Fraktion (die Überstände) werden gemeinsam gesammelt, wobei die in Schritt c des Verfahrens zu untersuchende Fraktion erhalten wird. Dazu können entweder eine Mehrzal an Buffy coats vor dem Anschluß an das Apherese-Gerät gepoolt werden (siehe 2), oder das Apherese-Gerät wird so ausgestaltet, dass eine Vielzahl von Buffy coats nacheinander verarbeitet werden kann, bevorzugt automatisiert. Dies kann z.B. mit Hilfe einer mit dem Apheresegerät verbundenen Stapelvorrichtung geschehen, die eine Mehrzahl von Buffy coats enthält und die nacheinander, jeweils unter Herstellung von Schlauchverbindungen, den Inhalt der Buffy coats der Apherese zuführt. Bevorzugt können mit dieser Vorrichtung mindestens 8, mindestens 10 oder mindestens 20 Buffy coats nacheinander automatisiert verarbeitet werden.
Alternativ dazu können zur Separation der Thrombozyten z.B. auch Zentrifugen eingesetzt werden, die die gleichzeitige Zentrifugation einer größeren Menge an Spendermaterial erlauben, so dass auch per Zentrifugation Material von mehr als 8 Spendern gleichzeitig gewonnen werden kann.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren nach Schritt b erhaltene Thrombozytenpool stammt daher von einer Mehrzahl von Spendern, insbesondere von mindestens 8 oder mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20 oder mindestens 50 Spendern. Die Erfindung ermöglicht es jedoch, das Ausgangsmaterial von beliebig vielen Spenden zusammen zu führen, in Abhängigkeit von der Menge an zur Verfügung stehenden Blutspenden.
Neben der Möglichkeit der Untersuchung und Standardisierung ist von Vorteil, dass in den erfindungsgemäßen standardisierten Thrombozytenkonzentraten individuelle Unterschiede in der Qualität des Spendermaterials ausgeglichen werden.
Bevorzugt wird Spendenmaterial von Spendern der gleichen Blutgruppe (A, B, AB, O) verwendet. Vorzugsweise sind die Spender alle Rhesus-positiv oder alle Rhesus-negativ. Wird Material von Spendern mit unterschiedlichem Rhesus-Faktor verwendet, ist das erhaltene Konzentrat als Rhesus-positiv einzustufen.
Ein potentieller Nachteil bei der Mischung von Material vieler Spender ist eine statistisch wahrscheinlichere mögliche Kontamination der ganzen erhaltenen Charge an Thrombozytenkonzentraten mit Pathogenen. Dies kann jedoch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgeschlossen werden, da mit diesem Verfahren eine Möglichkeit der Untersuchung auf Pathogene und der Inaktivierung der Pathogene in der ganzen Charge eröffnet wird. Damit wird für die Empfänger des Thrombozytenkonzentrats die Sicherheit vor Pathogeninfektion durch das erfindungsgemäße Verfahren erhöht.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher die thrombozytenreiche Fraktion vorzugsweise untersucht, z.B. auf Vorliegen von Kontaminationen oder im Hinblick auf die Einhaltung bestimmter, zur Standardisierung verwendeter Parameter. Erfindungsgemäß umfasst das Untersuchen und Standardisieren mindestens einen Schritt, ausgewählt aus den folgenden Schritten, bei denen man:

– die Thrombozytenmenge und/oder Thrombozytendichte des Thrombozytenkonzentrats bestimmt und gegebenenfalls einstellt,
– das Thrombozytenkonzentrat hinsichtlich der Anwesenheit von Pathogenen untersucht,
– Pathogene im Thrombozytenkonzentrat inaktiviert,
– die Menge an Antikörpern gegen Blutgruppenbestandteile untersucht,
– die Verunreinigung des Konzentrats mit Erythrozyten und Leukozyten untersucht,
– die Thrombozytenfunktion untersucht.

Die Thrombozytendichte pro μl wird mit einem automatischen Partikelzählgerät untersucht, der Gehalt an Erythrozyten und Leukozyten z.B. mit einem Partikelzählgerät, mit einer Nageotte-Zählkammer oder mit dem Durchflusszytometer. Angestrebt wird eine Thrombozytenzahl von mindestens etwa 2,4·10¹¹ Thrombozyten pro standardisiertem Thrombozytenkonzentrat (Schritt d), bevorzugt jedoch mindestens 3·10¹¹ Thrombozyten oder 3–6·10¹¹ Thrombozyten pro Konzentrat. Das typische Volumen des standardisierten Thrombozytenkonzentrats liegt bei etwa 250–300 ml, die Thrombozytendichte also bei mindestens etwa 8·10⁸ Thrombozyten/ml.
Die Thrombozytenfunktion wird z.B. mit der Aggregometrie nach Born bestimmt, mit der Durchflusszytometrie und/oder mit dem Plättchenfunktionsanalyzer oder anderen geeigneten Methoden. Funktionen, die in vitro untersucht werden können, sind z.B. Laktatproduktion, Glukoseverbrauch, P-Selektin-Expression, pH, pCO₂, pO₂ oder Antwort auf hypotonischen Schock (Goodrich et al., Vox Sang. 90:279-285).
Die Bakterienkontamination wird z.B. durch Bakterienkultur oder durch PCR (Polymerasekettenreaktion) untersucht, eine Kontamination mit Viren (z.B. HIV, Hepatitis A, B und oder C-Virus) oder Protozonen (z.B. Leishmanien) kann ebenfalls z.B. durch PCR festgestellt werden. Bevorzugt wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Anwesenheit von Bakterien geprüft. Eine Kontamination mit Viren wird im Allgemeinen schon bei dem verwendeten Spendermaterial (z.B. den Buffy coats) vor der Vereinigung der thrombozytenreichen Fraktionen aus dem Material untersucht.
Wird keine Kontamination festgestellt, wird das Konzentrat als pathogenfrei eingestuft und kann verwendet werden. Wird Anwesenheit von Pathogenen festgestellt, kann das Konzentrat verworfen oder Pathogene können inaktiviert werden. Auch nach einer Inaktivierung von Pathogenen wird das Konzentrat als pathogenfrei eingestuft.
Auch die Abwesenheit anderer Verunreinigungen des Thrombozytenkonzentrats, z.B. mit unerwünschten Antikörpern oder anderen Zellbestandteilen kann untersucht werden. Ist diese Verunreinigung zu hoch, kann ein Ausgleich mit anderen Chargen erfolgen, oder die zu stark verunreinigte Charge kann von der medizinischen Verwendung ausgeschlossen werden. Bevorzugt enthält das fertige Präparat weniger als 1·10⁶ Leukocyten und/oder weniger als 3·10⁹ Erythrocyten.
Die Untersuchung z.B. auf Pathogene oder Funktion und die weitere Behandlung z.B. Pathogeninaktivierung müssen nicht vor der Aufteilung in die einzelnen therapeutischen Einheiten erfolgen, sondern kann auch parallel oder danach stattfinden, solange gewährleistet ist, dass die in der Untersuchung gewonnenen Informationen allen Einheiten der Charge zugeordnet werden können.
Vorteilhafterweise werden im Rahmen der Standardisierung evtl. vorhandene Pathogene (Viren, Bakterien und/oder Protozoen) im Thrombozytenkonzentrat inaktiviert. Dies kann entweder standardmäßig bei allen Chargen geschehen oder nur bei solchen, bei denen eine Kontamination festgestellt wurde. Das Thromboyztenkonzentrat sollte zur Verwendung am Menschen keine vermehrungsfähigen Viren, Bakterien oder Protozoen enthalten.
Verfahren zur Pathogeninaktivierung sind im Stand der Technik bekannt und werden ständig weiter verbessert. Beispiele sind etwa Bestrahlung mit gamma-Strahlung, UV B-Licht oder UV C-Licht, Behandlung mit Amotosalen HCl und UV A-Licht oder mit Riboflavin und UV Licht (wie z.B. erläutert in Slichter et al., Blood 105:4106-4114; Slichter et al., Transfusion 46: 731-740; Apelseth et al., 2006, Transfusion 46:800-810; Sandler, Curr Hematol Rep 5: 53–54, Cardo et al., Vox Sang 90:85-81 und Goodrich et al., Vox Sang. 90:279-285).
Eine Inaktivierung von Pathogenen kann in einem Schritt mit der Aufteilung der Charge in mehrere therapeutische Einheiten erfolgen, z.B. durch Bestrahlung, wie Bestrahlung mit UV B-Licht, während des Abfüllens der Thrombozyten in einzelne Blutbeutel.
Bevorzugt wird sowohl die Thrombozytenkonzentration untersucht als auch mindestens einer der weiteren Standardisierungsschritte durchgeführt, insbesondere wird die Anwesenheit von Pathogenen, vor allem Bakterien, untersucht. Besonders bevorzugt ist die Untersuchung der Thrombozytenkonzentration, Untersuchung der Anwesenheit von Pathogenen, insbesondere Bakterien, und Inaktivierung von Pathogenen. Vorzugsweise werden alle genannten Untersuchungs- und Standardisierungsschritte durchgeführt.
Durch das beschriebene Verfahren ist es erstmals möglich, eine Charge von mehreren in ihrer Qualität gleichen, standardisierten Thromobozytenkonzentraten herzustellen, die bevorzugt vor der Anwendung am Patienten mit verschiedenen Verfahren auf Thrombozytenzahl, Thrombozytenfunktion und/oder Pathogenkontamination, insbesondere bakterielle Kontamination, getestet wurden.
Daher wird durch die Erfindung eine Charge mit einer Mehrzahl, grundsätzlich mit beliebig vielen, standardisierten Thrombozytenkonzentraten erhalten. Jedes einzelne Thrombozytenkonzentrat enthält vorzugsweise eine therapeutische Einheit Thrombozyten, also mindestens 2.0·10¹¹ Thrombozyten, bevorzugt mindestens 2.4·10¹¹ Thrombozyten oder mindestens 3.0·10¹¹ Thrombozyten. Die Mehrzahl standardisierter Thrombozytenkonzentrate umfasst dabei bevorzugt mindestens vier Thrombozytenkonzentrate, die kommerziellen Vorteile kommen jedoch bei größeren Chargen, z.B. bei mindestens 10, mindestens 20 oder mindestens 50 standardisierten Thrombozytenkonzentraten noch mehr zum tragen.
Das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Thrombozytenkonzentrat-Pool, das nach Ausführung der Schritte a, b und c des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird, umfasst damit mindestens 2 therapeutische Einheiten (also z.B. mindestens 4,8·10¹¹ Thrombozyten), bevorzugt mindestens 10 therapeutische Einheiten (z.B. mindestens 2,4·10¹² Thrombozyten), mindestens 20 therapeutische Einheiten (z.B. mindestens 4,8·10¹² Thrombozyten) oder mindestens 50 therapeutische Einheiten (z.B. mindestens 1,2·10¹³ Thrombozyten).
Das hier offenbarte Verfahren, das die Herstellung von Thrombozytenkonzentrat mit standardisierten Eigenschaften ermöglicht, erleichtert die Vorhersage der Effizienz von Transfusionen und verbessert die Vergleichbarkeit der Ergebnisse von Transfusionsbehandlungen untereinander. Durch die erfindungsgemäß ermöglichte Vereinfachung der Trenn- und Qualitätskontrollschritte erlaubt das Verfahren ferner die Herstellung von Thrombozytenkonzentraten zu einem niedrigeren Preis und außerdem mit geringeren Verlusten des wertvollen Spendermaterials. Dabei ist die Kostenersparnis abhängig von der Chargengröße. Je mehr Thrombozytenkonzentrate eine Charge umfasst, desto günstiger ist das Verfahren.
Die vorliegende Erfindung richtet sich außerdem auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Thrombozytenkonzentrate umfassen. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen oder die Thrombozytenkonzentrate der Erfindung selbst können eingesetzt werden, um Gerinnungsstörungen zu behandeln, die auf einen verminderten Thrombozytengehalt im Blut zurückzuführen sind. Derartige Gerinnungsstörungen können z.B. durch Leukämien, Knochenmarkskarzinosen oder Zytostatikatherapie, durch Verlust oder Verbrauch bei großen Operationen, Gewebsverletzungen oder schweren Infektionen hervorgerufen werden. In der Regel werden die Präparate den Patienten durch Transfusion verabreicht.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert. Diese Beispiele dienen der Illustration und sollen die Erfindung nicht beschränken.
Beispiele
Fraktionierung: Herstellung von in-line filtriertem Erythrozytenkonzentrat (EK), gefrorenem Frischplasma und Thrombozytenkonzentrat aus Buffy coat, gepoolt, leukozytendepletiert
nach Standard Operating Procedure (SOP)

aus 4-fach Beuteln, 500 ml

1. Zusammenfassung
Die Blutentnahme von max. 500 ml erfolgte in CPD/SAG-M (CPD: Natriumcitrat-Dihydrat 2,63 g/100 mL, Zitonensäure-Monohydrat 0,299 g/100 mL, Dextrose-Monohydrat 2,55 g/100 mL, Natriumbisphosphat-Monohydrat (monobasisch) 0,222 g; SAG-M: Dextrose-Monohydrat 0,9 g/100 mL, NaCl 0,877 g/100 mL, Adenin 0,0169 g/100 mL, D-Mannitol 0,525 g/100 mL), im 4-fach T/B(Top/Bottom) Beutelsystem mit integriertem Leukozytenfilter der Firma Maco Pharma (LQT 7290 PC; Wegener et al, 1997, Beitr Infusionsther Transfusionsmed 34:48-52, andere Systeme können verwendet werden). Um die Buffy-Coats weiterverarbeiten zu können, wurden diese im Rahmen der Spende als Blutprodukt mit eigener Konservennummer erzeugt. Dazu trug der Primärbeutel neben der Primärbeutelnummer noch das Produktetikett des Buffy-Coats. Auf dem Produktetikett war die Blutgruppe in Kurzform (A+, A–, ...) ausgegeben, um eine manuelle Zusammenstellung der Pools zu ermöglichen.
Nach der Blutentnahme wurde das Vollblut mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur gelagert und danach schnell in Komponenten aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgte innerhalb von 4 Stunden.
Plasma und EK wurden über das T/B-Verfahren, in diesem Fall mit der MacoPress, automatisch abgetrennt. Das EK wurde sofort mit der Additivlösung SAG-M resuspendiert.
Ein erstes Thrombozytenpräparat wurde durch Leukozytenfiltration eines aus vier Buffy coats gepoolten Präparates hergestellt, anschließend wurden 4–6 derartige Präparationen zu einem zweiten Thrombozytenpool vereinigt. Es wurden Buffy-Coats von blutgruppen- und rhesusgleichen Spendern verwendet.
2. Verwendete Geräte:

• Zentrifuge „Roto Silenta RS" (Fa. Hettich) oder „Roto Silenta RP" (Fa. Hettich)
• Plasmapressen MacoPress (Maco Pharma)
• Schlauchschweißgerät
• Ausstreifzange
• lösbare Plastikschlauchklemmen
• geeichte Waage Sartorius BP 2100
• Sterilschweißgerät (Terumo)
• Optidok-System R7012 OptiPure PS
• doppelt gekammerte Zentrifugenbecher für Thrombozytenpräparation

3. Herstellung von Buffy coats
Nach Vollblutentnahme erfolgte eine Zwischenlagerung des Blutes von einer Stunde bis zur Auftrennung durch Zentrifugation bei Raumtemperatur. Die Mindestruhezeit nach Entnahme ist die von der abnehmenden Schwester auf der Konserve dokumentierte Zeit + 60 Minuten, bei anschließender Warmfiltration entweder 1–18 Stunden oder über Nacht, bei anschließender Kaltfiltration 1–4 Stunden.
Das Schlauchende, das mit einer Schlauchklemme verschlossen ist, wurde vom mit Vollblut gefüllten Beutel auf eine Länge von ca. 5 cm abgeschweift.
Zum Austarieren der Zentrifuge wurden Differenzen austariert. Dies kann allgemein mit PVC-Weichfolienstücken, bei größeren Differenzen mit mit sterilem Aqua dest. gefüllten Leerbeutel erfolgen. Die Differenz zwischen zwei gefüllten Beutelsystemen einschließlich Tariergewichten darf nicht größer als ein Gramm sein.
Zum Packen der Zentrifuge wurde Flüssigkeit (SAG-M) aus einem Filter durch Schwerkraft in Pfeilrichtung in einen SAG-M-Beutel laufen gelassen, wobei der Filter beim Zentrifugieren nicht prall gefüllt sein darf.
Der SAG-M Beutel wurde flach auf einen Tisch gelegt, wobei die Schläuche vom Bearbeiter weg neben den Beutel gelegt wurden. Darüber wurden EK-Leerbeutel, darauf Filter, darauf Leerbeutel angeordnet, alle Schläuche wieder zur Seite, nicht zwischen die Beutel.
Der ganze Stapel wurde auf den gefüllten Primärbeutel angeordnet (die Seite ohne Etikett), die Schläuche zwischen Stapel und Primärbeutel. Der gesamten Stapel wurde in eine grüne OP-Haube platziert, der Primärbeutel nach unten. Die OP-Haube wurde über dem Stapel eingeschlagen.
Der 4fach Beutel mit in-line Filter wurde in beiden Zentrifugen im äußeren Becherkranz des Doppelgehänges untergebracht, da sonst die Beutel an den Rotorarmen scheuern können.
Es erfolgte eine Zentrifugation unter folgenden Bedingungen, die je nach Zentrifuge angepasst werden können:
Zentrifuge von der Firma Rettich, Roto Silenta/RS (4171), Rotor 4176, 2fach-Nutgehänge (4591), 2fach Kunststoffeinsätze für 4fach Blutbeutel 500 ml (4592), Rotordurchmesser 287 mm, Kapazität 12 Beutelsysteme
Programm 2: 22°C, 3530 U/min ≅ 4000 g, 10 min., Anlaufstufe 9 entspr. 1.18 min, Bremsstufe 3
Die MacoPressen wurden eingeschaltet, das Prüfgewicht nach jedem Programmwechsel (Prog. A für Vollblut, Programm C für Pool-TKs) gewogen und dokumentiert. Die Abweichungen lagen unter ±10 g von 500 g Prüfgewicht.
Nach Zentrifugenstillstand wurden die Beutel vorsichtig entnommen, ohne das Erythrozytensediment aufzuwirbeln, und mit dem Etikett vorne in die MacoPress eingehängt. Plasmabeutel wurden in die rechte Waage gehängt. SAG-M Beutel wurde an den Haken an der Presse in Augenhöhe aufgehängt. Die SAG-M-Lösung wurde durch den Filter in den Zwischenbeutel überführt, so dass die Erythrozyten beim Abpressvorgang direkt in SAG-M gelangten. Dazu wurde das am Zwischenbeutel befindliche Ventil geöffnet. Zwischen Filter und ursprünglichem SAG-M Beutel wurde dann eine Plastikklemme angelegt.
Der für das gefilterte Erythrozytenkonzentrat vorgesehene Beutel sowie der Zwischenbeutel (nun mit SAG-M gefüllt) wurden neben der MacoPress auf die externe Waage gelegt und der untere Überleitungsschlauch in die untere automatische Abklemmvorrichtung eingelegt. Der obere Überleitungsschlauch wurde in die oberen automatischen Abklemmvorrichtungen eingebracht. Die Verschlussventile zu den Transferbeuteln wurden geöffnet.
Das Erythrozytenkonzentrat wurde mit der SAG-M Lösung vorsichtig durchmischt und dicht an der Presse vom Primärbeutel abgeschweißt. Der Überleitungsschlauch zum Plasmabeutel wurde nach Sichtkontrolle der Entlüftung automatisch abgeschweißt. Gleichzeitig wurde Plasma in den oberen Beutel abgepresst.
Im Primärbeutel verblieb der sog. Buffy-Coat. Dieser enthält neben Leukozyten über 90% der gespendeten Thrombozyten. Der Buffy-Coat diente als Zwischenprodukt bei der Herstellung von gepoolten Thrombozytenkonzentraten.
4. Herstellung einer ersten gepoolten Thrombozytenpräparation
Buffy coats wurden mindestens 6 Stunden bei 22 ± 2°C zwischengelagert. Die Herstellung der Thrombozyten sollte aber spätestens 24 Std. nach Vollblutentnahme abgeschlossen sein.
4.1 Poolen von Buffy coats
Aus mindestens 4 blutgruppengleichen Buffy coats (BC) und einer Einheit Plasma- oder Elektrolyt-Lösung je 4 Buffy coats entstand ein Buffy coat-Pool. Es wurden Poole von 4 BC, sortiert nach Rh-Faktor verwendet.
Hinsichtlich AB0-Blutgruppe und RH-Faktor wurden folgende Regeln definiert:

a. AB0-Gleichheit, die Blutgruppe des ersten Produktes wird als Basis für den Vergleich herangezogen, Produkte mit einer abweichenden AB0-Blutgruppe werden abgewiesen.
b. RH-Faktor-Prüfung, das Endprodukt ist RH-pos, wenn mindestens eines der Produkte RH-pos. ist. Das Endprodukt ist RH-neg, wenn alle Produkte RH-neg. sind.

Die vier BC und das Plasma wurden mit dem Sterilschweißgerät, z.B. mit dem OptiPure PS verbunden. Hierbei waren die am Sterilschweißgerät vorhandenen Markierungen zu beachten. Das Plasma wurde so an ein Pooling-Set, in diesem Fall das OptiPure-System (OptiPure PLT BC Pooling-Set zur Herstellung eines Thrombozytenkonzentrates, mit integriertem PLX5 Leukozytendepletionsfilter, Lagerungsbeutel 1000, Kunststoff PL2410 – PL1813/1, Baxter, München) angeschweißt, dass der Schlauch zwischen Plasma und OptiPure möglichst lang wurde.
Die Schlauchschweißverbindungen wurden auf Unversehrtheit geprüft, z.B. durch Rollen auf saugfähiger Unterlage.
Die BC wurden an einem Infusionsständer aufgehängt und das Plasma an einem anderen, ca. 20 cm höher als die BC. Die untere Robertsklemme (zum Verschließen der Verbindung zwischen Buffy Coats/Plasma und dem Poolingbeutel) und obere Robertsklemme (zum Verschließen der Verbindung zwischen Plasma und dem Poolingbeutel, oberhalb der unteren Klemme), sowie die Schiebeklemme und die Rollenklemme zum Probenentnahmebeutel, wurden geschlossen. Danach wurde die Verbindung zwischen BC und Optidoc bzw. Plasma und Optidoc durch seitlichen Druck auf die Schweißnähte an den Verbindungsstellen geöffnet. Durch Öffnen der unteren Robertsklemme wurden die BC in den Poolingbeutel entleert.
Die untere Klemme wurde geschlossen und die oberen Klemme geöffnet, bis ca. 1/3 des Plasmas in die BC-Beutel geflossen war. Danach wurde die obere Klemme wieder geschlossen. Die BC-Beutel wurden vorsichtig geschwenkt und das BC von einem Beutel in den anderen fließen gelassen, um möglichst alle Thrombozyten aus den BC-Beuteln zu spülen. Durch Öffnen der unteren Klemme wurde der Inhalt der BC-Beutel in den Pooling-Beutel entleert.
Dieser Vorgang wurde noch zweimal wiederholt, bis ca. 230 g Plasma (vorher abwiegen, abschätzen) und der BC im Pooling-Beutel waren.
Der Pooling-Beutel wurde vom OptiPure-System zwischen der unteren Robertsklemme und dem Poolingbeutel und abgeschweißt.
4.2 Thrombocytenpräparation
Der Pooling-Beutel wurde mittels Beutelaufhänger in den Zentrifugeneinsatz gehängt, ein Leerbeutel in den anderen Zentrifugeneinsatz.
Jeweils zwei so bestückte Zentrifugeneinsätze wurden mittels der Waage und PVC-Gewichten austariert und gegenüber in die Zentrifuge „Roto Silenta RP" gestellt. Der volle Beutel kam nach außen.
Es folgte eine Zentrifugation (Programm 4: 450 g, Anlauf 720s, Plateau 6 min, Auslauf 8 min, Bremse 0, Temperatur 22°C). Die Zentrifugeneinsätze wurden anschließend vorsichtig entnommen, so dass die Thrombozyten nicht aufgewirbelt wurden.
Es folgte Einhängen in den Separator, z.B. MacoPress. Der TK Pool Beutel wurde auf die MacoPress gelegt und die Schläuche in die Schlauchklemmen der Optipress eingelegt. Die Rollenklemme und die Schiebeklemme zum Probenentnahmebeutel wurden geschlossen. Die Separation erfolgte mit Programm C, der Vorgang wurde mit <Start> begonnen, danach vorsichtig die Rollenklemme geöffnet, bis das TK in den Beutel strömte. Die Klemme schloß automatisch bei Erreichen der Erythrozytengrenzschicht. Mittels <SEAL> wurde der Vorgang beendet, der Thrombozytenkonzentrat-Pool wurde automatisch vom Poolingbeutel abgeschweißt.
5. Vereinigung von Thombozyten-Pools
4–6 TK Pools wurden nun in einen TK Pool Beutel zusammengeführt, wobei das für die Vereinigung von Buffy Coats beschriebene Verfahren (siehe 4.1) genutzt wurde. Hierbei wurden die TK über einen Leukozytenfilter gepresst.
6. Untersuchung des Thrombozyten-Pools
Aus dem prozessierten TK Pool Beutel wurde eine kleine Probe in einen Probenbeutel abgepresst. Dann wurden über eine Schlauchspinne, wie oben beschrieben, mehrere Lagerbeutel angeschweißt.
Die Thrombozyten im Probenbeutel wurden mit einem automatischen Partikelzählgerät gezählt. Das erhaltene Pool enthielt, je nach Präparation, ca. 1,5 – 2,4·10¹² Thrombozyten.
Im TK Pool Beutel kann die Pathogeninaktivierung erfolgen. Alternativ kann diese bereits in dem Beutel erfolgen, der nur Thrombozyten aus 4 Buffy coats enthält.
In jeden TK-Lagerbeutel wurden 2.4 × 10¹¹ bis 3.0 × 10¹¹ Thrombozyten abgepresst. In einem extra Analysebeutel wurde Material für weitere Funktionsuntersuchungen und Sterilitätskontrollen abgepresst.
Die Haltbarkeit betrug bis zu 9 Tagen, ausgehend vom Entnahmetag des ältesten Buffy coats.
Figuren:
1: Herstellung von Thrombocytenkonzentrat aus Buffy coats mittels Zentrifugation
Die gepoolten, mit Plasma oder Elektrolytlösung versetzten Buffy coats werden auf Einzelblutbeutel verteilt. Diese werden so zentrifugiert, dass die Thrombozyten im Plasma-/Elektrolytüberstand verbleiben, Erythrozyten und Leukozyten sedimentieren. Dann werden die thrombozytenreichen Überstände an den Poolbeuteln über einen Leukozytenfilter in einem Sammelbeutel gepresst. In diesem Sammelbeutel können die Thrombozytenkonzentrate weiter behandelt werden, z.B. mit einem Verfahren zur Pathogeninaktivierung, oder die Thrombozyten können entsprechend den Anforderungen des Verfahrens zur Pathogeninaktivierung nochmals in andere Beutel gefüllt werden. Nach der Behandlung wird die Thrombozytenzahl im Thrombozytenpool bestimmt und dieser so auf therapeutische Einheiten aufgeteilt, dass alle Einheiten eine vorher definierte Menge Thrombozyten enthalten. Es können weiter Untersuchungen der Qualität und Funktion der Thrombozyten durchgeführt werden.
bc: Buffy coat, TK: Thrombozytenkonzentrat, QS: Qualitätssicherung, Ery: Erythrozyten, Leuko: Leukozyten
2: Herstellung von Thrombocytenkonzentrat aus Buffy coats mittels Apherese
Werden die Buffy coats über einem Zellseparator aufgetrennt, werden sie zunächst gepoolt, mit Plasma bzw. Elektrolytlösung versetzt und der beliebig große Pool dann an den Zellseparator angehängt. Im Zellseparator werden die Thrombozyten von den anderen zellulären Bestandteilen getrennt und in einem Sammelbeutel als TK (Thrombocytenkonzentrat) Pool gesammelt. Alternativ können die Buffy coats sequentiell mit einem Beutel, der Plasma/Elektrolytlösung enthält, verbunden, ausgespült und der Inhalt in einen Reservoirbeutel überführt werden, aus dem dann das Blutzellgemisch in den Zellseparator läuft. In beiden Fällen kann die gewünschte Zelldichte an Thrombozyten über die Einstellparameter des Zellseparators vorgewählt werden. Die Menge der pro Charge zu verarbeitenden Buffy coats hängt dabei nur von der Größe der Sammelbeutel ab. Das entstandene TK-Pool wird dann weiter verarbeitet, wie für die Zentrifugatonsmethode beschrieben (siehe z.B. 1), wobei in der Abbildung beispielhaft nur zwei therapeutische Einheiten Thrombozytenkonzentrat dargestellt sind, bevorzugt aber mehr als zwei Einheiten erhalten werden.
bc: Buffy coat, TK: Thrombozytenkonzentrat, QS: Qualitätssicherung, Ery: Erythrozyten, Leuko: Leukozyten

Claims

Verfahren zur Herstellung eines standardisierten Thrombozytenkonzentrats aus Spendermaterial, Schritte umfassend, bei denen man: a) Thrombozyten enthaltendes Spendermaterial einer Mehrzahl von Spendern mit Hilfe eines Zellseparationsverfahrens auftrennt, b) die thrombozytenreiche Fraktion sammelt, c) die thrombozytenreiche Fraktion untersucht und/oder standardisiert, d) die thrombozytenreiche Fraktion in mehrere standardisierte Einheiten Thrombozytenkonzentrat aufteilt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem alle Einheiten des standardisierten Thrombozytenkonzentrats in Schritt d therapeutische Einheiten sind, die mindestens 2,0·10¹¹ Thrombozyten umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die thrombozytenreiche Fraktion in Schritt c mindestens 4,0·10¹¹ Thrombozyten umfasst.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, bei dem man vor der Untersuchung und Standardisierung in Schritt c eine Mehrzahl von in Schritt b erhaltenen thrombozytenreichen Fraktionen vereinigt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, bei dem man in Schritt a Spendermaterial von mindestens 8 Spendern gemeinsam auftrennt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, bei dem das Spendermaterial ein Buffy coat ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, bei dem man die Auftrennung mit einem Apheresegerät durchführt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, bei dem die Untersuchung und/oder Standardisierung mindestens einen Schritt umfasst, ausgewählt aus den folgenden Schritten, bei denen man: – die Thrombozytendichte des Thrombozytenkonzentrats einstellt, – das Thrombozytenkonzentrat hinsichtlich der Anwesenheit von Pathogenen untersucht, – Pathogene im Thrombozytenkonzentrat inaktiviert, – die Menge an Antikörpern gegen Blutgruppenbestandteile untersucht, – die Verunreinigung des Konzentrats mit Erythrozyten und Leukozyten untersucht, – die Thrombozytenfunktion untersucht.
Mehrzahl an standardisierten Thrombozytenkonzentraten, die jeweils mindestens 2,0·10¹¹ Thrombozyten umfassen, erhältlich durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8.
Thrombozytenkonzentrate nach Anspruch 9, bei dem eine Mehrzahl mindestens 4 standardisierte Thrombozytenkonzentrate umfasst.
Thrombozytenkonzentrate nach Anspruch 9 oder 10, die als pathogenfrei einzustufen sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Thrombozytenkonzentrate nach den Ansprüchen 9 bis 11.
Verwendung von Thrombozytenkonzentraten nach den Ansprüchen 9 bis 12 zur Behandlung von Gerinnungsstörungen, die auf einen verminderten Thrombozytengehalt im Blut zurückzuführen sind.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Gerinnungsstörungen durch Leukämien, Knochenmarkskarzinosen, Zytostatikatherapie, Verlust oder Verbrauch bei großen Operationen, Gewebsverletzungen und/oder schweren Infektionen hervorgerufen sind.