DE102006041493A1 - Process for the stereoselective hydroxylation of alkylaromatics - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen, stereoselektiven Hydroxylierung von Alkylaromaten zu aromatisch substituierten Alkanolen durch Umsetzung von Alkylaromaten mit einer Agrocybe-aegerita-Peroxidase (AaP) in Gegenwart mindestens eines Oxidationsmittels in einem Einstufen-Reaktionsverfahren. Die erfindungsgemäße Reaktion verläuft stark stereoselektiv, so dass Enantiomerenreinheiten von mehr als 95% ee erreicht werden. Das Verfahren kann in verschiedensten Bereichen der Synthesechemie eingesetzt werden, u.a. zur Herstellung von Pharmaka und deren Vorstufen sowie von Aromastoffen.The invention relates to a process for the enzymatic, stereoselective hydroxylation of alkylaromatics to aromatically substituted alkanols by reacting alkylaromatics with an agrocyte aegerita peroxidase (AaP) in the presence of at least one oxidizing agent in a one-step reaction process. The reaction of the invention is highly stereoselective, so that enantiomeric purities of more than 95% ee are achieved. The process can be used in various fields of synthetic chemistry, i.a. for the production of pharmaceuticals and their precursors as well as flavorings.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Hydroxylierung von Alkylaromaten, zu den entsprechenden aromatisch substituierten chiralen Alkanolen.The The invention relates to a method for enzymatic hydroxylation of alkylaromatics, to the corresponding aromatically substituted chiral alkanols.

Es ist allgemein bekannt, dass eine direkte stereoselektive Einführung von Sauerstoff-Funktionen (Oxygenierung) in organische Moleküle ein Problem in der chemischen Synthese darstellt. Chemische Hydroxylierungsreaktionen beruhen zumeist darauf, dass in Gegenwart von Elektronendonatoren und molekularem Sauerstoff (O2) durch einen Katalysator eine reaktive Sauerstoffspezies generiert wird, welche die C-H-Bindung am α-Kohlenstoffatom angreift. Diese hoch reaktiven Sauerstoffspezies sind nur wenig regio- und nicht stereoselektiv. Aus diesem Grund sind die Ausbeuten bei chemischen Hydroxylierungen, insbesondere bei der Synthese chiraler, d.h. enantiomerenreiner Produkte relativ gering ( Campestrini & Tonellato, 2005, Selective Catalytic Oxidations in Supercritical Carbon Dioxide. Current Organic Chemistry 9: 31–47 ; Warner et al., 2004, Green Chemistry. Environmental Impact Assessment Review 24: 775–799 ; Krause, N., 1995, Metallorganische Chemie. Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin Oxford ).It is well known that a direct stereoselective introduction of oxygen functions (oxygenation) into organic molecules is a problem in chemical synthesis. Chemical hydroxylation reactions are usually based on the fact that in the presence of electron donors and molecular oxygen (O 2 ) by a catalyst, a reactive oxygen species is generated, which attacks the CH bond at the α-carbon atom. These highly reactive oxygen species are only slightly regio- and not stereoselective. For this reason, the yields in chemical hydroxylations, in particular in the synthesis of chiral, ie enantiomerically pure products are relatively low ( Campestrini & Tonellato, 2005, Selective Catalytic Oxidations in Supercritical Carbon Dioxide. Current Organic Chemistry 9: 31-47 ; Warner et al., 2004, Green Chemistry. Environmental Impact Assessment Review 24: 775-799 ; Krause, N., 1995, Organometallic Chemistry. Spektrum Academic Publishing Heidelberg, Berlin Oxford ).

Andere Wege der chemischen Hydroxylierung erfordern aufwändige, mehrstufige Reaktionsschritte. Für die Gewinnung enantiomerenreiner Produkte ((R)- oder (S)-) sind zudem aufwändige Isolierungs- und Reinigungsschritte nach der eigentlichen Reaktion notwendig. Die Reinheit von Enantiomeren ist vor allem in der Pharmazeutischen Industrie eine Grundvoraussetzung für die Wirksamkeit von Medikamenten und die Vermeidung von Nebenwirkungen ( Mitsudome et al., 2005, Liquid-phase Epoxidation of Alkenes Using Molecular Oxygen Catalyzed by Vanadium Cation-exchanged Montmorillonite. Chemistry Letters 34: 1626–1631 ; Festel et al., 2004, Einfluss der Biotechnologieauf Produktionsverfahren in der Chemieindustrie. Chemie Ingenieur Technik 76: 307–312 ; Breuer et al., 2004, Industrielle Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Zwischenprodukte. Angewandte Chemie 116: 806–843 ).Other routes of chemical hydroxylation require elaborate, multi-step reaction steps. For the recovery of enantiomerically pure products ((R) - or (S) -) also elaborate isolation and purification steps after the actual reaction are necessary. The purity of enantiomers, especially in the pharmaceutical industry, is a prerequisite for the effectiveness of drugs and the prevention of side effects ( Mitsudome et al., 2005, Liquid-phase Epoxidation of Alkenes Using Molecular Oxygen Catalyzed by Vanadium Cation-exchanged montmorillonites. Chemistry Letters 34: 1626-1631 ; Festel et al., 2004, Biotechnological influence on production processes in the chemical industry. Chemical Engineer Technology 76: 307-312 ; Breuer et al., 2004, Industrial Processes for the Preparation of Optically Active Intermediates. Angewandte Chemie 116: 806-843 ).

Außerdem ist bekannt, dass einzelne Hydroxylgruppen enzymatisch und stereoselektiv mit Hilfe von Monooxygenasen (E.C. 1.14.) in Kohlenwasserstoffe eingeführt werden können. Aktuell- sind mehr als 100 solcher Enzyme bekannt, die jedoch nur zu einem geringen Teil stereoselektiv agieren. Es handelt sich dabei ausschließlich um intrazelluläre Enzyme, die NAD(P)H oder andere komplexe Elektronendonatoren, Hilfsproteine (Flavinreduktasen, Fer-ridoxine) sowie molekularen Sauerstoff als Cofaktoren benötigen ( Buchholz et al., 2005, Biocatalysts and Enzyme Technology. Wiley-VCH, Weinheim ; Aehle (Ed.), 2004, Enzymes in Industry. Wiley-VCH, Weinheim ; Holland, 1998, Hydroxylation and Dihydroxylation. In: Biotechnology. Vol. 8a: Biotransformations I, Wiley-VCH, Weinheim ).In addition, it is known that individual hydroxyl groups can be introduced into hydrocarbons enzymatically and stereoselectively with the aid of monooxygenases (EC 1.14.). Currently, more than 100 such enzymes are known, but only to a small extent act stereoselectively. These are exclusively intracellular enzymes which require NAD (P) H or other complex electron donors, auxiliary proteins (flavin reductases, ferridoxins) as well as molecular oxygen as cofactors ( Buchholz et al., 2005, Biocatalysts and Enzyme Technology. Wiley-VCH, Weinheim ; Aehle (Ed.), 2004, Enzymes in Industry. Wiley-VCH, Weinheim ; Holland, 1998, Hydroxylation and Dihydroxylation. In: Biotechnology. Vol 8a: Biotransformations I, Wiley-VCH, Weinheim ).

Als besonders vielseitige Biokatalysatoren sind die Cytochrom-P450-abhängigen Monooxygenasen bekannt, die in nahezu allen Organismen vorkommen. Sie sind u.a. an der Entgiftung von toxischen Verbindungen in der menschlichen Leber oder an der Synthese von Sekundärmetaboliten beteiligt (z.B. Steroide, die als Membranbestandteile, Vitamine, Hormone, Gallensäuren oder herzaktive Alkaloide fungieren). Derzeit ist die Nutzung dieser Enzyme jedoch noch stark eingeschränkt, da sie schwierig zu isolieren, wenig stabil und die benötigten Kosubstrate z. T. teuer sind. Aus diesem Grund versucht man mittels gezielter gerichteter Evolution bekannte P450 Enzyme (z.B. P450cam) so zu verändern, dass sie anstatt der komplexen Kosubstrate einfache Peroxide nutzen ( Roberts, 1999, The power of evolution: accessing the synthetic potential of P450s. Chemistry & Biology 6: R269–R272 ). Die auf diesem Weg erzeugten Enzyme weisen allerdings noch nicht die gewünschte Effizienz und Stabilität für chemische Synthesen auf.Particularly versatile biocatalysts are the cytochrome P450-dependent monooxygenases, which are found in almost all organisms. They are involved, among others, in the detoxification of toxic compounds in the human liver or in the synthesis of secondary metabolites (eg, steroids that function as membrane components, vitamins, hormones, bile acids, or cardiac active alkaloids). Currently, however, the use of these enzymes is still severely limited because they are difficult to isolate, less stable and the required Kosubstrate z. T. are expensive. For this reason, it is attempted to modify known P450 enzymes (eg P450 cam ) by means of targeted directed evolution in such a way that they use simple peroxides instead of the complex cosubstrates ( Roberts, 1999, The power of evolution: accessing the synthetic potential of P450s. Chemistry & Biology 6: R269-R272 ). However, the enzymes generated in this way do not yet have the desired efficiency and stability for chemical syntheses.

Die Ganzzellkatalyse verwendet anstelle der isolierten hydroxylierenden Enzyme ganze Organismen (Bakterien, Hefen, Schimmelpilze). Auf diese Weise ist es möglich, im Sinne von Biotransformationen eine Reihe von Substraten zu hydroxylieren. Beispiele sind die Nikotinsäurehydroxylierung durch Achromobacter xylosooxidans, die Hydroxylierung von Biphenylderivaten durch E. coli oder die Steroidtransformation mit Hilfe von Schimmelpilzen der Gattung Rhizopus ( Liese et al., 2000, Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim ). Nachteile der Katalyse mit ganzen Zellen bestehen in den zeit- und kostenintensiven Fermentationen, der möglichen Degeneration der Produktionsstämme und der komplizierten Aufarbeitung der komplexen Fermentationsbrühen.Whole cell catalysis uses whole organisms (bacteria, yeasts, molds) instead of isolated hydroxylating enzymes. In this way it is possible to hydroxylate a number of substrates in the sense of biotransformations. Examples are the nicotinic acid hydroxylation by Achromobacter xylosooxidans, the hydroxylation of biphenyl derivatives by E. coli or the steroid transformation with the aid of molds of the genus Rhizopus ( Liese et al., 2000, Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim ). Disadvantages of catalysis with whole cells consist in the time-consuming and costly fermentations, the possible degeneration of the production strains and the complicated work-up of the complex fermentation broths.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Prozess zur Darstellung von chiralen Alkoholen aus den entsprechenden Vorstufen mit möglichst geringem verfahrenstechnischen und apparativem Aufwand bei gleichzeitigem Einsatz kostengünstiger Cosubstrate durchzuführen. Die Umsetzung der Ausgangsverbindungen soll in möglichst kurzen Inkubationszeiten ohne erhöhte Anforderungen an sterile bzw. semisterile Reaktionsbedingungen erfolgen. Die Reaktionsprodukte sind dabei mit möglichst geringem Aufwand zu isolieren und eine aufwändige Enantiomerentrennung soll entfallen.The The object of the present invention is to provide a process for presentation of chiral alcohols from the corresponding precursors with as possible low procedural and equipment expense while Use cheaper Perform cosubstrates. The reaction of the starting compounds should be done in the shortest possible incubation times without increased Requirements for sterile or semisterile reaction conditions take place. The Reaction products are with the least possible effort too isolate and a complex separation of enantiomers should be omitted.

Das vorliegende Verfahren löst diese Aufgabe und betrifft ein Verfahren zur enzymatischen, stereoselektiven Hydroxylierung von Alkylaromaten zu chiralen aromatisch substituierten Alkanolen durch Umsetzung von Alkylaromaten mit einer Agrocybe-aegerita-Peroxidase (AaP) in Gegenwart mindestens eines Oxidationsmittels in einem Einstufen-Reaktionsverfahren.The present process solves this problem and relates to a process for the enzymatic, stereoselective hydroxylation of alkylaromatics chiral aromatic-substituted alkanols by reacting alkylaromatics with an agrocyte aegerita peroxidase (AaP) in the presence of at least one oxidizing agent in a one-step reaction process.

Die Ausgangsverbindungen (Alkylaromaten) werden dabei mit dem Agrocybe-aegerita-Peroxidase (AaP) bezeichneten Enzym, das eine besonders hohe Peroxygenaseaktivität besitzt, und zumindest eines Oxidationsmittels, zur Reaktion gebracht, wobei die stereoselektive Oxygenierung bestimmter C-H-Bindungen erfolgt.The Starting compounds (alkylaromatics) are mixed with Agrocybe aegerita peroxidase (AaP) designated enzyme which has a particularly high peroxygenase activity, and at least one oxidizing agent, wherein the stereoselective oxygenation of certain C-H bonds takes place.

Als Oxidationsmittel werden erfindungsgemäß vorzugsweise H2O2, organische Peroxide oder Hydroperoxide, wie z.B. tert.-Butylhydroperoxid, Luft oder Sauerstoff verwendet. Auf teure Elektronendonatoren, wie z.B. NAD(P)H kann bei dem vorliegenden Verfahren verzichtet werden (Konzentration des Oxidationsmittel: von 0,01 bis 10 mmol/L, bevorzugt 0,1 bis 2 mmol/L H2O2).As the oxidizing agent according to the invention preferably H 2 O 2 , organic peroxides or hydroperoxides, such as tert-butyl hydroperoxide, air or oxygen used. Expensive electron donors, such as NAD (P) H can be dispensed with in the present process (concentration of the oxidizing agent: from 0.01 to 10 mmol / L, preferably 0.1 to 2 mmol / LH 2 O 2 ).

Dem Reaktionsgemisch können zur weiteren Beschleunigung der Umsetzung der Ausgangsverbindung mit dem AaP-Enzym zusätzlich H2O2-generierende Enzyme, insbesondere Oxidasen, wie z.B. Glucose-Oxidase oder Arylalkohol-Oxidase sowie deren Substrate, z. B. Glucose oder Benzylalkohol, zugesetzt werden.The reaction mixture can additionally accelerate the reaction of the starting compound with the AaP enzyme H 2 O 2 -generating enzymes, in particular oxidases such as glucose oxidase or aryl alcohol oxidase and their substrates, eg. As glucose or benzyl alcohol may be added.

Die Grundlage des erfindungsgemäßen enzymatischen, zellfreien Verfahrens ist eine neuartige extrazelluläre Haloperoxidase, die über P450-ähnliche Katalyseeigenschaften verfügt und in Gegenwart eines geeigneten Oxidationsmittels (z.B. Peroxiden), insbesondere in gepufferten wässrigen Lösungen aliphatische Seitenketten von aromatischen Verbindungen (z.B. Ethylbenzol) zu den entsprechenden chiralen 1-Phenylalkanolen oxidiert, und dabei eine hohe Enantiomerenreinheit erreicht (> 95% ee).The Basis of the enzymatic, cell-free method is a novel extracellular haloperoxidase, the above P450-like Katalyseeigenschaften features and in the presence of a suitable oxidizing agent (e.g., peroxides), especially in buffered aqueous solutions aliphatic side chains of aromatic compounds (e.g., ethylbenzene) oxidized to the corresponding chiral 1-phenylalkanols, and thereby achieved a high enantiomeric purity (> 95% ee).

Bei dem eingesetzten Enzym handelt es sich um eine besondere Haloperoxidase mit Peroxygenasefunktion. Es wird von Basidiomyceten der Familien Bolbitiaceae (z.B. Agrocybe spp.) und Coprinaceae (z.B. Coprinus spp.) gebildet und zeichnet sich durch besondere katalytische Eigenschaften aus, die es von bisher beschriebenen Peroxidasen und Cytochrom-P450-Enzymen deutlich unterscheidet. Die Enzymherstellung erfolgt in Flüssigkultur, vorzugsweise in Bioreaktoren und stickstoffreichen Medien ( R. Ullrich, 2005, Dissertation, IHI Zittau ; M. Kluge, 2006, Diplomarbeit, IHI Zittau ).The enzyme used is a special haloperoxidase with peroxygenase function. It is formed by basidiomycetes of the families Bolbitiaceae (eg Agrocybe spp.) And Coprinaceae (eg Coprinus spp.) And is characterized by particular catalytic properties, which clearly distinguishes it from previously described peroxidases and cytochrome P450 enzymes. Enzyme production takes place in liquid culture, preferably in bioreactors and nitrogen-rich media ( R. Ullrich, 2005, dissertation, IHI Zittau ; M. Kluge, 2006, Diploma thesis, IHI Zittau ).

Die von dem als Agrocybe-aegerita-Peroxidase (AaP) bezeichneten Enzym katalysierten Reaktionen benötigen im Gegensatz zu chemischen Synthesen keine hochkonzentrierten aggressiven und umweltgefährdenden Reagenzien, und bei der Produktgewinnung kann auf chemikalien- und zeitintensive Reinigungsschritte zur Trennung der racemischen Gemische verzichtet werden. Üblicherweise wird das Enzym in einer Konzentration von 0,02 U/mL bis 10 U/mL AaP, insbesondere von 0,09 bis 8 U/mL AaP eingesetzt. Dies macht das dargestellte Reaktionsverfahren besonders umweltfreundlich.The from the enzyme called Agrocybe aegerita peroxidase (AaP) require catalysed reactions unlike chemical syntheses no highly concentrated aggressive and environmentally hazardous Reagents, and product recovery can be based on chemical and time-consuming purification steps to separate the racemic mixtures be waived. Usually will the enzyme in a concentration of 0.02 U / mL to 10 U / mL AaP, in particular from 0.09 to 8 U / mL AaP used. This does that illustrated reaction process particularly environmentally friendly.

Ein weiterer Vorteil gegenüber rein chemischen Synthesen besteht in der Prozessführung auf Grund der erfindungsgemäßen AaP-katalysierten Umsetzung bei Raumtemperatur und normalem Luftdruck.One another advantage over purely chemical syntheses consists in the process on the ground the AaP-catalyzed reaction of the invention at room temperature and normal air pressure.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren in wässrigen, gepufferten Lösungen durchgeführt. Dem Reaktionsgemisch können hierbei zur Stabilisierung der Reaktion im wässrigen Medium Puffer auf Basis organischer Säuren, vorzugsweise Zitronensäure, sowie Phosphate, vorzugsweise Kaliumhydrogenphosphate, zugesetzt werden (Pufferkonzentration 5 mmol/L bis 500 mmol/L, bevorzugt 20–100 mmol/L). Darüber hinaus ist es möglich, die Reaktion im pH-Staten ohne Puffer unter kontinuierlicher Zudosierung von Säuren/Basen durchzuführen.In a preferred embodiment if the process is carried out in aqueous, buffered solutions performed. the Reaction mixture can in order to stabilize the reaction in an aqueous medium buffer based organic acids, preferably citric acid, and phosphates, preferably potassium hydrogen phosphates, are added (buffer concentration 5 mmol / L to 500 mmol / L, preferably 20-100 mmol / L). Furthermore Is it possible, the reaction in pH-Staten without buffer under continuous addition of acids / bases.

Zur Verbesserung der Löslichkeit können dem Reaktionsgemisch organische Lösungsmittel zugesetzt werden. Erfindungsgemäß einsetzbare Lösungsmittel sind z.B. erotische Lösungsmittel, wie z.B. Ether (u.a. Diisopropylether), Methanol, Aceton, Acetonitril, DMF (N,N-Dimethylformamid) oder DMSO (Dimethylsulfoxid). Als Ausgangsverbindungen der Formel (I) werden insbesondere Verbindungen aus folgenden Gruppen eingesetzt: Alkylbenzole und am Aromaten (Ar) substituierte Alkylbenzole (R1-Ar-R2; R1 = X, NO2, NH2, OH; R2 = Alkyl-, insbesondere Ethyl-Substituent).To improve the solubility, organic solvents may be added to the reaction mixture. Solvents which can be used according to the invention are, for example, erotic solvents, for example ethers (inter alia diisopropyl ether), methanol, acetone, acetonitrile, DMF (N, N-dimethylformamide) or DMSO (dimethyl sulfoxide). The starting compounds of the formula (I) used are, in particular, compounds from the following groups: alkylbenzenes and aromatic (Ar) -substituted alkylbenzenes (R 1 -Ar-R 2 ; R 1 = X, NO 2 , NH 2 , OH; R 2 = alkyl -, In particular ethyl substituent).

Die Reaktion wird in einem Bereich von 5 bis 60°C, vorzugsweise bei 20 bis 30°C durchgeführt. Die Reaktionszeiten liegen üblicherweise im Bereich von 1 bis 90 Minuten, insbesondere im Bereich von 5 bis 30 Minuten.The Reaction is carried out in a range of 5 to 60 ° C, preferably at 20 to 30 ° C. The Reaction times are usually in the range of 1 to 90 minutes, especially in the range of 5 to 30 minutes.

Die erzielten ee-Werte liegen im Bereich von 80 bis 99,9%, vorzugsweise größer als 95% ee; die Ausbeuten liegen zwischen 30 und 90%.The achieved ee values are in the range of 80 to 99.9%, preferably greater than 95% ee; the yields are between 30 and 90%.

Die Vorteile der AaP-katalysierten Umsetzungen gegenüber Katalysen mit herkömmlichen Cytochrom-P450-Enzymen (Monooxygenasen) bestehen:

  • i) in der hohen erreichbaren Enantiomerenreinheit der Reaktionsprodukte,
  • ii) im Einsatz preiswerter Peroxide anstelle teurer Elektronendonatoren [NAD(P)H],
  • iii) in der Unabhängigkeit des hydroxylierenden Enzyms von Flavin-Reduktasen und Elektronentransportproteinen (Ferridoxine),
  • iv) in der einfachen Enzymgewinnung und
  • v) in der hohen Stabilität der extrazellulärer Enzyme im Vergleich zu den instabilen intrazellulärer und oftmals membrangebundenen P450-Enzyme.
The advantages of AaP-catalyzed reactions to catalysis with conventional cytochrome P450 enzymes (monooxygenases) are:
  • i) in the high achievable enantiomeric purity of the reaction products,
  • ii) the use of inexpensive peroxides instead of expensive electron donors [NAD (P) H],
  • iii) the independence of the hydroxylating enzyme from flavin reductases and electrons transport proteins (ferridoxins),
  • iv) in simple enzyme recovery and
  • v) the high stability of the extracellular enzymes compared to the unstable intracellular and often membrane bound P450 enzymes.

Vorteile der AaP gegenüber herkömmlichen Peroxidasen (u.a. Chlorperoxidase, Meerrettich-Peroxidase, Lignin-Peroxidase) sind:

  • i) ein breiteres Substratspektrum,
  • ii) eine stärker ausgeprägte Peroxygenase-Aktivität,
  • iii) eine insgesamt höhere Stabilität.
Advantages of AaP over conventional peroxidases (including chloroperoxidase, horseradish peroxidase, lignin peroxidase) are:
  • i) a broader substrate spectrum,
  • ii) a more pronounced peroxygenase activity,
  • iii) an overall higher stability.

Mit den AaP-katalysierten Reaktionen ist es erstmals möglich, Alkylaromaten mit Hilfe eines einzelnen extrazellulären Biokatalysators, welcher lediglich ein Peroxid als Cosubstrat benötigt in einem einstufigen Prozess stereoselektiv zu chiralen aromatisch substituierten Alkanolen, wie z.B. (R)-1-Phenylethanol) zu oxidieren.With The AaP-catalyzed reactions make it possible for the first time, alkyl aromatics with the help of a single extracellular biocatalyst, which only a peroxide as Cosubstrat needed in a one-step process stereoselective to chiral aromatic substituted alkanols, such as. (R) -1-phenylethanol).

Das Verfahren kann in verschiedensten Bereichen der Synthesechemie eingesetzt werden, u.a. zur Herstellung von chiralen Pharmazeutika und deren Vorstufen, Aromastoffen und Ausgangsstoffen für nachfolgende chemische Synthesen.The Process can be used in various fields of synthetic chemistry be, u.a. for the preparation of chiral pharmaceuticals and their Precursors, flavorings and precursors for subsequent chemical syntheses.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von dem in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiel näher erläutert werden, wobei die Erfindung nicht auf die Beispiele beschränkt ist.The Invention will be described below with reference to the one shown in the drawing embodiment be explained in more detail, the invention is not limited to the examples.

Beispiele:Examples:

Es zeigen:It demonstrate:

1: Allgemeines Schema 1 : General scheme

2: Formelschema gemäß Ausführungsbeispiel 2 : Formula scheme according to the embodiment

Ausführungsbeispiel:Embodiment:

50 μmol Ethylbenzen wurden in wässriger Kaliumphosphat-Pufferlösung (20 mM, pH = 7.0) suspendiert und zusammen mit 250 μmol H2O2 (5 × je 50 μM im Abstand von je 5 min zugegeben) und 5 U Agrocybe-aegerita-Peroxidase ( Unit bezogen auf die Oxidation von Veratrylalkohol zu Veratrylaldehyd; Ullrich et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 4575–81 ) in einem Gesamtvolumen von 50 ml bei 24 °C in einem verschlossenen Glasgefäß gerührt. Die Reaktionszeit betrug insgesamt 30 min. Das Enantiomerenverhältnis wurde anschließend mittels GC unter Verwendung einer chiralen Kapillarsäule zu 98,3:1,7 von R zu S (ee = 96,6%) bei einer Ausbeute von 82% bestimmt.50 .mu.mol ethylbenzene were suspended in aqueous potassium phosphate buffer solution (20 mM, pH = 7.0) and added together with 250 .mu.mol H 2 O 2 (5 × each 50 .mu.M at 5-min intervals) and 5 U Agrocybe aegerita peroxidase ( Unit based on the oxidation of veratryl alcohol to veratryl aldehyde; Ullrich et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 4575-81 ) in a total volume of 50 ml at 24 ° C in a sealed glass vessel. The reaction time was a total of 30 min. The enantiomeric ratio was then determined by GC using a chiral capillary column to be 98.3: 1.7 from R to S (ee = 96.6%) with a yield of 82%.

Claims (10)

Verfahren zur enzymatischen, stereoselektiven Hydroxylierung von Alkylaromaten zu aromatisch substituierten chiralen Alkanolen, durch Umsetzung von Alkylaromaten mit einer Agrocybe-aegerita-Peroxidase (AaP) in Gegenwart mindestens eines Oxidationsmittels in einem Einstufen-Reaktionsverfahren.Method for enzymatic, stereoselective Hydroxylation of alkylaromatics to aromatically substituted chiral ones Alkanols, by reaction of alkylaromatics with an agrocyte aegerita peroxidase (AaP) in the presence of at least one oxidizing agent in a one-step reaction process. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkylaromat Ethylbenzol eingesetzt wird.Method according to claim 1, characterized in that that ethylbenzene is used as alkylaromat. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Peroxidase die Enzyme Agrocybe chaxingu, Coprinus radians oder Coprinus verticulatus verwendet werden.Method according to claim 1 and / or 2, characterized that as peroxidase the enzymes Agrocybe chaxingu, Coprinus radians or Coprinus verticulatus. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Peroxidase die Enzyme aus Pilzen der Familien Bolbitiaceae und Coprinaceae verwendet werden.Method according to claim 1 and / or 2, characterized that as peroxidase the enzymes from fungi of the families Bolbitiaceae and Coprinaceae. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid, organische Peroxide oder Hydroperoxide, Luft oder Sauerstoff eingesetzt werden.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that as the oxidizing agent hydrogen peroxide, organic peroxides or hydroperoxides, air or oxygen used become. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oxidationsmittel in katalytischen Mengen, vorzugsweise in Mengen von < 0,01% bezogen auf den Alkylaromat eingesetzt wird.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the oxidizing agent in catalytic Quantities, preferably in amounts of <0.01% based on the alkyl aromatic is used. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsgemisch zur weiteren Beschleunigung der Umsetzung der Ausgangsverbindung mit dem AaP-Enzym weitere H2O2-generierende Enzyme zugesetzt werden.Method according to at least one of the preceding claims, characterized in that further H 2 O 2 -generating enzymes are added to the reaction mixture to further accelerate the reaction of the starting compound with the AaP enzyme. Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsmedium zur Stabilisierung der Reaktion im wässrigen Medium Puffer auf Basis organischer Säuren oder Phosphate zugesetzt werden.Method according to at least one of the aforementioned Claims, characterized in that the reaction medium for stabilization the reaction in the aqueous Medium buffers based on organic acids or phosphates added become. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 30°C durchgeführt wird.Method according to at least one of the preceding Claims, characterized in that the reaction at a temperature in Range from 15 to 30 ° C carried out becomes. Verfahren nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Verbesserung der Substrat-Löslichkeit organische Lösungsmittel zugesetzt werden können.Method according to at least one of the aforementioned Claims, characterized in that for improving the substrate solubility organic solvents can be added.
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