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Die
Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Durchlichtuntersuchung von
Objekten mit einem Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung
und einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes,
insbesondere einer Kamera. Die Erfindung betrifft weiterhin ein
Verfahren zur Durchlichtmikroskopie von Objekten, insbesondere mit
einer vorgenannten Vorrichtung.
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Mikroskope
zur Durchlichtuntersuchung von Objekten sind im Stand der Technik
allgemein bekannt. Die Wirkungsweise eines Mikroskops beruht dabei
im Wesentlichen darauf, dass das Licht einer Beleuchtungsvorrichtung
auf ein zu betrachtendes Objekt gerichtet wird, wobei üblicherweise
zur Erhöhung
der Lichtintensität
das einfallende Licht mittels eines sogenannten Kondensors, üblicherweise
einer Linse oder Linsenanordnung, in Richtung des Objekts gebündelt wird.
Mittels eines Objektivs, welches üblicherweise ebenso aus einer
Linse oder Linsenanordnung besteht, wird aus der Ebene des Objektes ein
Abbild des Objektes projeziert, welches ein reelles Bild darstellt
und entweder unmittelbar oder nach einer weiteren Vergrößerung betrachtet
werden kann.
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Hierbei
steht für
eine weitere Vergrößerung ein
Okkular zur Verfügung,
mittels dem das reelle Bild weiter vergrößert wird, um anschließend mit
dem Auge des Betrachters oder mittels einer Kamera erfasst zu werden.
Wesentlich für
eine gute Abbildungsqualität
ist es, dass ein Objekt einen ausreichenden Kontrast in dieser Durchlichtuntersuchung erzeugt.
Hierbei wird als Kontrast das Verhältnis der Intensitäten des
Lichtes, welches das Objekt durchleuchtet und des Umgebungslichtes
verstanden.
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Üblicherweise
wird dabei in Mikroskopen eine Amplitudenänderung des Lichtes aufgrund
der durch das Objekt reduzierten Transmission durch das Objekt ausgewertet.
Hierbei ergibt sich jedoch das Problem, dass gerade kleine transparente
Strukturen, wie sie z.B. bei lebenden Zellen auftreten, nur mit
großer
Schwierigkeit mikroskopisch beobachtet und untersucht werden können, da
derartige lebende Zellen aufgrund ihrer hohen Transparenz oftmals
nur einen ungenügenden
Amplitudenkontrast erzeugen.
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Es
ist daher im Stand der Technik weiterhin bekannt, zu untersuchende
Objekte, also beispielsweise lebende Zellen, mittels Farbstoffen,
insbesondere Fluoreszenzfarbstoffen, zu präparieren und sodann die Farbstoffe
mittels daran angepassten Lichtwellenlängen anzuregen und das Fluoreszenzlicht auszuwerten.
Dies führt
jedoch gerade bei lebenden Zellen zu der Problematik, dass eine
Fluoreszenzfärbung
biochemische Abläufe
in den Zellen empfindlich stören
kann und oftmals die untersuchten Zellen frühzeitig absterben. Auch ist
der Informationsgehalt in den so erhaltenen Bildern begrenzt, da
die Färbung oftmals
nur gezielte einzelne Strukturen sichtbar machen kann. Wegen der
Lebensdauer des Farbstoffes zum einen und der mitunter begrenzten
Lebensdauer der präparierten
lebenden Zellen sind darüber
hinaus Langzeitbeobachtungen derart präparierter Zellen kaum möglich.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, ein Mikroskop für Durchlichtuntersuchungen
sowie auch ein Verfahren zur Mikroskopie zur Verfügung zu
stellen, mittels dem die vorgenannten Nachteile überwunden werden und welches
die Grenzen bei der Beobachtung hochtransparenter Objekte, insbesondere
von lebenden Zellen, verbessert. Es ist dabei weiterhin Aufgabe
der Erfindung, mittels eines möglichst
geringen Aufwandes ein Maximum an Informationen aus einem untersuchten
Objekt herauszuholen, lebende Zellen direkt zu untersuchen, ohne
einen Einfluss auf die Lebensprozesse der Zellen zu nehmen und insbesondere
auch Langzeituntersuchungen zu ermöglichen.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch ein Mikroskop zur Durchlichtuntersuchung gelöst, welches
einen Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und einer
Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes, insbesondere
eine Kamera aufweist, wobei im Strahlengang ein Interferometer angeordnet
ist, welches Mittel zur Veränderung
der Polarisation und davon unabhängige Mittel
zur Veränderung
der relativen Phase in wenigstens einem der Teilstrahlen des Interferometers
aufweist.
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Die
Aufgabe wird weiterhin durch ein Verfahren zur Durchlichtmikroskopie
von Objekten gelöst, bei
dem der Strahlengang zwischen einer Beleuchtungsvorrichtung und
einer Vorrichtung zur Betrachtung/Erfassung eines Objektbildes durch
ein Interferometer führt
und wobei wenigstens ein Abbild eines Objektes, insbesondere eine
Serie von Abbildern, mittels einer Kamera aufgenommen wird, insbesondere
in Abhängigkeit
von einer Lage der Polarisation und/oder der Phase des Lichtes in
wenigstens einem der Teilstrahlen des Interferometers.
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Hierbei
können
für die
Erfindung im Wesentlichen jegliche Art von Interferometer zum Einsatz kommen.
Unter einem Interferometer wird dabei eine Vorrichtung verstanden,
die ein von einer Beleuchtungsvorrichtung stammendes Lichtstrahlenbündel, gegebenenfalls
nach einer vorherigen Raumfilterung, aufspaltet in zwei Teilstrahlen,
die nach Durchlaufen einer vorbestimmten Wegstrecke in zwei unabhängigen Armen
des Interferometers und gegebenenfalls nach einer Beeinflussung
von Phase und Polarisation wieder in einer Vorrichtung zur Strahlenzusammenführung zu
einem Lichtstrahlenbündel
zusammengeführt
wird, in welchem aufgrund der Überlagerung
Interferenzeffekte und Polarisationseffekte sichtbar gemacht werden
können,
die auf einer unterschiedlichen Beeinflussung der Lichtstrahlen
in den beiden Teilstrahlengängen
resultieren.
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Hierbei
können
Beeinflussungen insbesondere durch Änderungen der Polarisation
und der relativen Phasenlage vorgenommen werden. Beispielsweise
kann erfindungsgemäß der Aufbau
eines sogenannten Mach-Zehnder-Interferometers verwendet werden.
Die Erfindung ist jedoch nicht auf den Einsatz einer derartigen
Interferometeranordnung beschränkt
und es kann grundsätzlich
jegliche Interferometeranordnung verwendet werden, die nach einer
Aufspaltung eines Lichtbündels
zu zwei Teilstrahlen und der Möglichkeit
der unabhängigen Manipulierung
von Phase und Polarisation die Teilstrahlen wieder zu einem Bündel zusammenführen.
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Wesentlicher
Kerngedanke der Erfindung ist es dabei, dass mittels eines erfindungsgemäßen Mikroskops
bzw. Verfahrens neben der Auswertung von Amplitudenkontrastbildern
auch die Möglichkeit
besteht, Abbilder von Objekten aufzunehmen, die abhängig sind
von einerseits der Polarisation des eingestellten Lichtes, welches
zur Beleuchtung des Objektes dient sowie auch von der Phase. Hierbei
ist es wesentlich für
die Erfindung, dass sowohl die Polarisation als auch die Phase unabhängig voneinander mittels
derselben Vorrichtung verändert
werden können,
ohne dass zwischenzeitlich ein Einfluss auf die zu untersuchende
Probe bzw. das zu untersuchende Objekt genommen werden muss. Es
besteht somit die Möglichkeit,
neben dem vorgenannten Amplitudenkontrast auch den Interferenzkontrast
sowie den Polarisationskontrast auszuwerten und insbesondere diese
beiden Kontrastarten in den Bildern zu unterscheiden.
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Dies
kann einerseits dadurch erfolgen, dass ein Betrachter die entstandenen
Bilder unmittelbar mit dem Auge wahrnimmt und auswertet oder aber bevorzugterweise,
dass die Bilder mittels eines Detektors, z.B. einer Kamera erfasst
und anschließend weiter
ausgewertet werden. Die Möglichkeit,
unterschiedliche Kontrastinformationen auszuwerten, ist insbesondere
vorteilhaft bei transparenten lebenden Zellen, da bei diesen oftmals
eine optische Aktivität vorliegt,
was bedeutet, dass derartige Objekte sowohl Polarisation als auch
phasenschiebende Wirkungen aufweisen können. Hierbei können phasenschiebende
Wirkungen z.B. durch unterschiedliche optische Dichten oder unterschiedliche
Dicken eines untersuchten Objektes entstehen, wobei beispielsweise
Veränderungen
in der Polarisation durch doppelbrechende Wirkungen von Zellstrukturen
entstehen können.
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Derartige
optisch aktive Wirkungen von Objekten können mittels üblicher
Amplitudenkontrastmikroskopie nicht ausgewertet werden, hingegen mittels
des erfindungsgemäßen Mikroskops
bzw. eines Verfahrens zur Durchführung
mikroskopischer Untersuchungen, da hierbei mittels ein- und derselben
Interferometeranordnung sowohl die Polarisation als auch die relative
Phase bei den Teilstrahlen im Interferometer unabhängig voneinander
geändert
werden können,
so dass aufgrund der unabhängigen Änderbarkeit
Rückschlüsse darauf
gezogen werden können,
ob ein auftretender Kontrast in einem beobachteten Objekt auf eine
Polarisationsdrehung oder eine Phasenverschiebung zurückgeht.
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Hierbei
wird es als besonders vorteilhaft für die Erfindung empfunden,
dass sowohl das Mikroskop als auch das erfindungsgemäße Verfahren
ohne jegliche weitere Einflussnahme auf die zu untersuchende Probe
bzw. das zu beobachtende Objekt auskommt, so dass unbeeinflusste
Untersuchungen und insbesondere auch Langzeituntersuchungen möglich sind,
ohne die untersuchte Probe in irgendeiner Art und Weise zu stören und
hierdurch gegebenenfalls sogar ein Untersuchungsergebnis zu verfälschen.
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Mittels
einer Interferometeranordnung in einem erfindungsgemäßen Mikroskop,
beispielsweise mittels eines Mach-Zehnder-Interferometers, besteht die
Möglichkeit,
deutlich höhere
Kontraste zu erwirken, als dies mit einer üblichen Amplitudenmikroskopie
möglich
ist. Dies beruht auf der Möglichkeit,
dass mittels eines Interferometeraufbaus und einer entsprechenden
Justage das erfasste Abbild derart eingestellt werden kann, dass
zunächst
durch Interferenzeffekte und/oder Polarisationseffekte das durch das
Objekt unverfälschte
beleuchtende Licht in der Bildebene einen dunklen Hintergrund ergibt
und lediglich durch phasen- oder polarisationsschiebende Effekte
des beobachteten Objektes hellere Strukturen im Abbild erscheinen,
insbesondere wobei die Helligkeit über die Stärke des Effektes gibt. Ebenso ist
eine hierzu inverse Justage möglich.
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Hierfür kann es
in einer Ausführung
vorgesehen sein, den Interferometeraufbau durch Auswahl von Polarisation
und relativer Phasenverschiebung der Teilstrahlen im Interferometer
derart zu justieren, dass in der Bildebene im Wesentlichen eine
ebene Wellenfront senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Lichtstrahlen
vorliegt, und bei den beiden überlagerten
Teilstrahlen aus den jeweiligen Interferometerarmen eine sich gegenseitig
auslöschende
Interferenz gegeben ist.
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Hierfür können die
Teilstrahlen im Interferometer bevorzugt unpolarisiert oder gleich
polarisiert eingestellt werden, z.B. durch Auswahl einer geeigneten
Beleuchtungsvorrichtung und/oder durch Auswahl polarisierend wirkender
Strahlteiler und/oder polarisationsändernder Elemente. Die effektiven
optischen Längen
der beiden Interferometerarme sind aneinander anzupassen, zumindest
bis zu einer Genauigkeit unterhalb der Kohärenzlänge der verwendeten Beleuchtungsvorrichtung.
Feineinstellungen der Phasenlage können durch wenigstens ein phasenverschiebendes
Element in wenigsten einem der Interferometerarme realisiert werden,
z.B. mittels sogenannter Keilkompensatoren. Änderungen der Interferenz durch
ein Objekt lassen sodann Rückschlüsse zu auf
phasenverschiebende Wirkungen des Objektes bzw. von Objektbereichen.
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Es
kann weiterhin vorgesehen sein, dass das Licht nach dem Interferometer
durch entsprechende Einstellung des Interferometers, d.h. durch
Beeinflussung der Polarisation und der relativen Phase des Lichtes
in den beiden Teilstrahlengängen
derart eingestellt wird, dass die Polarisation eine definierte gewünschte Lage
einnimmt, z.B. zirkular oder linear ist. Es kann sodann vor einer
beobachtenden Kamera oder vor dem Auge des Betrachters eine Anordnung positioniert
werden, die dieses Licht filtert, d.h. vollständig abblockt, so dass ohne
die Einfügung
eines Objektes in das Mikroskop ein vollständig dunkles Abbild entsteht.
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Erst
durch die Einführung
eines Objektes erfolgt aufgrund polarisations- und/oder phasenverschiebender
Effekte eine über
den Querschnitt des Objektes abhängige
unterschiedliche Änderung
der zirkularen Polarisation in eine von der eingestellten Polarisation
abweichende Polarisation, z.B. also von der rein zirkularen in eine elliptische
Polarisation, so dass die Anordnung, welche durch das Objekt ungestörtes Licht
ausfiltert, für
derartige geänderte,
z.B. elliptische Polarisationsanteile zumindest teilweise durchlässig wird
und somit im Abbild, welches von einem Detektor, z.B. einer Kamera
erfassbar ist oder auch von dem Auge eines Betrachters, derartige
polarisations- oder phasenverschiebende Objektanteile heller erscheinen.
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Durch
Vergleich der Ergebnisse, die aus diese Arten und Weisen der Bildaufnahme
erstellt wurden, können
Rückschlüsse darauf
gezogen werden, ob ein Objekt, bzw. ein Objektbereiche polarisationsdrehend
ist oder phasenverschiebend. Dabei kann die Analysatoranordnung,
die für
die Polarisations-Kontrast-Messung nötig ist entfallen, z.B. aus dem
Strahlengang geschoben werden, wenn eine Messung zum Interferenzkontrast
vorgenommen wird. Ggfs kann sie auch so eingestellt werden, dass sie
das Licht der verwendeten Polarisation durchlässt und somit ein Messung nicht
verfälscht.
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Neben
dieser vorgenannten Art und Weise, eine Mikroskopie durchzuführen, ergeben
sich beliebige viele andere Möglichkeiten,
aufgrund der unabhängigen
Einstellung von Polarisation und Phase in wenigstens einem der Teilstrahlengänge des
Interferometers, wobei es bevorzugt sein kann, dass polarisationsändernde
Mittel auch in beiden Teilstrahlengängen des Interferometers vorgesehen
sind.
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Ein
erfindungsgemäßes Mikroskop
kann in einer bevorzugten ersten Alternative beispielsweise derart
aufgebaut sein, dass eine Mikroskopoptik zur Erzeugung eines Abbildes
eines Objektes außerhalb des
Interferometers nach einer Anordnung zur Strahlenzusammenführung angeordnet
ist. Hierdurch ergibt sich die Möglichkeit,
z.B. mittels einer Beleuchtungsvorrichtung polarisiertes oder auch
unpolarisiertes Licht zu erzeugen und mittels eines polarisierend
wirkenden Strahlteilers den erzeugten Lichtstrahl aufzuspalten in
zwei Teilstrahlen mit zueinander senkrecht stehender Polarisationsrichtung.
Vor der Zusammenführung
der beiden Teilstrahlen können
diese derart manipuliert werden, dass eine relative Phase der beiden
Strahlen zueinander eingestellt wird, dass das wieder zusammengeführte Strahlenbündel aufgrund
der vektoriellen Addition mit der eingestellten Phasenverschiebung
und den senkrechten Polarisationen zirkular polarisiertes Licht
erzeugt, beispielsweise rechts- oder linkszirkulares Licht je nach
eingestellter Phase. Durch Polarisationseinstellung und Phasenverschiebung
in den Interferometerarmen kann auch jegliche andere gewünschte Polarisation
eingestellt werden. Wichtig, ist dass ein gewünschte Polarisation zur Auswahl kommt,
z.B. zirkular.
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Die
Phasenverschiebung kann durch entsprechende phasenschiebende Mittel
in wenigstens einem der beiden Teilstrahlengänge des Interferometers erfolgen,
beispielsweise durch eine Anordnung mit einem Keilprisma/Keilkompensator,
welches mehr oder weniger weit in den Strahlengang eingeschoben
wird. Zur Kompensation des eingeschobenen Glasweges kann es dabei
vorgesehen sein, in dem anderen Interferometerarm einen entsprechenden
transparenten Körper,
beispielsweise einen Glasblock aus dem gleichen oder einem ähnlichen Material
einzufügen,
um die effektive Längenänderung
der Interferometerarme durch den Einsatz dieses phasenverschiebenden
Elementes auszugleichen.
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Es
besteht bei dieser Ausführung
so wie eingangs genannt die Möglichkeit,
durch Vorschaltung eines Analysators vor einer beobachtenden Kamera oder
dem Auge eines Betrachters, das z.B. rein zirkular polarisierte
Licht bzw. die gewählte
Polarisation des Licht, welches zur Beleuchtung eines Objektes in einer
Mikroskopanordnung dient, vollständig
zu blockieren bzw. auszufiltern.
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Unter
einer Mikroskopanordnung wird hierbei und bei allen anderen Ausführungen
im Wesentlichen verstanden, dass ein Kondensor, insbesondere eine
Linse oder Linsenanordnung, zur Beleuchtung eines Objektes vorgesehen
ist sowie ein Objektiv, um eine Abbildung des beleuchteten Objektes
zu projezieren, gegebenenfalls unter Erstellung eines Zwischenbildes,
welches weiterhin vergrößert durch ein
Okular betrachtet wird. Bei einer derartigen Anordnung ist demnach
die Mikroskopoptik zur Erzeugung eines Abbildes sowie die innerhalb der
Mikroskopoptik angeordnete Probe bzw. das Objekt außerhalb
des Interferometers angeordnet.
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Wird
demnach die Analysatoranordnung vor dem Auge des Betrachters oder
des Detektors/der Kamera derart einjustiert, dass die gewählte Polarisation
z.B. rein zirkulares Licht ausgefiltert wird und somit zu einem
vollständig
dunklen Abbild führt,
so ist es ersichtlich, dass helle Strukturen in einem Abbild des
Objektes darauf zurückzuführen sind,
dass das betrachtete Objekt entweder phasenschiebend oder aber polarisationsdrehend
wirkt, so dass es über
den Querschnitt des betrachteten Objektes zu unterschiedlichen Änderungen
des Lichtes aus der gewählten,
z.B. reinen zirkularen Polarisation heraus kommt, z.B. wobei diese Änderungen
dazu führen, dass
sich die reine zirkulare Polarisation in eine elliptische Polarisation ändert, so
dass entsprechend elliptisch polarisierte Lichtanteile die Analysatoranordnung
wenigstens teilweise passieren können
und zu einem hellen Abbild führen.
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Es
wird somit deutlich, dass neben der reinen Mikroskopie des Amplitudenkontrastes
mittels einer derartigen Vorrichtung auch Phasen- bzw. Interferenz-
und Polarisationskontraste aufgenommen werden können. Um eine Unterscheidung
zwischen einer polarisationsdrehenden oder phasenschiebenden Wirkung
des Objektes bzw. von Objektbereichen unterscheiden zu können.
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Die
Phasenkontrast-Mikroskopie wird mit dieser Vorrichtung sodann ebenso,
wie zuvor beschrieben durchgeführt.
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Es
kann verfahrensgemäß vorgesehen
sein, eine erste Serie von Abbildern eines Objektes aufzunehmen,
bei der zwischen der Aufnahme zweier Abbilder die Polarisation in
wenigstens einem der Teilstrahlen geändert wird und eine zweite
Serie, bei der zwischen der Aufnahme zweier Abbilder die relative Phase
in wenigstens einem der Teilstrahlen geändert wird. Hierbei kann die
Einstellung der relativen Phase wie vorgenannt z.B. durch ein phasenverschiebendes
Element wie ein Keilprisma bewirkt werden, wobei es vorgesehen sein
kann, die Polarisation durch ein entsprechendes Mittel zur Polarisationsänderung,
wie beispielsweise eine Lambda-Halbe Platte vorzunehmen oder durch ähnlich wirkende
Elemente.
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Es
besteht so nachträglich
durch Auswertung der aufgenommenen Abbildungen die Möglichkeit,
Rückschlüsse dahingehend
zu ziehen, welche Bereiche eines Objektes phasenschiebend bzw. polarisationsdrehend
wirken. Dies lässt
somit Rückschlüsse dahingehend
zu, ob Objektbereiche gegebenenfalls doppelbrechend sind, beispielsweise wenn
sie polarisationsdrehend wirken oder aber unterschiedliche Brechungsindices
bzw. unterschiedliche Dicken bei dem Objekt vorliegen, wenn diese Objektbereiche
als phasenschiebend erkannt werden.
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Hierbei
kann es vorgesehen sein, dass die vorgenannte zweite Serie von Abbildern
aufgenommen wird, wenn die Teilstrahlen in dem Interferometer unpolarisiert
oder gleich polarisiert sind gegenüber einer Aufnahme der ersten
Serie, wo die Teilstrahlen im Interferometer linear polarisiert
sind, insbesondere wobei beide Teilstrahlen senkrecht zueinander
polarisiert sind. Dies schließt
bei der Aufnahme der zweiten Serie aus, dass sich Effekte ergeben,
die gegebenenfalls auf polarisiertes Licht zurückzuführen sind.
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Eine Änderung
von polarisiertem Licht in den Teilstrahlen des Interferometers
zu unpolarisiertem Licht in den Teilstrahlen des Interferometers
kann beispielsweise durch entsprechende Auswahl der Vorrichtung
zur Strahlteilung erreicht werden. Beispielsweise können Strahlteilerwürfel eingesetzt
werden, die polarisierend bzw. nicht polarisierend wirken. Derartige
Strahlteilerwürfel
können
sodann mittels eines Verschiebemechanismus ausgetauscht werden,
um das Interferometer auf polarisierten bzw. unpolarisierten Betrieb
umzustellen.
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In
dieser vorgenannten Anordnung kann es beispielsweise auch vorgesehen
sein, dass die Teilstrahlen gegenüber einer Justage, bei der
diese exakt parallel zueinander verlaufen, derart justiert werden,
dass die Teilstrahlen aus den Interferometerarmen in der Vorrichtung
zur Strahlzusammenführung unter
einem Winkel ungleich 0 überlagert
sind. Hierdurch kann sich in der Ebene des zu beobachtenden Objektes,
welches sich außerhalb
des Interferometers befindet, ein Strahlversatz ergeben, wobei es
sodann vorgesehen sein kann, dass im Strahlengang nach dem zu beobachtenden
Objekt eine Vorrichtung zur Kompensation dieses Strahlversatzes
angeordnet ist, um die beiden versetzten Strahlen wieder aufeinanderzuführen. Es
besteht so die Möglichkeit, eine
sogenannte differentielle Interferenzmikroskopie durchzuführen, da
beide Teilstrahlen das Objekt an unterschiedlichen Orten durchleuchten
und anschließend
wieder überlagert
werden, so dass insbesondere Brechungsindexänderungen oder Dickenänderungen,
mithin große
Gradienten dieser Parameter in dem erzeugten Abbild dargestellt
werden können.
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Hierbei
kann es insbesondere für
eine Vereinfachung der Justage vorgesehen sein, dass nach der Beleuchtungsvorrichtung
und vor dem Interferometer ein zumindest temporär angeordnetes Maskenelement
vorgesehen ist, welches einen von der Beleuchtungsvorrichtung emitierten
Lichtstrahl über dessen
Querschnitt räumlich
in der Intensität
moduliert. Beispielsweise kann es sich bei einem solchen Maskenelement
um ein optisches Gitter oder Lochblenden oder eine ähnliche
Maske handeln. Eine derartige Maske bewirkt, dass in der Abbildung
des Objektes ebenso die Maskenstruktur sichtbar wird, wobei sich
bei ungenügender
Justage zwei Abbildungen der Masken bezogen auf die beiden unvollständig überlagerten
Teilstrahlen ergeben, so dass für
eine optimale Justage und Anpassung der Verkippung der beiden Teilstrahlen
und der Vorrichtung zur Kompensation der Verkippung die beiden Teilstrahlen
auf einfache Weise aufeinander justiert werden können, nämlich dadurch, dass die beiden
separaten Maskenbilder zur Deckung gebracht werden. Für die sodann
eigentliche Untersuchung kann es vorgesehen sein, dass das Maskenelement
aus dem Strahlengang herausgekippt wird, so dass dieses die Mikroskopieuntersuchung
nicht weiter stört.
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Bei
dieser vorbeschriebenen Anordnung ist wie eingangs genannt das beleuchtete
Objekt sowie die Mikroskopanordnung, d.h. Kondensor und Objektiv,
im Strahlengang nachgeschaltet zum Interferometer angeordnet.
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Die
Anordnung aus Beleuchtungsvorrichtung und Interferometer kann somit
als eine spezielle erfindungsgemäße Beleuchtungsvorrichtung
verstanden werden, die gegebenenfalls auch mit üblichen klassischen Durchlichtmikroskopen
zum Einsatz kommen kann. Es kann demnach eine Vorrichtung, umfassend
eine Beleuchtungsvorrichtung und ein Interferometer, verwendet werden,
um den Objektträger
eines üblichen
Mikroskops zu beleuchten, wobei hier insbesondere durch die Interferometeranordnung
und die darin vorgesehenen Mittel zur Phasenschiebung und Polarisationsdrehung
auf einfache Art und Weise die Einstellung einer gewünschten,
z.B. der zirkularen Polarisation bei dem beleuchteten Licht ermöglichen.
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In
einer anderen bevorzugten und alternativen Anordnung eines erfindungsgemäßen Mikroskops
kann es vorgesehen sein, dass in beiden Teilstrahlengängen des
Interferometers vor einer Strahlzusammenführung jeweils eine Mikroskopoptik
angeordnet ist, wobei in einer Mikroskopoptik ein zu beobachtendes
Objekt und in die andere Mikroskopoptik ein Referenzobjekt einsetzbar
ist. Es erfolgt hier demnach eine Strahlenzusammenführung der
beiden Teilstrahlen des Interferometers erst, nachdem die beiden
Teilstrahlen jeweils eine zugehörige
Mikroskopoptik durchlaufen haben. Es erfolgt somit eine Interferenz
dieser Teilstrahlen in einem Bereich nach dem Interferometer, so
dass eine Änderung
der Interferenz unmittelbar beeinflusst werden kann durch ein Objekt,
welches sich in einer der Mikroskopoptiken des einen Teilstrahles
des Interferometers befindet.
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Hierbei
wird, wie vorgenannt unter der Mikroskopoptik im Wesentlichen wiederum
Kondensor und Objektiv sowie ein Objektträger zur Aufnahme eines Objektes
verstanden. Erfindungsgemäß ist es
dabei vorgesehen, dass nur einer der Objektträger in den beiden Mikroskopoptiken
der beiden Teilstrahlen ein Objekt trägt, so dass der jeweils andere
Objektträger lediglich
als Referenzobjekt dient, so dass grundsätzlich beide Teilstrahlen,
abgesehen von dem Objekt, identisch beeinflusst werden hinsichtlich
Polarisation, Phasenschiebung und Amplitudenänderung und somit klar ist,
dass eine Änderung
in der Interferenz/der Polarisation auf das Objekt selbst zurückzuführenist.
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Alternativ
kann hier auch nur eine Mikroskopoptik in einem der Interferometerarme
zum Einsatz kommen, d.h. die Mikroskopoptik mit dem Refrenzobjekt
kommt in Entfall. Um hier einen Einfluß der Mikroskopoptik bei der
Auswertung auszuschließen, kann
es vorgesehen sein, zunächst
wenigsten ein Nullbild aufzunehmen, dass ein Bild ohne Objekt. Diese
Nullbild kann dann von späteren
Aufnahmen mit Objekt abgezogen/subtrahiert werden, um den Einfluss
der Mikroskopoptik in den Bildern zu eliminieren.
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Diese
Anordnungen können
beispielsweise so justiert werden, dass sich nach der Strahlenzusammenführung durch
entsprechende Auswahl der Polarisation in den beiden Teilstrahlen
und Einflussnahme auf die relative Phase der Teilstrahlen zueinander
am Ausgang des Interferometers ein definiert polarisiertes, z.B.
zirkulares Licht ergibt, welches wiederum, wie auch bei der ersten
Ausführung,
mittels einer Analysatoranordnung, beispielsweise aus Lambdaviertelplatte
und Linearpolarisator, vollständig
gefiltert bzw. geblockt werden kann, so dass sich außerhalb
des Interferometers eine dunkle Abbildung bei der Beobachtung durch
das Auge des Betrachters oder eine Kamera ergibt.
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Ändert nun
ein Objekt in der Objektebene einer der beiden Mikroskopanordnungen
in dem einen Teilstrahl durch eine optisch aktive Wirkung, d.h.
entweder durch eine Polarisationsdrehung oder eine Phasenschiebung
diese ausgewählte,
z.B. zirkulare Polarisation außerhalb
des Interferometers nach der Überlagerung
der Teilstrahlen in eine geänderte,
z.B. elliptische Polarisation, so können derart polarisierte Anteile
den vorbeschriebenen Analysator passieren und zu einem Abbild des
Objektes in der Kamera oder im Auge des Betrachters führen, da über den Querschnitt
betrachtet, unterschiedliche Bereiche des Objektes zu unterschiedlich
starken Abweichungen von der gewählten,
z.B. zirkularen Polarisation führen.
Es ergibt sich somit auch bei dieser Anordnung eine Überlagerung
von Interferenz und Polarisationskontrastbildern, so dass äquivalent
mit dem vorbeschriebenen Verfahren auch bei dieser Anordnung durch
verschiedene Messserien, bei denen zum einen die Polarisation zwischen
verschiedenen Aufnahmen geändert
wird und zum anderen die Phasenverschiebung zwischen verschiedenen
Aufnahmen geändert
wird, Rückschlüsse darauf
zulässt,
ob die untersuchten Strukturen phasenschiebend oder polarisationsdrehend
sind.
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Insbesondere
bei einer optischen Aktivität, die
auf eine Doppelbrechung von Objektbereichen zurückzuführen ist, ist es bekannt, dass
die Stärke der
Doppelbrechung abhängig
davon ist, wie eine lineare Polarisation bei einem beleuchtenden
Licht relativ zu der doppelbrechenden Struktur orientiert ist. Die
Stärke
der polarisationsdrehenden Wirkung eines derartigen doppelbrechenden
Bereichs ist somit abhängig
von der Richtung der linearen Polarisation bei der Beleuchtung.
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Um
einen derartigen Effekt ausmessen zu können, kann es verfahrensmäßig vorgesehen
sein, dass in beiden Interferometerarmen, d.h. beiden Teilstrahlen
des Interferometers jeweils Mittel zur Änderung der Polarisation des
jeweils linear polarisierten Lichtes vorgesehen ist, insbesondere
wobei es vorgesehen sein kann, dass in den beiden Teilstrahlen die
linearen Polarisationen senkrecht zueinander ausgerichtet sind.
Verfahrensgemäß können dann z.B.
durch eine Wirkverbindung von zwei Mitteln zur Polarisationsbeeinflussung
in den beiden jeweiligen Teilstrahlen betragsmäßig die gleichen Beträge einer Polarisationsänderung
eingestellt werden, wobei jeweils immer die Polarisationen in den
Teilstrahlen nach den polarisationsändernden Mitteln, wie z.B. Lambdahalbeplatten,
bevorzugt weiterhin senkrecht zueinander stehen, bzw. die bei einer Änderung
die relative Lager der Polarisationen in den Teilstrahlen erhalten
bleibt und durch eine entsprechende Phasenschiebereinstellung unabhängig von
der eingestellten Polarisationsrichtung eines Teilstrahles am Ausgang
des Interferometers immer wieder das gewünscht polarisierte, z.B. zirkular
polarisiertes Licht erhalten wird.
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Dies
bedeutet, dass unabhängig
von der Einstellung der polarisationsändernden Mittel in den Teilstrahlen
bei einer erfassenden Kamera bzw. bei dem Auge des Betrachters ohne
Berücksichtigung
eines beobachteten Objektes immer ein dunkles Bild aufgrund der
filternden Wirkung des vorbeschriebenen Analysators entsteht, welcher
die gewünschte
Polarisation, z.B. rein zirkular polarisiertes Licht blockiert. Durch
die Änderung
der linearen Polarisation in den beiden Interferometerarmen wird
dabei jedoch die Ausrichtung der linearen Polarisation relativ zu
einem betrachteten Objekt geändert,
so dass in Abhängigkeit
von der Änderung
der linearen Polarisation desjenigen Lichtes, welches das Objekt
in einem der Interferometerarme beleuchtet, eine Serie von Abbildungen
des Objektes, z.B. mittels einer Kamera aufgenommen werden kann,
um die Stärke
der doppelbrechenden Wirkung in Abhängigkeit des Winkels der linearen
Polarisation relativ zum Objekt auszumessen. So können doppelbrechende
Strukturen, insbesondere hinsichtlich ihrer Ausrichtung in der Probe,
näher untersucht
werden, ohne dass die Probe selbst bewegt werden muss.
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Hierfür ist es
wie vorbeschrieben bevorzugt vorgesehen, dass die Mittel zur Polarisationsbeeinflussung
untereinander wirkverbunden sind, beispielsweise derart, dass eine
Drehung eines polarisationsändernden
Elementes in einem der Interferometerarme automatisch zu einer Drehung
des anderen polarisationsändernden
Elementes um den gleichen Betrag in dem anderen Interferometerarm
führt. Eine
solche Wirkverbindung kann z.B. durch ein Getriebe mit einer 1 zu
1 Übersetzung
realisiert sein.
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Auch
bei dieser Anordnung kann es vorgesehen sein, vergleichende Aufnahmen
von Abbildungen durchzuführen,
um Abbildaufnahmen mit einer polarisierten Beleuchtung eines Objektes
gegenüber Abbildungen
mit einer unpolarisierten Beleuchtung eines Objektes gegenüberstellen
zu können.
Auch hier kann es vorgesehen sein, einen Strahlteiler am Eingang
eines Interferometers entweder polarisierend bzw. nicht polarisierend
auszubilden und derartige Strahlteiler, beispielsweise als Strahlteilerwürfel auszubilden
und mittels eines Verschiebemechanismus gegeneinander zu ersetzen.
Neben den vorgenannten Ausführungen
kann es grundsätzlich
vorgesehen sein, hier nicht nur zirkulare Polarisation bei den überlagerten
Strahlen außerhalb
des Interferometers zu analysieren, sondern gegebenenfalls jede beliebige
Art der Polarisation durch entsprechende Auswahl bzw. Einstellung
einer Analysatoranordnung, wie beispielsweise einer Lamdaviertelplatte und
eines Linearpolarisators.
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Ein
derartiges Mikroskop der vorgenannten Art gemäß der ersten oder auch der
zweiten Alternative oder jeder anderen erfindungsgemäßen Anordnung
kann sich bevorzugt dadurch auszeichnen, dass die optischen Elemente
zur Beeinflussung des Strahlenganges oder die Mittel zur Änderung
der Polarisation und/oder die Mittel zur Änderung der relativen Phase
mittels jeweils wenigstens eines Aktuators justierbar sind. Es ergibt
sich so die Möglichkeit,
beispielsweise bei umlenkenden Spiegeln, Aktuatoren vorzusehen bezüglich wenigstens
zweier Achsen, um eine automatische Justierbarkeit zu ermöglichen. Ebenso
kann es vorgesehen sein, dass die Mittel zur Änderung der Polarisation, wie
beispielsweise Lamda-halbe-Platten,
mittels Aktuatoren gezielt drehbar sind und dass Mittel zur relativen
Phasenschiebung, wie beispielsweise Keilprismen, mittels Aktuatoren
in den Strahlgang hinein- oder herausfahrbar sind.
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Hierbei
wird es als besonders vorteilhaft empfunden, wenn das Mikroskop
eine Steuerung aufweist, insbesondere eine Softwaresteuerung, die auf
einer Datenverarbeitungsanlage realisiert ist, mittels der der gewünschte Parameter,
wie z.B. Polarisation, Phasen oder Justierung automatisch einstellbar
sind. So kann durch einen Benutzer einfacherweise, beispielsweise
mittels einer Bedienoberfläche eines
Programms, eine Auswahl von Parametern vorgenommen werden, die sodann
durch die übergeordnete
Steuerung und die Aktuatoren automatisch eingestellt werden. Insbesondere
kann eine derartige Steuerung behilflich sein, um das Interferometer
hinsichtlich der gewünschten
Art der Interferenz zu justieren, welches erfahrungsgemäß manuell
aufwendig ist. Hierbei kann gerade eine Auswertung der bei der Justage
bewirkten Interferenzmuster durch die Aufnahme mittels einer nachgeschalteten
Kamera ausgewertet werden, um so zu einer optimalen Justage zu kommen.
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Es
besteht so auch weiterhin die Möglichkeit, mittels
einer vorgenannten Steuerung einer Kamera, die bei Mikroskopanordnung
vorgesehen sein kann, automatisch eine Folge von einzelnen Aufnahmen
eines Objektes zu erfassen, insbesondere wobei zwischen zwei Aufnahmen
eine automatische, insbesondere vorprogrammierte Änderung
wenigstens eines Parameters, wie z.B. eine Änderung der Phase und eine Änderung
der Polarisation vorgenommen wird. Der gesamte Messvorgang bzw.
die Durchführung
einer Messserie kann somit voll automatisch, insbesondere nach einer
vorherigen Programmierung erfolgen, ohne dass ein Nutzer bei der
Durchführung
der mikroskopischen Untersuchung manuell eingreifen muss.
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In
einer bevorzugten Anwendung der vorgenannten Mikroskopanordnungen
kann es vorgesehen sein, dass eine Justage des Interferometers derart
erfolgt, dass die überlagerten
Teilstrahlen außerhalb
des Interferometers ein Interferenzstreifenmuster ausbilden. Dies
kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die beiden Teilstrahlen
aus den Interferometerarmen unter einem leichten Winkel zueinander
justiert werden, so dass sich winkelabhängig mehr oder weniger eng
beieinanderliegende Interferenzstreifen ergeben.
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Insbesondere
bei einer Mikroskopanordnung, bei der ein Mikroskobjektiv mit einem
zu betrachtenden Objekt innerhalb eines Interferometerarmes, d.h.
eines Teilstrahlenweges angeordnet ist, wird es sodann zu einer
lateralen Verzerrung des Interferenzstreifenmusters kommen, wenn
ein Objekt in der Objektebene der Mikroskopanordnung vorhanden ist.
Ist kein Objekt vorhanden, so ergeben sich bei idealer Justage der
Anordnung lediglich gerade ausgerichtete Interferenzstreifen. Eine
laterale Verzerrung der Interferenzstreifen kann also dahingehend
ausgewertet werden, dass ein Objekt in der Objektebene vorhanden
ist, wobei hier zu berücksichtigen
ist, dass in dem zweiten Interferometerarm ein Referenzobjekt vorhanden
ist, welches beispielsweise lediglich aus einem leeren Objektträger besteht, oder – wie vorgenannt – ein Nullbild
berücksichtigt wird.
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Dies Überprüfung kann
auch bei einer exakt parallelen Justage der Teilstrahlen bei der Überlagerung
erfolgt, wenn diese so justiert werden, dass z.B. negative Interferenz über die
ganze Bildebene auftritt, wenn kein Objekt vorhanden ist. Stört ein Objekt die
Interferenz, so kommt es zu helleren Bildanteilen, was Rückschlüsse zulässt auf
die Existenz eines Objektes im Objektträger. Diese Verfahren ist ebenso analog
und äquivalent
möglich,
wenn maximal positive Interferenz einjustiert wird.
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Es
kann somit auf Grund dieser Erkenntnis ein Verfahren realisiert
werden, bei dem beispielsweise automatisiert nacheinander Objektträger, beispielsweise
mittels eines Scanverfahrens in die Objektebene eingefahren werden,
um zu untersuchen, ob auf bzw. in einem Objektträger ein zu untersuchendes Objekt
vorhanden ist oder ob es sich um einen leeren Objektträger handelt.
So können
beispielsweise automatisiert Scans durchgeführt werden, um die Belegung
von Objektträgern,
wie beispielsweise Mikrotiterplatten, festzustellen. Hierbei können eine
Vielzahl von Objektträger
z.B. auf einem Tisch angeordnet sein, der verfahrbar ist und so
die Möglichkeit
bietet nacheinander verschiedene Objektträger in die Objektebene des
Mikroskopes zu fahren, z.B. mittels einer x-y-Schrittsteuerung.
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Wird
somit beispielsweise mit einer Kamera ein ungestörtes Interferenz-(streifen)-muster festgestellt,
so lässt
dies auf eine Nichtbelegung des Objektträgers schließen, wohingegen ein gestörtes Interferenz-(streifen)-muster
eine Belegung des Objektträgers
mit einem Objekt anzeigt.
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Hierbei
wird es als besonders vorteilhaft empfunden, dass eine Veränderung
der Interferenz selbst dann vorkommt, wenn sich ein beobachtetes Objekt
nicht exakt in der Brennebene des Objektives einer Mikroskopanordnung
befindet und somit keine scharfe Abbildung des Objektes bei dieser Überprüfung erfolgt.
Es kann sodann ergänzend
auch vorgesehen sein, dass bei der Feststellung, dass ein Objekt
im Objektträger
vorhanden ist, die Mikroskopanordnung hinsichtlich der Lage des
Objektives durchgefahren wird, um unterschiedliche Ebenen im Objektträger, wie
beispielsweise bei Mikrotiterplatten, durchzufahren und so verschiedene
Ebenen des Objektträger
mikroskopisch zu untersuchen, wenn eine Belegung des Objektträgers zuvor
festgestellt wurde. Es können
so beispielsweise automatisierte Mikroskopieuntersuchungen an beliebigen
Anzahlen von Objektträgern
durchgeführt
werden.
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Durch
dieses Verfahren besteht auch die Möglichkeit, bewegte Objekte,
auf oder in einem Objektträger
zu verfolgen. Hierfür
kann eine Rückkopplung
vorgesehen sein, von einem Detektor bzw. einer Kamera zu einer Translationsvorrichtung
für den
Objektträger
wenigstens in X-Y, bevorzugt in X-Y-Z-Ebene, um das bewegte Objekt
im Sehfeld oder Fokus zu halten.
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Anwendungsgebiet
der erfindungsgemäßen Mikroskopanordnung
bzw. des Verfahrens sind beispielsweise im Bereich der Krebsforschung,
Stammzellenforschung oder auch der Immunologie zu sehen. Insbesondere
Proteine, die in Stammzellen oder Viren vorkommen, können mittels
Interferenzeffekten und der erfindungsgemäßen Anordnung mit hohen Kontrasten
nachgewiesen werden.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung sind den Figuren dargestellt. Es zeigen:
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1:
Eine Ausführung
mit Mikroskopanordnungen in jedem Interferometerarm
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2:
Eine Ausführung
wie in 1, aber nur mit einer Mikroskopanordnung in einem
der Interferometerarme
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3:
Eine Ausführung
mit einer Mikroskopoptik ausserhalb des Interferometers;
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4:
Eine Ausführung
wie in 2, aber mit zueinander verkippten Teilstrahlengängen des
Interferometers;
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5:
Bilddarstellung eines Mausfibroplast
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Die 1 zeigt
einen Mikroskopaufbau, bei dem in jedem Arm des Interferometers
eine Mikroskopanordnung vorgesehen ist. Hierbei dient eine Mikroskopanordnung
zur Beobachtung eines Objektes und die andere zur Berücksichtigung
eines Referenzobjekts, damit die Strahlengänge in beiden Interferometerarmen
bis auf das beobachtete Objekt identisch sind.
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Durch
die Lichtquelle 1 wird Licht erzeugt, z.B. mittels einem
thermischen Leuchtmittel, wie Halogen-, Quecksilberdampf-, Xenondampf-,
Natriumdampf-Leuchte
oder mittels eines Lasers, wie z.B. Diodenlaser, Gaslaser, Festköperlaser,
durchstimmbarer Diodenlaser, Optisch parametrischer Oszillator. Die
Anwendung eines Laser hat dabei den Vorteil einer höheren Kohärenzlänge, so
dass die Längenanpassung
in den Interferometerarmen unkritischer ist als z.B. bei Thermischen
Leuchtmitteln. Insbesondere bei letzteren wird die Länge der
beiden Interferometerarme exakt identisch eingestellt, zumindest
innerhalb der jeweils zu berücksichtigenden
Kohärenzlänge.
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Nach
der Lichtquelle 1 kann im Strahlengang eine Aufweitungs-
oder Kollimationsoptik 2 vorgesehen sein, z.B. ein Teleskop
zum Aufweiten des Lichtbündels,
z.B. der Laserstrahlung. Hierbei kann ein Raumfilter im Teleskop
angeordnet sein, z.B. durch ein Pinhole im Fokus des Teleskops.
Alternativ kann ein Kollektor zum Bündeln von Licht thermischer Quellen
vorgesehen sein.
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Im
Strahlengang folgt sodann am Eingang zum Interferometeraufbau ein
Strahlteiler 3, der als Strahlteilerwürfel ausgebildet sein kann
mit a) polarisierender Wirkung für
polarisationsoptische Messungen (Doppelbrechung und optische Aktivität im Objekt,
Erzeugung des Polarisationskontrastes)) oder b) nicht polarisierender
Wirkung für
interferometrische Messungen (Brechungsindex, Dicke, optische Dichte,
Gangunterschiede, Phasengrenzen, Erzeugung des Interferenzkontrastes
und eines Interferenzstreifenmusters), insbesondere bei denen Polarisationseffekte
ausgeschlossen werden sollen. Das gleiche Bauteil 3 kann
am Ausgang des Interferometers zu Zusammenführung der beiden Teilstrahlen
des Interferometers dienen.
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Durch
den Strahlteiler 3 wird der Lichtstrahl I aufgespalten
in die beiden Teilstrahlen II und III, die z.B. senkrecht zueinander
polarisiert sein können, oder
bei nicht polarisierenden Strahlteilern 3 keine Polarisation
aufweisen. Beide Teilstrahlen II und III durchlaufen in den Interferometerarmen
bis zur Zusammenführung
im In der Vorrichtung zur Strahlzusammenführung 3 am Ausgang
des Interferometers dieselbe Weglänge, zumindest bis auf die
Kohärenzlänge genau.
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Nach
der Strahlaufteilung folgt in jedem der Interferometerarme ein polarisationsoptisches
Element 4, z.B. ein rotierbares, insbesondere automatisch
rotierbares polarisationsoptisches Element 4 um linear
oder zirkular zu polarisieren oder um die eingestrahlte Polarisation
zu drehen. Es kann sich z.B. um ein Polaroid, Polarisationsprisma
(Rochon, Glen-Thomson, Wollaston, ...), ein Gitter, eine Lambda-Halbe
Platte, Lambda-Viertel Platte, Flüssigkristallfilter für die Messung
von statistisch in der Probeverteilten doppelbrechenden oder gerichteten
oder optisch aktiven Strukturen oder Ähnliches handeln. Zur richtungsunabhängigen Untersuchung
können die
beiden Elemente 4 in den beiden Interferometerarmen Armen
gekoppelt sein, z.B. um sie simultan durchstimmen zu können.
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Zur
Umlenkung, um die spätere
Zusammenführung
der Teilstrahlen II und III zu ermöglichen sind im Strahlengang
Umlenkelemente 5 vorgesehen, z.B. 90° Umlenkspiegel, Prismen oder
Oberflächenspiegel,
jeweils mit Justagemöglichkeiten
und/oder mit motorisierter Justagemöglichkeit (angetriebene Feingewindeschrauben).
Durch die Umlenkelemente 5 lassen sich die Wellenfronten
aus den beiden Interferometerarmen zueinander ausrichten, insbesondere
zur Erzeugung eines Interferenzstreifenmusters.
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Im
unteren Interferometerarm ist ein optisches Element 6 zur
Einstellung der relativen Phasen zwischen den Teilstrahlen II und
III vorgesehen. Es kann sich in einer Ausführung z.B. um einen Keilkompensator
aus Glaskeilen (Quarz) handeln. Mit diesem Phasenschiebenden Element 6 kann
z.B. der Interferenzkontrast durch den Gangunterschied bei unpolarisierten
Teilstrahlen II und III verändert
werden oder bei polarisierten Teilstrahlen II und III der Gangunterschied,
um bei der Überlagerung
der Teilstrahlen II und III am Ausgang des Interferometers eine
gewünschte
Polarisation einzustellen, insbesondere eine zirkulare Polarisation.
Hierzu können
bei einem Keilkompensator die Keile senkrecht zur optischen Achse
auseinander gezogen oder ineinander geschoben werden, damit der
der Glasweg kürzer
oder länger
wird. Alternativ können
für das
Element 6 z.B. auch Pockelszellen oder, Kerrzellen eingesetzt
werden.
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Im
oberen Arm ist ein optisches Element 7 zur Kompensation
der Wegverlängerung
durch das Element 6 angeordnet. Hierdurch kann z.B. der
Glasweg eines Keilkompensators kompensiert werden, so dass beide
Interferometerarme dieselbe effektive optische Länge haben. Das Kompensationselement 7 ist
bevorzugt aus demselben Material wie das phasenschiebende Element 6 zum
Erhalt der Phasenbeziehung und der Kohärenz der Teilstrahlen. Z.B.
kann es aus Quarzglas sein, wenn z.B. ein Keilkompensator aus Quarzglas
beim Element 6 eingesetzt wird.
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In
beiden Teilstrahlengängen
des Interferometers folgt noch vor dem Element 3 zur Strahlzusammenführung je
eine Mikroskopanordnung, umfassend einen Kondensor 10,
z.B. eine Sammellinse oder Linsenanordnung zur Bündelung des Beleuchtungslichtes
auf die Probe bzw. das zu beobachtende Objekt und ein Objektiv 11,
z.B. ebenfalls eine Linse oder Linsenanordnung, z.B. ein Trockenobjektiv, Wasserimmersions-, Ölimmersionsobjektiv).
Diese Objektiv erzeugt ein reelles Zwischenbild hinter der Strahlzusammenführung 3,
z.B. im Tubus der Mikroskopanordnung.
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Zwischen
Kondensor und Objektiv befindet sich im unteren Interferometerarm
mit dem Teilstrahl II ein Objektträger 8 mit einem zu
beobachtenden Objekt und im oberen Teilstrahl III ein Referenzobjekt 9,
welches z.B. lediglich denselben Objektträger umfassen kann, jedoch ohne
Objekt. So ist sichergestellt, dass beide Teilstrahlengänge bis
auf das zu untersuchende Objekt identisch sind.
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Beide
Teilstrahlen II und III werden in der Anordnung zur Strahlzusammenführung 3 wieder überlagert
und anschließend
durch eine Optik 12, z.B. eine Linse für ein unendlich korrigiertes
Mikroskop, auf einen Detektor 14 abgebildet. Der Detektor
kann z.B. als Kamera mit CCD oder CMOS- Chip oder als Photomultiplier,
Photodiode, Videokamera, Digitalkamera ausgebildet sein.
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Vor
dem Detektor 14 oder alternativ dem Okular für das Auge
eines Betrachters kann eine Anordnung zur Polarisationsfilterung
angeordnet sein, die z.B. eine gewünschte Polarisation filtert,
d.h. blockt, z.B. kann die Anordnung so eingestellt sein, dass zirkular
oder linear polarisiertes Licht nicht passieren kann. Hierfür kann eine
Kombination aus einer Lambda-Viertel-Platte 13 und eines
Linear-Polarisators 4 eingesetzt
werden. Ebenso kann es sich um ein Flüssigkristallfilter, insbesondere
ein elektronisch programmierbares Flüssigkristallfilter oder ein
Prisma handeln.
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Im
Strahlengang beider Teilstrahlen II und III können je noch zwei Glasplatten 16 eingesetzt
sein, um ein Wellenfrontonverkippung zu ermöglichen. Hierfür sind die
Rotationsachsen bevorzugt parallel versetzt zur optischen Achse.
Die Platten können
zur Einstellung eines Interferenzstreifenmusters oder zur parallelen
Ausrichtung der Wellenfronten dienen, und ebenso wie alle andere
optischen Element motorisiert sein für eine automatische Justage
und automatisierte Messung.
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Die
beschriebene Anordnung der 1 kann wie
folgt eingesetzt werden:
Die bevorzugt kohärenten, jedoch durch Auswahl des
Strahlteilers 3 unpolarisierten Objekt- und Referenzwelle
II und III überlagern
sich und erzeugen durch Interferenz ein Interferenzmuster, insbesondere
welches bei ebener Wellenfront so eingestellt werden kann durch
Phasenschiebung am Element 6, dass das Hintergrundlicht
sich auslöscht.
So kann ein hoher Interferenzkontrast erzeugt werden.
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Phasenretardierungen
in der Objektwelle II, hervorgerufen durch die Verteilung der optischen Dichte
in dem zu beobachtenden Objekt 8 der Probe, erzeugen im
Interferenzbild Helligkeitsunterschiede bzw. bei thermischer nicht
oder weniger kohärenter Beleuchtung,
insbesondere mit höherer
Bandbreite charakteristische Interferenzfarben. Ein Objekt unterschiedlicher
optischer Dichte (Phasenobjekt) kann auf diese Weise starken Kontrast
erzeugen durch ein helles Bild vor dunklem Hintergrund. Hierbei
ist vorteilhaft, dass das Objekt nicht einmal vollständig fokussiert
sein muss, da die Interferenz auch ohne scharfe Objektabbildung
in der Bildebene des Detektors entsteht.
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Durch
Polarisation von Objektwelle II und Referenzwelle III kann bei der Überlagerung
nach der Strahlzusammenführung 3 z.B.
zirkular, (bzw. linear) polarisiertes Licht erzeugt werden, welches
durch die Analysatoranorndung 13/4 geblock werden
kann, so dass kein Signal am Detektor bzw. nur ein dunkeles Bild
an der Kamera entsteht. Alle Strukturen in der Objekt-Probe, die
die Polarisation des Objektstrahles II drehen oder die entsprechende
E-Feldkomponente verkleinern, sorgen für eine Abweichung aus der ungestörten zirkularen
(oder linearen) Polarisation nach der Überlagerung der Teilstrahlen.
Diese gestörten Anteile
der Welle können
den Analysator 13/4 passieren und erzeugen ein
Signal auf dem Detektor oder der Kamera.
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Um
alle Strukturen, deren Ausrichtungen statistisch in der Objekt-Probe
verteilt sein können, polarisationsoptisch
zu erfassen, ist es bevorzugt vorgesehen die Rotation der Polarisation
der eingestrahlten Objektwelle II stufenweise oder kontinuierlich
zwischen 0° und
90° zu drehen.
Unabhängig
von der Lage der Struktur wird es somit eine Einstellung geben,
in der diese Struktur ein Signal erzeugt, sofern sie polarisationsdrehend
wirkt. Hierbei kann es vorgesehen sein, dass simultan mit einer Änderung der
Polarisation in der Objektwelle II auch die Polarisation in der
Referenzwelle III gedreht wird, um zu gewährleisten, dass diese Polarisationen
immer senkrecht zueinander stehen und immer nach der Überlagerung
zirkular polarisiertes Licht entsteht. Hierzu können die Elemente 4 zur
Polarisationsdrehung in den Interferometerarmen wirkverbunden sein,
z.B. durch ein 1:1 Getriebe.
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Um
den Kontrast der durch die Änderung
der Polarisation entsteht von dem Kontrast der durch Phasenretardierung
entsteht, unterscheiden zu können,
ist die Aufnahme einer Bilderserie erforderlich, bei der in jedem
Bild eine andere Einstellung der relativen Phase und der relativen
Polarisation vorgenommen wird. Durch Vergleich können die Kontrastarten unter
Kenntnis der eingestellten Parameter unterschieden und insbesondere
unterschiedlich im Bild eingezeichnet werden. Sind alle polarisierenden Strukturen
und Brechungsindizes und Phasengrenzen mit einer Bilderserie erfasst,
kann ein vollständiges
Bild zusammengestellt werden, in welchem Brechungsindizes, Grenzen
von Bereichen unterschiedlicher Dichte, gerichtete Strukturen, und
Konzentrationen von optisch aktiven Substanzen deutlich und kontrastreich
zu erkennen sind.
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So
liefert eine erfindungsgemäße Anordnung der
beschriebenen Art die Möglichkeit
ohne vorherige Manipulation an der Objektprobe verschiedenste Kontrast-Arten
aufzunehmen, voneinander zu unterscheiden und in aufgenommenen Bilderserien
unterschiedlich darzustellen, da mit ein und demselben Aufbau sowohl
Polarisationseffekte als auch Phaseneffekte ausgemessen werden können.
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Bei
einer Ausfilterung der zirkularen Polarisation kann es auch vorgesehen
sein, die Polarisation der Objektwelle II und Referenzwelle III
so einzustellen, dass die Überlagerung
eine bestimmte bekannte elliptische Polarisation bildet. Bereiche
im Objekt, die eine eingestellte elliptische Polarisation exakt
in die zirkulare Polarisation zurückdrehen, erzeugen dann ein
Minimum im Signal. So kann auf einfache Weise festgestellt werden,
um welchen Betrag der untersuchte Objektbereich die Polarisation
dreht.
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Z.B.
mit der zu 1 beschriebenen Anordnung kann
auch eine Automatische Detektion von Objekten aufgrund des Interferenzkontrast
erfolgen. Bei paralleler Ausrichtung der unpolarisierten Wellen II
und III nach der Überlagerung,
ist der Helligkeitsunterschied im Bild, zwischen Probe und deren
Umgebung so groß,
daß er
für eine
automatische Erkennung genutzt werden kann. Mit einem Videosystem können so
z.B. in der Objektprobe mobile Zellen erfasst und durch Rückkoppelung
mit einem motorisierten Objektträger,
bzw. Objektmanipulator oder Probenteller im Sehfeld behalten werden.
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Es
kann ebenso das Probenvolumen z.B. von Mikrotiterplatten automatisch
daraufhin untersucht werden, ob ein Objekt im Probenvolumen enthalten
ist oder nicht. Z.B. Zellen können
automatisch gefunden werden, da der erzeugte Gangunterschied das
Interferenzstreifenmuster auslenkt. So kann die Probe in der x-y-Ebene
gefunden werden. Durch Verfahren der z-Achse bei parallelen Wellenfronten
der Teilstrahlen II und III kann die Fokusebene gefunden werden,
indem nach dem größten Kontrast
gesucht wird. Also der größten hellen
Fläche
vor einem dunklen Hintergrund, oder umgekehrt. Oder es wird die Grenze
zwischen hellem und dunklem Gebiet mit dem steilsten Intensitätsanstieg
gesucht, was automatisch erfolgen kann, z.B. durch eine Bildverarbeitung,
beispielsweise softwaretechnisch.
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Bei
kohärenter
Beleuchtung kann nach Aufnehmen einer Bilderserie und einem Durchstimmen der
Phase durch Bildanalyse und eine mathematische Rücktransformation des Beugungsbildes
aus dem Fourier- in den Realraum die relative Lage und Größe der beugenden
Strukturen in drei Richtungen rekonstruiert werden.
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Alle
Freiheitsgrade zur Ausrichtung der Wellenfronten zueinander, zum
Durchstimmen der relativen Phase der Teilstrahlen und zur Rotation
der Polarisationsrichtung können
bevorzugt motorisiert sein. Das Interferometer kann so mechanische
und thermische Einflüsse
ggfs. automatisch kompensieren und eine Justage beibehalten. Zur
Aufnahme von Bilderserien werden die optischen Komponenten zur Phasenanpassung,
z.B. ein Keilkompensator und zur Polarisationsdrehung beispielsweise
softwaremäßig in definierte
Positionen gedreht und es kann dann von jeder entsprechenden Position
ein Bild erzeugt werden. Die Software enthält darüber hinaus den Algorithmus
zur Aufschlüsselung
der Bildinformation in Phasen und Polarisationskontrast, wobei es
vorgesehen sein kann, dass die Software die Bilder optimiert zusammensetzt.
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Die 2 zeigt
eine Alternative, bei der die Referenzmikroskopanordnung im Teilstrahl
III in Entfall gekommen ist. Um hier Einflüsse in den Bildserien durch
die Mikroskopoptik auszuschließen
kann es vorgesehen sein, zunächst
von einer Einfügung
eines Objektes in das Mikroskop wenigstens ein Nullbild aufzunehmen
und diese später
von den aufgenommenen Bildern zu subtrahieren.
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Die 3 zeigt
eine alternative Anordnung eines erfindungsgemäßen Mikroskops, bei dem die Mikroskopoptik
ausserhalb des Interferometers angeordnet ist. Ansonsten sind oder
können
alle anderen Komponenten und deren Ausgestaltung, die zur 1 beschrieben
wurden, auch bei dieser Ausführung
vorgesehen sein. Die zur Durchführung
mikroskopischer Untersuchungen genannten Verfahrensmöglichkeiten,
d.h. insbesondere die Interferenz-Kontrast-Mikroskopie mit unpolarisiertem
Licht im Interferometer und die Polarisations-Kontrast-Mikroskopie
mit polarisiertem Licht können
hier genauso durchgeführt
werden.
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Die 4 zeigt
eine Abwandlung der Ausführung
nach 2. Auch hier sind oder können alle zu den 1 oder 2 genannten
Merkmale realisiert sein. Die Ausführung nach 3 unterscheide sich
von der 2 dadurch, dass der Teilstrahl
II bei der Zusammenführung
mit dem Teilstrahl III im Element 3 nicht parallel zueinander,
sondern unter einem Winkel zueinander verlaufen.
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Hierdurch
ergibt sich in der Ebene des zu beobachtenden Objektes 8 ein
Strahlversatz zwischen den Teilstrahlen II und III, so dass diese
unterschiedliche nebeneinanderliegende Bereich des Objektes 8 durchleuchten.
Beide Teilstrahlen werden also in dem Objekt unterschiedlich hinsichtlich
Phasenschiebung oder Polarisationsdrehung beeinflusst. Zwischen
der Mikroskopoptik 10, 11 und der Kameraoptik 12, 14 kann
sodann ein optisches Element 18 vorgesehen sein, mit dem
der einjustierte Strahlversatz, bzw. der eingestellte Winkel zwischen
den Teilstrahlen II und III kompensiert wird, so dass die Teilstrahlen
nach dem Element 18 parallel zueinander verlaufen und übereinander
liegen.
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Bei
dem Element 18 kann es sich z.B. um ein Wollaston- oder
Nomarski-Prisma handeln, welche die lateral versetzten Teilstrahlen
zusammenführen können und/oder
die Polarisationsrichtungen gleich zueinander ausrichten.
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Mit
dieser Anordnung kann ein Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskop
realisiert werden, bei welchem wiederum ohne Manipulation an der
Objektprobe gleichzeitig Messungen zu unterschiedlichen Phasen und
Polarisationen durchgeführt
werden können,
wie auch bei den anderen möglichen Ausführungen,
insbesondere so, wie es dort bereits beschrieben wurde. Auch hier
wird ein Keilkompensator oder ein anderes Element 6 zur
Phasenschiebung eingesetzt, um Polarisationskontrast vom Phasenkontrast
in den aufgenommenen Bilder oder gemessenen Daten unterscheiden
zu können.
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Um
bei der Justage zugehörige
Wellenanteile miteinander zu Überlagern,
insbesondere die Winkeleinstellung zwischen den Teilstrahlen II
und III an den Versatz anzupassen, der durch das Element 18 erzeugt
wird, kann es vorgesehen sein, ein Maske 17, z.B. ein optisches
Gitter 17 vor dem Eingang in das Interferometer vorzusehen.
So werden beide Teilstrahlen mit dem Muster der Maske über den Querschnitt
intensitätsmoduliert
und es besteht die Möglichkeit
die Teilstrahlen exakt zu justieren, z.B. durch Verkippung des Element 5 im
unteren Interferometerarm, wenn die Muster der beiden Teilstrahlen nach
dem Element 18 exakt zur Deckung kommen.
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Die 5 zeigt
zur Verdeutlichung die Unterschiede zwischen üblicher Amplituden-Kontrast-Mikroskopie
und der Interferenz-Mikroskopie nach der Erfindung.
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Erkennbar
ist in der linken oberen Darstellung der 4 ein Mausfibroblast
in normaler Durchlicht-Amplitudenmikroskopie. Die Darstellung zeigt wenig
Kontrast und die Zellstrukturen sind somit nur ungenau zu erkennen.
Aufnahmen mit der erfindungsgemäßen Anordnung
und dem erfindungsgemäßen Verfahren
zeigen die Bilder mittig und rechts in nullter Interferenzordnung,
in der Phase zwischen den beiden Bildern um Pi verschoben.
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Deutlich
ist im mittleren Bild ein heller Zellbereich und im rechten Bild
derselbe Zellbereich in dunkler Darstellung zu erkennen, der einen
optisch aktiven Bereich kennzeichnet, der also entweder polarisationsdrehend
oder phasenschiebend wirkt, so dass weitere Rückschlüsse auf diesen Bereich gezogen
werden können,
die sich aus der reinen Amplituden-Kontrast-Mikroskopie nicht ergeben.