DE102006033306A1

DE102006033306A1 - Tirf Mikroskop

Info

Publication number: DE102006033306A1
Application number: DE200610033306
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr. Hecker
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2006-07-17
Filing date: 2006-07-17
Publication date: 2008-01-31
Also published as: WO2008009581A1

Abstract

Mikroskop zur TIRF-Mikroskopie mit einer Mehrfarben-Lichtquelle zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe mit einem Beleuchtungsstrahl, mit einer Wellenlängenselektionseinrichtung zur variablen Auswahl einer Hauptwellenlänge des Beleuchtungsstrahls und mit einer Ablenkeinrichtung zur variablen Beeinflussung des Beleuchtungsstrahls, wobei die Ablenkeinrichtung zur Veränderung des Einfallswinkels des Beleuchtungsstrahlengangs zur Probe vorgesehen ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop und ein Verfahren zur Total-Internen-Reflexions(TIRF)-Mikroskopie mit einer Mehrfarbenlichtquelle, bei dem der TIRF-Einfallswinkel verändert wird.
Eine bekannte Vorrichtung verwendet für jede unterschiedliche Wellenlänge eine eigene optische Achse.
Nachteilig ist dem bekannten Stand der Technik, dass alle Einstellungen an allen Achsen einzeln getroffen werden müssen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, den Stand der Technik weiter zu entwickeln. Es kann dabei wünschenswert sein, Sequenzen gleicher Eindringtiefe bei unterschiedlicher Wellenlänge des Anregungslichts, aber gleicher Eindringtiefe aufzunehmen.
Diese Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 bestimmte Mikroskop sowie durch die in den Ansprüchen 9 bis 12 bestimmten Verfahren gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den weiteren Unteransprüchen angegeben.
Die Erfindung geht dabei von der Erkenntnis aus, dass sowohl die Veränderung der Wellenlänge als auch die Veränderung des Einfallswinkels die Eindringtiefe des evanescenten Feldes verändert.
Erfindungsgemäß ist die oben genannte Aufgabe bei einem Mikroskop zur TIRF-Mikroskopie mit einer Mehrfarben-Lichtquelle zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe mit einem Beleuchtungsstrahl, mit einer Wellenlängenselektionseinrichtung zur variablen Auswahl einer Hauptwellenlänge des Beleuchtungsstrahls und mit einer Ablenkeinrichtung zur variablen Beeinflussung des Beleuchtungsstrahls dadurch gelöst, dass die Ablenkeinrichtung zur Veränderung des Einfallswinkels des Beleuchtungsstrahlengangs zur Probe vorgesehen ist.
Die Mehrfarbenlichtquelle kann aus einer Anzahl von Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlänge, etwa unterschiedlicher Laser, UV, VIS (z.B. 405nm, 488nm, 532nm, 561nm, 635nm) oder IR oder aus Lasern mit unterschiedlichern Laserlinien bestehen. Ebenso können die Lichtquellen Leuchtdioden, Glühlampen (HG-Dampf, Metallhydrid) oder OPOs sein. Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlänge können üblicherweise über wellenselektive Elemente zu einem Strahl vereinigt werden. Daneben kann die Mehrfarbenlichtquelle auch aus einer Laser-Weißlichtquelle, etwa aus einer monochromatischen Lichtquelle wie einem Laser, und mit einer photonischen Faser gebildet sein.
Die Wellenselektionseinrichtung können schaltbare Schutter (akustooptisch, mechanisch, elektrooptisch) vor den einzelnen Lichtquellen oder schaltbare Filter (Filterrad, akustooptische Elemente wie AOM oder AOTF) im vereinigten Strahl sein. Auch die Verwendung von akustooptischen Elementen zur gleichzeitigen Vereinigung und Auswahl ist denkbar.
Die Ablenkeinrichtung kann durch einen Scanner (z.B. Kippspiegel) gebildet sein, der den selektierten Lichtstrahl vor oder nach der Wellenlängenselektionseinrichtung derart ablenkt, dass der Lichtstrahl unter verschiedenen Winkeln auf die Probe einfällt. Ebenso kann die Ablenkeinrichtung ein sein.
Der Beleuchtungsstrahlengang kann durch das Mikroskopobjektiv hindurch oder seitlich vom Linsensystem des Mikroskopobjektivs innerhalb oder außerhalb des Gehäuses des Mikroskopobjektivs geführt sein.
Das Mikroskop zur TIRF-Mikroskopie kann zur wahlweisen oder gleichzeitigen Verwendung als epi-Fluoreszens-, Hell- oder Dunkellicht- oder zur konfokalen Scanning Mikroskopie ausgestaltet sein.
Vorzugsweise ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Wellenselektionseinrichtung und die Ablenkeinrichtung in gegenseitiger Abhängigkeit steuert.
Zweckmäßigerweise ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert.
Mit besonderem Vorteil ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur konstanten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in der Probe.
Vorteilhafterweise ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur Aufnahme eines Bildes mit konstanter Eindringtiefe von mindestens einem Teil der Probe.
Nach einer Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur Aufnahme meherer Bilder von mindestens einem Teil der Probe mit unterschiedlicher, jeweils konstanter Eindringtiefe.
Nach einer weiteren Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge automatisch steuert zur Aufnahme meherer Bilder mit unterschiedlicher, jeweils konstanter Eindringtiefe.
Nach einer weiteren Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass das Mikroskop nur eine einzige optische Achse für den Beleuchtungsstrahlengang aufweist.
Erfindungsgemäß ist des weiteren die ursprünglich genannte Aufgabe bei einem Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten gelöst:

– Auswahl einer ersten Beleuchtungswellenlänge
– Auswahl einer bestimmten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes
– Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der ersten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe
– Aufnehmen eines ersten Bildes von mindestens einem Ausschnitt einer Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel

Erfindungsgemäß ist des weiteren die ursprünglich genannte Aufgabe bei einem weiteren Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten gelöst:

– Auswahl einer ersten Beleuchtungswellenlänge
– Auswahl einer bestimmten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes
– Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der ersten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe
– Aufnehmen eines ersten Bildes von mindestens einem Ausschnitt einer Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel
– Auswahl einer zweiten Beleuchtungswellenlänge
– Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der zweiten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe
– Aufnehmen eines zweiten Bildes von mindestens einem Ausschnitt der Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel

– Festlegen einer Beleuchtungswellenlänge
– Festlegen mehrerer Eindringtiefen des evaneszenten Feldes
– Automatisches Berechnen der zugeordneten Einfallswinkel des Beleuchtungslichtes für die verschiedenen Eindringtiefen in Abhängigkeit von der Beleuchtungswellenlänge und der Eindringtiefe
– Aufnehmen mehrerer Bilder von mindestens einem Ausschnitt einer Probe für die verschiedenen Eindringtiefen.

– Festlegen mehrerer Beleuchtungswellenlängen
– Festlegen mehrerer Eindringtiefen des evaneszenten Feldes
– Automatisches Berechnen der zugeordneten Einfallswinkel des Beleuchtungslichtes für bestimmte Kombinationen aus Beleuchtungswellenlänge und Eindringtiefe in Abhängigkeit von der Beleuchtungswellenlänge und der Eindringtiefe
– Aufnehmen mehrerer Bilder von mindestens einem Ausschnitt einer Probe für die bestimmten Kombinationen aus Beleuchtungswellenlänge und Eindringtiefe.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand schematischer Darstellungen zu einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Gleiche Bezugszeichen in den einzelnen Figuren beizeichnen dabei gleiche Elemente. Es zeigt
1 das erfindungsgemäße Mikroskop.
Die 1 zeigt ein TIRF-Mikroskop. Vier Laser 1 senden Licht unterschiedlicher Wellenlängen (405nm, 488nm, 561nm, 635nm) an die Wellenlängenselektionseinrichtung 2. Diese ist hier mit Blenden für die einzelnen Laser derart ausgeführt, dass wahlweise die Wellenlänge eines Lasers in den Beleuchtungsstrahlengang freigegeben wird. Der Beleuchtungsstrahl wird über einen dichroitischen Spiegel in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt und über einen Scanner 5 und das Mikroskopobjektiv 6 im Einfallswinkel 7 über das Glasplättchen 8 auf die Probe 9 eingestrahlt. Der Einfallswinkel ist dabei stets so gewählt, dass Totalreflexion stattfindet. Das in einer bestimmten Eindringtiefe in die Probe eindringende evanszente Feld regt Teile der Probe zur Fluoreszenz an. Das Fluoreszenzlicht wird im Detektionsstrahlengang 10 durch das Objektiv 6, zurück über den Scanner 5 und durch den dichroitischen Spiegel 3 auf den Detektor 11 geführt. Der Detektor ist über eine Verbindung 23 mit einem Computer 13 verbunden. Der Computer 13 enthält eine Speichereinheit und eine Recheneinheit und empfängt das Signal des Detektors 11 und berechnet daraus eine bildhaft darstellbare Darstellung des Detektorsignals. Eine Steuereinheit 12 ist mit einer Verbindung 20 mit dem Scanner, mit einer Verbindung 21 mit der Wellenlängenselektionseinrichtung 2 und mit einer Verbindung 22 mit dem Computer 13 verbunden. Die Steuereinheit 12 steuert oder regelt dabei die Tätigkeit des Scanners 5 und der Wellenlängen selektionseinrichtung 2 nach Maßgabe des Computers 13. Die Steuereinheit 12 kann auch durch den Computer 13 ausgebildet sein. Die Darstellung des Detektorsignals im Computer 13 wird von diesem zur Darstellung auf dem Monitor 14 aufbereitet und auf dem Monitor 14 bildhaft dargestellt. Daneben speichert der Computer 13 die Darstellung zur späteren Darstellung auf dem Monitor 14 oder zur weiteren Verrechnung mit anderen Darstellungen. Dabei werden dreidimensionale und mehrfarbige Darstellungen der Probe 9 gespeichert und auf dem Monitor 14 dargestellt.
Dabei werden die beanspruchten Verfahren durchgeführt. Um die Eindringtiefe zu vergrößern, wird der Einfallswinkel 7 des Beleuchtungslichtstrahls 4 durch den Scanner 5 verkleinert. Dies geschieht etwa dadurch, dass der Beleuchtungsstahl 4 näher zum Zentrum des Objektivs 6 hin in dieses eingestrahlt wird.
Dies wird durchgeführt, um bei einem Wechsel zu einer höheren Wellenlänge durch die Wellenlängenselektionseinrichtung 2 die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes konstant zu halten, da sich bei einer Erhöhung der Wellenlänge die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes vergrößert. Auf diese Weise gelingt es, mit mehreren Wellenlängen die Probe bei einer konstanten Eindringtiefe anzuregen und so Bilder der Probe von unterschiedlichen Fluorophoren in der gleichen Ebene zu erhalten.
Die Erfindung kann sowohl mit Fluoreszenzanregung der Probe 9 als auch ohne Fluoreszenzanregung der Probe 9 betrieben werden.
Die 1 zeigt lediglich den TIRF-Strahlengang. Selbstverständlich kann das Mikroskop auch noch weitere Strahlengänge, etwa zur normalen epi-Fluoreszenz oder zur konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, umfassen.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass die Verfahren automatisiert und damit zeit- und kostensparend ausgeführt werden können. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass die Anordnung bei einem Wechsel der Wellenlängen nicht erst neu justiert werden muss. Die Erfindung erlaubt die automatische Aufnahme von Bildsequenzen unterschiedlicher Farben und Eindringtiefen (Stacking).

1: Laser
2: Wellenlängenselektionseinrichtung
3: Dichroitischer Spiegel
4: Beleuchtungsstrahlengang
5: Scanner
6: Objektiv
7: Einfallswinkel
8: Glasplättchen
9: Probe
10: Detektionsstrahlengang
11: Detektor
12: Steuereinheit
13: Computer
14: Monitor
20: Verbindung Steuereinheit zu Scanner
21: Verbindung Steuereinheit zu Wellenlängenselektionseinrichtung
22: Verbindung Steuereinheit zu Computer
23: Verbindung von Detektor zu Computer
24: Verbindung von Computer zu Monitor

Claims

Mikroskop zur TIRF-Mikroskopie mit einer Mehrfarben-Lichtquelle zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe mit einem Beleuchtungsstrahl, mit einer Wellenlängenselektionseinrichtung zur variablen Auswahl einer Hauptwellenlänge des Beleuchtungsstrahls und mit einer Ablenkeinrichtung zur variablen Beeinflussung des Beleuchtungsstrahls, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung zur Veränderung des Einfallswinkels des Beleuchtungsstrahlengangs zur Probe vorgesehen ist.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Wellenselektionseinrichtung und die Ablenkeinrichtung in gegenseitiger Abhängigkeit steuert.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur konstanten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in der Probe.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur Aufnahme eines Bildes mit konstanter Eindringtiefe von mindestens einem Teil der Probe.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge steuert zur Aufnahme meherer Bilder von mindestens einem Teil der Probe mit unterschiedlicher, jeweils konstanter Eindringtiefe.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die die Ablenkeinrichtung in Abhängigkeit von der Hauptwellenlänge automatisch steuert zur Aufnahme meherer Bilder mit unterschiedlicher, jeweils konstanter Eindringtiefe.
Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop nur eine einzige optische Achse für den Beleuchtungsstrahlengang aufweist.
Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten: – Auswahl einer ersten Beleuchtungswellenlänge – Auswahl einer bestimmten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der ersten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe – Aufnehmen eines ersten Bildes von mindestens einem Ausschnitt einer Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel
Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten: – Auswahl einer ersten Beleuchtungswellenlänge – Auswahl einer bestimmten Eindringtiefe des evaneszenten Feldes – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der ersten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe – Aufnehmen eines ersten Bildes von mindestens einem Ausschnitt einer Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel – Auswahl einer zweiten Beleuchtungswellenlänge – Automatisches Anpassen des Einfallswinkels des Beleuchtungslichtes in Abhängigkeit von der zweiten Beleuchtungswellenlänge und der bestimmten Eindringtiefe – Aufnehmen eines zweiten Bildes von mindestens einem Ausschnitt der Probe in der bestimmten Eindringtiefe mit der ersten Beleuchtungswellenlänge und dem automatisch angepassten Einfallswinkel
Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten: – Festlegen einer Beleuchtungswellenlänge – Festlegen mehrerer Eindringtiefen des evaneszenten Feldes – Automatisches Berechnen der zugeordneten Einfallswinkel des Beleuchtungslichtes für die verschiedenen Eindringtiefen in Abhängigkeit von der Beleuchtungswellenlänge und der Eindringtiefe – Aufnehmen mehrerer Bilder von mindestens einem Ausschnitt einer Probe für die verschiedenen Eindringtiefen.
Verfahren zur TIRF-Mikroskopie mit den folgenden Verfahrensschritten: – Festlegen mehrerer Beleuchtungswellenlängen – Festlegen mehrerer Eindringtiefen des evaneszenten Feldes – Automatisches Berechnen der zugeordneten Einfallswinkel des Beleuchtungslichtes für bestimmte Kombinationen aus Beleuchtungswellenlänge und Eindringtiefe in Abhängigkeit von der Beleuchtungswellenlänge und der Eindringtiefe – Aufnehmen mehrerer Bilder von mindestens einem Ausschnitt einer Probe für die bestimmten Kombinationen aus Beleuchtungswellenlänge und Eindringtiefe.