DE102006027450A1 - Method of inducing insulin synthesis in chorionic cells - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bietet ein einfaches, leicht durchführbares Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in isolierten Chorionzellen, die aus der Eihaut gewonnen wurden. Die Zellen werden durch Zugabe von L-Gastrin und GLP-1 bzw. Exendin-4 zur Insulinsynthese angeregt, wobei eine große Insulinmenge freigesetzt wird. Damit sind die Zellen und das Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Diabetes mellitus geeignet.The present invention provides a simple, easily practicable method of inducing insulin synthesis in isolated chorionic cells obtained from the egg skin. The cells are stimulated by the addition of L-gastrin and GLP-1 or exendin-4 for insulin synthesis, with a large amount of insulin is released. Thus, the cells and method for inducing insulin synthesis are useful in the preparation of an agent for the treatment of diabetes mellitus.

Description

Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in ChorionzellenMethod of induction of Insulin synthesis in chorionic cells

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in isolierten Chorionzellen und ihre Verwendung zur Transplantation und bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung des Diabetes mellitus.The The present invention relates to a method of inducing insulin synthesis in isolated chorionic cells and their use for transplantation and in the manufacture of an agent for the treatment of diabetes mellitus.

Beschreibung und Einleitung des allgemeinen Gebietes der ErfindungDescription and introduction of the general field of the invention

Die Plazenta als ein kurzlebiges transientes Organ verfügt über eine Reihe von pluripotenten Zellen, welche ohne ethische Probleme in hoher Zahl und ohne Belastung für Mutter und Kind entnommen werden können. Hierzu zählen Stammzellen aus dem Nabelschnurblut sowie Amnion- und Chorionzellen. Für die Transplantation sind sie hervorragend geeignet, da sie neben ihrem Stammzellähnlichen Phänotyp eine immunologische Unreife aufweisen und damit eine wesentlich geringere Abstoßungsreaktion bei Transplantation hervorrufen, als adulte Zellen.The Placenta as a transient transient organ has one Series of pluripotent cells, which without ethical problems in high number and no load for Mother and child can be removed. These include stem cells from umbilical cord blood and amniotic and chorionic cells. For the transplant They are eminently suitable as they are next to their stem cell-like phenotype have an immunological immaturity and thus a significant less rejection reaction when transplanted, as adult cells.

Stand der TechnikState of the art

Zahlreiche wissenschaftliche Arbeitsgruppen beschäftigen sich damit, Stammzellen auch zur Therapie von Diabetes im speziellen Diabetes Typ-1 einzusetzen.numerous Scientific working groups deal with it, stem cells also for the treatment of diabetes in the special type-1 diabetes.

Die Differenzierung von embryonalen Stammzellen führte dabei bisher nur zu geringer Insulinproduktion, die durch ein hohes Risiko, Teratome zu bilden, begleitet wird, so dass die Anwendung neben ethischen auch gesundheitliche- Probleme aufwirft. Die Differenzierung mesenchymaler Zellen wie Zellen des Knochenmarks oder Zellen aus dem Nabenschnurblut sind bisher in Ansätzen verfolgt worden, in denen die Zellen durch virale Transfektion von Differenzierungsgenen zur Insulinsynthese und -sezernierung angeregt worden waren, wodurch die spätere potentielle Transplantation in Menschen erschwert wird.The Differentiation of embryonic stem cells has so far only led to less Insulin production, which is at high risk of forming teratomas accompanied by ethical and health-related Poses problems. The differentiation of mesenchymal cells such as Cells of the bone marrow or cells from the umbilical cord blood are so far in approaches in which the cells were transfected by viral transfection Differentiation genes for insulin synthesis and secretion excited which were the later potential transplantation in humans is made more difficult.

Dies trifft ebenso auf die Differenzierung endodermaler Zellen wie Leber- oder Dünndarmzellen zu, dem bisher erfolgreichsten Ansatz. Die Induktion der Insulinsynthese bis zu einem Drittel der Produktion in authentischen Inselzellen war allerdings nur nach retroviraler- bzw. adenoviraler Transfektion von Differenzierungsgenen bzw. des Telomerasegens möglich. Ausgehend von plazentaren Zellen wurde bisher nur eine Arbeit zur induzierten Insulinsynthese veröffentlicht, in der Amnionzellen in diabetische Mäuse injiziert wurden. Da Insulin nur auf der mRNA Ebene detektiert wurde, ist der tatsächliche Erfolg dieses Ansatzes nur schwer abzuschätzen.This also applies to the differentiation of endodermal cells such as liver or small intestine cells, the most successful approach so far. The induction of insulin synthesis up to a third of production in authentic islet cells was only after retroviral or adenoviral transfection differentiation genes or telomerase gene possible. outgoing of placental cells has so far been only one work induced Insulin synthesis published, in which amniotic cells were injected into diabetic mice. There insulin was detected only at the mRNA level, is the actual Difficult to estimate the success of this approach.

Zurzeit gewährleisten lediglich Transplantationen von Pankreas- bzw. Inselzellen eine physiologisch regulierte Insulinfreisetzung in Diabetespatienten. Im Vergleich zur konventionellen Insulin-Therapie führt dies immerhin zu einer Verhinderung oder zumindest Verzögerung der Diabetes-spezifischen Sekundärkomplikationen. Die Pankreas- bzw. Inselzelltransplantation ist jedoch durch das begrenzte Spenderaufkommen nur bei wenigen Patienten einsetzbar.For now guarantee only transplants of pancreatic or islet cells Physiologically regulated insulin release in diabetes patients. Compared to conventional insulin therapy this leads after all, to prevent or at least delay the Diabetes-specific secondary complications. However, the pancreatic or islet cell transplantation is by the Limited donation can only be used in a few patients.

Daher besteht der dringende Bedarf an geeigneten Zellen, in denen die Insulinsynthese induziert werden kann und ein entsprechendes Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in diesen Zellen.Therefore There is an urgent need for suitable cells in which the Insulin synthesis can be induced and a corresponding procedure for Induction of insulin synthesis in these cells.

Aufgabetask

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches, leicht durchführbares Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in isolierten Chorionzellen bereitzustellen, wobei die Chorionzellen und die Kultivierungsbedingungen so optimiert sind, dass eine hohe Insulinmenge erzeugt wird und die Nachteile im Stand der Technik überwunden werden.task The present invention is a simple, easy to carry out Method of inducing insulin synthesis in isolated chorionic cells to provide the chorionic cells and the culture conditions are optimized so that a high amount of insulin is produced and the disadvantages are overcome in the prior art.

Lösung der Aufgabesolution the task

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1.These The object is achieved by a method having the features of claim 1.

Das Verfahren zeichnet sich aus durch eine besondere Kultivierungsmethode der isolierten Chorionzellen und dem gezielten Zusatz einer Kombination von speziellen Substanzen, die die Differenzierung von Chorionzellen zu Insulinproduzierenden Zellen fördern. Diese Substanzen entstammen der Gruppe der Enterohormone, wie Gastrin sowie dessen Derivate und Glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) sowie dessen Derivate einschließlich Exendin-4, oder es sind Wachstums-und Differenzierungsfaktoren wie Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-α (NGF-α), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF)-Rezeptoren bindende Substanzen und/oder Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen.The Process is characterized by a special cultivation method the isolated chorionic cells and the targeted addition of a combination of special substances that differentiate chorionic cells to promote insulin-producing cells. These substances come from the group of enterohormones, such as gastrin and its derivatives and glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) and its derivatives including exendin-4, or they are growth and differentiation factors such as hepatocyte growth factor (HGF), Vascular Endothelial Growth Factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-α (NGF-α), betacellulin, Epidermal growth factor (EGF) receptors binding substances and / or Substances that reduce the intracellular cAMP concentration increase.

Vorteilhafterweise werden als Zellen zur Induktion der Insulinsysnthese Stammzellen aus der Plazenta insbesondere dem Chorion verwendet. Diese Chorionzellen entstammen ausschließlich der Eihaut und weisen keine Verunreinigungen durch Amnionzellen oder Chorionzellen aus anderen Teilen der Plazenta auf. Diese Zellen sind aber soweit differenziert, dass eine Tumorbildung nach Injektion nahezu ausgeschlossen werden kann. Damit sind diese Zellen für das Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese besser geeignet, als bisher im Stand der Technik bekannte Zellen, die eine mögliche Teratombildung bedingen und/oder nur durch eine virale Transfektion zur Insulinproduktion fähig sind.Advantageously, stem cells from the placenta, in particular the chorion, are used as cells to induce insulin synthesis. These chorion cells are derived exclusively from the egg skin and have no contamination by amniotic cells or chorion cells from other parts of the placenta. However, these cells are so far differentiated that tumor formation after injection can almost be ruled out. So these are Zel len more suitable for the process for the induction of insulin synthesis, as previously known in the art cells that cause a possible teratoma and / or only by a viral transfection to insulin production are capable.

Im Unterschied zu Zellen aus dem Amnion und Zellen aus anderen Teilen der Plazenta exprimieren die erfindungsgemäßen Chorionzellen endodermale Marker wie z.B. α-Fetoprotein (AFP) (1) in vivo und werden nicht mit Differenzierungsgenen wie PDX-1, MAF1 oder NeuroD mittels retro- bzw. adenoviraler Vektoren transfiziert.In contrast to cells from the amnion and cells from other parts of the placenta, the chorion cells according to the invention express endodermal markers such as α-fetoprotein (AFP) (US Pat. 1 ) in vivo and are not transfected with differentiation genes such as PDX-1, MAF1 or NeuroD by means of retro or adenoviral vectors.

Endodermale Marker wie z.B. α-Fetoprotein (AFP) zeigen an, dass die erfindungsgemäßen Chorionzellen zu endodermalen Zellen wie Dünndarm- oder Leberzellen differenzieren können.endodermal Markers such as e.g. α-fetoprotein (AFP) indicate that the chorion cells according to the invention become endodermal Cells like small intestine or Differentiate liver cells.

Das Verfahren zur Induktion von Insulin in isolierten Chorionzellen weist folgende Schritte auf:

  • a) Bereitstellung und Kultivierung von Chorionzellen
  • b) Erzeugung und Kultivierung von Chorionzell-Sphäroiden
  • b) Induktion der Insulinsynthese
The process for inducing insulin in isolated chorionic cells comprises the following steps:
  • a) Provision and cultivation of chorionic cells
  • b) Production and Cultivation of Chorionic Spheroids
  • b) induction of insulin synthesis

a) Bereitstellung und Kultivierung von Chorionzellena) Provision and cultivation of chorion

Chorionzellen werden aus Choriongewebe eines Säugetieres, bevorzugt eines Menschen durch Abtrennung der gesamten Eihaut von der restlichen Plazenta und Verwerten des Amnions erhalten. Das Choriongewebe wird zerkleinert und einer Kollagenasebehandlung unterzogen, so dass Chorioneinzelzellen entstehen. Die Kultivierung der Chorioneinzelzellen erfolgt in Medium, wobei die adhärente Kultivierung der Chorioneinzelzellen vorzugsweise in serumfreiem oder in fötales Kälberserum enthaltendem Kulturmedium erfolgt.chorion are made from chorionic tissue of a mammal, prefers a human by separating the entire egg skin from the remaining placenta and recovering the amnion obtained. The chorionic tissue is crushed and subjected to collagenase treatment, so that Chorioneinzelzellen arise. The cultivation of individual chorionic cells takes place in medium, with the adherent Cultivation of individual chorionic cells, preferably in serum-free or in fetal calf serum containing culture medium.

b) Erzeugung und Kultivierung von Chorionzell-Sphäroidenb) Production and Cultivation of Chorionic Spheroids

Die Erzeugung von Chorionzell-Sphäroiden erfolgt durch Kultur der mechanisch oder enzymatisch abgelösten Zellen in serumfreiem oder Medium, das fötales Kälberserum enthält, auf nicht-adhärenten Zellkulturmaterialien, so dass die Zellen als frei flotierende Aggregate in dreidimensionaler Form (=Sphäroide) vorliegen. Nicht-adhärente Zellkulturmaterialien sind beispielsweise Zellkulturflaschen für Suspensionskultur aus Plastik.The Generation of chorionic spheroids occurs by culture of the mechanically or enzymatically detached cells in serum-free or medium containing fetal calf serum nonadherent Cell culture materials, leaving the cells as free floating aggregates in three-dimensional form (= spheroids) available. Non-adherent Cell culture materials are, for example, cell culture bottles for suspension culture from plastic.

Alternativ erfolgt die Kultivierung der Chorionzellen auf Matrigel zu adhärenten Chorionzell-Sphäroiden in serumfreien Medium oder Medium, das fötales Kälberserum enthält.alternative the cultivation of the chorion cells on Matrigel is carried out to adherent chorionic cell spheroids in serum-free medium or medium containing fetal calf serum.

c) Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von Enterohormonc) induction of insulin synthesis by Addition of enterohormone

Die Induktion der Insulinsynthese erfolgt durch Kultivierung der Chorionzell-Sphäroide in serumfreien Medium oder Medium, das fötales Kälberserum enthält auf nicht-adhärenten Zellkulturmaterialien und gezielter Zugabe von Enterohormonen wie Gastrin oder einem Gastrin-Derivat und GLP-1 bzw. einem GLP-1- Derivat, z.B Exendin-4. In den Chorionzell-Sphäroiden wird auf diese Weise die Bildung sowohl von Insulin-mRNA als auch von Insulin-Protein induziert. Der Gehalt an zellulärem Insulinprotein (gemessen als Insulin-C-Peptid) liegt dabei im Durchschnitt bei 37 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 6) pro mg Gewebeprotein. Dies entspricht bei einem molekularen 1:1 Verhältnis einer Insulinmenge von 58 ng bis 77 ng Insulin.The Induction of insulin synthesis is carried out by cultivating the chorionic cell spheroids in serum-free medium or medium containing fetal calf serum on non-adherent cell culture materials and targeted addition of enterohormones such as gastrin or a gastrin derivative and GLP-1 or a GLP-1 derivative, for example exendin-4. In the Chorionzell spheroids becomes in this way the formation of both insulin mRNA and insulin protein induced. The content of cellular Insulin protein (measured as insulin C-peptide) is on average at 37 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 6) per mg tissue protein. This corresponds to a molecular 1: 1 relationship an insulin amount of 58 ng to 77 ng insulin.

Alternativ erfolgt die Induktion der Insulinsynthese der auf Matrigel adhärenten Chorionzell-Sphäroide durch Kultivierung in serumfreien Medium oder Medium, das fötales Kälberserum enthält, mit Enterohormonen wie Gastrin oder einem Gastrin-Derivat und GLP-1 bzw. einem GLP-1-Derivat, z.B. Exendin-4. Der Gehalt an zellulärem Insulinprotein (gemessen als Insulin-C-Peptid) liegt hierbei im Durchschnitt bei 73 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 3) pro mg Gewebeprotein. Dies entspricht bei einem molekularen 1:1 Verhältnis einer Insulinmenge von 135 ng bis 154 ng Insulin.alternative the induction of insulin synthesis of the Matrigel adherent chorionic cell spheroids occurs Cultivation in serum-free medium or medium, the fetal calf serum contains with enterohormones such as gastrin or a gastrin derivative and GLP-1 or a GLP-1 derivative, e.g. Exendin-fourth The content of cellular insulin protein (measured as insulin C-peptide) is included here on average 73 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 3) per mg tissue protein. This corresponds to a molecular 1: 1 relationship an insulin amount of 135 ng to 154 ng insulin.

Alternativ werden neben den Enterohormonen Gastrin und/oder dessen Derivate, GLP-1 und/oder dessen Derivate einschließlich Exendin-4 auch Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-α (NGF-α), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF)-Rezeptoren bindende Substanzen und/oder Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen, verwendet, um die Insulinsynthese zu induzieren. Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen sind beispielsweise db-cAMP, 8-Br-cAMP, oder Isobutyl-Methyl-Xanthin.alternative In addition to the enterohormones, gastrin and / or its derivatives, GLP-1 and / or its derivatives including exendin-4 also hepatocyte growth factor (HGF), Vascular Endothelial Growth Factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-α (NGF-α), betacellulin, Epidermal growth factor (EGF) receptors binding substances and / or Substances that increase the intracellular cAMP concentration, to induce insulin synthesis. Substances that reduce the intracellular cAMP concentration increase are, for example, db-cAMP, 8-Br-cAMP, or isobutyl-methyl-xanthine.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Induktion der Insulinsynthese in isolierten Chorionzellen ist einfach durchführbar und erzeugt hohe Insulinmengen. Damit sind diese Zellen zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Diabetes bei Patienten geeignet.The inventive method For induction of insulin synthesis in isolated chorionic cells is easy feasible and generates high amounts of insulin. So these cells are for manufacturing an agent for treating diabetes in patients.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Mittel zur Behandlung von Diabetes bei Patienten, das Chorionzellen beinhaltet, die durch Zugabe von Enterohormonen zur Insulinsysnthese angeregt werden.The The invention further relates to an agent for the treatment of diabetes in patients, which includes chorionic cells, by adding Enterohormonen be stimulated to Insulinsysnthese.

Der Begriff Patient bezieht sich dabei gleichermaßen auf Menschen und Wirbeltiere. Damit kann das Mittel zur Behandlung von Diabetes in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden.The term patient refers equally to humans and vertebrates. In order to the agent can be used for the treatment of diabetes in human and veterinary medicine.

Das Mittel zur Behandlung von Diabetes der vorliegenden Erfindung wird den Patienten, als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral intravenös, intramuskulär oder subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Sprayform verabreicht.The An agent for the treatment of diabetes of the present invention is the patient, as part of a pharmaceutically acceptable composition either orally, rectally, parenterally intravenously, intramuscularly or subcutaneously, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravascular, local (Powder, ointment or drops) or administered in spray form.

Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können die Modifikationen als Salze, Ester, Amide und "Prodrugs" beinhalten, sofern sie nach zuverlässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen.pharmaceutical acceptable compositions can which include modifications as salts, esters, amides and prodrugs, provided they are of a reliable medical grade Assess no excessive toxicity, irritation or cause allergic reactions in the patient.

Der Terminus "Prodrug" bezieht sich auf Verbindungen, die zur Verbesserung der Aufnahme transformiert werden, wie beispielsweise durch Hydrolyse im Blut. Dosierungsformen für die örtliche Administration des Impfstoffes dieser Erfindung schließen Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen, mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Preservativen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt.Of the Term "prodrug" refers to Compounds that are transformed to improve uptake, such as by hydrolysis in the blood. Dosage forms for the local Administration of the vaccine of this invention include ointments, Powders, sprays or inhalants. The active component is used under sterile conditions, with a physiologically acceptable Carrier and potential Preservatives, buffers or propellants, as needed, mixed.

Ausführungsbeispieleembodiments

a) Bereitstellung und Kultivierung von Chorionzellena) Provision and cultivation of chorion

i) Isolierung von Chorionzelleni) isolation of chorionic cells

Von einer Plazenta, die beispielsweise durch Kaiserschnitt nach normaler Schwangerschaft erhalten wird, wird das Chorion laevi einschließlich der daran befindlichen Reste der äußeren Capsula decidua abgetrennt. Die restliche Plazenta, einschließlich des Amnions, wird nicht weiter verwendet. Das Choriongewebe wird in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) von Blutresten befreit. Beispielsweise werden etwa 50 cm2 des Choriongewebes in etwa 1 cm2 große Fragmente zerkleinert und anschließend in einer Kollagenaselösung beispielsweise 200 mg/70 ml PBS inkubiert, vorzugsweise 60 Minuten bei 37°C. Dabei erfolgt die Zerlegung des Gewebes in Einzelzellen und Bindegewebsfragmente.From a placenta obtained, for example, by caesarean section after normal pregnancy, the chorion laevi, including the remains of the outer capsule decidua located on it is separated. The remaining placenta, including the amnion, will be discontinued. The chorion tissue is freed of blood residue in phosphate buffered saline (PBS). For example, about 50 cm 2 of the chorionic tissue are fragmented into fragments about 1 cm 2 in size and subsequently incubated in a collagenase solution, for example 200 mg / 70 ml PBS, preferably at 37 ° C. for 60 minutes. The tissue is divided into single cells and connective tissue fragments.

Die Reaktion wird durch Zugabe von 10% fötalem Kälberserum-haltigem Kulturmedium beendet und die Suspension durch einen Filter mit Porengröße von 70 μm gefiltert. Die Zellen werden anschließend von der Enzymlösung getrennt, z.B. durch zweimalige Zentrifugation 634 g 10 min, und in Epithelzellmedium, z.B. Quantum 286 (PAA, Cölbe) kultiviert, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 × 106 Zellen/ml bei 37°C.The reaction is terminated by addition of 10% fetal calf serum-containing culture medium and the suspension is filtered through a 70 μm pore size filter. The cells are then separated from the enzyme solution, eg by centrifuging 634 g for 10 min twice, and cultured in epithelial cell medium, eg Quantum 286 (PAA, Cölbe), preferably at a concentration of 0.5 × 10 6 cells / ml at 37 ° C ,

ii) Adhärente Zellkulturii) Adherent cell culture

Nach etwa 24h wird das Kulturmedium erneuert und dabei nicht adhärente Zellen entfernt. Die Zellen werden für ein bis drei weitere Tage kultiviert.To About 24 hours, the culture medium is renewed and not adherent cells away. The cells are for cultivated one to three more days.

b) Erzeugung und Kultivierung von Chorionzellenb) Production and Cultivation of Chorionic Cells

Suspensions-ZellkulturSuspension cell culture

Die adhärent gewachsenen Zellen werden vom Boden der Kulturflaschen abgelöst und in solche Zellkulturflaschen überführt, die eine Adhärenz weitgehend verhindern, beispielsweise Zellkulturflaschen für Suspensionskultur aus Plastik, so dass sich in serumfreien Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe) frei flotierende Zellsphäroide von ca. 0,1 – 0,2 mm Durchmesser bilden.The adherent grown cells are detached from the bottom of the culture bottles and in such cell culture bottles transferred, the an adherence largely prevent, for example, cell culture bottles for suspension culture made of plastic, resulting in serum-free Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe) freely floating cell spheroids of about 0.1-0.2 mm diameter.

c) Induktion der Insulinsynthesec) induction of insulin synthesis

Dem serumfreien Medium werden Substanzen zugegeben, die die Differenzierung von Chorionzellen zu insulinproduzierenden Zellen fördern. Im Besonderen ist dies eine Mischung aus L-Gastrin (Endkonzentration 100 ng/ml) und dem Inkretinhormon GLP-1 (7–36) (Endkonzentration 50 ng/ml) oder einem Analogon des Inkretinhormons wie beispielsweise Exendin-4 (Endkonzentration 50 ng/ml). Alleiniger Zusatz von L-Gastrin oder GLP-1 (bzw. Exendin-4) fördert ebenfalls die Differenzierung zu insulinproduzierenden Zellen, jedoch wesentlich weniger wirksam, als bei kombinierter Gabe. Eine Induktion der Insulinproduktion wird auch durch Zugabe anderer Peptide induziert, wie beispielsweise durch Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-α (NGF-α), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF), oder durch Substanzen die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen (beispielsweise db-cAMP, 8-Br-cAMP, oder Isobutyl-Methyl-Xanthin).the Serum-free medium is added to substances that differentiate from chorionic cells to insulin-producing cells. In particular this is a mixture of L-gastrin (final concentration 100 ng / ml) and the incretin hormone GLP-1 (7-36) (Final concentration 50 ng / ml) or an analog of the incretin hormone such as exendin-4 (final concentration 50 ng / ml). sole Addition of L-gastrin or GLP-1 (or exendin-4) also promotes the differentiation to insulin-producing cells, but essential less effective than with combined administration. An induction of insulin production is also induced by the addition of other peptides, such as by hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), nerve growth factor-α (NGF-α), betacellulin, Epidermal growth factor (EGF), or by substances affecting the intracellular cAMP concentration increase (for example, db-cAMP, 8-Br-cAMP, or isobutyl-methyl-xanthine).

Die Chorionzell-Sphäroide werden 7–21 Tage in serumfreien Medium als Suspensionskultur mit L-Gastrin und Exendin-4 bei 37°C bzw. mit den Substanzen, die die Differenzierung von Chorionzellen zu insulinproduzierenden Zellen fördern inkubiert, wobei das Medium regelmäßig gewechselt wird.The Chorionzell spheroids be 7-21 days in serum-free medium as a suspension culture with L-gastrin and exendin-4 at 37 ° C or with the substances that differentiate chorion cells to promote insulin-producing cells incubated, the Medium changed regularly becomes.

Alternativ erfolgt die Kultur, unter ansonsten gleichen Bedingungen, nach Adhärenz der Chorionzell-Sphäroide auf Matrigel-beschichteten Plastikmaterial, bspw. auf BioCoat Thin-Layer Matrigel Matrix 6-Well Zellkulturplatten von BD-Biosciences Discovery Labware (Heidelberg).alternative the culture is carried out under otherwise identical conditions, according to the adherence of the Chorionzell spheroids on Matrigel-coated plastic material, for example on BioCoat thin-layer Matrigel Matrix 6-well cell culture plates from BD-Biosciences Discovery Labware (Heidelberg).

Analyse der Insulinsynthese in den als Sphäroide kultivierten ZellenAnalysis of insulin synthesis in the as spheroids cultured cells

Definierte Aliqots der Chorionzell-Sphäroide aus den Suspensionskulturen werden durch Zentrifugation als Pellet gesammelt. Bei den auf Matrigel adhärierten Sphäroiden wird das Matrigel mit Dispase aufgelöst (entsprechend einer Vorschrift des Herstellers) und definierte Aliquots der Zellen werden ebenfalls durch Zentrifugation pelletiert.Defined aliquots of chorionic cell spheroids from the suspension cultures are collected by centrifugation as a pellet. For the spheroids adhered to Matrigel, the Matrigel is resolved with dispase (according to a manufacturer's instructions) and defined aliquots of the cells are also pelleted by centrifugation.

Expression des InsulingensExpression of insulin gene

In einem Aliquot wird die Expression des Insulingens auf der Ebene der mRNA durch RT-PCR überprüft. Dazu erfolgt eine Isolierung der RNA nach einem, dem Fachmann bekannten Standardverfahren z.B. auf folgende Weise:
Die RNA wird mittels "Perfect RNATM, Eukaryotic, Mini Kit" (Eppendorf, Hamburg) entsprechend den Herstellerangaben extrahiert und dann mit dem Cloned AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Karlsruhe) ebenfalls entsprechend den Herstellerangaben revers transkribiert. Die komplementäre DNA wird dann mit HotMasterMix (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert: 35 PCR-Zyklen (95 °C für 45 sec, 58 °C für 30 sec, 68 °C für 45 sec) und 68 °C für 5 min nach dem initialen Denaturierungsschritt (95 °C für 2 min). Die mRNA-Banden werden auf beta-Actin bezogen. Für die Amplifizierung werden beispielsweise die folgenden Primer verwendet: Insulin, 5'-CTC ACA CCT GGT GGA AGC TC-3' und 5'-AGA GGG AGC AGA TGC TGG TA-3'; beta-Actin, 5'-TTC CAG CCT TCC TTC CTG G-3' und 5-TTG CGC TCA GGA GGA GCA AT-3'. Das PCR-Produkt entspricht einer Länge von 245 bp. Siehe 2.In an aliquot, the expression of insulin gene at the level of mRNA by RT-PCR is checked. For this purpose, the RNA is isolated according to a standard method known to the person skilled in the art, for example in the following manner:
The RNA is extracted using "Perfect RNA ™ , Eukaryotic, Mini Kit" (Eppendorf, Hamburg) according to the manufacturer's instructions and then reverse transcribed using the Cloned AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Karlsruhe) according to the manufacturer's instructions. The complementary DNA is then amplified with HotMasterMix (Eppendorf) under the following conditions: 35 PCR cycles (95 ° C for 45 sec, 58 ° C for 30 sec, 68 ° C for 45 sec) and 68 ° C for 5 min after initial denaturation step (95 ° C for 2 min). The mRNA bands are related to beta-actin. For example, the following primers are used for amplification: insulin, 5'-CTC ACA CCT GGT GGA AGC TC-3 'and 5'-AGA GGG AGC AGA TGC TGG TA-3'; beta-actin, 5'-TTC CAG CCT TCC TTC CTG G-3 'and 5-TTG CGC TCA GGA GGA GCA AT-3'. The PCR product corresponds to a length of 245 bp. Please refer 2 ,

Bestimmung des zellulären InsulingehaltesDetermination of cellular insulin content

Die aus den Aliquoten erhaltenen Pellets werden nach Suspension in Albuminhaltigem Phosphatpuffer mit Ultraschall aufgeschlossen und der Gehalt an Insulin-C-Peptid wird mittels Enzymimmunoassay z.B. Mercodia (Uppsala, Schweden) nach Herstellerangaben bestimmt. Insulin-C-Peptid wird gemessen, da auch das Opti-MEM Medium Insulin enthält und so die Ergebnisse verfälscht werden würden. Der verwendete C-Peptid-Assay zeigt keinerlei Kreuzreaktion mit Insulin.The pellets obtained from the aliquots are incubated after suspension in albumin Phosphate buffer with ultrasound digested and the content of Insulin C-peptide is determined by enzyme immunoassay e.g. Mercodia (Uppsala, Sweden) determined according to manufacturer's instructions. Insulin C-peptide is measured as well as the Opti-MEM medium insulin contains and so the results are falsified would. The C-peptide assay used does not show any cross-reaction with Insulin.

Ergebnis: Beim Zusatz von L-Gastrin + GLP-1 bzw. Exendin-4 werden zelluläre Insulin-C-Peptid-Werte von 37 ± 7 ng/mg Zellprotein für Suspensionskulturen von Zellspäroiden (dies entspricht bei einem molekularen 1:1 Verhältnis einer Insulinmenge von 58 ng bis 77 ng Insulin) und 73 ± ng/mg Zellprotein für Matrigel-Kulturen von Zellsphäroiden erhalten (dies entspricht bei einem molekularen 1:1 Verhältnis einer Insulinmenge von 135 ng bis 154 ng Insulin) (3). Die zellulären C-Peptid-Gehalte von Chorionzell-Sphäroiden kultiviert ohne eines der im Ausführungsbeispiel genannten Zusätze liegt bei 0.8 ± 0.5 ng/mg Zellprotein für Suspensionskulturen und bei 12 ± 3 ng/mg Zellprotein für Matrigel-adhärierte Chorionzell-Sphäroide.Result: When L-gastrin + GLP-1 or exendin-4 are added, cellular insulin C-peptide levels of 37 ± 7 ng / mg cell protein are determined for suspension cultures of cell porogens (this corresponds to a 1: 1 molecular weight ratio of insulin from 58 ng to 77 ng insulin) and 73 ± ng / mg cell protein for Matrigel cultures of cell spheroids (this corresponds to a molecular 1: 1 ratio of an insulin amount of 135 ng to 154 ng insulin) ( 3 ). The cellular C-peptide contents of choriocellular spheroids cultured without any of the additives mentioned in the exemplary embodiment is 0.8 ± 0.5 ng / mg cell protein for suspension cultures and 12 ± 3 ng / mg cell protein for Matrigel-adhered chorionic cell spheroids.

Bestimmung des GesamtproteingehaltesDetermination of total protein content

Aus den Aliquoten erhaltene Pellets werden nach Suspension in aqua dest mit Ultraschall aufgeschlossen und der Proteingehalt des Homogenats mit einem kolorimetrischen Kit z.B. dem Total Protein Kit, Micro Lowry von Sigma (St. Louis, Mo, USA) nach Herstellerangaben bestimmt Out The aliquots obtained pellets are after suspension in distilled water sonicated with the ultrasound and the protein content of the homogenate with a colorimetric kit e.g. the Total Protein Kit, Micro Lowry from Sigma (St. Louis, Mo, USA) according to the manufacturer's instructions

AbbildungslegendenFigure legends

1 zeigt die Expression von AFP im Choriongewebe. 1 shows expression of AFP in chorionic tissue.

Dargestellt ist eine Anfärbung von Kryoschnitten aus humanem Plazentagewebe, wobei die Expression des endodermalen Markers AFP durch Inkubation mit Ziegen-anti-AFP-Primärantikörper (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; Santa Cruz, CA) und nachfolgende Darstellung mit 1:400 verdünntem Fluorescein-Isothiocyanat-gekoppeltem Esel-anti-Ziege Immunglobulin (Dianova, Hamburg) verdeutlicht wird. AFP-Expression ist vor allem im Chorionmesenchym zu finden. shown is a staining of cryosections from human placental tissue, wherein expression of the endodermal marker AFP by incubation with goat anti-AFP primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc .; Santa Cruz, CA) and below with 1: 400 diluted fluorescein isothiocyanate-coupled Donkey anti-goat immunoglobulin (Dianova, Hamburg) is clarified. AFP expression is especially in chorionmesenchyme.

Zellkerne werden durch Anfärbung mit Bisbenzimide (Höchst 33342) deutlich. Die Vergrößerung beträgt 1:100.nuclei be by staining with Bisbenzimide (Höchst 33342) clearly. The magnification is 1: 100.

2 zeigt die induzierte Insulin mRNA aus Chorionzellen 2 shows the induced insulin mRNA from chorion cells

Aus Chorionzellen gewonnene Chorionzell-Sphäroide werden eine Woche entweder ohne Enterohormone (als Minuszeichen dargestellt „„) oder mit einer Kombination von 100 ng/ml Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 (als Pluszeichen dargestellt „+") inkubiert. Gesamt RNA wird extrahiert und in cDNA umgeschrieben. Abschließend werden Insulin mRNA und als positive Kontrolle beta-Aktin mRNA mittels PCR amplifiziert. Ein Insulin mRNA Amplifikationsprodukt ist nur in der Probe mit einer Kombination von 100ng/ml Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 (als Pluszeichen dargestellt „+") nachweisbar.Out Choriocellular spheroids derived from chorionic cells will become one week either without Enterohormone (shown as minus sign "") or with a combination of 100 ng / ml gastrin and 50 ng / ml GLP-1 (as Plus sign shown "+") incubated RNA is extracted and transcribed into cDNA. To conclude Insulin mRNA and as a positive control beta-actin mRNA by PCR amplified. An insulin mRNA amplification product is only available in the sample with a combination of 100ng / ml gastrin and 50 ng / ml GLP-1 (shown as plus sign "+") detectable.

3 zeigt den Insulin C-Peptid Gehalt nach Induktion in Chorionzellen 3 shows the insulin C-peptide content after induction in chorionic cells

Aus Chorionzellen gewonnene Chorionzell-Sphäroide werden eine Woche ohne Enterohormone (als Minuszeichen dargestellt „–„) oder mit einer Kombination von 100 ng/ml Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 (als Pluszeichen dargestellt „+") inkubiert. Dabei liegt der Gehalt an zellulärem Insulin-C-Peptid bei den frei flotierenden Chorionzell-Sphäroiden im Durchschnitt bei 37 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 6), bei den auf Matrigel adhärenten Chorionzell-Sphäroiden im Durchschnitt bei 73 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 3).Choriocellular spheroids obtained from chorionic cells are incubated for one week without enterohormones (shown as minus sign "-") or with a combination of 100 ng / ml gastrin and 50 ng / ml GLP-1 (shown plus sign "+") Content of cellular insulin C-peptide in the freely floating chorionic cell spheroids averaged 37 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 6) in the Matrigel-adherent Cho rion cell spheroids average 73 ± 7 ng (MW ± SEM, n = 3).

Claims (22)

Verfahren zur Induktion von Insulin in isolierten Chorionzellen bestehend aus den Schritten a) Bereitstellung und Kultivierung von Chorionzellen b) Erzeugung und Kultivierung von Chorionzell-Sphäroiden c) Induktion der InsulinsyntheseMethod of inducing insulin in isolated chorionic cells consisting of the steps a) Provision and cultivation of chorionic cells b) Production and Cultivation of Chorionic Spheroids c) Induction of insulin synthesis Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass die isolierten Chorionzellen aus der Eihaut eines Säugetieres entnommen wurden.Method according to claim 1 characterized in that the isolated chorion cells from the Skin of a mammal were removed. Verfahren gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Chorionzellen in Medium kultiviert werden.Method according to the preceding claims characterized in that the chorion cells are cultured in medium become. Verfahren gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass das Medium serumfreies oder fötales Kälberserum enthaltenes Kulturmedium ist.Method according to the preceding claims characterized in that the medium is serum-free or fetal calf serum contained culture medium. Verfahren gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von Enterohormon erfolgt.Method according to the preceding claims characterized in that the induction by the addition of enterohormone he follows. Verfahren gemäß Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet dass Enterohormon ausgewählt sind aus der Gruppe L-Gastrin und dessen Derivate, Exendin-4 und dessen Derivate, Glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) sowie dessen Derivate einschliesslich Exendin-4, Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-α (NGF-α), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF)-Rezeptoren bindende Substanzen und Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen.Method according to claim 6, characterized in that enterohormone are selected from the group L-gastrin and its derivatives, exendin-4 and its derivatives, Glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) and its derivatives including Exendin-4, hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), nerve growth factor-α (NGF-α), betacellulin, epidermal growth factor (EGF) receptors binding substances and substances that the intracellular Increase cAMP concentration. Verfahren gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet dass Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen ausgewählt sind aus der Gruppe db-cAMP, 8-Br-cAMP, Isobutyl-Methyl-Xanthin.Method according to claim 7 characterized in that substances containing the intracellular cAMP concentration increase selected are from the group db-cAMP, 8-Br-cAMP, isobutyl-methyl-xanthine. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 7 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von L-Gastrin und GLP-1 erfolgt.Method according to claim 5 to 7, characterized in that the induction by adding L-gastrin and GLP-1 occurs. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 7 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von L-Gastrin und Exendin-4 erfolgt.Method according to claim 5 to 7, characterized in that the induction by adding L-gastrin and exendin-4 take place. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 9 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von 100 ng/ml L-Gastrin und 50 ng/ml Exendin-4 erfolgt.Method according to claim 5 to 9, characterized in that the induction by adding 100 ng / ml L-gastrin and 50 ng / ml exendin-4. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 9 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion durch Zugabe von 100ng/ml L-Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 erfolgt.Method according to claim 5 to 9, characterized in that the induction by adding 100ng / ml L-gastrin and 50ng / ml GLP-1. Verfahren gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Kultivierung der Chorionzellen nicht-adhärent erfolgt.Method according to the preceding claims characterized in that the cultivation of the chorion cells is non-adherent. Verfahren gemäß Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet dass 30ng bis 40 ng zelluläres Insulin-C-Peptid pro mg Gewebeprotein entstehen.Method according to claim 12, characterized in that 30ng to 40 ng of cellular insulin C-peptide per mg tissue protein. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet dass die Kultivierung der Chorionzellen auf Matrigel erfolgt.Process according to claims 1 to 11 characterized in that the cultivation of chorionic cells done on Matrigel. Verfahren gemäß Anspruch 14 dadurch gekennzeichnet dass 70 ng bis 80 ng zelluläres Insulin-C-Peptid pro mg Gewebeprotein entstehen.Method according to claim 14 characterized in that 70 ng to 80 ng of cellular insulin C-peptide per mg tissue protein. Chorionzellen zur Induktion von Insulin aus Choriongewebe der Eihaut dadurch gekennzeichnet dass in ihnen die Insulinsynthese durch Zugabe von Enterohormonen ausgewählt aus der Gruppe Gastrin und dessen Derivate, Glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) sowie dessen Derivate einschließlich Exendin-4, Hepatocyte growth factor (HGF), Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), Nerve growth factor-α (NGF-α), Betacellulin, Epidermal growth factor (EGF)-Rezeptoren bindende Substanzen, Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen, induziert wird.Chorionic cells for the induction of insulin from chorionic tissue the egg skin characterized in that in them the insulin synthesis by the addition of enterohormones selected from the group of gastrin and its derivatives, glucagon-like polypeptide 1 (GLP-1) and its Including derivatives Exendin-4, hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A), nerve growth factor-α (NGF-α), betacellulin, epidermal growth factor (EGF) receptors binding substances, substances that the intracellular increase cAMP concentration, is induced. Chorionzellen gemäß Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von L-Gastrin und GLP-1 erfolgt.Chorionic cells according to claim 16 characterized that the induction of insulin synthesis by adding L-gastrin and GLP-1. Chorionzellen gemäß Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von 100ng/ml L-Gastrin und 50 ng/ml GLP-1 erfolgt.Chorionic cells according to claim 17 characterized that the induction of insulin synthesis by adding 100ng / ml L-gastrin and 50 ng / ml GLP-1. Chorionzellen gemäß Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von L-Gastrin und Exendin-4 erfolgt.Chorionic cells according to claim 16 characterized that the induction of insulin synthesis by adding L-gastrin and exendin-4 takes place. Chorionzellen gemäß Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet dass die Induktion der Insulinsynthese durch Zugabe von 100ng/ml L-Gastrin und 50 ng/ml Exendin-4 erfolgt.Chorionic cells according to claim 19 characterized that the induction of insulin synthesis by adding 100ng / ml L-gastrin and 50 ng / ml exendin-4 takes place. Chorionzellen gemäß der vorangegangenen Ansprüche 16 bis 20 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.Chorionic cells according to the preceding claims 16 to 20 for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes. Mittel zur Behandlung von Diabetes mellitus, dadurch gekennzeichnet dass es Chorionzellen gemäß Anspruch 16 bis 21 enthält.Means for the treatment of diabetes mellitus, by characterized in that it contains chorion cells according to claim 16 to 21.
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